1. Einrichtung
<ol><li>Installieren Sie R, falls es noch nicht installiert ist. HINWEIS: PAST ist in R geschrieben und erfordert daher, dass seine Benutzer R installiert haben. Zum Zeitpunkt des Schreibens dieses Artikels erfordert die Installation von PAST direkt von Bioconductor R4.0.  Ältere Versionen von PAST können von Bioconductor für R3.6 installiert werden, und PAST kann von Github für Benutzer mit R3.5 installiert werden. Die R-Installationsanleitung kann unter folgendem Link heruntergeladen werden: https://www.r-project.org/.</li>
	<li>Installieren Sie die neueste Version von RStudio Desktop oder aktualisieren Sie RStudio (optional). HINWEIS: RStudio ist eine hilfreiche Umgebung für die Arbeit mit der Sprache R. Die Installation wird empfohlen, insbesondere für diejenigen, die PAST in der Befehlszeile und nicht über die Shiny GUI-Anwendung ausführen möchten. RStudio und seine Installationsanleitung finden Sie unter folgendem Link: <a href="https://rstudio.com/products/rstudio/">https://rstudio.com/products/rstudio/</a>.</li>
	<li>Installieren Sie PAST von Bioconductor11, indem Sie den Anweisungen auf Bioconductor folgen. HINWEIS: Die Installation über Bioconductor sollte die Installation der Abhängigkeiten von PAST übernehmen. Darüber hinaus kann PAST von Github12installiert werden, aber die Installation von Github installiert Abhängigkeiten nicht automatisch.</li>
	<li>Installieren Sie PAST Shiny (optional). Laden Sie die Datei "app. R" von der Seite "Releases" des Github-Repositorys: https://github.com/IGBB/PAST/releases/ und merken Sie sich, wo sich die heruntergeladene Datei befindet. HINWEIS: PAST kann verwendet werden, indem seine Methoden direkt mit R aufruft werden, aber Benutzer, die mit R weniger vertraut sind, können die Past Shiny-Anwendung ausführen, die eine geführte Benutzeroberfläche bereitstellt. PAST Shiny ist ein R-Skript, das im shiny_app Zweig des PAST Github-Repositorys verfügbar ist. PAST Shiny versucht, seine Abhängigkeiten während der ersten Ausführung zu installieren.</li>
	<li>Beginnen Sie die Analyse, indem Sie die Anwendung auf eine der drei unten beschriebenen Arten starten.<ol>
<li>PAST Shiny mit RStudio<ol>
<li>Erstellen Sie mit RStudio ein neues Projekt in dem Ordner, in dem sich die App befindet. R befindet sich. Klicken Sie auf Datei | Neues Projekt und wählen Sie diesen Ordner aus.</li>
			<li>Sobald ein neues Projekt erstellt wurde, öffnen Sie die App. R-Datei, die zuvor heruntergeladen wurde. RStudio erkennt diese App. R ist eine Shiny-App und erstellt eine Schaltfläche App ausführen auf der Leiste über dem angezeigten Quellcode. Klicken Sie auf App ausführen. RStudio öffnet dann ein Fenster, in dem die Anwendung PAST Shiny angezeigt wird.</li>
		</ol>
</li>
		<li>PAST Shiny mit R-Konsole<ol>
<li>Starten Sie R und führen Sie den folgenden Code aus, um die PAST Shiny-Anwendung zu starten: shiny::runApp('path/to/folder/with/shiny/app. R". Ersetzen Sie den Text in Anführungszeichen durch den Ordner, in dem die App angezeigt wird. R wurde heruntergeladen und behalten Sie die Zitate.</li>
		</ol>
</li>
		<li>PAST ohne R Shiny<ol>
<li>Führen Sie library(PAST) in einer R-Konsole aus, um PAST zu laden.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Shiny-Analyse anpassen (optional)
<ol><li>Ändern Sie den Analysetitel von "Neue Analyse" in etwas, das die Art der ausgeführten Analyse besser widerspiegelt, was dazu beiträgt, den Überblick über mehrere Analysen zu behalten (siehe Abbildung 1).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig1.jpg"> Abbildung 1. Bitte klicken <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig1large.jpg" target="_blank">Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="2"><li>Ändern Sie die Anzahl der Kerne und den Modus. Legen Sie die Anzahl der Kerne auf eine beliebige Zahl zwischen 1 und der Gesamtzahl auf dem Computer fest, aber beachten Sie, dass die Zuweisen weiterer Ressourcen für PAST andere Vorgänge auf dem Computer verlangsamen kann. Legen Sie den Modus basierend auf der Beschreibung in Abschnitt 6 fest.</li>
</ol>3. GWAS-Daten laden
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die GWAS-Daten tabulatorgetrennt sind. Stellen Sie sicher, dass die Assoziationsdatei die folgenden Spalten enthält: Merkmal, Markername, Locus oder Chromosom, Position auf dem Chromosom, p-Wert undR2-Wert für den Marker. Stellen Sie sicher, dass die Effektdatei die folgenden Spalten enthält: Merkmal, Markername, Ort oder Chromosom, Position auf dem Chromosom und Effekt. Die Reihenfolge dieser Spalten ist nicht wichtig, da der Benutzer beim Laden der Daten die Namen der Spalten angeben kann. Alle zusätzlichen Spalten werden ignoriert. Tassel13 kann verwendet werden, um diese Dateien zu erzeugen.
<ol><li>Laden Sie GWAS-Daten mit PAST Shiny.<ol>
<li>Wählen Sie eine Assoziationsdatei und eine Effektdatei aus, indem Sie die Auswahlfelder Zuordnungsdatei und Effektdatei verwenden. Ändern Sie die Spaltennamen in den Eingabefeldern Spaltenname Zuordnen und Effektspaltenname unterhalb der Dateiauswahlfelder, um die Spaltennamen in den Daten widerzuspiegeln.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig2.jpg"> Abbildung 2. Bitte klicken <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig2large.jpg" target="_blank">Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="2"><li>Laden Sie GWAS-Daten mit PAST in die R-Konsole.<ol>
<li>Ändern Sie den folgenden Code, und führen Sie ihn aus: gwas_data = load_GWAS_data("path/to/association_file.tsv", "path/to/effects_file.tsv", association_columns = c("Trait", "Marker", "Locus", "Site", "p", "marker_R2"), effects_columns = c("Trait", "Marker", "Locus", "Site", "Effect")
</li>
	</ol>
</li>
	<li>HINWEIS: Ändern Sie die Pfade zum tatsächlichen Speicherort der GWAS-Dateien. Die für association_columns und effects_columns angegebenen Werte sind die Standardwerte. Wenn die Namen nicht mit den Standardwerten übereinstimmen, geben Sie die Spaltennamen an. Andernfalls können diese weggelassen werden.</li>
</ol>4. Lastverknüpfungs-Ungleichgewichtsdaten (LD)
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die LD-Daten (Linkage Disequilibrium) tabulatorgetrennt sind und die folgenden Datentypen enthalten: Locus, Position1, Site1, Position2, Site2, Abstand in Basispaaren zwischen Position1 und Position2 undR2-Wert.
