1. 설정
<ol><li>아직 설치되지 않은 경우 R을 설치합니다. 참고: 과거는 R로 작성되므로 사용자가 R을 설치해야 합니다. 이 글을 쓰는 시점에, 바이오 컨덕터에서 직접 과거를 설치하려면 R4.0이 필요합니다.  이전 버전의 PAST는 R3.6용 바이오 컨더덕터에서 설치할 수 있으며, 과거는 Github에서 R3.5를 가진 사용자를 위해 설치할 수 있습니다. R 설치 지침은 다음 링크에서 다운로드할 수 있습니다: https://www.r-project.org/.</li>
	<li>RStudio 데스크톱의 최신 버전을 설치하거나 RStudio(선택 사항)를 업데이트합니다. 참고: RStudio는 R 언어로 작업하는 데 유용한 환경입니다. 특히 샤이니 GUI 응용 프로그램을 통해서가 아닌 명령줄에서 과거를 실행하기로 선택한 분은 설치를 권장합니다. RStudio 및 설치 지침은 다음 링크에서 찾을 수 있습니다: <a href="https://rstudio.com/products/rstudio/">https://rstudio.com/products/rstudio/</a>.</li>
	<li>생체 전도체에 대한 지침에 따라 바이오 컨덕터11에서 과거를 설치하십시오. 참고: 바이오 컨덕터를 통한 설치는 과거 종속성의 설치를 처리해야 합니다. 또한 과거는 Github12에서설치할 수 있지만 Github에서 설치하면 종속성을 자동으로 설치하지 않습니다.</li>
	<li>과거 샤이니(선택 사항)를 설치합니다. 파일 "응용 프로그램을 다운로드합니다. Github 리포지토리의 릴리스 페이지에서 R" : https://github.com/IGBB/PAST/releases/ 다운로드한 파일이 있는 위치를 기억하십시오. 참고: 과거는 R로 직접 메서드를 호출하여 사용할 수 있지만 R에 익숙하지 않은 사용자는 가이드 사용자 인터페이스를 제공하는 PAST Shiny 응용 프로그램을 실행할 수 있습니다. PAST 샤이니는 과거 Github 리포지토리의 shiny_app 지점에서 사용할 수 있는 R 스크립트입니다. 과거 샤이니는 첫 번째 실행 중에 종속성을 설치하려고 시도합니다.</li>
	<li>아래에 설명된 세 가지 방법 중 하나에서 응용 프로그램을 시작하여 분석을 시작합니다.<ol>
<li>RStudio와 과거 샤이니<ol>
<li>RStudio를 사용하여 앱이 있는 폴더에 새 프로젝트를 만듭니다. R이 있습니다. | 파일 클릭 새 프로젝트 및 해당 폴더를 선택합니다.</li>
			<li>새 프로젝트가 만들어지면 앱을 엽니다. R 파일은 이전에 다운로드했습니다. RStudio는 해당 앱을 인식합니다. R은 샤이니 앱이며 표시된 소스 코드 위의 막대에 앱 실행 버튼을 만듭니다. 실행 앱을클릭합니다. 그런 다음 RStudio는 과거 샤이니 응용 프로그램을 표시하는 창을 시작합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>R 콘솔과 과거 샤이니<ol>
<li>R을 실행하고 과거 빛나는 응용 프로그램을 시작하기 위해 다음 코드를 실행 : runApp에 ('경로 / 폴더 / / 반짝이 / 응용 프로그램. R'. 따옴표의 텍스트를 어떤 앱에 폴더로 바꿉다. R이 다운로드되고 따옴표를 유지합니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>R 샤이니없이 과거<ol>
<li>R 콘솔에서 라이브러리(과거)를 실행하여 과거를 로드합니다.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 샤이니 분석 사용자 지정 (선택 사항)
<ol><li>분석 제목을 "새 분석"에서 여러 분석을 추적하는 데 도움이 되는 실행 중인 분석 유형을 더 잘 반영하는 것으로 변경합니다(그림 1참조).</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig1.jpg"> 그림 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="2"><li>코어 수와 모드를 수정합니다. 코어 수를 1개에서 컴퓨터의 총 번호 사이에 임의로 설정하지만 PAST에 더 많은 리소스를 투입하면 컴퓨터의 다른 작업이 느려질 수 있다는 점에 유의하십시오. 섹션 6의 설명에 따라 모드를 설정합니다.</li>
</ol>3. 로드 GWAS 데이터
참고: GWAS 데이터가 탭 구분이 없는지 확인합니다. 연결 파일에 특성, 마커 이름, 궤적 또는 염색체, 염색체의 위치, p 값 및 마커의 R2 값과 같은 열이 포함되어 있는지 확인합니다. 효과 파일에 특성, 마커 이름, 궤적 또는 염색체, 염색체 위치 및 효과와 같은 열이 포함되어 있는지 확인합니다. 사용자가 데이터를 로드할 때 열이름을 지정할 수 있기 때문에 이러한 열의 순서는 중요하지 않습니다. 추가 열은 무시됩니다. TASSEL13은 이러한 파일을 생성하는 데 사용할 수 있습니다.
<ol><li>과거 샤이니와 GWAS 데이터를 로드합니다.<ol>
<li>연결 파일 및 효과 파일 선택 상자를 사용하여 연결 파일 및 효과 파일을 선택합니다. 파일 선택 상자 아래에 있는 연결 열 이름 및 효과 열 이름 입력 상자의 열 이름을 변경하여 데이터의 열 이름을 반영합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig2.jpg"> 그림 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="2"><li>R 콘솔에서 과거와 함께 GWAS 데이터를 로드합니다.<ol>
<li>다음 코드를 수정하고 실행합니다. gwas_data = load_GWAS_data ("경로 / to/association_file.tsv", "경로 / association_file/effects_file.tsv", association_columns = c ("특성", "마커", "로커스", "사이트", "p", "marker_R2"), effects_columns = c ("특성", "마커", "메쿠스", "사이트", "효과")
</li>
	</ol>
</li>
	<li>참고: GWAS 파일의 실제 위치로 경로를 변경합니다. association_columns 및 effects_columns 위해 제공된 값은 기본 값입니다. 이름이 기본 값과 일치하지 않으면 열 이름을 지정합니다. 그렇지 않으면 생략할 수 있습니다.</li>
</ol>4. 로드 연결 분리 (LD) 데이터
참고: 연결 분산(LD) 데이터가 탭 구분되어 있는지 확인하고 다음과 같은 유형의 데이터가 포함되어 있는지 확인합니다: 로커스, Position1, Site1, Position2, Site2, Position1과 Position2 사이의 기본 쌍의 거리 및 R2 값.
<ol><li>과거 샤이니와 LD 데이터를 로드합니다.<ol>
<li>LD 데이터가 포함된 파일을 선택합니다. 파일 선택 상자 아래에 있는 LD 열 이름 입력 상자의 열 이름을 변경하여 필요한 경우 LD 데이터의 열 이름과 일치합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig3.jpg"> 그림 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="2"><li>R 콘솔에서 과거와 LD 데이터를 로드합니다.<ol>
<li>LD 데이터를 로드하려면 다음 코드를 수정하고 실행합니다. LD = load_LD ("경로 /to/LD.tsv", LD_columns = c ("Locus1", "Position1", "Site1", "Position2", "Site2", "site2", "Dist_bp", "R.2") 참고: LD 파일의 실제 위치로 경로를 변경합니다. LD_columns 대해 제공된 값은 기본 값입니다. 이름이 이러한 기본값과 일치하지 않는 경우 열의 올바른 이름을 지정합니다. 그렇지 않으면 생략할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. 유전자에 SNP를 할당
