1. Kurulum
<ol><li>Henüz yüklenmemişse R'yi yükleyin. NOT: PAST R ile yazılmıştır ve bu nedenle kullanıcılarının R yüklü olduğunu gerektirir. Bu yazının yazıldığı sırada, PAST'ı doğrudan Bioconductor'dan yüklemek R4.0 gerektirir.  PAST'in eski sürümleri R3.6 için Bioconductor'dan, PAST ise R3.5'li kullanıcılar için Github'dan yüklenebilir. R kurulum talimatları aşağıdaki bağlantıdan indirilebilir: https://www.r-project.org/.</li>
	<li>RStudio Desktop'ın en son sürümünü yükleyin veya RStudio'yu güncelleyin (isteğe bağlı). NOT: RStudio, R diliyle çalışmak için yararlı bir ortamdır. Kurulumu, özellikle PARLAK GUI uygulaması yerine komut satırında PAST çalıştırmayı seçenler için önerilir. RStudio ve kurulum talimatları aşağıdaki bağlantıda bulunabilir: <a href="https://rstudio.com/products/rstudio/">https://rstudio.com/products/rstudio/</a>.</li>
	<li>Bioconductor11'den PAST'ı Biyoikondüktör ile ilgili talimatları izleyerek yükleyin. NOT: Bioconductor aracılığıyla kurulum, PAST'in bağımlılıklarının yüklenmesini işlemelidir. Ayrıca, PAST Github12' den yüklenebilir, ancak Github'dan yüklemek bağımlılıkları otomatik olarak yüklemez.</li>
	<li>PAST Shiny'yi yükleyin (isteğe bağlı). "app" dosyasını indirin. R" github deposunun Sürümler sayfasından: https://github.com/IGBB/PAST/releases/ ve indirilen dosyanın nerede olduğunu unutmayın. NOT: PAST, yöntemlerini doğrudan R ile çağırarak kullanılabilir, ancak R'ye daha az aşina olan kullanıcılar, rehberli bir kullanıcı arabirimi sağlayan PAST Shiny uygulamasını çalıştırabilir. PAST Shiny, PAST Github deposunun shiny_app dalında bulunan bir R komut dosyasıdır. PAST Shiny ilk çalıştırma sırasında bağımlılıklarını yüklemeye çalışacaktır.</li>
	<li>Uygulamayı aşağıda açıklanan üç yoldan biriyle başlatarak analize başlayın.<ol>
<li>RStudio ile PAST Parlak<ol>
<li>RStudio'yu kullanarak, uygulamanın bulunduğu klasörde yeni bir proje oluşturun. R bulunur. Dosya |'nı tıklatın Yeni Proje ve bu klasörü seçin.</li>
			<li>Yeni bir proje oluşturulduktan sonra uygulamayı açın. R dosyası daha önce indirildi. RStudio bu uygulamayı tanır. R parlak bir uygulamadır ve görüntülenen kaynak kodunun üstündeki çubukta bir Uygulama Çalıştır düğmesi oluşturur. Uygulamayı Çalıştır 'ıtıklatın. RStudio daha sonra PAST Shiny uygulamasını görüntüleyen bir pencere başlatacak.</li>
		</ol>
</li>
		<li>R Konsollu PAST Shiny<ol>
<li>R'yi başlatın ve PAST Shiny uygulamasını başlatmak için aşağıdaki kodu çalıştırın: shiny::runApp('yol/klasör/ile/parlak/uygulama. R'. Tırnak işaretleri metnini uygulamanın bulunduğu klasörle değiştirin. R indirildi ve alıntılar sakla.</li>
		</ol>
</li>
		<li>R Shiny olmadan GEÇMİş<ol>
<li>PAST'i yüklemek için R Console'da kitaplığı (PAST) çalıştırın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Parlak analizi özelleştirin (isteğe bağlı)
<ol><li>Analiz başlığını "Yeni Analiz"den, birden çok analizin izlenmesine yardımcı olan çalıştırılma türünü daha iyi yansıtan bir şeyle değiştirin (bkz. Şekil 1).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig1.jpg"> Şekil 1. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig1large.jpg" target="_blank">için lütfen buraya tıklayın.</a>
<ol start="2"><li>Çekirdek sayısını ve modu değiştirin. Çekirdek sayısını makinedeki toplam sayıyla 1 arasında herhangi bir sayıya ayarlayın, ancak GEÇMIŞ'e daha fazla kaynak ayırmanın makinedeki diğer işlemleri yavaşlatabileceğini unutmayın. Modu bölüm 6'daki açıklamaya göre ayarlayın.</li>
</ol>3. GWAS verilerini yükleyin
NOT: GWAS verilerinin sekmeyle sınırlandırılmış olduğunu doğrulayın. İlişkilendirme dosyasının aşağıdaki sütunları içerdiğinden emin olun: özellik, işaret adı, lokus veya kromozom, kromozom üzerindeki konum, p değeri ve işaretleyici için R2 değeri. Efekt dosyasının aşağıdaki sütunları içerdiğinden emin olun: özellik, işaret adı, locus veya kromozom, kromozom üzerindeki konum ve efekt. Kullanıcı verileri yüklerken sütunların adlarını belirtebileceğinden, bu sütunların sırası önemli değildir. Ek sütunlar yoksayılır. TASSEL13 bu dosyaları üretmek için kullanılabilir.
<ol><li>GWAS verilerini PAST Shiny ile yükleyin.<ol>
<li>İlişkilendirme Dosyası ve Efekt dosyası seçim kutularını kullanarak bir ilişkilendirlik dosyası ve efekt dosyası seçin. Dosya seçim kutularının altındaki İlişkilendirme Sütunu Adı ve Efekt Sütunları Adı giriş kutularındaki sütun adlarını verilerdeki sütun adlarını yansıtacak şekilde değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig2.jpg"> Şekil 2. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig2large.jpg" target="_blank">için lütfen buraya tıklayın.</a>
<ol start="2"><li>GWAS verilerini R Konsolu'na PAST ile yükleyin.<ol>
<li>Aşağıdaki kodu değiştirin ve çalıştırın: gwas_data = load_GWAS_data("yol/association_file.tsv", "yol/yol/effects_file.tsv", association_columns = c("Özellik", "İşaretçi", "Locus", "Site", "p", "marker_R2"), effects_columns = c("Özellik", "İşaretçi", "Locus", "Site", "Efekt")
</li>
	</ol>
</li>
	<li>NOT: GWAS dosyalarının gerçek konumunun yollarını değiştirin. association_columns ve effects_columns için sağlanan değerler varsayılan değerlerdir. Adlar varsayılan değerlerle eşleşmezse, sütun adlarını belirtin. Aksi takdirde, bunlar atlanabilir.</li>
</ol>4. Yük bağlantı dengesi (LD) verileri
NOT: Bağlantı dengesi (LD) verilerinin sekmeyle sınırlandırılmış olduğunu ve aşağıdaki veri türlerini içerdiğini doğrulayın: Locus, Position1, Site1, Position2, Site2, Position1 ve Position2 arasındaki temel çiftler halinde mesafe ve R2 değeri.
<ol><li>LD verilerini PAST Shiny ile yükleyin.<ol>