<ol><li>Laden Sie LD-Daten mit PAST Shiny.<ol>
<li>Wählen Sie die Datei aus, die LD-Daten enthält. Ändern Sie die Spaltennamen in den Eingabefeldern LD-Spaltennamen unterhalb des Dateiauswahlfelds so, dass sie bei Bedarf mit den Spaltennamen in den LD-Daten übereinstimmen.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig3.jpg"> Abbildung 3. Bitte klicken <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig3large.jpg" target="_blank">Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="2"><li>Laden Sie LD-Daten mit PAST in die R-Konsole.<ol>
<li>Ändern Sie den folgenden Code, und führen Sie ihn aus, um LD-Daten zu laden: LD = load_LD("path/to/LD.tsv", LD_columns = c("Locus1", "Position1", "Site1", "Position2", "Site2", "Dist_bp", "R.2") HINWEIS: Ändern Sie den Pfad zum tatsächlichen Speicherort der LD-Datei. Die für LD_columns angegebenen Werte sind die Standardwerte. Wenn die Namen nicht mit diesen Standardwerten übereinstimmen, geben Sie die richtigen Namen der Spalten an. andernfalls können diese weggelassen werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Zuweisen von SNPs zu Genen
HINWEIS: Laden Sie Anmerkungen im GFF-Format herunter oder suchen Sie sie anderweitig. Diese Anmerkungen sind oft in Online-Datenbanken für bestimmte Organismen zu finden. Seien Sie vorsichtig bei Anmerkungen von geringer Qualität, da die Qualität der Anmerkungsdaten die Qualität der Pfadanalyse beeinflusst. Vergewissern Sie sich, dass die erste Spalte dieser Anmerkungen (das Chromosom) mit dem Format des Locus/Chromosoms in den Assoziations-, Effekt- und LD-Daten übereinstimmt. Beispielsweise sollten die Anmerkungen das erste Chromosom nicht "chr1" nennen, wenn die GWAS- und LD-Datendateien das erste Chromosom "1" nennen.
<ol><li>Weisen Sie SNPs Genen mit PAST Shiny zu. HINWEIS: Weitere Informationen zur Bestimmung eines geeignetenR2-Cutoffs finden Sie in Tang et al.6, im Abschnitt "SNP to gene algorithm for the pathway analysis".<ol>
<li>Wählen Sie die Datei aus, die GFF-Anmerkungen enthält. Überlegen Sie, welche Fenstergröße und derR2-Cutoff für die betrachtete Art am besten geeignet sind, und ändern Sie sie, wenn die Standardwerte nicht zu den hochgeladenen Daten passen. HINWEIS: Die Standardwerte in PAST spiegeln in erster Linie werte wider, die für Mais geeignet sind. In diesem Schritt wird die Anzahl der Kerne verwendet, die zu Beginn der PAST Shiny-Analyse (Schritt 2.2) festgelegt wurden.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig4.jpg"> Abbildung 4. Bitte klicken <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig4large.jpg" target="_blank">Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="2"><li>Weisen Sie Genen mit PAST in der R-Konsole SNPs zu.<ol>
<li>Ändern und führen Sie den folgenden Code aus, um Genen SNPs zuzuweisen: Gene = assign_SNPs_to_genes(gwas_data, LD, "path/to/annotations.gff", c("gene"), 1000, 0.8, 2) HINWEIS: In diesem Beispielcode werden mehrere Standardvorschläge bereitgestellt: 1000 ist die Größe des Fensters um den SNP, um nach Genen zu suchen; 0,8 ist der Grenzwert fürR2; 2 ist die Anzahl der Kerne, die für die parallele Verarbeitung verwendet werden. Der Pfad zu den Anmerkungen sollte auch in den tatsächlichen Speicherort der Anmerkungsdatei geändert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. Entdecken Sie wichtige Pfade
HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Pathways-Datei die folgenden Daten im tabulatorgetrennten Format mit einer Zeile für jedes Gen in jedem Pathway enthält: Pathway ID - ein Bezeichner wie "PWY-6475-1"; Pfadbeschreibung - eine längere Beschreibung dessen, was die Wege tun, wie "Trans-Lycopin-Biosynthese"; Gen - ein Gen im Signalweg, das mit den in den Anmerkungen angegebenen Namen übereinstimmen sollte. Pathway-Informationen können wahrscheinlich in Online-Datenbanken für bestimmte Organismen wie MaizeGDB gefunden werden. Die zweite vom Benutzer angegebene Option ist der Modus. "Zunehmend" bezieht sich auf Phänotypen, die widerspiegeln, wann ein steigender Wert des gemessenen Merkmals wünschenswert ist, wie z. B. Ertrag, während "abnehmend" sich auf ein Merkmal bezieht, bei dem eine Abnahme der gemessenen Werte von Vorteil ist, z. B. Insektenschadenswerte. Die Signifikanz von Signalwegen wird mit den zuvorbeschriebenenMethoden4,6,14getestet.
<ol><li>Entdecken Sie bedeutende Wege mit PAST Shiny.<ol>
<li>Wählen Sie die Datei mit den Pfaddaten aus, und stellen Sie sicher, dass der Modus in den Analyseoptionen ausgewählt ist. Ändern Sie bei Bedarf die Anzahl der Gene, die sich in einem Signalweg befindet, um sie für die Analyse beizubehalten, und die Anzahl der Permutationen, die zum Erstellen der Nullverteilung verwendet werden, um die Signifikanz der Wirkung zu testen.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig5.jpg"> Abbildung 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
HINWEIS: In diesem Schritt wird die Anzahl der Kerne und der Modus verwendet, der zu Beginn der PAST Shiny-Analyse (Schritt 2.2) eingestellt wurde. Die Standardanzahl der Gene ist derzeit auf 5 Gene festgelegt, so dass Wege mit weniger bekannten Genen entfernt werden. Der Benutzer kann diesen Wert auf 4 oder 3 senken, um kürzere Pfade einzubeziehen, aber dadurch werden falsch positive Ergebnisse riskiert. Die Erhöhung dieses Wertes kann die Leistungsfähigkeit der Analyse erhöhen, entfernt jedoch mehr Pfade aus der Analyse. Das Ändern der Anzahl der verwendeten Permutationen erhöht und verringert die Leistung des Tests.
<ol start="2"><li>Entdecken Sie wichtige Pfade mit PAST in der R Console.<ol>
<li>Ändern Sie den folgenden Code, und führen Sie ihn aus, um wichtige Pfade zu ermitteln: rugplots_data <- find_pathway_significance(Gene, "path/to/pathways.tsv", 5, "increasing", 1000, 2) HINWEIS: In diesem Beispielcode werden mehrere vorgeschlagene Standardwerte bereitgestellt. 5 ist die Mindestanzahl von Genen, die sich in einem Signalweg befindet, um den Signalweg in der Analyse zu halten, zunehmend bezieht sich auf eine zunehmende Menge des gemessenen Merkmals (es wird empfohlen, dass der Benutzer unabhängig vom Merkmal sowohl zunehmend als auch abnimmt; die Dateninterpretation unterscheidet sich jedoch für die beiden), 1000 ist die Anzahl der Male, um die Effekte zu untersuchen, um die Nullverteilung zu bestimmen, und 2 ist die Anzahl der Kerne, die für die parallele Verarbeitung verwendet werden. Ändern Sie den Pfad zum tatsächlichen Speicherort der Pfaddatei.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. Rugplots ansehen