참고: GFF 형식으로 주석을 다운로드하거나 찾습니다. 이 주석은 종종 특정 유기체에 대한 온라인 데이터베이스에서 찾을 수 있습니다. 주석 데이터의 품질이 경로 분석의 품질에 영향을 미치기 때문에 품질이 낮은 주석에 주의하십시오. 이러한 주석의 첫 번째 열(염색체)이 협회, 효과 및 LD 데이터에서 궤색/염색체의 형식과 일치하는지 확인합니다. 예를 들어 GWAS 및 LD 데이터 파일이 첫 번째 염색체 "1"을 호출하는 경우 주석은 첫 번째 염색체 "chr1"을 호출해서는 안됩니다.
<ol><li>과거 샤이니와 유전자에 SNP를 할당합니다. 참고: 적절한R2 차단을 결정하는 것에 대한 자세한 내용은 탕 외6,"통로 분석을 위한 유전자 알고리즘"이라는 섹션에서 찾을 수 있다.<ol>
<li>GFF 주석이 포함된 파일을 선택합니다. 기본값이 업로드된 데이터에 맞지 않는 경우 고려 중인 종에 가장 적합한 창 크기와 R2 컷오프가 가장 적합한 지 고려합니다. 참고: 과거의 기본 값은 주로 옥수수에 적합한 값을 반영합니다. 과거 샤이니 분석(2.2단계)의 시작 부분에 설정된 코어 수가 이 단계에서 사용됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig4.jpg"> 그림 4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="2"><li>R 콘솔에서 과거와 유전자에 SNP를 할당합니다.<ol>
<li>다음 코드를 수정하고 실행하여 유전자에 SMP를 할당합니다. 유전자 = assign_SNPs_to_genes (gwas_data, LD, "경로/to/annotations.gff", c("유전자"), 1000, 0.8, 2) 참고: 이 샘플 코드에서는 몇 가지 기본 제안이 제공됩니다: 1000은 유전자를 검색하기 위해 SNP 주변의 창 크기입니다. 0.8은 R2의컷오프 값입니다. 2는 병렬 처리에 사용되는 코어의 수입니다. 주석에 대한 경로도 주석 파일의 실제 위치로 변경해야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. 중요한 경로를 발견하십시오.
참고: 경로 파일에 탭 구분 형식의 다음 데이터가 포함되는지 확인하며, 각 경로의 모든 유전자에 대해 한 줄씩 포함되는지 확인합니다: 통로 ID - "PWY-6475-1"과 같은 식별자; 통로 설명 - 통로가 "트랜스 리코펜 생합성"과 같은 무엇을하는지에 대한 긴 설명; 유전자 - 주석에 제공된 이름과 일치해야 하는 통로의 유전자입니다. 경로 정보는 MaizeGDB와 같은 특정 유기체에 대한 온라인 데이터베이스에서 찾을 수 있습니다. 두 번째 사용자 지정 옵션은 모드입니다. "증가"는 수율과 같이 측정된 특성의 증가값이 바람직할 때 를 반영하는 표현형을 지칭하며, "감소"는 곤충 손상 등급과 같이 측정값의 감소가 유익한 특성을 의미한다. 경로의 중요성은 이전에 설명된 방법4,6,14를사용하여 테스트된다.
<ol><li>과거 샤이니와 함께 중요한 경로를 발견할 수 있습니다.<ol>
<li>경로 데이터가 포함된 파일을 선택하고 분석 옵션에서 모드가 선택되었는지 확인합니다. 필요한 경우, 효과의 중요성을 테스트하기 위해 null 분포를 만드는 데 사용되는 분석 및 순열 수를 유지하기 위해 경로에 있어야 하는 유전자의 수를 변경합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig5.jpg"> 그림 5. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
참고: 과거 샤이니 분석(2.2단계)의 시작 부분에 설정된 코어 수와 모드가 이 단계에서 사용됩니다. 유전자의 기본 수는 현재 5개의 유전자에서 설정됩니다, 그래서 더 적은 알려진 유전자를 가진 통로는 제거될 것입니다. 사용자는 이 값을 4 또는 3으로 낮출 수 있으며, 더 짧은 경로를 포함할 수 있지만 그렇게 하면 거짓 긍정 결과가 발생할 수 있습니다. 이 값을 늘리면 분석의 힘이 증가할 수 있지만 분석에서 더 많은 경로를 제거할 수 있습니다. 사용되는 순열 수를 변경하면 테스트의 힘이 증가하고 감소합니다.
<ol start="2"><li>R 콘솔에서 과거와 함께 중요한 경로를 발견하십시오.<ol>
<li>다음 코드를 수정하고 실행하여 중요한 경로를 발견합니다. rugplots_data <- find_pathway_significance(유전자, "경로/경로/통로.tsv", 5, "증가", 1000, 2) 참고: 이 샘플 코드에서는 제안된 몇 가지 기본값이 제공됩니다. 도 5는 분석에서 경로를 유지하기 위해 경로에 있어야 하는 최소한의 유전자 수이며, 증가하여 측정된 특성의 양이 증가하고 있음을 의미합니다(특성에 관계없이 사용자가 증가 및 감소하는 것이 좋습니다. 데이터 해석은 2가지에 대해 다를 것이다), 1000은 null 분포를 결정하는 효과를 샘플링하는 횟수이며, 및 2는 병렬 처리에 사용되는 코어의 수입니다. 경로 파일의 실제 위치로 경로를 변경합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. 러그플롯 보기
<ol><li>과거 샤이니와 함께 러그플롯을 볼 수 있습니다.<ol>
<li>모든 입력이 업로드되고 설정되면 분석 시작을클릭합니다. 진행률 표시줄이 나타나고 마지막으로 완료된 분석 단계를 나타냅니다. 분석이 완료되면 과거 샤이니가 결과 탭으로 전환됩니다. 결과 테이블이 왼쪽 열("경로"라고 표시)에 표시되고 Rugplots가 오른쪽 열에 표시됩니다("플롯"이라고 표시).</li>
		<li>슬라이더를 사용하여 필터링 매개 변수를 제어합니다. 필터링 수준이 만족스럽으면 왼쪽 하단의 결과 다운로드 버튼을 클릭하여 모든 이미지와 테이블을 분석 제목으로 명명된 ZIP 파일에 개별적으로 다운로드합니다. 이 ZIP 파일에는 필터링된 테이블, 필터링되지 않은 테이블 및 필터링된 테이블의 경로당 하나의 이미지가 포함되어 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig6.jpg"> 그림 6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig7.jpg"> 그림 7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<ol start="2"><li>R 콘솔에서 과거와 함께 러그플롯 보기<ol>