<li>LD verilerini içeren dosyayı seçin. Gerekirse, dosya seçim kutusunun altındaki LD Sütun Adları giriş kutularındaki sütun adlarını LD verilerindeki sütun adlarıyla eşleşecek şekilde değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig3.jpg"> Şekil 3. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig3large.jpg" target="_blank">için lütfen buraya tıklayın.</a>
<ol start="2"><li>R Konsolu'na GEÇMIŞle LD Verileri Yükleyin.<ol>
<li>LD verilerini yüklemek için aşağıdaki kodu değiştirin ve çalıştırın: LD = load_LD("yol//LD.tsv", LD_columns = c("Locus1", "Konum1", "Site1", "Konum2", "Site2", "Dist_bp", "R.2") NOT: Yolu LD dosyasının gerçek konumuna değiştirin. LD_columns için sağlanan değerler varsayılan değerlerdir. Adlar bu varsayılanlarla eşleşmezse, sütunların doğru adlarını belirtin; aksi takdirde, bunlar atlanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Genlere SNP'ler atayın
NOT: Ek açıklamaları GFF biçiminde indirin veya başka bir şekilde bulun. Bu ek açıklamalar genellikle belirli organizmalar için çevrimiçi veritabanlarında bulunabilir. Ek açıklamalar verilerinin kalitesi yol analizinin kalitesini etkileyeceğinden, düşük kaliteli ek açıklamalar konusunda dikkatli olun. Bu ek açıklamaların ilk sütununun (kromozom) ilişkilendirilmez, efektler ve LD verilerindeki locus/kromozomun biçimiyle eşleştiğini onaylayın. Örneğin, GWAS ve LD veri dosyaları ilk kromozomu "1" olarak adlandırıyorsa, ek açıklamalar ilk kromozomu "chr1" olarak adlandırmamalıdır.
<ol><li>PAST Shiny ile genlere SNP'ler atayın. NOT: Uygun bir R2 kesmesinin belirlenmesi hakkında daha fazla bilgi Tang ve ark.6'da , "YOL analizi için SNP'den gen algoritmasına" adlı bölümde bulunabilir.<ol>
<li>GFF ek açıklamalarını içeren dosyayı seçin. Hangi pencere boyutunun ve R2 kesmesinin düşünülen türler için en uygun olduğunu düşünün ve varsayılanlar yüklenen verilere uymuyorsa değiştirin. NOT: PAST'deki varsayılan değerler öncelikle mısır için uygun değerleri yansıtır. Bu adımda, GEÇMİş Parlak analizin başında ayarlanan çekirdek sayısı (Adım 2.2) kullanılır.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig4.jpg"> Şekil 4. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig4large.jpg" target="_blank">için lütfen buraya tıklayın.</a>
<ol start="2"><li>R Konsolu'nda GEÇMIŞ olan genlere SNP'ler atayın.<ol>
<li>Genlere SNP atamak için aşağıdaki kodu değiştirin ve çalıştırın: gen = assign_SNPs_to_genes(gwas_data, LD, "yol/anotations.gff", c("gen"), 1000, 0,8, 2) NOT: Bu örnek kodda, birkaç varsayılan öneri sağlanır: 1000, genleri aramak için SNP'nin etrafındaki pencerenin boyutudur; 0.8, R2için kesme değeridir; 2, paralel işleme için kullanılan çekirdek sayısıdır. Ek açıklamaların yolu da ek açıklamalar dosyasının gerçek konumuna değiştirilmelidir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Önemli yolları keşfedin
NOT: Pathways dosyasının, her yoldaki her gen için bir satırla birlikte sekmeyle ayrılmış biçimde aşağıdaki verileri içerdiğini doğrulayın: yol kimliği - "PWY-6475-1" gibi bir tanımlayıcı; yol açıklaması - yolların "trans-likopen biyosentezi" gibi ne yaptığının daha uzun bir açıklaması; gen - ek açıklamalarda verilen isimlerle eşleşmesi gereken yoldaki bir gen. Yol bilgileri büyük olasılıkla MaizeGDB gibi belirli organizmalar için çevrimiçi veritabanlarında bulunabilir. Kullanıcı tarafından belirtilen ikinci seçenek moddur. "Artan", verim gibi ölçülen özelliğin artan bir değeri istendiğinde yansıtan fenotipleri ifade ederken, "azalan", böcek hasar derecelendirmeleri gibi ölçülen değerlerde bir düşüşün faydalı olduğu bir özelliği ifade eder. Yolların önemi daha önce açıklananyöntemler 4, 6,14kullanılarak test edilir.
<ol><li>PAST Shiny ile önemli yolları keşfedin.<ol>
<li>Yol verilerini içeren dosyayı seçin ve çözümleme seçeneklerinde modun seçili olduğundan emin olun. Gerekirse, analiz için onu korumak için bir yolda olması gereken genlerin sayısını ve etkinin önemini test etmek için boş dağılımı oluşturmak için kullanılan permütasyonların sayısını değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig5.jpg"> Şekil 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
NOT: Bu adımda, GEÇMIŞ Parlak analizinin (Adım 2.2) başında ayarlanan çekirdek sayısı ve mod kullanılır. Varsayılan gen sayısı şu anda 5 gen olarak belirlenmiştir, bu nedenle daha az bilinen genlere sahip yollar çıkarılacaktır. Kullanıcı, daha kısa yollar eklemek için bu değeri 4 veya 3'e düşürebilir, ancak bunu yapmak yanlış olumlu sonuçlar riskiyle karşı karşıya kalacaktır. Bu değerin artırılması analizin gücünü artırabilir, ancak analizden daha fazla yol kaldıracaktır. Kullanılan permütasyon sayısını değiştirmek testin gücünü arttırır ve azaltır.
<ol start="2"><li>R Console'da PAST ile önemli yolları keşfedin.<ol>
<li>Önemli yolları bulmak için aşağıdaki kodu değiştirin ve çalıştırın: rugplots_data <- find_pathway_significance(genler, "yol/yol/yollar.tsv", 5, "artan", 1000, 2) NOT: Bu örnek kodda, önerilen birkaç varsayılan değer sağlanır. 5, yolu analizde tutmak için bir yolda olması gereken minimum gen sayısıdır, artan ölçülen özelliğin artan bir miktarını ifade eder (kullanıcının özellikten bağımsız olarak hem artan hem de azalan çalışması önerilir; veri yorumlama ikisi için farklılık gösterir, ancak), 1000, boş dağılımı belirlemek için etkileri örnekleme sayısıdır, ve 2 paralel işleme için kullanılan çekirdek sayısıdır. Yolu, yollar dosyasının gerçek konumuna değiştirin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Rugplots'ı Görüntüleyin
<ol><li>PAST Parlak ile Rugplots görüntüleyin.<ol>