<ol><li>Sehen Sie sich Rugplots mit PAST Shiny an.<ol>
<li>Nachdem alle Eingaben hochgeladen und festgelegt wurden, klicken Sie auf Analyse starten. Ein Fortschrittsbalken wird angezeigt und zeigt an, welcher Schritt der Analyse zuletzt abgeschlossen wurde. Wenn die Analyse abgeschlossen ist, wechselt PAST Shiny zur Registerkarte Ergebnisse. In der linken Spalte wird eine Ergebnistabelle angezeigt (mit der Bezeichnung "Pathways") und die Rugplots in der rechten Spalte (mit der Bezeichnung "plots").</li>
		<li>Verwenden Sie den Schieberegler, um die Filterparameter zu steuern. Wenn die Filterstufe zufriedenstellend ist, klicken Sie unten links auf die Schaltfläche Ergebnisse herunterladen, um alle Bilder und Tabellen einzeln in eine ZIP-Datei herunterzuladen, die mit dem Analysetitel benannt ist. Diese ZIP-Datei enthält die gefilterte Tabelle, die ungefilterte Tabelle und ein Bild pro Pfad in der gefilterten Tabelle.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig6.jpg"> Abbildung 6. Bitte klicken <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig6large.jpg" target="_blank">Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig7.jpg"> Abbildung 7. Bitte klicken <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig7large.jpg" target="_blank">Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<ol start="2"><li>Rugplots mit PAST in der R-Konsole anzeigen<ol>
<li>Ändern Sie den folgenden Code, und führen Sie ihn aus, um die Ergebnisse zu speichern: plot_pathways(rugplots_data, "Pvalue", 0,02, "steigend", "output_folder") HINWEIS: In diesem Beispielcode werden mehrere vorgeschlagene Standardwerte bereitgestellt. pvalue stellt die Daten bereit, die zum Filtern unbedeutender Pfade verwendet werden können, nachdem der Benutzer einen Signifikanzschwellenwert ausgewählt hat. 0,02 ist der Standardwert, der bei der Filterung verwendet wird, und erhöhen bezieht sich auf eine zunehmende Menge des gemessenen Merkmals (es wird empfohlen, dass der Benutzer unabhängig vom Merkmal sowohl zunehmend als auch abnehmend ausgeht; die Dateninterpretation unterscheidet sich jedoch für die beiden); output_folder ist der Ordner, in den die Bilder und Tabellen geschrieben werden (dieser Ordner muss vor dem Ausführen der Funktion vorhanden sein). Eine Tabelle mit gefilterten Ergebnissen, die ungefilterten Ergebnisse und einzelne Bilder für jeden Pfad in den gefilterten Ergebnissen werden in diesen Ordner geschrieben.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rafalski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+genetics+in+crop+improvement.">Association genetics in crop improvement.</a> Current Opinion in Plant Biology. 13 (2), 174-180 (2010).</li><li>Yan, J., Warburton, M., Crouch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+Mapping+for+Enhancing+Maize+(Zea+mays+L.)+Genetic+Improvement.">Association Mapping for Enhancing Maize (Zea mays L.) Genetic Improvement.</a> Crop Science. 51 (2), 433-449 (2011).</li><li>Xiao, Y., Liu, H., Wu, L., Warburton, M., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Association+Studies+in+Maize:+Praise+and+Stargaze.">Genome-wide Association Studies in Maize: Praise and Stargaze.</a> Molecular Plant. 10 (3), 359-374 (2017).</li><li>Wang, K., Li, M., Bucan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-Based+Approaches+for+Analysis+of+Genomewide+Association+Studies.">Pathway-Based Approaches for Analysis of Genomewide Association Studies.</a> The American Journal of Human Genetics. 81 (6), 1278-1283 (2007).</li><li>Weng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP-based+pathway+enrichment+analysis+for+genome-wide+association+studies.">SNP-based pathway enrichment analysis for genome-wide association studies.</a> BMC Bioinformatics. 12 (1), 99 (2011).</li><li>Tang, J., Perkins, A., Williams, W., Warburton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+genome-wide+associations+to+identify+metabolic+pathways+involved+in+maize+aflatoxin+accumulation+resistance.">Using genome-wide associations to identify metabolic pathways involved in maize aflatoxin accumulation resistance.</a> BMC Genomics. 16 (1), 673 (2015).</li><li>Warburton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Association+Mapping+of+Aspergillus+flavus+and+Aflatoxin+Accumulation+Resistance+in+Maize.">Genome-Wide Association Mapping of Aspergillus flavus and Aflatoxin Accumulation Resistance in Maize.</a> Crop Science. 55 (5), 1857-1867 (2015).</li><li>Warburton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Association+and+Metabolic+Pathway+Analysis+of+Corn+Earworm+Resistance+in+Maize.">Genome-Wide Association and Metabolic Pathway Analysis of Corn Earworm Resistance in Maize.</a> The Plant Genome. 11 (1), 170069 (2018).</li><li>Li, H., Thrash, A., Tang, J., He, L., Yan, J., Warburton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+GWAS+data+to+identify+metabolic+pathways+and+networks+involved+in+maize+lipid+biosynthesis.">Leveraging GWAS data to identify metabolic pathways and networks involved in maize lipid biosynthesis.</a> The Plant Journal. 98 (5), 853-863 (2019).</li><li>Thrash, A., Tang, J., DeOrnellis, M., Peterson, D., Warburton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAST:+The+Pathway+Association+Studies+Tool+to+Infer+Biological+Meaning+from+GWAS+Datasets.">PAST: The Pathway Association Studies Tool to Infer Biological Meaning from GWAS Datasets.</a> Plants. 9 (1), 58 (2020).</li><li>Adam, T., Mason, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PAST: Pathway Association Study Tool (PAST). Bioconductor version: Release (3.10). , (2020).</li><li>Thrash, A., DeOrnellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IGBB/PAST. , (2019).</li><li>Bradbury, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TASSEL:+software+for+association+mapping+of+complex+traits+in+diverse+samples.">TASSEL: software for association mapping of complex traits in diverse samples.</a> Bioinformatics. 23 (19), 2633-2635 (2007).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+A+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: A knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 15545-15550 (2005).</li></ol>

