Ces travaux sont soutenus financièrement par les NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) et l’Université du Connecticut.

1. Synthèse des JBNT
REMARQUE : Le monomère JBNT a été préparé tel qu’il a étépublié précédemment 11.
<ol><li>Synthèse du composé A1<ol>
<li>Préparer une solution contenant 8,50 g d’acide 2-cyanoacétique et 9,80 g d’éthylcarbamate dans 25 mL de toluène et 2,5 mL de N, N-diméthylformamide. Ajouter 4,90 mL de chlorure de phosphoryl dans le sens de la goutte. Chauffer ensuite le mélange à 70 °C et continuer à remuer pendant 1,5 h.</li>
		<li>Refroidir le mélange de réaction à température ambiante et verser 100 g d’eau glacée. Extraire la couche aqueuse avec de l’acétate éthylique (3 x 250 mL) et laver avec 100 mL de saumure. Séchez la couche organique sur du sulfate de sodium anhydre, filtrez et évaporez les substances volatiles sous vide pour obtenir un solide jaune pâle.</li>
		<li>Soumettez le solide jaune à la chromatographie de colonne flash de gel de silice (3% méthanol/dichloromethane) pour produire 15.61 g de composé A1 comme poudre blanche.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthèse du composé A2<ol>
<li>Mélanger 3,12 g de composé A1 et 2,75 g de carbonate de potassium dans 50 mL de N, N-diméthylformamide. Remuer à température ambiante pendant 2 h.</li>
		<li>Ajouter 2,6 mL de disulfide de carbone à la suspension de réaction. Continuer à remuer pendant 4 h.</li>
		<li>Ajouter l’éthanol absolu au mélange de réaction à 0 °C. Filtrer le jaune et laver avec de l’éther de déthyle. Sécher sous vide pendant la nuit pour produire 6,18 g de composé A2 comme solide jaune pâle.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthèse du composé A3<ol>
<li>Ajouter 2,7 mL d’iodure de méthyle dans 15 mL d’acétyltrile. En outre, préparer séparément une solution de composé A2 en ajoutant 6,18 g d’A2 à 80 mL d’eau / acétyltrile (7:3 ratio). Mélanger les deux solutions et remuer à température ambiante pendant 30 min.</li>
		<li>Chauffer le mélange de réaction à 95 °C et continuer à remuer pendant 3 h.</li>
		<li>Refroidir le mélange de réaction à température ambiante, puis évaporer les substances volatiles sous vide.</li>
		<li>Extraire les résidus 3x avec 100 mL d’acétate d’éthyle et laver avec de la saumure. Séchez la couche organique sur du sulfate de sodium anhydre, filtrez et évaporez les substances volatiles sous vide pour obtenir un solide jaune.</li>
		<li>Soumettez le solide jaune à la chromatographie de colonne flash de gel de silice (30% acétate d’éthyle/hexanes) pour donner 4.52 g du composé A3 comme solide jaune clair.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthèse du composé A4<ol>
<li>Préparer la solution d’allylamine en ajoutant 925 μL d’allylamine dans 20 mL d’éthanol. Ajoutez cette solution dropwise à la solution du composé A3, préparé en ajoutant 3,14 g d’A3 dans 75 mL d’éthanol absolu, plus de 30 min. Ensuite, chauffer le mélange de réaction au reflux pendant 16 h.</li>
		<li>Refroidir le mélange de réaction à température ambiante et évaporer les substances volatiles pour donner un solide jaune.</li>
		<li>Soumettez le solide jaune à la chromatographie de colonne flash de gel de silice (50% acétate d’éthyle/hexanes à 2% méthanol/dichloromethane) pour produire 1,80 g d’A4 composé comme cristal blanc.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthèse du composé A5<ol>
<li>Ajouter 2,05 g d’hydrochlorure de guanidinium et 7,8 mL d’éthoxide de sodium (21 wt % en éthanol) dans 14 mL d’éthanol absolu. Chauffer le mélange à 45 °C pendant 15 min.</li>
		<li>Filtrer le matériau insoluble et ajouter le filtrate directement dans la solution du composé A4, préparé en ajoutant 2,70 g d’A4 dans 40 mL d’éthanol absolu. Chauffer le mélange de réaction au reflux pendant 16 h.</li>