<li>결과를 저장하기 위해 다음 코드를 수정하고 실행합니다. plot_pathways(rugplots_data, "가치", 0.02, "증가", "output_folder") 참고: 이 샘플 코드에서는 제안된 몇 가지 기본값이 제공됩니다. pvalue는 유의 임계값이 사용자가 선택한 후 중요하지 않은 경로를 필터링하는 데 사용할 수 있는 데이터를 제공합니다. 0.02는 필터링에 사용되는 기본 값이며, 증가는 측정된 특성의 증가양을 의미합니다(특성에 관계없이 사용자가 증가 및 감소하는 것을 사용하는 것이 좋습니다. 데이터 해석은 둘 에 대해 다를 것입니다. output_folder 이미지와 테이블이 기록되는 폴더입니다(이 폴더는 함수를 실행하기 전에 존재해야 합니다). 필터링된 결과 테이블, 필터링되지 않은 결과 및 필터링된 결과의 모든 경로에 대한 개별 이미지가 이 폴더에 기록됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rafalski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+genetics+in+crop+improvement.">Association genetics in crop improvement.</a> Current Opinion in Plant Biology. 13 (2), 174-180 (2010).</li><li>Yan, J., Warburton, M., Crouch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+Mapping+for+Enhancing+Maize+(Zea+mays+L.)+Genetic+Improvement.">Association Mapping for Enhancing Maize (Zea mays L.) Genetic Improvement.</a> Crop Science. 51 (2), 433-449 (2011).</li><li>Xiao, Y., Liu, H., Wu, L., Warburton, M., Yan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+Association+Studies+in+Maize:+Praise+and+Stargaze.">Genome-wide Association Studies in Maize: Praise and Stargaze.</a> Molecular Plant. 10 (3), 359-374 (2017).</li><li>Wang, K., Li, M., Bucan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathway-Based+Approaches+for+Analysis+of+Genomewide+Association+Studies.">Pathway-Based Approaches for Analysis of Genomewide Association Studies.</a> The American Journal of Human Genetics. 81 (6), 1278-1283 (2007).</li><li>Weng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNP-based+pathway+enrichment+analysis+for+genome-wide+association+studies.">SNP-based pathway enrichment analysis for genome-wide association studies.</a> BMC Bioinformatics. 12 (1), 99 (2011).</li><li>Tang, J., Perkins, A., Williams, W., Warburton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+genome-wide+associations+to+identify+metabolic+pathways+involved+in+maize+aflatoxin+accumulation+resistance.">Using genome-wide associations to identify metabolic pathways involved in maize aflatoxin accumulation resistance.</a> BMC Genomics. 16 (1), 673 (2015).</li><li>Warburton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Association+Mapping+of+Aspergillus+flavus+and+Aflatoxin+Accumulation+Resistance+in+Maize.">Genome-Wide Association Mapping of Aspergillus flavus and Aflatoxin Accumulation Resistance in Maize.</a> Crop Science. 55 (5), 1857-1867 (2015).</li><li>Warburton, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Association+and+Metabolic+Pathway+Analysis+of+Corn+Earworm+Resistance+in+Maize.">Genome-Wide Association and Metabolic Pathway Analysis of Corn Earworm Resistance in Maize.</a> The Plant Genome. 11 (1), 170069 (2018).</li><li>Li, H., Thrash, A., Tang, J., He, L., Yan, J., Warburton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leveraging+GWAS+data+to+identify+metabolic+pathways+and+networks+involved+in+maize+lipid+biosynthesis.">Leveraging GWAS data to identify metabolic pathways and networks involved in maize lipid biosynthesis.</a> The Plant Journal. 98 (5), 853-863 (2019).</li><li>Thrash, A., Tang, J., DeOrnellis, M., Peterson, D., Warburton, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PAST:+The+Pathway+Association+Studies+Tool+to+Infer+Biological+Meaning+from+GWAS+Datasets.">PAST: The Pathway Association Studies Tool to Infer Biological Meaning from GWAS Datasets.</a> Plants. 9 (1), 58 (2020).</li><li>Adam, T., Mason, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> PAST: Pathway Association Study Tool (PAST). Bioconductor version: Release (3.10). , (2020).</li><li>Thrash, A., DeOrnellis, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> IGBB/PAST. , (2019).</li><li>Bradbury, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TASSEL:+software+for+association+mapping+of+complex+traits+in+diverse+samples.">TASSEL: software for association mapping of complex traits in diverse samples.</a> Bioinformatics. 23 (19), 2633-2635 (2007).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+A+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: A knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 102, 15545-15550 (2005).</li></ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

