Bu çalışma NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Kariyer Ödülü (1653702) ve Connecticut Üniversitesi tarafından finansal olarak desteklenmektedir.

1. JBNT'lerin Sentezi
NOT: JBNT monomer daha önce yayınlandı olduğu gibi hazırlanmıştır11.
<ol><li>Bileşik A1 sentezi<ol>
<li>25 mL toluen ve 2,5 mL N, N-dimetilformamid içinde 8,50 g 2-siyanoasetik asit ve 9,80 g etilkarbamat içeren bir çözelti hazırlayın. Damla yönünde 4,90 mL fosforel klorür ekleyin. Daha sonra karışımı 70 ° C'ye ısıtın ve 1,5 saat karıştırmaya devam edin.</li>
		<li>Reaksiyon karışımını oda sıcaklığına soğutun ve 100 g buzlu su dökün. Sulu tabakayı etil asetat (3 x 250 mL) ile çıkarın ve 100 mL salamura ile yıkayın. Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, soluk sarı bir katı elde etmek için uçucuları vakum altında filtreleyin ve buharlaştırın.</li>
		<li>Sarı katıyı silika jel flaş sütun kromatografisine (%3 metanol/dikloromethane) tabi tutarak beyaz bir toz olarak 15,61 g bileşik A1 elde edin.</li>
	</ol></li>
	<li>A2 bileşiği sentezi<ol>
<li>3.12 g bileşik A1 ve 2.75 g potasyum karbonatı 50 mL N, N-dimetilformamid karıştırın. Oda sıcaklığında 2 saat karıştırın.</li>
		<li>Reaksiyon süspansiyonu için 2,6 mL karbon disülfid ekleyin. 4 saat karıştırmaya devam edin.</li>
		<li>Reaksiyon karışımına 0 °C'de mutlak etanol ekleyin. Sarı çökeltiyi filtreleyin ve dietil eter ile yıkayın. Soluk sarı katı olarak 6,18 g bileşik A2 elde etmek için vakum altında bir gecede kurutun.</li>
	</ol></li>
	<li>A3 bileşiği sentezi<ol>
<li>15 mL asetonitril içine 2,7 mL metil iyodür ekleyin. Ayrıca, 6,18 g A2 ila 80 mL su/asetonitril (7:3 oranı) ekleyerek ayrı ayrı bir A2 bileşik çözeltisi hazırlayın. Hem çözeltileri karıştırın hem de oda sıcaklığında 30 dakika karıştırın.</li>
		<li>Reaksiyon karışımını 95 °C'ye ısıtın ve 3 saat boyunca karıştırmaya devam edin.</li>
		<li>Reaksiyon karışımını oda sıcaklığına soğutun ve ardından uçucuları vakum altında buharlaştırin.</li>
		<li>Kalıntıyı 100 mL etil asetat ile 3x çıkarın ve salamura ile yıkayın. Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, sarı bir katı elde etmek için vakum altındaki uçucuları filtreleyin ve buharlaştırın.</li>
		<li>Sarı katıyı silika jel flaş sütun kromatografisine (%30 etil asetat/hexanes) maruz kalarak A3 bileşiğin 4,52 g'ını açık sarı katı olarak elde edin.</li>
	</ol></li>
	<li>A4 bileşiği sentezi<ol>
<li>20 mL etanol içine 925 μL allylamin ekleyerek alllamin çözeltisi hazırlayın. Bu çözeltiyi, 75 mL mutlak etanolde 3,14 g A3 eklenerek hazırlanan bileşik A3 çözeltisine damla yönünde ekleyin, 30 dakikadan fazla. Daha sonra reaksiyon karışımını reflüye 16 saat ısıtın.</li>
		<li>Reaksiyon karışımını oda sıcaklığına soğutun ve sarı bir katı vermek için uçucuları buharlaştırin.</li>
		<li>Sarı katıyı silika jel flaş kolon kromatografisine (%50 etil asetat/heksanlar %2 metanol/dikloromethane) tabi tutarak beyaz kristal olarak 1,80 g bileşik A4 elde edin.</li>
	</ol></li>
	<li>A5 bileşiği sentezi<ol>
<li>14 mL mutlak etanol içine 2,05 g guanidinyum hidroklorür ve 7,8 mL sodyum etoksit (etanolde% 21 wt) ekleyin. Karışımı 15 dakika boyunca 45 °C'ye ısıtın.</li>
		<li>Çözünmeyen malzemeyi filtreleyin ve filtratı doğrudan 40 mL mutlak etanol içine 2,70 g A4 ekleyerek hazırlanan A4 bileşiği çözeltisine ekleyin. Reaksiyon karışımını reflüye 16 saat ısıtın.</li>
		<li>2,65 g bileşik A5 elde etmek için çökeltmeyi beyaz olmayan bir katı olarak filtreleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Bileşik A6 sentezi<ol>
<li>1 dakika boyunca 120 mL tetrahidrofuranda 2,11 g bileşik A5 ve 1,10 g 4-Dimetilaminopyridine eklenerek elde edilen bulamaç karışımına yavaşça 24,9 mL trietilamin ekleyin. Oda sıcaklığında 2 dakika karıştırın.</li>