		<li>Filtrer le précipité pour obtenir 2,65 g de composé A5 comme un solide blanc éteint.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthèse du composé A6<ol>
<li>Ajouter 24,9 mL de triethylamine lentement au mélange de boue obtenu en ajoutant 2,11 g de composé A5 et 1,10 g de 4-Dimethylaminopyridine dans 120 mL de tétrahydrofuran sur 1 min. Remuer à température ambiante pendant 2 min.</li>
		<li>Ajouter 20,7 mL de di-tert-butyl dicarbonate dropwise au mélange de réaction et continuer à remuer à température ambiante pendant 40 h.</li>
		<li>Ajouter 20 mL d’eau pour étancher la réaction. Évaporer les volatiles sous vide.</li>
		<li>Extraire les résidus visqueux rouges avec 500 mL d’acétate d’éthyle. Ensuite, lavez-le avec 250 mL d’eau, 75 mL d’acide citrique à 10 %, 2x avec 200 mL d’eau, 200 mL de bicarbonate de sodium saturé et 200 mL de saumure. Séchez la couche organique sur du sulfate de sodium anhydre, filtrez et évaporez les substances volatiles sous vide pour donner un solide rouge/orange.</li>
		<li>Soumettez la chromatographie de colonne flash de gel de silice (0-20% acétate d’éthyle/hexanes) pour produire 3.87 g de composé A6 comme mousse blanche.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthèse du composé A7<ol>
<li>Ajouter l’oxyde N-méthylmorpholine N (50 wt.% dans l’eau, 1,64 mL) dans le sens de la goutte à la solution du composé A6 (2,93 g) dans l’acétone/eau (8:1, 58,5 mL) et remuer à température ambiante pendant 5 min.</li>
		<li>Ajouter le tétraoxyde d’osmium (solution 4% aqueuse) dans le sens de la goutte au mélange sur une période de 3 min et continuer à remuer à température ambiante pendant 24 h.</li>
		<li>Étanchez la réaction avec du sulfite de sodium aqueux de 1,0 M jusqu’à ce que la solution devient incolore. Retirer les substances volatiles sous vide pour obtenir une boue blanche dans l’eau. Extraire les résidus avec 350 mL de dichloromethane, puis laver avec 150 mL d’eau suivie d’un lavage avec 150 mL de saumure.</li>
		<li>Séchez la couche organique sur du sulfate de sodium anhydre, filtrez et évaporez les substances volatiles sous vide pour produire 2,45 g de composé A7 comme solide blanc.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthèse du composé A8<ol>
<li>Ajouter 760 g de paréide de sodium au mélange de 1,36 g de composé A7 dans 35 mL de dichlorométhane/eau (6:1, 35 mL) et remuer à température ambiante pendant 42 h.</li>
		<li>Filtrer le matériau insoluble et concentrer le filtrate sous vide. Extraire les résidus qui en résultent avec 250 mL de dichloromethane, puis laver avec 100 mL d’eau et 100 mL de saumure. Séchez la couche organique sur le sulfate de sodium anhydre, filtrez et évaporez les substances volatiles sous vide pour donner au produit brut.</li>
		<li>Soumettez le produit brut à la chromatographie de colonne flash de gel de silice (5-40% acétate d’éthyle/hexanes, puis 5% méthanol/dichloromethane) pour produire 1.08 g de composé A8.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthèse du composé A9<ol>
<li>Préparer une solution de 830 mg de composé A8 dans 15 mL de 1,2-dichloroéthane. Ajouter la solution de dropwise au mélange de 6-benzyloxycarbonylamino-2-L-amino-hexanoic acide trimethylsilyl ethyl ester (649,5 mg) et N,N-diisopropylethylamine (591 μL) en 24 mL de 1,2-dichloroéthane sur 3 min et remuer à température ambiante pendant 15 min.</li>
		<li>Ajouter 360,3 mg de triacetoxyborohydride de sodium à la solution et continuer à remuer à température ambiante pendant 24 h.</li>