PAST의 주요 목표는 GWAS 데이터의 신진 대사 경로 분석을 더 넓은 청중에게, 특히 비 인간 및 비 동물 유기체에 가져오는 것입니다. 과거에 대한 대체 방법은 종종 인간이나 동물에 초점을 맞춘 명령줄 프로그램입니다. 사용자 친화성은 광택 응용 프로그램을 개발하기로 선택하고 응용 프로그램을 출시하기 위해 R 및 바이오 전도체를 사용하기로 선택하는 등 PAST 개발의 주요 목표였습니다. 사용자는 PAST를 사용하기 위해 프로그램을 컴파일하는 방법을 배울 필요가 없습니다.
대부분의 유형의 분석 소프트웨어와 마찬가지로 PAST의 결과는 입력 데이터만큼만 양호합니다. 입력 데이터에 오류가 있거나 잘못 포맷된 경우 PAST는 실행되지 않거나 정보 없는 결과를 생성하지 못합니다. GWAS 데이터, LD 데이터, 주석 및 경로 파일의 형식이 올바르게 지정되도록 하려면 PAST에서 올바른 출력을 받는 데 매우 중요합니다. 과거는 이중 동선 마커만 분석하고 각 입력 데이터 집합에 대해 하나의 특성만 실행할 수 있습니다. 또한, 불량 한 유전 또는 부정확한 phenotyping에 의해 생성 된 GWAS 데이터 도 명확하거나 반복 가능한 결과 생성 가능성이 없습니다. 과거는 GWAS 결과의 생물학적 해석에 도움이 될 수 있지만 환경 변화, 실험 적 오류 또는 인구 구조가 제대로 고려되지 않은 경우 혼란스러운 데이터 세트를 명확히 할 가능성은 낮습니다.
사용자는 Shiny 응용 프로그램에서 이러한 매개 변수를 R 콘솔의 PAST 함수에 전달하여 분석의 일부 매개 변수를 변경할 수 있습니다. 이러한 매개 변수는 PAST에서 보고한 결과를 변경할 수 있으며 사용자는 기본값에서 이를 수정할 때 주의해야 합니다. LD는 사용자에 의해 측정되기 때문에, 일반적으로 GWAS에서 도 사용 된 동일한 마커 데이터 세트를 사용하여, LD 측정은 인구에 특정. 모든 연구, 특히 옥수수 이외의 종에 대 한, (특히 자기 수 분, polyploid, 또는 높은 이종 종), 기본값의 변경 보증 될 수 있습니다.