		<li>Reaksiyon karışımına damla yönünde 20,7 mL di-tert-butil dikarbonat ekleyin ve oda sıcaklığında 40 saat karıştırmaya devam edin.</li>
		<li>Reaksiyonun söndürülmesi için 20 mL su ekleyin. Uçucuları vakum altında buharlaştır.</li>
		<li>Kırmızı viskoz kalıntıyı 500 mL etil asetat ile çıkarın. Ardından, 250 mL su, 75 mL% 10 sitrik asit, 200 mL su ile 2x, 200 mL doymuş sodyum bikarbonat ve 200 mL salamura ile yıkayın. Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, kırmızı/turuncu bir katı vermek için vakum altındaki uçucuları filtreleyin ve buharlaştırın.</li>
		<li>Katıyı silika jel flaş kolon kromatografisine (%0-20 etil asetat/heksanes) vererek beyaz köpük olarak 3,87 g bileşik A6 elde edin.</li>
	</ol></li>
	<li>Bileşik A7 sentezi<ol>
<li>Aseton/suda (8:1, 58,5 mL) A6 (2,93 g) bileşik çözeltisine damla yönünde N-metilmorfolin N-oksit (suda% 50 wt.% ekleyin) ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırın.</li>
		<li>Karışıma 3 dakikalık bir süre boyunca damla yönünde osmiyum tetraoksit (%4 sulu çözelti) ekleyin ve 24 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırmaya devam edin.</li>
		<li>Çözelti renksiz olana kadar reaksiyonun 1.0 M sulu sodyum sülfit ile söndürülmesi. Suda beyaz bir bulamaca neden olmak için vakum altındaki uçucuları çıkarın. Kalıntıyı 350 mL diklorometan ile çıkarın ve ardından 150 mL su ile yıkayın ve ardından 150 mL salamura ile yıkayın.</li>
		<li>Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, beyaz bir katı olarak 2,45 g bileşik A7 elde etmek için vakum altındaki uçucuları filtreleyin ve buharlaştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Bileşik A8 sentezi<ol>
<li>35 mL dikloromethane/suda (6:1, 35 mL) 1,36 g bileşik A7 karışımına 760 g sodyum periodide ekleyin ve 42 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırın.</li>
		<li>Çözünmeyen malzemeyi filtreleyin ve filtratı vakum altında yoğunlaştırın. Elde edilen kalıntıyı 250 mL diklorometan ile çıkarın ve ardından 100 mL su ve 100 mL salamura ile yıkayın. Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, ham ürünü vermek için vakum altındaki uçucuları filtreleyin ve buharlaştırın.</li>
		<li>Ham ürünü silika jel flaş kolon kromatografisine (%5-40 etil asetat/altıgen, daha sonra %5 metanol/dikloromethane) 1,08 g bileşik A8 verimine tabi tutunun.</li>
	</ol></li>
	<li>Bileşik A9 sentezi<ol>
<li>1,2-dikloroetan 15 mL'de 830 mg bileşik A8 çözeltisi hazırlayın. Damlacık çözeltisini 6-benzyloxycarbonylamino-2-L-amino-heksanoik asit trimetilsilyl etil ester (649.5 mg) karışımına ekleyin ve N,N-diisopropylethylamine (591 μL) 24 mL'de 1,2-dikloroetan 3 dakika boyunca karıştırın ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırın.</li>
		<li>Çözeltiye 360,3 mg sodyum triacetoxyborohidrit ekleyin ve 24 saat boyunca oda sıcaklığında karıştırmaya devam edin.</li>
		<li>Reaksiyon karışımını 6 mL su ile söndürin. Reaksiyon karışımını 200 mL diklorometan ile 3x çıkarın ve suda% 10 sitrik asit 200 mL, 200 mL su ile 2x, 200 mL doymuş sodyum bikarbonat ve 200 mL salamura ile yıkayın. Organik tabakayı susuz sodyum sülfat üzerine kurutun, ham ürünü elde etmek için vakum altındaki uçucuları filtreleyin ve buharlaştırın.</li>
		<li>Ham ürünü 885 mg bileşik A9 elde etmek için silika jel flaş sütun kromatografisine (%5-30 etil asetat/heksanes) tabi edin.</li>
	</ol></li>
	<li>JBNT monomer sentezi<ol>
<li>0,54 g bileşik A9 'ı (0,54 g) %94 trifluoroasetik asit/tiyoanisol çözeltisinin 10 mL'sinde çözün ve oda sıcaklığında 72 saat karıştırın.</li>