Die Autoren haben nichts preiszugeben.

Ein primäres Ziel von PAST ist es, Stoffwechselweganalysen von GWAS-Daten einem breiteren Publikum zugänglich zu machen, insbesondere für nicht-menschliche und nicht-tierische Organismen. Alternative Methoden zu PAST sind oft Befehlszeilenprogramme, die sich auf Menschen oder Tiere konzentrieren. Benutzerfreundlichkeit war ein primäres Ziel bei der Entwicklung von PAST, sowohl bei der Entscheidung für die Entwicklung einer Shiny-Anwendung als auch bei der Entscheidung, R und Bioconductor zur Freigabe der Anwendung zu verwenden. Benutzer müssen nicht lernen, wie man Programme kompiliert, um PAST zu verwenden.
Wie bei den meisten Arten von Analysesoftware sind die Ergebnisse von PAST nur so gut wie die Eingabedaten; Wenn die Eingabedaten Fehler aufweisen oder falsch formatiert sind, kann PAST nicht ausgeführt werden oder führt zu uninformativen Ergebnissen. Sicherzustellen, dass die GWAS-Daten, LD-Daten, Anmerkungen und Pfaddateien korrekt formatiert sind, ist entscheidend für den Erhalt der korrekten Ausgabe von PAST. PAST analysiert nur biallele Marker und kann nur ein Merkmal für jeden Satz von Eingabedaten ausführen. Darüber hinaus ist es unwahrscheinlich, dass GWAS-Daten, die durch schlechte Genotypisierung oder falsche oder ungenaue Phänotypisierung erzeugt werden, klare oder wiederholbare Ergebnisse liefern. PAST kann bei der biologischen Interpretation von GWAS-Ergebnissen helfen, aber es ist unwahrscheinlich, dass chaotische Datensätze geklärt werden, wenn Umweltschwankungen, experimentelle Fehler oder Populationsstrukturen nicht richtig berücksichtigt wurden.
Benutzer können einige Parameter der Analyse ändern, sowohl in der Shiny-Anwendung als auch durch Übergeben dieser Parameter an die Funktionen von PAST in der R-Konsole. Diese Parameter können die von PAST gemeldeten Ergebnisse ändern, und Benutzer sollten vorsichtig sein, wenn sie diese von den Standardwerten ändern. Da LD von den Benutzern gemessen wird, in der Regel mit dem gleichen Markerdatensatz, der auch in der GWAS verwendet wurde, sind die LD-Messungen spezifisch für die Population. Für alle Studien, insbesondere für andere Arten als Mais (insbesondere selbstbestäubende, polyploide oder hochheterogene Arten), können Änderungen der Standardwerte gerechtfertigt sein.