An erratum was issued for: A Pathway Association Study Tool for GWAS Analyses of Metabolic Pathway Information. One of the affiliations was updated.
The second affiliation was updated from:
USDA-ARS Corn Host Plant Resistance Research Unit, Mississippi State University
to:
Corn Host Plant Resistance Research Unit, USDA-ARS

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61268">A Pathway Association Study Tool for GWAS Analyses of Metabolic Pathway Information</a>. One of the affiliations was updated.

Erratum: A Pathway Association Study Tool for GWAS Analyses of Metabolic Pathway Information

게놈 전체 협회 연구(GWAS)는 복잡한 특성과 그들과 관련된 게놈영역을연구하는 인기 있는 방법이다1,2,3. 연구의 이 모형에서, 단 수십만개의 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 마커는 특성과의 그들의 협회를 위해 시험되고, 협회의 중요성을 평가됩니다. 잘못된 발견률(FDR) 임계값(또는 다른 유형의 유의 임계값)을 충족하는 마커-특성 협회는 연구를 위해 유지되지만 진정한 연관성은 필터링될 수 있습니다. 복잡하고 다원성 특성의 경우, 각 유전자의 효과는 작을 수 있으며(따라서 여과됨), 일부 진상항제는 연구3에존재하지 않을 수 있는 특정 조건에서만 발현된다. 따라서, 많은 SMP가 특성과 연관된 바와 같이 유지될 수 있지만, 각각은 매우 작은 효과를 가질 수 있다. 너무 많은 SNP 호출이 누락될 것이며, 특성의 생물학적 의미와 유전 적 구조에 대한 해석은 불완전하고 혼란 스러울 수 있습니다. 대사 경로 분석은 그들의 생물학적 기능에 따라 그룹화 된 유전자의 결합 된 효과에 초점을 맞추어 이러한 문제 중 일부를 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다4,5,6.
이 문서에서 설명한 메서드의 이전 구현을 사용하여 여러 연구가 완료되었습니다. 아플라톡신 축적7,옥수수 귀벌레 저항8,및 오일 생합성9는 모두 이전 구현과 함께 연구되었다. 이러한 분석은 성공적이었지만 분석 도구가 R, Perl 및 Bash의 조합으로 작성되었으며 파이프라인이 자동화되지 않았기 때문에 분석 프로세스가 복잡하고 시간이 많이 걸리며 번거로울 수 있었습니다. 각 분석에 대해 이 방법을 수정하는 데 필요한 전문 지식으로 인해 다른 연구원과 공유할 수 있는 새로운 방법이 개발되었습니다.
경로 협회 연구 도구(PAST)10은 프로그래밍 언어에 대한 지식이 적고 짧은 기간에 분석을 실행하여 이전 방법의 단점을 해결하도록 설계되었습니다. 이 방법은 옥수수로 테스트되었지만 PAST는 종별 가정을 하지 않습니다. 과거는 샤이니 앱으로 R 콘솔을 통해 실행할 수 있으며, 온라인 버전은 곧 MaizeGDB에서 사용할 수 있을 것으로 예상됩니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:719px;" width="717">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">Computer</td>
			<td style="width:74px;">NA</td>
			<td style="width:123px;">NA</td>
			<td style="width:300px;">Any computer with 8GB RAM should be sufficient</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:223px;">R</td>
			<td style="width:74px;">R Project</td>
			<td style="width:123px;">NA</td>
			<td>R 3.6 or greater is required to install from Bioconductor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a pathway association study tool for gwas analyses of metabolic pathway information

최근에는 대사경로 분석을 이용한 게놈 전체 협회 연구(GWAS) 데이터를 해석하기 위한 이전에 설명된 방법의 새로운 구현이 개발및 발표되고 있다. 경로 협회 연구 도구(PAST)는 사용자 친화성 및 느린 실행 분석으로 문제를 해결하기 위해 개발되었습니다. 이 새로운 사용자 친화적 인 도구는 바이오 컨덕터 및 Github에 출시되었습니다. 테스트에서 PAST는 이전에 24시간 이상 필요한 1시간 이내에 분석을 실행했습니다. 이 문서에서는 Shiny 응용 프로그램 또는 R 콘솔을 사용하여 PAST를 실행하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