<li>Tüm girişler yüklendikten ve ayarlandıktan sonra Analize Başla 'yıtıklatın. Bir ilerleme çubuğu görüntülenir ve analizin en son hangi adımının tamamlandığını gösterir. Analiz tamamlandığında, PAST Shiny Sonuçlar sekmesine geçer. Sol sütunda bir sonuç tablosu ("yollar" olarak etiketlenmiştir) ve Rugplots sağ sütunda ("çizimler" olarak etiketlenmiş) görüntülenir.</li>
		<li>Filtreleme parametrelerini denetlemek için kaydırıcıyı kullanın. Filtreleme düzeyi tatmin edici olduğunda, tüm görüntüleri ve tabloları analiz başlığıyla adlandırılan bir ZIP dosyasına tek tek indirmek için sol alttaki Sonuçları İndir düğmesini tıklatın. Bu ZIP dosyası filtre uygulanmış tabloyu, filtrelenmemiş tabloyu ve filtre uygulanmış tablodaki yol başına bir görüntü içerir.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig6.jpg"> Şekil 6. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig6large.jpg" target="_blank">için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig7.jpg"> Şekil 7. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig7large.jpg" target="_blank">için lütfen buraya tıklayın.</a>
<ol start="2"><li>R Konsolunda GEÇMIŞle Rugplots'ı Görüntüleme<ol>
<li>Sonuçları kaydetmek için aşağıdaki kodu değiştirin ve çalıştırın: plot_pathways(rugplots_data, "pvalue", 0,02, "artan", "output_folder") NOT: Bu örnek kodda, önerilen birkaç varsayılan değer sağlanır. pvalue, kullanıcı tarafından bir önem eşiği seçildikten sonra önemsiz yolları filtrelemek için kullanılabilecek verileri sağlar; 0.02, filtrelemede kullanılan varsayılan değerdir ve artan, ölçülen özelliğin artan bir miktarını ifade eder (kullanıcının özelliğinden bağımsız olarak hem artan hem de azalan çalışması önerilir; veri yorumlama ikisi için farklılık gösterecektir); output_folder, görüntülerin ve tabloların yazılacağı klasördür (bu klasör işlevi çalıştırmadan önce bulunmalıdır). Filtre uygulanmış sonuçlar, filtre uygulanmamış sonuçlar ve filtre uygulanmış sonuçlardaki her yol için tek tek görüntüler tablosu bu klasöre yazılır.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rafalski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+genetics+in+crop+improvement.">Association genetics in crop improvement.</a> Current Opinion in Plant Biology. 13 (2), 174-180 (2010).</li><li>Yan, J., Warburton, M., Crouch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+Mapping+for+Enhancing+Maize+(Zea+mays+L.)+Genetic+Improvement.">Association Mapping for Enhancing Maize (Zea mays L.) Genetic Improvement.</a> Crop Science. 51 (2), 433-449 (2011).</li><li>Xiao, Y., Liu, H., Wu, L., Warburton, M., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Association+Studies+in+Maize:+Praise+and+Stargaze.">Genome-wide Association Studies in Maize: Praise and Stargaze.</a> Molecular Plant. 10 (3), 359-374 (2017).</li><li>Wang, K., Li, M., Bucan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-Based+Approaches+for+Analysis+of+Genomewide+Association+Studies.">Pathway-Based Approaches for Analysis of Genomewide Association Studies.</a> The American Journal of Human Genetics. 81 (6), 1278-1283 (2007).</li><li>Weng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP-based+pathway+enrichment+analysis+for+genome-wide+association+studies.">SNP-based pathway enrichment analysis for genome-wide association studies.</a> BMC Bioinformatics. 12 (1), 99 (2011).</li><li>Tang, J., Perkins, A., Williams, W., Warburton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+genome-wide+associations+to+identify+metabolic+pathways+involved+in+maize+aflatoxin+accumulation+resistance.">Using genome-wide associations to identify metabolic pathways involved in maize aflatoxin accumulation resistance.</a> BMC Genomics. 16 (1), 673 (2015).</li><li>Warburton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Association+Mapping+of+Aspergillus+flavus+and+Aflatoxin+Accumulation+Resistance+in+Maize.">Genome-Wide Association Mapping of Aspergillus flavus and Aflatoxin Accumulation Resistance in Maize.</a> Crop Science. 55 (5), 1857-1867 (2015).</li><li>Warburton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Association+and+Metabolic+Pathway+Analysis+of+Corn+Earworm+Resistance+in+Maize.">Genome-Wide Association and Metabolic Pathway Analysis of Corn Earworm Resistance in Maize.</a> The Plant Genome. 11 (1), 170069 (2018).</li><li>Li, H., Thrash, A., Tang, J., He, L., Yan, J., Warburton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+GWAS+data+to+identify+metabolic+pathways+and+networks+involved+in+maize+lipid+biosynthesis.">Leveraging GWAS data to identify metabolic pathways and networks involved in maize lipid biosynthesis.</a> The Plant Journal. 98 (5), 853-863 (2019).</li><li>Thrash, A., Tang, J., DeOrnellis, M., Peterson, D., Warburton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAST:+The+Pathway+Association+Studies+Tool+to+Infer+Biological+Meaning+from+GWAS+Datasets.">PAST: The Pathway Association Studies Tool to Infer Biological Meaning from GWAS Datasets.</a> Plants. 9 (1), 58 (2020).</li><li>Adam, T., Mason, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PAST: Pathway Association Study Tool (PAST). Bioconductor version: Release (3.10). , (2020).</li><li>Thrash, A., DeOrnellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IGBB/PAST. , (2019).</li><li>Bradbury, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TASSEL:+software+for+association+mapping+of+complex+traits+in+diverse+samples.">TASSEL: software for association mapping of complex traits in diverse samples.</a> Bioinformatics. 23 (19), 2633-2635 (2007).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+A+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: A knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 15545-15550 (2005).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