An erratum was issued for: A Pathway Association Study Tool for GWAS Analyses of Metabolic Pathway Information. One of the affiliations was updated.
The second affiliation was updated from:
USDA-ARS Corn Host Plant Resistance Research Unit, Mississippi State University
to:
Corn Host Plant Resistance Research Unit, USDA-ARS

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61268">A Pathway Association Study Tool for GWAS Analyses of Metabolic Pathway Information</a>. One of the affiliations was updated.

Erratum: A Pathway Association Study Tool for GWAS Analyses of Metabolic Pathway Information

Genomweite Assoziationsstudien (GWAS) sind eine beliebte Methode zur Untersuchung komplexer Merkmale und der damit verbundenen genomischen Regionen1,2,3. In dieser Art von Studie werden Hunderttausende von Einzelnukleotidpolymorphismusmarkern (SNP) auf ihre Assoziation mit dem Merkmal getestet und die Bedeutung der Assoziationen bewertet. Marker-Merkmals-Assoziationen, die den Schwellenwert für die falsche Entdeckungsrate (FDR) (oder eine andere Art von Signifikanzschwelle) erfüllen, werden für die Studie beibehalten, aber wahre Assoziationen können herausgefiltert werden. Bei komplexen, polygenen Merkmalen kann die Wirkung jedes Gens gering sein (und somit herausgefiltert werden), und einige Allele werden nur unter bestimmten Bedingungen exprimiert, die in der Studie möglicherweise nicht vorhanden sind3. Während also viele SNPs als mit dem Merkmal verbunden beibehalten werden können, kann jede einen sehr geringen Effekt haben. Zu viele SNP-Aufrufe werden fehlen, und eine Interpretation der biologischen Bedeutung und der genetischen Architektur des Merkmals kann unvollständig und verwirrend sein. Die Analyse des Stoffwechselwegs kann helfen, einige dieser Probleme anzugehen, indem sie sich auf die kombinierten Wirkungen von Genenkonzentriert,die nach ihrer biologischen Funktion gruppiert sind4,5,6.
Mehrere Studien wurden mit einer früheren Implementierung der in diesem Artikel beschriebenen Methode abgeschlossen. Aflatoxinakkumulation7, Maisohrwurmresistenz8und Ölbiosynthese9 wurden alle mit der vorherigen Implementierung untersucht. Während diese Analysen erfolgreich waren, war der Analyseprozess kompliziert, zeitaufwendig und umständlich, da die Analysewerkzeuge in einer Kombination aus R, Perl und Bash geschrieben wurden und die Pipeline nicht automatisiert war. Aufgrund des Fachwissens, das erforderlich ist, um diese Methode für jede Analyse zu modifizieren, wurde nun eine neue Methode entwickelt, die mit anderen Forschern geteilt werden kann.
Das Pathway Association Study Tool (PAST)10 wurde entwickelt, um die Mängel der vorherigen Methode zu beheben, indem weniger Kenntnisse in Programmiersprachen erforderlich sind und Analysen in kürzerer Zeit ausgeführt werden. Während die Methode mit Mais getestet wurde, macht PAST keine artspezifischen Annahmen. PAST kann über die R-Konsole als Shiny-App ausgeführt werden, und eine Online-Version wird voraussichtlich bald auf MaizeGDB verfügbar sein.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:719px;" width="717">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Computer</td>
			<td style="width:74px;">NA</td>
			<td style="width:123px;">NA</td>
			<td style="width:300px;">Any computer with 8GB RAM should be sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">R</td>
			<td style="width:74px;">R Project</td>
			<td style="width:123px;">NA</td>
			<td>R 3.6 or greater is required to install from Bioconductor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pathway association study tool for gwas analyses of metabolic pathway information

Vor kurzem wurde eine neue Implementierung einer zuvor beschriebenen Methode zur Interpretation von GWAS-Daten (Genome-Wide Association Study) mittels Stoffwechselweganalyse entwickelt und veröffentlicht. Das Pathway Association Study Tool (PAST) wurde entwickelt, um Bedenken hinsichtlich Benutzerfreundlichkeit und langsam laufenden Analysen auszuräumen. Dieses neue benutzerfreundliche Tool wurde auf Bioconductor und Github veröffentlicht. In Tests führte PAST Analysen in weniger als einer Stunde durch, die zuvor vierundzwanzig oder mehr Stunden benötigten. In diesem Artikel stellen wir das Protokoll für die Verwendung der Shiny-Anwendung oder der R-Konsole zum Ausführen von PAST vor.