		<li>Reaksiyon karışımına dietil eter (80 mL) ekleyin ve çökeltmeyi santrifüjleyin. Süpernatant içeren berrak trifluoroasetik asidi dökün ve beyaz çökeltiyi 168,6 mg ham JBNT monomer(Ek Dosya 1)elde etmek için dietil eter ve metanol ile yıkayın.</li>
		<li>Ham JBNT monomerini, ters faz sütununa sahip yüksek performanslı bir sıvı kromatografisi (HPLC) ile arındırın. İzolasyon programı aşağıda listelenmiştir: Solvent A: % 100 su; solvent B: %100 asetonitril; solvent C: pH=1 HCl su çözeltisi; akış hızı: 3 mL/dk (bkz. Tablo 1).</li>
		<li>Yaklaşık 7.2 dakikada en büyük zirveyi toplayın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. JBNT / FN için İmalat
<ol><li>40 μL 1 mg/mL FN sulu çözeltiye ve pipete birkaç kez 80 μL 1 mg/mL JBNT sulu çözelti ekleyin.</li>
	<li>Yaklaşık 10 s pipetlemeden sonra beyaz katı süspansiyonun varlığını kontrol edin. NOT: NM'nin kendi kendine montaj sürecini yakalamak için bir video çekildi (Ek Dosya 2).</li>
</ol>3. Liyofilize örneklerin gözlemlenmesi
NOT: Bu adım, JBNT'lerden ve FN'den yapılan NM'nin iskele yapısını göstermek için gerçekleştirilir.
<ol><li>Lyophilized malzeme gözlemi için FN, JBNT ve FN/JBNT NM çözümlerini hazırlayın. 20 μg/mL'lik bir FN çözeltisi yapmak için 10 μL 100 μg/mL FN'yi 40 μL damıtılmış su ile seyreltin.</li>
	<li>45 μL DI suda 5 μL 1 mg/mL JBNT seyrelterek 100 mg/mL JBNT çözeltisi hazırlayın.</li>
	<li>NM çözeltisini oluşturmak için 35 μL DI suda 10 μL 100 μg/mL FN ve 5 μL 1 mg/mL JBNT karıştırın.</li>
	<li>Sırasıyla FN, JBNT çözümü ve NM çözümü ile 96 kuyulu yuvarlak alt mikro plakalardan oluşan üç kuyuyu kapla. Her kuyu 50 μL çözelti alır.</li>
	<li>NM'nin iskele yapısını görselleştirmek için aşağıda açıklandığı gibi liyofilizasyon gerçekleştirin.<ol>
<li>Plakayı gece boyunca -80 °C'de dondurun.</li>
		<li>Lyophilized cihazı ve vakum pompasını açın.</li>
		<li>Sistemin sıcaklığını -50 °C'ye düşürmek için soğuma düğmesine basın.</li>
		<li>Donmuş plakayı liyofilize enstrümana koyun ve aletlerin tüm açıklıklarını kapatın.</li>
		<li>Sistem basıncını 0,9 mbar'a düşürmek için başlat düğmesini tıklatın.</li>
		<li>4 saat sonra, havalandırma düğmesine basın ve sistem basıncını atmosferik basınca artırmak için vanayı açın.</li>
		<li>Tabağı teofiliz aletinden çıkar.</li>
		<li>FN, JBNT'leri ve ortaya çıkan kendi kendine monte edilmiş NM'yi gözlemlemek için bir mikroskop kullanın. Malzemeler için bir kamera ile birkaç fotoğraf çekin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Absorpsiyon spektrum ölçümü
NOT: Kendi kendine monte edilmiş JBNT / FN NM12'yisunmak için FN ve JBNT'ler için spektrum değişikliğini kullanın.
<ol><li>JBNT/FN NM çözeltisini hazırlamak için 30 μL 100 μg/mL FN'yi 15 μL damıtılmış su ve 5 μL 1 mg/mL JBNT ile karıştırın. Çözeltiyi birkaç kez pipetledikten sonra beyaz katı süspansiyon görülebilir. NOT: Çözeltideki son JBNT ve FN konsantrasyonları sırasıyla 100 μg/mL ve 60 μg/mL'dir. NM çözümünde kullanılana aynı konsantrasyonda JBNT'ler ve FN çözümleri de kontrol çözümleri olarak hazırlanmıştır.</li>
	<li>JBNT kontrol çözeltisini hazırlamak için 5 μL 1 mg/mL JBNT'yi 45 μL damıtılmış su ile seyreltin.</li>
	<li>FN kontrol çözeltisi hazırlamak için 30 μL 100 μg/mL FN'yi 20 μL damıtılmış su ile seyreltin.</li>
	<li>NM'nin montajını karakterize etmek için FN, JBNT ve JBNT/FN NM çözeltilerinin UV-vis emme spektrumunu spektrofotometre ile ölçün (bkz. Malzeme Tablosu).<ol>
<li>UV-Vis düğmesini tıklatın. Spektrofotometrenin test yüzeyini temizleyin ve üzerine 2 μL damıtılmış su bırakın. 190-850 nm arasında boş olarak ölçün.</li>
		<li>Spektrofotometrenin test yüzeyini temizleyin ve üzerine 2 μL FN çözeltisi bırakın. FN çözeltisinin UV-Vis emilim spektrumunu 190 nm'den 850 nm'ye kadar ölçün.</li>