PAST'ın birincil hedefi, GWAS verilerinin metabolik yol analizlerini, özellikle insan olmayan ve hayvan olmayan organizmalar için daha geniş bir kitleye ulaştırmaktır. GEÇMIŞe alternatif yöntemler genellikle insanlara veya hayvanlara odaklanan komut satırı programlarıdır. Kullanıcı dostu olmak, HEM Parlak bir uygulama geliştirmeyi seçmede hem de uygulamayı serbest bırakmak için R ve Bioconductor'ı kullanmayı seçmede PAST'in gelişiminde birincil hedefti. Kullanıcıların PAST'ı kullanmak için programları nasıl derleyeceklerini öğrenmeleri gerekmez.
Çoğu analiz yazılımı türünde olduğu gibi, PAST sonuçları yalnızca giriş verileri kadar iyidir; giriş verilerinde hatalar varsa veya yanlış biçimlendirilmişse, PAST başarısız olur veya bilgisiz sonuçlar üretemez. GWAS verilerinin, LD verilerinin, ek açıklamaların ve yol dosyalarının doğru biçimlendirildiğinden emin olmak, PAST'den doğru çıktı almak için kritik öneme sahiptir. PAST yalnızca iki alelik işaretleyicileri analiz eder ve her giriş verisi kümesi için yalnızca bir özellik çalıştırabilir. Buna ek olarak, zayıf genotipleme veya yanlış veya kesin olmayan fenotipleme tarafından üretilen GWAS verilerinin de net veya tekrarlanabilir sonuçlar üretmesi olası değildir. PAST, GWAS sonuçlarının biyolojik olarak yorumlanmasına yardımcı olabilir, ancak çevresel varyasyon, deneysel hata veya nüfus yapısı düzgün bir şekilde hesaba katılmadıysa kaotik veri kümelerini açıklığa kavuşturma olasılığı düşüktür.
Kullanıcılar, hem Parlak uygulamada hem de bu parametreleri GEÇMIŞ'in R konsolundaki işlevlerine geçirerek analizin bazı parametrelerini değiştirmeyi seçebilir. Bu parametreler PAST tarafından bildirilen sonuçları değiştirebilir ve kullanıcılar bunları varsayılanlardan değiştirirken dikkatli olmalıdır. LD kullanıcılar tarafından ölçüldüğünden, genellikle GWAS'ta da kullanılan aynı işaretleyici veri kümesi kullanılarak, LD ölçümleri popülasyona özgüdür. Tüm çalışmalar için, özellikle mısır dışındaki türler için (özellikle kendi kendine tozlaşan, poliploid veya yüksek heterojen türler), varsayılanlardaki değişiklikler garanti edilebilir.