Wenn nach einer Ausführung des PAST-Softwaretools keine Ergebnisse erzielt werden, überprüfen Sie, ob alle Eingabedateien korrekt formatiert sind. Ein erfolgreicher Lauf anhand der Beispieldaten im PAST-Paket, die auf einem Mais-GWAS kornfarbener Farbe basieren, ist in Abbildung 8 dargestellt. Diese Tabelle und das resultierende Bild können über die Schaltfläche Ergebnisse herunterladen heruntergeladen werden. Ein Beispiel für das heruntergeladene Bild ist in Abbildung 210 dargestellt. Falsche Einstellungen können zu Ergebnissen führen, die biologisch nicht sinnvoll sind, aber die Bestimmung der Unrichtigkeit muss dem Forscher überlassen werden, der die Gültigkeit der gewählten Einstellungen überprüfen und alle bekannten Beweise für das interessierende Merkmal berücksichtigen sollte.
Abbildung 910 zeigt den Rugplot, der aus der Pfadanalyse der GWAS-Ergebnisse hergestellt wurde, die mit einer Maisplatte von 288 Inzuchtlinien erstellt wurden, die für die Kornfarbe phänotypisiert worden waren. Dieses vereinfachte Beispiel, bei dem die Phänotypen entweder "weiß" oder "gelb" waren, wurde verwendet, weil der Weg, der für die Schaffung der hellgelben Carotinoidpigmente verantwortlich ist, bekannt ist und für den größten Teil des Phänotyps verantwortlich sein sollte. Daher erwarteten wir, dass der Trans-Lycopin-Biosyntheseweg (der Carotinoide produziert) signifikant mit der Kornfarbe assoziiert ist, was er ist. Pfad-ID und Name sind oben im Diagramm aufgeführt. Die horizontale Achse des Diagramms ordnet alle Gene, die in die Analyse einbezogen wurden, von links nach rechts in der Reihenfolge der größten Wirkung auf das Merkmal bis zum kleinsten. Allerdings sind nur die Gene im Trans-Lycopin-Biosyntheseweg markiert (oben in der Grafik als Schraffurmarkierungen, die im Vergleich zu allen anderen Genen in der Analyse im Genrang ihrer Wirkung erscheinen). Es gibt 7 Gene in diesem Weg. Der Running Enrichment Score (ES) wird entlang der vertikalen Achse gezeichnet. Die ES für jedes Gen wird in der Reihenfolge der Wirkung in die laufende Summe aufgenommen und die Summe wird an die Anzahl der analysierten Gene angepasst. So ändert sich der Score, wenn man sich direkt entlang der horizontalen Achse bewegt und neigt dazu, zu steigen, wenn die größeren Effektgene eingeschlossen werden, aber irgendwann ist die Zunahme des Effekts kleiner als die Anpassung für das Hinzufügen eines anderen Gens, und der gesamte Score beginnt zu sinken. Die Spitze der laufenden ES-Linie ist mit einer gepunkteten vertikalen Linie markiert; Dies ist der ES für den gesamten Pathway und wird vom Programm verwendet, um festzustellen, ob der Pathway ausgewählt und als Rugplot dargestellt wird.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig8.jpg"> Abbildung 8: Abgeschlossener Lauf von PAST Shiny. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig9.jpg"> Abbildung 9:Pfadbild von abgeschlossener Ausführung von PAST (oder von Shiny heruntergeladen). Diese Zahl wurde aus Thrash et al.10zitiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig9large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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A Pathway Association Study Tool for GWAS Analyses of Metabolic Pathway Information

Durch die Ausführung des Pathway Association Study Tool (PAST), entweder über die Shiny-Anwendung oder über die R-Konsole, können Forscher ein tieferes Verständnis der biologischen Bedeutung ihrer Ergebnisse einer genomweiten Assoziationsstudie (GWAS) erlangen, indem sie die beteiligten Stoffwechselwege untersuchen.

Ein Pathway Association Study Tool für GWAS-Analysen von Stoffwechselweginformationen

Recently, a new implementation of a previously described method for interpreting genome-wide association study (GWAS) data using metabolic pathway ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

3.1K Aufrufe.  Mississippi State University. Durch die Ausführung des Pathway Association Study Tool (PAST), entweder über die Shiny-Anwendung oder über die R-Konsole, können Forscher ein tieferes Verständnis der biologischen Bedeutung ihrer Ergebnisse einer genomweiten Assoziationsstudie (GWAS) erlangen, indem sie die beteiligten Stoffwechselwege untersuchen. 

Serie: A Pathway Association Study Tool for GWAS Analyses of Metabolic Pathway Information

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state when water is supplied. The genomic sequencing of microscopic animals such as tardigrades risks bacterial contamination that sometimes leads to erroneous interpretations, for example, regarding the extent of horizontal gene transfer in these animals. Here, we provide an ultralow input method to sequence the genome of the tardigrade, Hypsibius dujardini, from a single specimen. By employing rigorous washing and contaminant exclusion along with an efficient extraction of the 50 ~ 200 pg genomic DNA from a single individual, we constructed a library sequenced with a DNA sequencing instrument. These libraries were highly reproducible and unbiased, and an informatics analysis of the sequenced reads with other H. dujardini genomes showed a minimal amount of contamination. This method can be applied to unculturable tardigrades that could not be sequenced using previous methods.

Contamination during the genomic sequencing of microscopic organisms remains a large problem. Here, we show a method to sequence the genome of a tardigrade from a single specimen with as little as 50 pg of genomic DNA without whole genome amplification to minimize the risk of contamination.