		<li>Spektrofotometrenin test yüzeyini temizleyin ve üzerine 2 μL JBNT çözeltisi bırakın. JBNT çözeltisinin emilim spektrumunu 190 nm'den 850 nm'ye kadar ölçün.</li>
		<li>Spektrofotometrenin test yüzeyini temizleyin ve üzerine 2 μL JBNT/FN NM çözeltisi bırakın. JBNT/FN NM çözeltisinin emilim spektrumunu 190 nm'den 850 nm'ye kadar ölçün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. İletim elektronik mikroskopisi (TEM) için JBNT/FN NM hazırlanması
<ol><li>Temel plazma temizleyici ile negatif boyamadan önce birkaç ızgarayı temizleyin (bkz. Malzeme Tablosu).</li>
	<li>İki farklı işlemi takiben numuneler için negatif boyama gerçekleştirin.<ol>
<li>Ayrı ızgaralara 3 μL 1 mg/mL JBNT sulu çözelti ve 3 μL JBNT/FN NM çözeltisi bırakın ve 2 dakika bekletin. Ardından her ızgarayı %0,5 uranil asetat (UA) çözeltisinin 100 μL'si ile durulayın. Fazla çözeltiyi filtre kağıdı ile boşaltın ve ızgaraları havayla kurutun.</li>
		<li>9 μL JBNT/FN NM solüsyonunun 3 μL%2,0 UA çözeltisi ile karıştırın ve birkaç kez pipetlayın. Pipet ızgaralar üzerinde karışık çözelti ve 2 dakika boyunca ızgaralarda tutun. Karışık çözeltiyi ızgaralardan çıkarmak ve ızgaraları oda sıcaklığında kurutmak için bir filtre kağıdı kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Son olarak, numuneyi JBNT'ler, adım 5.2.1 ile lekelenmiş JBNT/FN NM ve TEM ile 5.2.2 adımı ile lekelenmiş JBNT/FN NM için karakterize edin.</li>
</ol>6. In vitro biyolojik fonksiyon tahlil
<ol><li>200 μL negatif kontrol (NC, PBS), JBNT, FN ve JBNT/FN NM çözümlerini sırasıyla 8 iyi odalmış bir slayt kuyusuna ekleyin.</li>
	<li>Kuyuların dibindeki malzemeleri kaplamak için 8 kuyulu odalı örtü örtüsünü liyofilize aletle dondurun. Dondurarak kurutma protokolü adım 3.5 ile aynıdır.</li>
	<li>Daha sonra kuyulara 10.000 hücre /kuyu hMSC (Passage 3) ekleyin ve % 5 CO 2 ile 37 °C'de24saat kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Kuluçkadan sonra, hücre kültürü ortamını kuyulardan dışarı atın ve kültürü 1x PBS çözeltisi ile durulayın.</li>
	<li>Her kuyuya 100 μL sabitleyici çözelti ekleyin ve 5 dakika bekletin. Hücreleri 1x PBS ile iki kez hafifçe durulayın.</li>
	<li>Seyreltin 1% Triton-X 100 ila% 0.1. Her kuyuya 100 μL% 0.1 Triton-X 100 ekleyin ve 10 dakika bekletin. Hücreleri 1x PBS ile iki kez hafifçe durulayın.</li>
	<li>Rhodamine Phalloidin'i 1,65 μM'ye seyreltin. Hücreleri 1x PBS ile iki kez hafifçe durulayın.</li>
	<li>Floresan mikroskopla hücre görüntülerini yakalayın.</li>
	<li>Her grup için floresan görüntülerdeki hücre numaralarını sayın. Her kuyuda üç rastgele alanın ortalamasını alarak hücre yapışıklık yoğunluğunu hesaplayın.</li>
	<li>Tüm verileri ortalama ± standart sapma (SD) olarak sunun. Tek kuyruklu bir t testi kullanarak istatistiksel analizler yapın, ardından istatistiksel olarak anlamlı olarak kabul edilen p<0.05 ile varyans analizi (ANOVA).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+mobilization+of+exogenous+mesenchymal+stem+cells+to+bone+for+fracture+healing+and+sex+difference.">Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference.</a> Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).</li><li>Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+vitronectin+and+collagen+I+promotes+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).</li><li>Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+convergence+of+fracture+repair+and+stem+cells:+interplay+of+genes,+aging,+environmental+factors+and+disease.">The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).</li><li>De Becker, A., Riet, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homing+and+migration+of+mesenchymal+stromal+cells:+How+to+improve+the+efficacy+of+cell+therapy.">Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy.</a> World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).</li><li>Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+encapsulate+and+slowly+release+dexamethasone.">Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).</li><li>Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+for+incorporating+hydrophobic+drugs+in+physiological+environments.">Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).</li><li>Fenniri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+Rosette+Nanotubes:+Design,+Self-Assembly,+and+Characterization.">Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotube/hydrogel+composites+for+cartilage+tissue+engineering.">Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).</li><li>Van den Bogaerdt, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+cross-linking+by+adipose-derived+mesenchymal+stromal+cells+and+scar-derived+mesenchymal+cells:+Are+mesenchymal+stromal+cells+involved+in+scar+formation.">Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).</li><li>Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+molecule+visualized+in+electron+microscopy:+a+long,+thin,+flexible+strand.">Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand.</a> Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).</li><li>Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> U. S. Patent. , (2017).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+biomimetic+Nano-Matrix+for+stem+cell+Anchorage.">Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage.</a> Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).</li><li>Jones, M., Leroux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+micelles+-+a+new+generation+of+colloidal+drug+carriers.">Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).</li><li>Singh, P., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+and+stem+cell+differentiation+-+lessons+from+chondrogenesis.">Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis.</a> Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).</li><li>Martino, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+integrin+specificity+and+stem+cell+differentiation+in+2D+and+3D+environments+through+regulation+of+fibronectin+domain+stability.">Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability.</a> Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).</li><li>Somaiah, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+promotes+higher+adhesion,+survival+and+proliferation+of+mesenchymal+stem+cells.">Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells.</a> PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).</li><li>Ogura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow+and+enhancement+of+cell+attachment+by+fibronectin.">Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin.</a> Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).</li><li>Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Printing+of+scaffolds+for+tissue+regeneration+applications.">3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+and+functionally+optimized+silk-fibroin-gelatin+scaffold+using+3D+printing+to+repair+cartilage+injury+in+vitro+and+in+vivo.">Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo.</a> Advanced Material. 29, 1701089 (2017).</li><li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+inflammatory+activation+by+self-assembling+Rosette+nanotubes+in+human+Calu-3+pulmonary+epithelial+cells.">Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells.</a> Small. 4 (6), 817-823 (2008).</li><li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosette+nanotubes+show+low+acute+pulmonary+toxicity+in+vivo.">Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).</li></ol>