An erratum was issued for: A Pathway Association Study Tool for GWAS Analyses of Metabolic Pathway Information. One of the affiliations was updated.
The second affiliation was updated from:
USDA-ARS Corn Host Plant Resistance Research Unit, Mississippi State University
to:
Corn Host Plant Resistance Research Unit, USDA-ARS

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61268">A Pathway Association Study Tool for GWAS Analyses of Metabolic Pathway Information</a>. One of the affiliations was updated.

Erratum: A Pathway Association Study Tool for GWAS Analyses of Metabolic Pathway Information

Genom çapındaki ilişki çalışmaları (GWAS), karmaşık özellikleri ve bunlarla ilişkili genomik bölgeleri incelemek için popüler bir yöntemdir1,2,3. Bu tür bir çalışmada, yüz binlerce tek nükleotid polimorfizm (SNP) belirteci, özellik ile ilişkileri açısından test edilir ve derneklerin önemi değerlendirilir. Çalışma için yanlış bulma oranı (FDR) eşiğini (veya başka bir önem eşiğini) karşılayan işaretleyici özellik ilişkilendirmeleri korunur, ancak gerçek ilişkilendirmeler filtrelenebilir. Karmaşık, polijenik özellikler için, her genin etkisi küçük olabilir (ve böylece filtrelenebilir) ve bazı aleller sadece çalışmada bulunmayan belirli koşullarla ifade edilir3. Bu nedenle, birçok SNP özellik ile ilişkili olarak korunabilir, ancak her biri çok küçük bir etkiye sahip olabilir. Çok fazla SNP çağrısı eksik olacak ve özelliğin biyolojik anlamının ve genetik mimarisinin bir yorumu eksik ve kafa karıştırıcı olabilir. Metabolik yol analizi, biyolojik işlevlerine göre gruplanmış genlerin kombine etkilerine odaklanarak bu sorunların bazılarını ele almaya yardımcı olabilir4,5,6.
Bu makalede açıklanan yöntemin önceki bir uygulaması kullanılarak çeşitli çalışmalar tamamlanmıştır. Aflatoksin birikimi7, mısır kulak kurdu direnci8ve yağ biyosentezi9 önceki uygulama ile çalışılmıştır. Bu analizler başarılı olsa da, analiz araçları R, Perl ve Bash'in bir kombinasyonuyla yazıldığı ve işlem hattı otomatik olmadığı için analiz süreci karmaşık, zaman alıcı ve hantaldı. Her analiz için bu yöntemi değiştirmek için gereken özel bilgi nedeniyle, şimdi diğer araştırmacılarla paylaşılabilen yeni bir yöntem geliştirilmiştir.
Pathway Association Çalışma Aracı (PAST)10, programlama dilleri hakkında daha az bilgi gerektirerek ve analizleri daha kısa sürede çalıştırarak önceki yöntemin eksikliklerini gidermek için tasarlanmıştır. Yöntem mısırla test edilirken, PAST türe özgü varsayımlarda bulunmiyor. PAST, Parlak bir uygulama olarak R konsolu üzerinden çalıştırılabilir ve çevrimiçi bir sürümün yakında MaizeGDB'de kullanıma sunulması bekleniyor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:719px;" width="717">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Computer</td>
			<td style="width:74px;">NA</td>
			<td style="width:123px;">NA</td>
			<td style="width:300px;">Any computer with 8GB RAM should be sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">R</td>
			<td style="width:74px;">R Project</td>
			<td style="width:123px;">NA</td>
			<td>R 3.6 or greater is required to install from Bioconductor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pathway association study tool for gwas analyses of metabolic pathway information

Son zamanlarda, metabolik yol analizi kullanılarak genom çapındaki ilişkilendirme çalışması (GWAS) verilerini yorumlamak için daha önce tanımlanmış bir yöntemin yeni bir uygulaması geliştirilmiş ve piyasaya salmıştır. Pathway Association Çalışma Aracı (PAST), kullanıcı dostu ve yavaş çalışan analizlerle ilgili endişeleri gidermek için geliştirilmiştir. Bu yeni kullanıcı dostu araç Bioconductor ve Github'da piyasaya sürüldü. Testlerde PAST, daha önce yirmi dört veya daha fazla saat gerektiren analizleri bir saatten kısa bir sürede yaptı. Bu makalede, PAST'i çalıştırmak için Parlak uygulamayı veya R konsolunu kullanma protokolünü sunuyoruz.