		<li>Étancher le mélange de réaction avec 6 mL d’eau. Extraire le mélange de réaction 3x avec 200 mL de dichloromethane et laver avec 200 mL d’acide citrique à 10% dans l’eau, 2x avec 200 mL d’eau, 200 mL de bicarbonate de sodium saturé, et 200 mL de saumure dans cet ordre. Séchez la couche organique sur du sulfate de sodium anhydre, filtrez et évaporez les substances volatiles sous vide pour obtenir le produit brut.</li>
		<li>Soumettez le produit brut à la chromatographie de colonne flash de gel de silice (5-30% acétate d’éthyle/hexanes) pour produire 885 mg composé A9.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthèse du monomère JBNT<ol>
<li>Dissoudre 0,54 g de composé A9 (0,54 g) dans 10 mL de solution d’acide trifluoroacétique/thioanisole à 94 % et remuer à température ambiante pendant 72 h.</li>
		<li>Ajouter l’éther de déthyle (80 mL) au mélange de réaction et centrifugeuser le précipité vers le bas. Verser l’acide trifluoroacétique clair contenant du supernatant et laver le précipité blanc avec de l’éther de diéthyle et du méthanol pour produire 168,6 mg brut de monomère JBNT(Dossier supplémentaire 1).</li>
		<li>Purifiez le monomère brut JBNT par une chromatographie liquide haute performance (HPLC) avec une colonne de phase inverse. Le programme d’isolement est énuméré ci-dessous : Solvant A : 100 % eau; solvant B: 100% acétyltrile; solvant C : solution d’eau pH=1 HCl; débit : 3 mL/min (voir le tableau 1).</li>
		<li>Recueillir le plus grand pic à environ 7,2 min.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fabrication pour JBNT/FN
<ol><li>Ajouter 80 μL de solution aqueuse JBNT de 1 mg/mL à 40 μL de solution aqueuse FN de 1 mg/mL et pipette à plusieurs reprises.</li>
	<li>Vérifiez la présence d’une suspension solide blanche après le pipetage pendant environ 10 s. REMARQUE : Une vidéo a été tournée pour capturer le processus d’auto-assemblage de NM (Fichier supplémentaire 2).</li>
</ol>3. Observation de spécimens lyophilisés
REMARQUE : Cette étape est effectuée pour montrer la structure de l’échafaudage de NM fabriqué à partir de JBNTs et FN.
<ol><li>Préparer les solutions FN, JBNT et FN/JBNT NM pour l’observation des matériaux lyophilisés. Diluer 10 μL de 100 μg/mL de FN avec 40 μL d’eau distillée pour faire une solution de 20 μg/mL de FN.</li>
	<li>Préparer une solution de 100 mg/mL de JBNTs en diluant 5 μL de 1 mg/mL de JBNTs dans 45 μL d’eau DI.</li>
	<li>Mélanger 10 μL de 100 μg/mL FN et 5 μL de 1 mg/mL de JBNTs dans 35 μL d’eau DI pour former la solution NM.</li>
	<li>Enduire trois puits de microplaques rondes rondes de 96 puits avec la solution FN, JBNT et NM, respectivement. Chaque puits reçoit 50 μL de la solution.</li>
	<li>Effectuez la lyophilisation, comme décrit ci-dessous, pour visualiser la structure de l’échafaudage du NM.<ol>
<li>Congeler la plaque à -80 °C pendant la nuit.</li>
		<li>Allumez l’instrument lyophilisé et la pompe à vide.</li>
		<li>Appuyez sur le bouton de refroidissement pour réduire la température du système à -50 °C.</li>
		<li>Mettez la plaque congelée dans l’instrument lyophilisé et fermez toutes les ouvertures des instruments.</li>
		<li>Cliquez sur le bouton de démarrage pour réduire la pression du système à 0,9 mbar.</li>
		<li>Après 4 h, appuyez sur le bouton aération et ouvrez la vanne pour augmenter la pression du système sur la pression atmosphérique.</li>
		<li>Sortez la plaque de l’instrument lyophilisé.</li>
		<li>Utilisez un microscope pour observer le FN, les JBNT et le NM auto-assemblé qui en résulte. Prenez plusieurs photos avec un appareil photo pour les matériaux.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Mesure des spectres d’absorption
REMARQUE : Utilisez le changement de spectre pour les FN et les JBNT pour présenter le JBNT/FN NM12 auto-assemblé.