Dr. Yupeng Chen, NanoDe Therapeutics, Inc.'in kurucu ortağıdır.

Bu çalışmada, DNA'dan ilham alan JBNT'ler ve FN ile oluşturulan kendi kendine monte edilmiş bir biyomimetik NM geliştirdik. JBNT çözeltisini hazırlarken, JBNT liyofilize tozu PBS yerine suya çözülmelidir, çünkü PBS, montajlarını engelleyen JBNT'lerin aglomerasyonuna neden olacaktır. Ayrıca, NM'nin nano-fibril yapılarını gözlemlemek istiyorsak NM de suda monte edilmelidir, çünkü PBS'deki tuz, görüntülerin çözünürlüğünü büyük ölçüde azaltabilecek NM lifleri ile birlikte gelecektir....

İnsan mezenkimal kök hücreler (hMSC'ler), dokuların yenilenmesine ve bakımına yardımcı olan farklı mezenkimal soylar boyunca kendini yenileme ve kendini farklılaştırma potansiyelini göstermiştir1. Farklılaşma potansiyeline dayanarak, hMSC'ler mezenkimal doku yaralanmaları ve hematopoetik bozukluk tedavisi için aday olarak kabul edilir2. hMSC'ler doku onarımını, anjiogenezini artırarak ve iltihabı azaltarak yara iyileşmesini teşvik etme yeteneğini göstermiştir3. Bununla birlikte, biyokimyasal veya biyomalzemeler yardımı olmadan, hMSC'lerin bir hedef dokuya ulaşması ve istenen yerde çalışması için verimlilik düşüktür4. Lezyonlara yapışmak için hMSC'leri çekmek için çeşitli tasarlanmış iskeleler kullanılsa da, uzun bir kemiğin ortasındaki büyüme plakası kırığı gibi bazı bölgelere, düzensiz şekilli bir yaralı bölgeye mükemmel bir şekilde sığmayan geleneksel önceden imal edilmiş iskeleler tarafından kolayca erişilemez.
Burada, kendi kendine yerinde monte edilebilen ve ulaşılması zor bir hedefe enjekte edilebilen bir biyomimetik nanomalzeme geliştirdik. Enjekte edilebilir biyo-iskele NM, Janus baz nanotüpler (JBNTs) ve fibronektinden (FN) oluşur. Rozet Nanotüpleri (RNTs) olarak da bilinen JBNT'ler, DNA baz çiftlerinden, özellikle timin ve adenden türetilir, burada5,6,7. Şekil 1'degörüldüğü gibi, nanotüpler, türetilmiş DNA tabanının altı molekülü hidrojen bağları aracılığıyla kendi kendine birleşerek bir düzlem oluşturduğunda oluşur6. Daha sonra altı molekül, 200-300 μm uzunluğa kadar olabilen güçlü bir pi istifleme etkileşimi7aracılığıyla bir düzlemde birbirlerine yığılır. JBNT'ler morfolojik olarak kollajen liflerini taklit etmek için tasarlanmıştır, böylece FN onlarla reaksiyona girecektir.
FN, hücre dışı matriste (ECM)9bulunan yüksek moleküler ağırlıklı yapışkan glikoproteindir. Bunlar kök hücrelerin ECM'nin diğer bileşenlerine, özellikle kollajen10'abağlanmasına aracılık edebilir. JBNT'leri morfolojik olarak kollajen liflerini taklit etmek için tasarladık, böylece FN onlarla reaksiyona girerek kararsız bağlanma yoluyla birkaç saniye içinde NM oluşturabilir. Bu nedenle, NM, geleneksel olarak imal edilmiş iskeleler tarafından erişilemeyen bir kemik kırılma bölgesine enjekte edilecek umut verici bir biyo-iskeledir. Burada, enjekte edilebilir NM, doku yenilenmesi için bir iskele görevi görebilme potansiyellerini sergileyen hMSC ankraj in vitro'yu geliştirmek için mükemmel bir yetenek sunar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dichloroethane</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>39121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-cyanoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C88505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dimethylaminopyridine</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>D1450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 wells Chambered Coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>allylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>145831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentrated hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15230147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl dicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>361941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethyl acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>319902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylcarbamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHE0023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R37814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A13543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hexanes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>227064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human mesenchymal stem cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A17114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylformamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>227056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methylmorpholine N-oxide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A19802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetraoxide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>45385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>20012050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoryl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>347825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse phase column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25305-154630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silica gel</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>S0821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium ethoxide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L13083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium periodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium sulfite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium triacetoxyborohydride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer(NanoDrop One/One&#7580; UV-Vis)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem Cell Growth Medium BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thioanisole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T28002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>toluene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triethylamine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HFH10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion

Kök hücre ankrajını artırabilen bir doku mühendisliği biyolojik iskelesi olarak hizmet edecek bir biyomimetik NM geliştirilmiştir. Biyomimetik NM, sulu bir çözeltide kendi kendine montaj yoluyla JBNT'lerden ve FN'den oluşturulur. JBNT'ler iç hidrofobik içi boş kanallar ve dış hidrofilik yüzeylerle 200-300 μm uzunluğundadır. JBNT'ler pozitif olarak ve FN'ler negatif olarak ücretlendirilir. Bu nedenle, nötr sulu bir çözeltiye enjekte edildiğinde, NM demetlerini oluşturmak için yaygın olmayan yapıştırma yoluyla birbirine bağlanırlar. Kendi kendine montaj işlemi, herhangi bir kimyasal başlatıcı, ısı kaynağı veya UV ışığı olmadan birkaç saniye içinde tamamlanır. NM çözeltisinin pH'ı FN'lerin izoelektrik noktasından (pI 5.5-6.0) daha düşük olduğunda, NM demetleri pozitif yüklü FN varlığı nedeniyle kendiliğinden serbest kalacaktır.
NM'nin hücre dışı matrisi (ECM) morfolojik olarak taklit ettiği bilinmektedir ve bu nedenle, hMSC yapıştırmasını geliştirmek için mükemmel bir platform sağlayan enjekte edilebilir bir iskele olarak kullanılabilir. Hücre yoğunluğu analizi ve floresan görüntüleme deneyleri, NM'lerin negatif kontrole kıyasla hMSC'lerin ankrajını önemli ölçüde artırdığını gösterdi.