Sonuçlar GEÇMIŞ yazılım aracının çalıştırılmasından sonra üretilmezse, tüm giriş dosyalarının doğru biçimlendirildiğinden emin olun. Tahıl rengindeki bir mısır GWAS'ını temel alan PAST paketindeki örnek veriler kullanılarak yapılan başarılı bir çalışma Şekil 8'de gösterilmiştir. Bu tablo ve elde edilen görüntü, Sonuçları İndir düğmesi kullanılarak indirilebilir. İndirilen görüntünün bir örneği Şekil 210'da gösterilmiştir. Yanlış ayarlar biyolojik olarak mantıklı olmayan sonuçlara yol açabilir, ancak yanlışlığı belirlemek, seçilen ayarların geçerliliğini iki kez kontrol etmesi ve ilgi çekicilik özelliği ile ilgili bilinen tüm kanıtları göz önünde bulundurması gereken araştırmacıya bağlı olmalıdır.
Şekil 910, tahıl rengi için fenotiplenmiş 288 inbred çizgiden oluşan bir mısır paneli ile oluşturulan GWAS sonuçlarının yol analizinden üretilen rugplot'unu göstermektedir. Fenotiplerin "beyaz" veya "sarı" olduğu bu basit örnek, parlak sarı karotenoid pigmentlerin oluşturulmasından sorumlu yolun bilinmesi ve fenotipin çoğundan sorumlu olması gerektiği için kullanılmıştır. Böylece, trans likopen biyosentez yolunun (karotenoid üreten) tahıl rengi ile önemli ölçüde ilişkili olduğunu görmeyi bekliyorduk, ki öyle. Yol kimliği ve adı grafiğin en üstünde listelenir. Grafiğin yatay ekseni, analize dahil edilen tüm genleri, özellik üzerindeki en büyük etkiden en küçüğe doğru sıralanmış olarak soldan sağa sıralar. Bununla birlikte, sadece trans likopen biyosentez yolundaki genler işaretlenir (grafiğin üst kısmında, tarama izleri olarak, analizdeki diğer tüm genlere kıyasla etkilerinin gen sıralamasında görünür). Bu yolda 7 gen var. Çalışan zenginleştirme puanı (ES) dikey eksen boyunca çizilir. Her gen için ES, etki sırasına göre çalışan toplama eklenir ve toplam analiz edilen gen sayısına ayarlanır. Böylece, biri yatay eksen boyunca hareket ettikçe puan değişir ve daha büyük etki genleri dahil edildikçe artmaya eğilimlidir, ancak bir noktada, etkideki artış başka bir gen eklemiş olmanın ayarından daha küçüktür ve tüm puan azalmaya başlar. Çalışan ES çizgisinin tepe noktası noktalı dikey çizgi ile işaretlenir; Bu, tüm yol için ES'dir ve program tarafından yolun seçilip bir rugplot olarak sunulup sunulmamasını belirlemek için kullanılır.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig8.jpg"> Şekil 8: PAST Shiny'nin tamamlanan çalışması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig8large.jpg" target="_blank"></a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig9.jpg"> Şekil 9: PAST'in tamamlanmış çalışmasından (veya Shiny'den indirilen) yol görüntüsü. Bu rakam Thrash ve ark.10'dan alıntılanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig9large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Pathway Association Study Tool for GWAS Analyses of Metabolic Pathway Information at JoVE.com

A Pathway Association Study Tool for GWAS Analyses of Metabolic Pathway Information

Araştırmacılar, Pathway Association Çalışma Aracı'nı (PAST) parlak uygulama veya R konsolu aracılığıyla çalıştırarak, ilgili metabolik yolları araştırarak genom çapındaki ilişki çalışmalarının (GWAS) sonuçlarının biyolojik anlamı hakkında daha derin bir anlayış kazanabilirler.

Metabolik Yol Bilgilerinin GWAS Analizleri için Bir Pathway Association Çalışma Aracı

Recently, a new implementation of a previously described method for interpreting genome-wide association study (GWAS) data using metabolic pathway ...

a-pathway-association-study-tool-for-gwas-analyses-metabolic-pathway

Research

JoVE Journal

Genetics

3.1K Görüntüleme.  Mississippi State University. Araştırmacılar, Pathway Association Çalışma Aracı'nı (PAST) parlak uygulama veya R konsolu aracılığıyla çalıştırarak, ilgili metabolik yolları araştırarak genom çapındaki ilişki çalışmalarının (GWAS) sonuçlarının biyolojik anlamı hakkında daha derin bir anlayış kazanabilirler. 

Video: A Pathway Association Study Tool for GWAS Analyses of Metabolic Pathway Information

Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for protein synthesis by translating codons in mRNA into amino acid sequences. tRNAs were long considered as house-keeping molecules that lacked regulatory functions. However, a growing body of evidence indicates that cellular tRNA levels fluctuate in correspondence to varying conditions such as cell type, environment, and stress. The fluctuation of tRNA expression directly influences gene translation, favoring or repressing the expression of particular proteins. Ultimately comprehending the dynamic of protein synthesis requires the development of methods able to deliver high-quality tRNA profiles. The method that we present here is named SPOt, which stands for Streamlined Platform for Observing tRNA. SPOt consists of three steps starting with metabolic labeling of cell cultures with radioactive orthophosphate, followed by guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction of radioactive total RNAs and finally hybridization on in-house printed macroarrays. tRNA levels are estimated by quantifying the radioactivity intensities at each probe spot. In the protocol presented here we profile tRNAs in Mycobacterium smegmatis mc2155, a nonpathogenic bacterium often used as a model organism to study tuberculosis.