PAST 소프트웨어 도구 실행 후 결과가 생성되지 않은 경우 모든 입력 파일의 형식이 올바르게 지정되었는지 확인합니다. 곡색의 옥수수 GWAS를 기반으로 하는 PAST 패키지의 예제 데이터를 사용한 성공적인 실행은 그림 8에나와 있다. 이 테이블과 결과 이미지는 결과 다운로드 버튼을 사용하여 다운로드할 수 있습니다. 다운로드한 이미지의 예는 도 210에표시됩니다. 잘못된 설정은 생물학적 의미가없는 결과로 이어질 수 있지만 부정확성을 결정하는 것은 선택한 설정의 유효성을 다시 확인하고 관심의 특성에 관한 알려진 모든 증거를 고려해야하는 연구원에게 달려 있어야합니다.
도 910은 곡물 색에 대한 표현형이었던 288개의 근친선의 옥수수 패널로 생성된 GWAS 결과의 경로 분석에서 생성된 러그플롯을 나타낸다. 표현형이 "흰색" 또는 "노란색"이었던 이 단순한 예는 밝은 노란색 카로티노이드 안료를 만드는 통로가 알려져 있고 대부분의 표현형에 대한 책임이 있기 때문에 사용되었습니다. 따라서, 우리는 트랜스 리코펜 생합성 경로 (카로티노이드를 생산하는)가 곡물 색상과 현저하게 연관될 것으로 예상했습니다. 경로 ID와 이름은 그래프 상단에 나열됩니다. 그래프의 수평 축은 특성에 가장 큰 영향을 미치는 순서로 왼쪽에서 오른쪽으로 배열된 분석에 포함된 모든 유전자를 가장 작은 특성으로 평가합니다. 그러나, 트랜스 리코펜 생합성 경로에 있는 유전자만 표시된다 (그래프의 상단에, 해치 마크로, 분석에 있는 다른 모든 유전자에 비해 그들의 효과의 유전자 순위에 나타나는). 이 통로에 있는 7개의 유전자가 있습니다. 실행 보강 점수(ES)는 세로 축을 따라 플롯됩니다. 각 유전자에 대한 ES는 실행 합계로 추가되어 효과순으로, 총은 분석된 유전자의 수에 따라 조정된다. 따라서, 점수는 수평축을 따라 오른쪽으로 이동하여 더 큰 효과 유전자가 포함됨에 따라 증가하는 경향이 있지만, 어느 시점에서, 효과의 증가는 다른 유전자를 첨가한 조정보다 작으며, 전체 점수는 감소하기 시작한다. 실행 중인 ES 선의 정점은 점선세로 표시됩니다. 이것은 전체 경로에 대한 ES이며 경로가 선택되고 rugplot로 제시되는지 여부를 결정하는 프로그램에 의해 사용됩니다.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig8.jpg"> 그림 8: 과거 샤이니의 완료 실행. 이 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig8large.jpg" target="_blank">그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61268/61268fig9.jpg"> 그림 9: 과거 (또는 샤이니에서 다운로드)의 완료 된 실행에서 경로 이미지. 이 수치는 Thrash 외10에서인용되었습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61268/61268fig9large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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A Pathway Association Study Tool for GWAS Analyses of Metabolic Pathway Information

경로 협회 연구 도구 (과거)를 실행 하 여, 빛나는 응용 프로그램을 통해 또는 R 콘솔을 통해, 연구원은 그들의 게놈 전체 협회 연구의 생물학적 의미의 깊은 이해를 얻을 수 있습니다 (GWAS) 관련 된 신진 대사 경로 조사 하 여 결과.

신진 대사 경로 정보의 GWAS 분석을 위한 통로 협회 연구 도구

Recently, a new implementation of a previously described method for interpreting genome-wide association study (GWAS) data using metabolic pathway ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

3.1K 조회수.  Mississippi State University. 경로 협회 연구 도구 (과거)를 실행 하 여, 빛나는 응용 프로그램을 통해 또는 R 콘솔을 통해, 연구원은 그들의 게놈 전체 협회 연구의 생물학적 의미의 깊은 이해를 얻을 수 있습니다 (GWAS) 관련 된 신진 대사 경로 조사 하 여 결과. 

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Metabolic Labeling and Profiling of Transfer RNAs Using Macroarrays

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for protein synthesis by translating codons in mRNA into amino acid sequences. tRNAs were long considered as house-keeping molecules that lacked regulatory functions. However, a growing body of evidence indicates that cellular tRNA levels fluctuate in correspondence to varying conditions such as cell type, environment, and stress. The fluctuation of tRNA expression directly influences gene translation, favoring or repressing the expression of particular proteins. Ultimately comprehending the dynamic of protein synthesis requires the development of methods able to deliver high-quality tRNA profiles. The method that we present here is named SPOt, which stands for Streamlined Platform for Observing tRNA. SPOt consists of three steps starting with metabolic labeling of cell cultures with radioactive orthophosphate, followed by guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction of radioactive total RNAs and finally hybridization on in-house printed macroarrays. tRNA levels are estimated by quantifying the radioactivity intensities at each probe spot. In the protocol presented here we profile tRNAs in Mycobacterium smegmatis mc2155, a nonpathogenic bacterium often used as a model organism to study tuberculosis.

We describe an original transfer RNA analysis platform named SPOt (Streamlined Platform for Observing tRNA). SPOt simultaneously measures cellular levels of all tRNAs in biological samples, in only three steps, and in less than 24 hours.

신진 대사 라벨 및 Macroarrays를 사용 하 여 전송 RNAs의 프로 파일링

Transfer RNAs (tRNA) are abundant short non-coding RNA species that are typically 76 to 90 nucleotides in length. tRNAs are directly responsible for ...

연구

유전학

Ultralow Input Genome Sequencing Library Preparation from a Single Tardigrade Specimen

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state when water is supplied. The genomic sequencing of microscopic animals such as tardigrades risks bacterial contamination that sometimes leads to erroneous interpretations, for example, regarding the extent of horizontal gene transfer in these animals. Here, we provide an ultralow input method to sequence the genome of the tardigrade, Hypsibius dujardini, from a single specimen. By employing rigorous washing and contaminant exclusion along with an efficient extraction of the 50 ~ 200 pg genomic DNA from a single individual, we constructed a library sequenced with a DNA sequencing instrument. These libraries were highly reproducible and unbiased, and an informatics analysis of the sequenced reads with other H. dujardini genomes showed a minimal amount of contamination. This method can be applied to unculturable tardigrades that could not be sequenced using previous methods.