Frequenzverschiebungen Eingabe Genom Sequenzierung Bibliothek Vorbereitung von einem einzigen Tardigrade Exemplar

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Forschung

Genetik

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

Methodik für die präzise Erkennung der mitochondrialen DNA-Methylierung

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Hochdurchsatz-Identifizierung des Gens regulatorischen Sequenzen mit Next-Generation Sequenzierung der kreisförmigen Chromosom Konformation erfassen (4C-Seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated with a better outcome than alcohol- and tobacco-related OPSCC. Chromogenic in situ hybridization (CISH) of HPV viral RNA could allow the semiquantitative evaluation of viral transcripts of the oncogenic proteins E6 and E7 and an in situ visualization with a good spatial resolution. This technique allows the diagnosis of an active infection with the visualization of HPV transcription in the tumoral HPV-infected cells. An advantage of this technique is the avoidance of contamination from nonneoplastic HPV-infected cells adjacent to the tumor. Overall, its good diagnosis performances have it considered to be the gold standard for active HPV infection identification. Since E6 and E7 viral protein interaction with cell proteins pRb and p53 is mandatory for cell transformation, HPV RNA CISH is functionally relevant and acutely reflects active oncogenic HPV infection. This technique is clinically relevant as well since &#34;low&#34; or &#34;high&#34; HPV transcription levels helped the identification of two prognosis groups among HPV-related p16-positive head and neck cancer patients. Here we present the protocol for manual HPV RNA CISH performed on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) slides with a kit obtained from the manufacturer. Instead of chromogenic revelation, RNA in situ hybridization may also be performed with fluorescent revelation (RNA FISH). It may also be combined with conventional immunostaining.

Human papillomavirus (HPV) RNA chromogenic in situ hybridization is considered to be one of the gold standards for active human papillomavirus infection detection within tumors. It allows the visualization of HPV E6-E7 mRNA expression with localization and semiquantitative evaluation of its signal.

Chromogene In-Situ-Hybridisierung ist ein Tool für hpV-bezogene Kopf- und Halskrebsdiagnose

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is pathogenic, one must query many databases to determine whether the gene of interest is linked to a genetic disease, whether the specific variant has been reported before, and what functional data is available in model organism databases that may provide clues about the gene&#8217;s function in human. MARRVEL (Model organism Aggregated Resources for Rare Variant ExpLoration) is a one-stop data collection tool for human genes and variants and their orthologous genes in seven model organisms including in mouse, rat, zebrafish, fruit fly, nematode worm, fission yeast, and budding yeast. In this Protocol, we provide an overview of what MARRVEL can be used for and discuss how different datasets can be used to assess whether a variant of unknown significance (VUS) in a known disease-causing gene or a variant in a gene of uncertain significance (GUS) may be pathogenic. This protocol will guide a user through searching multiple human databases simultaneously starting with a human gene with or without a variant of interest. We also discuss how to utilize data from OMIM, ExAC/gnomAD, ClinVar, Geno2MP, DGV and DECHIPHER. Moreover, we illustrate how to interpret a list of ortholog candidate genes, expression patterns, and GO terms in model organisms associated with each human gene. Furthermore, we discuss the value protein structural domain annotations provided and explain how to use the multiple species protein alignment feature to assess whether a variant of interest affects an evolutionarily conserved domain or amino acid. Finally, we will discuss three different use-cases of this website. MARRVEL is an easily accessible open access website designed for both clinical and basic researchers and serves as a starting point to design experiments for functional studies.

Here, we present a protocol to access and analyze many human and model organism databases efficiently. This protocol demonstrates the use of MARRVEL to analyze candidate disease-causing variants identified from next-generation sequencing efforts.

Navigieren in MARRVEL, einem webbasierten Tool, das Informationen zur Humangenomik und Modellgenetik integriert

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame (ORF) annotation impose two arbitrary criteria: a minimum length of 100 codons and a single ORF per transcript. However, a growing number of studies report expression of proteins from allegedly non-coding regions, challenging the accuracy of current genome annotations. These novel proteins were found encoded either within non-coding RNAs, 5' or 3' untranslated regions (UTRs) of mRNAs, or overlapping a known coding sequence (CDS) in an alternative ORF. OpenProt is the first database that enforces a polycistronic model for eukaryotic genomes, allowing annotation of multiple ORFs per transcript. OpenProt is freely accessible and offers custom downloads of protein sequences across 10 species. Using OpenProt database for proteomic experiments enables novel proteins discovery and highlights the polycistronic nature of eukaryotic genes. The size of OpenProt database (all predicted proteins) is substantial and need be taken in account for the analysis. However, with appropriate false discovery rate (FDR) settings or the use of a restricted OpenProt database, users will gain a more realistic view of the proteomic landscape. Overall, OpenProt is a freely available tool that will foster proteomic discoveries.

OpenProt is a freely accessible database that enforces a polycistronic model of eukaryotic genomes. Here, we present a protocol for the use of OpenProt databases when interrogating mass spectrometry datasets. Using OpenProt database for analysis of proteomic experiments allows for discovery of novel and previously undetectable proteins.

Massenspektrometrie-basierte Proteomics Analysen mithilfe der OpenProt-Datenbank zu enthüllen neue Proteine übersetzt aus dem nicht-kanonischen Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

The organization and structure of chromatin domains are unique to individual cell lineages. Their misregulation might lead to a loss in cellular identity and/or disease. Despite tremendous efforts, our understanding of the formation and propagation of chromatin domains is still limited. Chromatin domains have been studied under steady-state conditions, which are not conducive to following the initial events during their establishment. Here, we present a method to inducibly reconstruct chromatin domains and follow their re-formation as a function of time. Although, first applied to the case of PRC2-mediated repressive chromatin domain formation, it could be easily adapted to other chromatin domains. The modification of and/or the combination of this method with genomics and imaging technologies will provide invaluable tools to study the establishment of chromatin domains in great detail. We believe that this method will revolutionize our understanding of how chromatin domains form and interact with each other.