We describe an original transfer RNA analysis platform named SPOt (Streamlined Platform for Observing tRNA). SPOt simultaneously measures cellular levels of all tRNAs in biological samples, in only three steps, and in less than 24 hours.

Metabolik etiketleme ve Transfer RNA Macroarrays kullanarak profil oluşturma

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

Genetik

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state when water is supplied. The genomic sequencing of microscopic animals such as tardigrades risks bacterial contamination that sometimes leads to erroneous interpretations, for example, regarding the extent of horizontal gene transfer in these animals. Here, we provide an ultralow input method to sequence the genome of the tardigrade, Hypsibius dujardini, from a single specimen. By employing rigorous washing and contaminant exclusion along with an efficient extraction of the 50 ~ 200 pg genomic DNA from a single individual, we constructed a library sequenced with a DNA sequencing instrument. These libraries were highly reproducible and unbiased, and an informatics analysis of the sequenced reads with other H. dujardini genomes showed a minimal amount of contamination. This method can be applied to unculturable tardigrades that could not be sequenced using previous methods.

Contamination during the genomic sequencing of microscopic organisms remains a large problem. Here, we show a method to sequence the genome of a tardigrade from a single specimen with as little as 50 pg of genomic DNA without whole genome amplification to minimize the risk of contamination.

Ultralow giriş genom Kütüphane hazırlık bir tek Tardigrade örnekten sıralama

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Mitokondrial DNA metilasyonu doğru algılanması için metodoloji

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated with a better outcome than alcohol- and tobacco-related OPSCC. Chromogenic in situ hybridization (CISH) of HPV viral RNA could allow the semiquantitative evaluation of viral transcripts of the oncogenic proteins E6 and E7 and an in situ visualization with a good spatial resolution. This technique allows the diagnosis of an active infection with the visualization of HPV transcription in the tumoral HPV-infected cells. An advantage of this technique is the avoidance of contamination from nonneoplastic HPV-infected cells adjacent to the tumor. Overall, its good diagnosis performances have it considered to be the gold standard for active HPV infection identification. Since E6 and E7 viral protein interaction with cell proteins pRb and p53 is mandatory for cell transformation, HPV RNA CISH is functionally relevant and acutely reflects active oncogenic HPV infection. This technique is clinically relevant as well since &#34;low&#34; or &#34;high&#34; HPV transcription levels helped the identification of two prognosis groups among HPV-related p16-positive head and neck cancer patients. Here we present the protocol for manual HPV RNA CISH performed on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) slides with a kit obtained from the manufacturer. Instead of chromogenic revelation, RNA in situ hybridization may also be performed with fluorescent revelation (RNA FISH). It may also be combined with conventional immunostaining.

Human papillomavirus (HPV) RNA chromogenic in situ hybridization is considered to be one of the gold standards for active human papillomavirus infection detection within tumors. It allows the visualization of HPV E6-E7 mRNA expression with localization and semiquantitative evaluation of its signal.

Kromojenik In situ hybridization HPV Ile Ilgili baş ve boyun kanseri tanısı için bir araç ss

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is pathogenic, one must query many databases to determine whether the gene of interest is linked to a genetic disease, whether the specific variant has been reported before, and what functional data is available in model organism databases that may provide clues about the gene&#8217;s function in human. MARRVEL (Model organism Aggregated Resources for Rare Variant ExpLoration) is a one-stop data collection tool for human genes and variants and their orthologous genes in seven model organisms including in mouse, rat, zebrafish, fruit fly, nematode worm, fission yeast, and budding yeast. In this Protocol, we provide an overview of what MARRVEL can be used for and discuss how different datasets can be used to assess whether a variant of unknown significance (VUS) in a known disease-causing gene or a variant in a gene of uncertain significance (GUS) may be pathogenic. This protocol will guide a user through searching multiple human databases simultaneously starting with a human gene with or without a variant of interest. We also discuss how to utilize data from OMIM, ExAC/gnomAD, ClinVar, Geno2MP, DGV and DECHIPHER. Moreover, we illustrate how to interpret a list of ortholog candidate genes, expression patterns, and GO terms in model organisms associated with each human gene. Furthermore, we discuss the value protein structural domain annotations provided and explain how to use the multiple species protein alignment feature to assess whether a variant of interest affects an evolutionarily conserved domain or amino acid. Finally, we will discuss three different use-cases of this website. MARRVEL is an easily accessible open access website designed for both clinical and basic researchers and serves as a starting point to design experiments for functional studies.

Here, we present a protocol to access and analyze many human and model organism databases efficiently. This protocol demonstrates the use of MARRVEL to analyze candidate disease-causing variants identified from next-generation sequencing efforts.

İnsan Genomik ve Model Organizma Genetiği Bilgilerini Entegre Eden Web Tabanlı Bir Araç olan MARRVEL'de Gezinme

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame (ORF) annotation impose two arbitrary criteria: a minimum length of 100 codons and a single ORF per transcript. However, a growing number of studies report expression of proteins from allegedly non-coding regions, challenging the accuracy of current genome annotations. These novel proteins were found encoded either within non-coding RNAs, 5' or 3' untranslated regions (UTRs) of mRNAs, or overlapping a known coding sequence (CDS) in an alternative ORF. OpenProt is the first database that enforces a polycistronic model for eukaryotic genomes, allowing annotation of multiple ORFs per transcript. OpenProt is freely accessible and offers custom downloads of protein sequences across 10 species. Using OpenProt database for proteomic experiments enables novel proteins discovery and highlights the polycistronic nature of eukaryotic genes. The size of OpenProt database (all predicted proteins) is substantial and need be taken in account for the analysis. However, with appropriate false discovery rate (FDR) settings or the use of a restricted OpenProt database, users will gain a more realistic view of the proteomic landscape. Overall, OpenProt is a freely available tool that will foster proteomic discoveries.