Contamination during the genomic sequencing of microscopic organisms remains a large problem. Here, we show a method to sequence the genome of a tardigrade from a single specimen with as little as 50 pg of genomic DNA without whole genome amplification to minimize the risk of contamination.

Ultralow 입력된 게놈 시퀀싱 단일 Tardigrade 견본에서 라이브러리 준비

Tardigrades are microscopic animals that enter an ametabolic state called anhydrobiosis when facing desiccation and can return to their original state ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

미토 콘 드리 아 DNA 메 틸 화의 정확한 탐지를 위한 방법론

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

차세대 시퀀싱의 원형 염색체 구조를 사용 하 여 유전자 규제 시퀀스의 높은 처리량 Id (4 C-seq)를 캡처

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Chromogenic In Situ Hybridization as a Tool for HPV-Related Head and Neck Cancer Diagnosis

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated with a better outcome than alcohol- and tobacco-related OPSCC. Chromogenic in situ hybridization (CISH) of HPV viral RNA could allow the semiquantitative evaluation of viral transcripts of the oncogenic proteins E6 and E7 and an in situ visualization with a good spatial resolution. This technique allows the diagnosis of an active infection with the visualization of HPV transcription in the tumoral HPV-infected cells. An advantage of this technique is the avoidance of contamination from nonneoplastic HPV-infected cells adjacent to the tumor. Overall, its good diagnosis performances have it considered to be the gold standard for active HPV infection identification. Since E6 and E7 viral protein interaction with cell proteins pRb and p53 is mandatory for cell transformation, HPV RNA CISH is functionally relevant and acutely reflects active oncogenic HPV infection. This technique is clinically relevant as well since &#34;low&#34; or &#34;high&#34; HPV transcription levels helped the identification of two prognosis groups among HPV-related p16-positive head and neck cancer patients. Here we present the protocol for manual HPV RNA CISH performed on formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) slides with a kit obtained from the manufacturer. Instead of chromogenic revelation, RNA in situ hybridization may also be performed with fluorescent revelation (RNA FISH). It may also be combined with conventional immunostaining.

Human papillomavirus (HPV) RNA chromogenic in situ hybridization is considered to be one of the gold standards for active human papillomavirus infection detection within tumors. It allows the visualization of HPV E6-E7 mRNA expression with localization and semiquantitative evaluation of its signal.

시투 혼성화에서 발색성 HPV 관련 두경부 암 진단을 위한 도구

Human papillomavirus (HPV) infection is a major risk factor for a subtype of oropharyngeal squamous cell carcinoma (OPSCC), which tends to be associated ...

Navigating MARRVEL, a Web-Based Tool that Integrates Human Genomics and Model Organism Genetics Information

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is pathogenic, one must query many databases to determine whether the gene of interest is linked to a genetic disease, whether the specific variant has been reported before, and what functional data is available in model organism databases that may provide clues about the gene&#8217;s function in human. MARRVEL (Model organism Aggregated Resources for Rare Variant ExpLoration) is a one-stop data collection tool for human genes and variants and their orthologous genes in seven model organisms including in mouse, rat, zebrafish, fruit fly, nematode worm, fission yeast, and budding yeast. In this Protocol, we provide an overview of what MARRVEL can be used for and discuss how different datasets can be used to assess whether a variant of unknown significance (VUS) in a known disease-causing gene or a variant in a gene of uncertain significance (GUS) may be pathogenic. This protocol will guide a user through searching multiple human databases simultaneously starting with a human gene with or without a variant of interest. We also discuss how to utilize data from OMIM, ExAC/gnomAD, ClinVar, Geno2MP, DGV and DECHIPHER. Moreover, we illustrate how to interpret a list of ortholog candidate genes, expression patterns, and GO terms in model organisms associated with each human gene. Furthermore, we discuss the value protein structural domain annotations provided and explain how to use the multiple species protein alignment feature to assess whether a variant of interest affects an evolutionarily conserved domain or amino acid. Finally, we will discuss three different use-cases of this website. MARRVEL is an easily accessible open access website designed for both clinical and basic researchers and serves as a starting point to design experiments for functional studies.

Here, we present a protocol to access and analyze many human and model organism databases efficiently. This protocol demonstrates the use of MARRVEL to analyze candidate disease-causing variants identified from next-generation sequencing efforts.

인간 유전체학 및 모델 유기체 유전학 정보를 통합하는 웹 기반 도구인 MARRVEL 탐색

Through whole-exome/genome sequencing, human geneticists identify rare variants that segregate with disease phenotypes. To assess if a specific variant is ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame (ORF) annotation impose two arbitrary criteria: a minimum length of 100 codons and a single ORF per transcript. However, a growing number of studies report expression of proteins from allegedly non-coding regions, challenging the accuracy of current genome annotations. These novel proteins were found encoded either within non-coding RNAs, 5' or 3' untranslated regions (UTRs) of mRNAs, or overlapping a known coding sequence (CDS) in an alternative ORF. OpenProt is the first database that enforces a polycistronic model for eukaryotic genomes, allowing annotation of multiple ORFs per transcript. OpenProt is freely accessible and offers custom downloads of protein sequences across 10 species. Using OpenProt database for proteomic experiments enables novel proteins discovery and highlights the polycistronic nature of eukaryotic genes. The size of OpenProt database (all predicted proteins) is substantial and need be taken in account for the analysis. However, with appropriate false discovery rate (FDR) settings or the use of a restricted OpenProt database, users will gain a more realistic view of the proteomic landscape. Overall, OpenProt is a freely available tool that will foster proteomic discoveries.