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

This method is designed to follow formation of PRC2-mediated chromatin domains in cell lines, and the method can be adapted to many other systems.

Eine Methode zur Untersuchung der de novo Bildung von Chromatin-Domänen

The organization and structure of chromatin domains are unique to individual cell lineages. Their misregulation might lead to a loss in cellular identity ...

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene expression, cell identity and differentiation. Many approaches developed to study the 3D architecture of the genome can be divided into two complementary categories: chromosome conformation capture based technologies (C-technologies) and imaging. While the former is based on capturing the chromosome conformation and proximal DNA interactions in a population of fixed cells, the latter, based on DNA fluorescence in situ hybridization (FISH) on 3D-preserved nuclei, allows contemporary visualization of multiple loci at a single cell level (multicolor), examining their interactions and distribution within the nucleus (3D multicolor DNA FISH). The technique of 3D multicolor DNA FISH has a limitation of visualizing only a few predetermined loci, not permitting a comprehensive analysis of the nuclear architecture. However, given the robustness of its results, 3D multicolor DNA FISH in combination with 3D-microscopy and image reconstruction is a possible method to validate C-technology based results and to unambiguously study the position and organization of specific loci at a single cell level. Here, we propose a step by step method of 3D multicolor DNA FISH suitable for a wide range of human primary cells and discuss all the practical actions, crucial steps, notions of 3D imaging and data analysis needed to obtained a successful and informative 3D multicolor DNA FISH within different biological contexts.

3D multicolor DNA FISH represents a tool to visualize multiple genomic loci within 3D preserved nuclei, unambiguously defining their reciprocal interactions and localization within the nuclear space at a single cell level. Here, a step by step protocol is described for a wide spectrum of human primary cells.

3D Multicolor DNA FISH Tool zur Erforschung der Kernarchitektur in menschlichen Primärzellen

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...

An Approach to Study Shape-Dependent Transcriptomics at a Single Cell Level

Different types of cardiac hypertrophy have been associated with an increased volume of cardiac myocytes (CMs), along with changes in CM morphology. While the effects of cell volume on gene expression are well known, the effects of cell shape are not well understood. This paper describes a method that has been designed to systematically analyze the effects of CM morphology on gene expression. It details the development of a novel single-cell trapping strategy that is then followed by single-cell mRNA sequencing. A micropatterned chip has also been designed, which contains 3000 rectangular-shaped fibronectin micropatterns. This makes it possible to grow CMs in distinct length:width aspect ratios (AR), corresponding to different types of heart failure (HF). The paper also describes a protocol that has been designed to pick up single cells from their pattern, using a semi-automated micro-pipetting cell picker, and individually inject them into a separate lysis buffer. This has made it possible to profile the transcriptomes of single CMs with defined geometrical morphotypes and characterize them according to a range of normal or pathological conditions: hypertrophic cardiomyopathy (HCM) or afterload/concentric versus dilated cardiomyopathy (DCM) or preload/eccentric. In summary, this paper presents methods for growing CMs with different shapes, which represent different pathologies, and sorting these adherent CMs based on their morphology at a single-cell level. The proposed platform provides a novel approach to high throughput and drug screening for different types of HF.

This paper presents methods for growing cardiac myocytes with different shapes, which represent different pathologies, and sorting these adherent cardiac myocytes based on their morphology at a single cell level. The proposed platform provides a novel approach to high throughput and drug screening for different types of heart failure.

Ein Ansatz zur Untersuchung formabhängiger Transkriptomik auf einer Ebene einer einzelzelligen Ebene

Different types of cardiac hypertrophy have been associated with an increased volume of cardiac myocytes (CMs), along with changes in CM morphology. While ...

Sample Preparation to Bioinformatics Analysis of DNA Methylation: Association Strategy for Obesity and Related Trait Studies

Obesity is directly connected to lifestyle and has been associated with DNA methylation changes that may cause alterations in the adipogenesis and lipid storage processes contributing to the development of the disease. We demonstrate a complete protocol from selection to epigenetic data analysis of patients with and without obesity. All steps from the protocol were tested and validated in a pilot study. 32 women participated in the study, in which 15 individuals were classified with obesity according to Body Mass Index (BMI) (45.1 &#177; 5.4 kg/m2); and 17 individuals were classified without obesity according to BMI (22.6 &#177; 1.8 kg/m2). In the group with obesity, 564 CpG sites related to fat mass were identified by linear regression analysis. The CpG sites were in the promoter regions. The differential analysis found 470 CpGs hypomethylated and 94 hypermethylated sites in individuals with obesity. The most hypomethylated enriched pathwayswere in the RUNX, WNT signaling, and response to hypoxia. The hypermethylated pathways were related to insulin secretion, glucagon signaling, and Ca2+. We conclude that the protocol effectively identified DNA methylation patterns and trait-related DNA methylation. These patterns could be associated with altered gene expression, affecting adipogenesis and lipid storage. Our results confirmed that an obesogenic lifestyle could promote epigenetic changes in human DNA.

The present study describes the workflow to manage DNA methylation data obtained by microarray technologies. The protocol demonstrates steps from sample preparation to data analysis. All procedures are described in detail, and the video shows the significant steps.

Probenvorbereitung zur bioinformatischen Analyse der DNA-Methylierung: Assoziationsstrategie für Adipositas und verwandte Merkmalsstudien

Obesity is directly connected to lifestyle and has been associated with DNA methylation changes that may cause alterations in the adipogenesis and lipid ...