OpenProt is a freely accessible database that enforces a polycistronic model of eukaryotic genomes. Here, we present a protocol for the use of OpenProt databases when interrogating mass spectrometry datasets. Using OpenProt database for analysis of proteomic experiments allows for discovery of novel and previously undetectable proteins.

Kütle spektrometresi tabanlı proteomik analizleri roman proteinler açıklayacak OpenProt veritabanı kullanarak kanonik olmayan açık okuma çerçevesi tercüme

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

The organization and structure of chromatin domains are unique to individual cell lineages. Their misregulation might lead to a loss in cellular identity and/or disease. Despite tremendous efforts, our understanding of the formation and propagation of chromatin domains is still limited. Chromatin domains have been studied under steady-state conditions, which are not conducive to following the initial events during their establishment. Here, we present a method to inducibly reconstruct chromatin domains and follow their re-formation as a function of time. Although, first applied to the case of PRC2-mediated repressive chromatin domain formation, it could be easily adapted to other chromatin domains. The modification of and/or the combination of this method with genomics and imaging technologies will provide invaluable tools to study the establishment of chromatin domains in great detail. We believe that this method will revolutionize our understanding of how chromatin domains form and interact with each other.

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

This method is designed to follow formation of PRC2-mediated chromatin domains in cell lines, and the method can be adapted to many other systems.

Kromatin Etki Alanlarının De novo Oluşumunu İnceleme Yöntemi

The organization and structure of chromatin domains are unique to individual cell lineages. Their misregulation might lead to a loss in cellular identity ...

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene expression, cell identity and differentiation. Many approaches developed to study the 3D architecture of the genome can be divided into two complementary categories: chromosome conformation capture based technologies (C-technologies) and imaging. While the former is based on capturing the chromosome conformation and proximal DNA interactions in a population of fixed cells, the latter, based on DNA fluorescence in situ hybridization (FISH) on 3D-preserved nuclei, allows contemporary visualization of multiple loci at a single cell level (multicolor), examining their interactions and distribution within the nucleus (3D multicolor DNA FISH). The technique of 3D multicolor DNA FISH has a limitation of visualizing only a few predetermined loci, not permitting a comprehensive analysis of the nuclear architecture. However, given the robustness of its results, 3D multicolor DNA FISH in combination with 3D-microscopy and image reconstruction is a possible method to validate C-technology based results and to unambiguously study the position and organization of specific loci at a single cell level. Here, we propose a step by step method of 3D multicolor DNA FISH suitable for a wide range of human primary cells and discuss all the practical actions, crucial steps, notions of 3D imaging and data analysis needed to obtained a successful and informative 3D multicolor DNA FISH within different biological contexts.

3D multicolor DNA FISH represents a tool to visualize multiple genomic loci within 3D preserved nuclei, unambiguously defining their reciprocal interactions and localization within the nuclear space at a single cell level. Here, a step by step protocol is described for a wide spectrum of human primary cells.

3D Çok Renkli DNA FISH Aracı İnsan Birincil Hücrelerde Nükleer Mimari Çalışma

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...

An Approach to Study Shape-Dependent Transcriptomics at a Single Cell Level

Different types of cardiac hypertrophy have been associated with an increased volume of cardiac myocytes (CMs), along with changes in CM morphology. While the effects of cell volume on gene expression are well known, the effects of cell shape are not well understood. This paper describes a method that has been designed to systematically analyze the effects of CM morphology on gene expression. It details the development of a novel single-cell trapping strategy that is then followed by single-cell mRNA sequencing. A micropatterned chip has also been designed, which contains 3000 rectangular-shaped fibronectin micropatterns. This makes it possible to grow CMs in distinct length:width aspect ratios (AR), corresponding to different types of heart failure (HF). The paper also describes a protocol that has been designed to pick up single cells from their pattern, using a semi-automated micro-pipetting cell picker, and individually inject them into a separate lysis buffer. This has made it possible to profile the transcriptomes of single CMs with defined geometrical morphotypes and characterize them according to a range of normal or pathological conditions: hypertrophic cardiomyopathy (HCM) or afterload/concentric versus dilated cardiomyopathy (DCM) or preload/eccentric. In summary, this paper presents methods for growing CMs with different shapes, which represent different pathologies, and sorting these adherent CMs based on their morphology at a single-cell level. The proposed platform provides a novel approach to high throughput and drug screening for different types of HF.

This paper presents methods for growing cardiac myocytes with different shapes, which represent different pathologies, and sorting these adherent cardiac myocytes based on their morphology at a single cell level. The proposed platform provides a novel approach to high throughput and drug screening for different types of heart failure.

ŞekilBağımlı Transkripsiyonları Tek Hücre Düzeyinde Çalışma Yaklaşımı

Different types of cardiac hypertrophy have been associated with an increased volume of cardiac myocytes (CMs), along with changes in CM morphology. While ...