OpenProt is a freely accessible database that enforces a polycistronic model of eukaryotic genomes. Here, we present a protocol for the use of OpenProt databases when interrogating mass spectrometry datasets. Using OpenProt database for analysis of proteomic experiments allows for discovery of novel and previously undetectable proteins.

질량 분석 기반 Proteomics 분석 소설 단백질을 공개할 OpenProt 데이터베이스를 사용 하 여 비 정식 열려있는 독서 프레임에서 번역

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

The organization and structure of chromatin domains are unique to individual cell lineages. Their misregulation might lead to a loss in cellular identity and/or disease. Despite tremendous efforts, our understanding of the formation and propagation of chromatin domains is still limited. Chromatin domains have been studied under steady-state conditions, which are not conducive to following the initial events during their establishment. Here, we present a method to inducibly reconstruct chromatin domains and follow their re-formation as a function of time. Although, first applied to the case of PRC2-mediated repressive chromatin domain formation, it could be easily adapted to other chromatin domains. The modification of and/or the combination of this method with genomics and imaging technologies will provide invaluable tools to study the establishment of chromatin domains in great detail. We believe that this method will revolutionize our understanding of how chromatin domains form and interact with each other.

A Method to Study de novo Formation of Chromatin Domains

This method is designed to follow formation of PRC2-mediated chromatin domains in cell lines, and the method can be adapted to many other systems.

크로마틴 도메인의 드 노보 형성을 연구하는 방법

The organization and structure of chromatin domains are unique to individual cell lineages. Their misregulation might lead to a loss in cellular identity ...

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene expression, cell identity and differentiation. Many approaches developed to study the 3D architecture of the genome can be divided into two complementary categories: chromosome conformation capture based technologies (C-technologies) and imaging. While the former is based on capturing the chromosome conformation and proximal DNA interactions in a population of fixed cells, the latter, based on DNA fluorescence in situ hybridization (FISH) on 3D-preserved nuclei, allows contemporary visualization of multiple loci at a single cell level (multicolor), examining their interactions and distribution within the nucleus (3D multicolor DNA FISH). The technique of 3D multicolor DNA FISH has a limitation of visualizing only a few predetermined loci, not permitting a comprehensive analysis of the nuclear architecture. However, given the robustness of its results, 3D multicolor DNA FISH in combination with 3D-microscopy and image reconstruction is a possible method to validate C-technology based results and to unambiguously study the position and organization of specific loci at a single cell level. Here, we propose a step by step method of 3D multicolor DNA FISH suitable for a wide range of human primary cells and discuss all the practical actions, crucial steps, notions of 3D imaging and data analysis needed to obtained a successful and informative 3D multicolor DNA FISH within different biological contexts.

3D multicolor DNA FISH represents a tool to visualize multiple genomic loci within 3D preserved nuclei, unambiguously defining their reciprocal interactions and localization within the nuclear space at a single cell level. Here, a step by step protocol is described for a wide spectrum of human primary cells.

인간의 1 차 세포에서 핵 아키텍처를 연구하는 3D 다색 DNA FISH 도구

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...

An Approach to Study Shape-Dependent Transcriptomics at a Single Cell Level

Different types of cardiac hypertrophy have been associated with an increased volume of cardiac myocytes (CMs), along with changes in CM morphology. While the effects of cell volume on gene expression are well known, the effects of cell shape are not well understood. This paper describes a method that has been designed to systematically analyze the effects of CM morphology on gene expression. It details the development of a novel single-cell trapping strategy that is then followed by single-cell mRNA sequencing. A micropatterned chip has also been designed, which contains 3000 rectangular-shaped fibronectin micropatterns. This makes it possible to grow CMs in distinct length:width aspect ratios (AR), corresponding to different types of heart failure (HF). The paper also describes a protocol that has been designed to pick up single cells from their pattern, using a semi-automated micro-pipetting cell picker, and individually inject them into a separate lysis buffer. This has made it possible to profile the transcriptomes of single CMs with defined geometrical morphotypes and characterize them according to a range of normal or pathological conditions: hypertrophic cardiomyopathy (HCM) or afterload/concentric versus dilated cardiomyopathy (DCM) or preload/eccentric. In summary, this paper presents methods for growing CMs with different shapes, which represent different pathologies, and sorting these adherent CMs based on their morphology at a single-cell level. The proposed platform provides a novel approach to high throughput and drug screening for different types of HF.

This paper presents methods for growing cardiac myocytes with different shapes, which represent different pathologies, and sorting these adherent cardiac myocytes based on their morphology at a single cell level. The proposed platform provides a novel approach to high throughput and drug screening for different types of heart failure.

단일 세포 수준에서 모양 의존적 전사학을 연구하는 접근법

Different types of cardiac hypertrophy have been associated with an increased volume of cardiac myocytes (CMs), along with changes in CM morphology. While ...