Çalışmalarımız, JBNT ve FN'nin NM oluşumunun hızlı olduğunu keşfetti, bu da 10 saniyede gerçekleşti. Şekil 2'degösterildiği gibi, JBNT çözeltisi FN çözeltisi ile karıştırıldığında ve birkaç kez pipetlendiğinde beyaz flokül elde edildi. NM'nin oluşum süreci tamamen biyomimetiktir. Harici uyaranlara gerek yoktur. İmalat süreci, çapraz bağlantı için ultraviyole ışık veya kimyasal başlatıcıya dayanan bazı gelişmekte olan biyomalzemelerden çok daha<su...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion at JoVE.com

Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

Bu protokolün amacı, Janus baz nanotüpleri (JBNTs) ve fibronektin (FN) ile bir biyomimetik nanomatrixin (NM) montajını göstermektir. İnsan mezenkimal kök hücreleri (hMSC' ler) ile birlikte kültürlendiğinde, NM'ler hMSC'lerin yapışkanını teşvik etmede mükemmel biyoaktivite sergiler.

Kök Hücre Yapışması için Janus Baz Nanotüpler ve Fibronektin ile Biyomimetik Nano Matris İmalatı

A biomimetic NM was developed to serve as a tissue-engineering biological scaffold, which can enhance stem cell anchorage. The biomimetic NM is formed ...

fabrication-biomimetic-nano-matrix-with-janus-base-nanotubes

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.0K Görüntüleme.  University of Connecticut. Bu protokolün amacı, Janus baz nanotüpleri (JBNTs) ve fibronektin (FN) ile bir biyomimetik nanomatrixin (NM) montajını göstermektir. İnsan mezenkimal kök hücreleri (hMSC' ler) ile birlikte kültürlendiğinde, NM'ler hMSC'lerin yapışkanını teşvik etmede mükemmel biyoaktivite sergiler.

Video: Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Önceden Tasarlanmış Boyut ve Şekle Sahip Polimerik ve Biyohidred Elyafların Mikroakışkan İmalatı

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Biyomühendislik

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and membrane environment2.
Coagulation Factor VIII (FVIII)3 is a multi-domain blood plasma glycoprotein. Defect or deficiency of FVIII is the cause for Hemophilia type A&#160;-&#160;a severe bleeding disorder. Upon proteolytic activation, FVIII binds to the serine protease Factor IXa on the negatively charged platelet membrane, which is critical for normal blood clotting4. Despite the pivotal role FVIII plays in coagulation, structural information for its membrane-bound state is incomplete5. Recombinant FVIII concentrate is the most effective drug against Hemophilia type A and commercially available FVIII can be expressed as human or porcine, both forming functional complexes with human Factor IXa6,7.
In this study we present a combination of Cryo-electron microscopy (Cryo-EM), lipid nanotechnology and structure analysis applied to resolve the membrane-bound structure of two highly homologous FVIII forms: human and porcine. The methodology developed in our laboratory to helically organize the two functional recombinant FVIII forms on negatively charged lipid nanotubes (LNT) is described.&#160;The representative results demonstrate that our approach is sufficiently sensitive to define the differences in the helical organization between the two highly homologous in sequence (86% sequence identity) proteins. Detailed protocols for the helical organization, Cryo-EM and electron tomography (ET) data acquisition are given. The two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) structure analysis applied to obtain the 3D reconstructions of human and porcine FVIII-LNT is discussed. The presented human and porcine FVIII-LNT structures show the potential of the proposed methodology to calculate the functional, membrane-bound organization of blood coagulation Factor VIII at high resolution.

We present a combination of Cryo-electron microscopy, lipid nanotechnology, and structure analysis applied to resolve the membrane-bound structure of two highly homologous FVIII forms: human and porcine. The methodology developed in our laboratory&#160;to helically organize the two functional recombinant FVIII forms on negatively charged lipid nanotubes (LNT) is described.

Lipid Nanotüpler Kan Pıhtılaşma Faktör VIII Sarmal Organizasyonu

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Matrix Modifikasyon Bağlı Hücresel Yapışma ve De-yapışma Real-time Değişiklikleri Tedbir Hücre-substrat Empedans ve Canlı Hücre Görüntüleme kullanma

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Solvent destekli çift katlı lipid (SALB) Yöntemi ile biyomembran Fabrikasyon

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

DNA nanotüpler Semiflexible polimerler eğitim için çok yönlü bir araç olarak

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

İmalat ve Organ-on-chip sistemin doğrudan Transendothelial elektrik direncini ölçmek için entegre elektrotlar ile doğrulama

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

Kültür Ultrathin Porated elastik Hydrogels bir Biomimetic membran için çift olarak hücre

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

Hücre tohum için özel özel Wells ve kendinden montajlı 3D baskı kalıpları kullanarak doku yüzük imalatı

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Gümüş nano tanecikleri ve onların antibakteriyel faaliyetleri ve sitotoksik özellikleri değerlendirilmesi ile modifiye çok duvarlı karbon nanotüpler sentezi

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...