<ol><li>Mélanger 30 μL de 100 μg/mL FN avec 15 μL d’eau distillée et 5 μL de 1 mg/mL de JBNTs pour préparer la solution JBNT/FN NM. Suspension solide blanche peut être vu après pipetting la solution à plusieurs reprises. REMARQUE : Les concentrations finales de JBNTs et de FN dans la solution sont respectivement de 100 μg/mL et de 60 μg/mL. Les solutions JBNT et FN à la même concentration que celle utilisée dans la solution NM ont également été préparées comme solutions de contrôle.</li>
	<li>Diluer 5 μL de 1 mg/mL de JBNTs avec 45 μL d’eau distillée pour préparer la solution de contrôle JBNT.</li>
	<li>Diluer 30 μL de 100 μg/mL FN avec 20 μL d’eau distillée pour préparer la solution de contrôle des FN.</li>
	<li>Mesurer les spectres d’absorption uv-vis des solutions FN, JBNT et JBNT/FN NM avec le spectrophotomètre (voir tableau des matériaux)pour caractériser l’assemblage de NM.<ol>
<li>Cliquez sur le bouton UV-Vis. Nettoyez la surface d’essai du spectrophotomètre et laissez tomber 2 μL d’eau distillée dessus. Mesurez-le comme blanc de 190-850 nm.</li>
		<li>Nettoyez la surface d’essai du spectrophotomètre et déposez 2 μL de solution FN dessus. Mesurer les spectres d’absorption UV-Vis de la solution FN de 190 nm à 850 nm.</li>
		<li>Nettoyez la surface d’essai du spectrophotomètre et déposez 2 μL de solution JBNT dessus. Mesurer les spectres d’absorption de la solution JBNT de 190 nm à 850 nm.</li>
		<li>Nettoyez la surface d’essai du spectrophotomètre et déposez 2 μL de solution JBNT/FN NM dessus. Mesurer les spectres d’absorption de la solution JBNT/FN NM de 190 nm à 850 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Préparation de JBNT/FN NM pour la microscopie électronique de transmission (TEM)
<ol><li>Nettoyez plusieurs grilles avant de les colorer négativement avec un nettoyeur plasma de base (voir tableau des matériaux).</li>
	<li>Effectuez la coloration négative pour les spécimens suivant deux processus différents.<ol>
<li>Déposer 3 μL de 1 mg/mL de solution aqueuse JBNTs et 3 μL de solution JBNT/FN NM sur les grilles séparées et la laisser pendant 2 minutes. Rincez ensuite chaque grille avec 100 μL de solution d’acétate d’uranyle (UA) de 0,5 %. Égoutter l’excès de solution avec du papier filtre et sécher à l’air les grilles.</li>
		<li>Mélangez 9 μL de solution JBNT/FN NM avec 3 μL de solution UA à 2,0 % et pipette à plusieurs reprises. Pipette la solution mixte sur les grilles et le garder sur les grilles pendant 2 min. Utilisez un papier filtre pour enlever la solution mixte des grilles et sécher les grilles à température ambiante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Enfin, caractérisez le spécimen pour JBNTs, JBNT/FN NM taché de l’étape 5.2.1, et JBNT/FN NM taché avec l’étape 5.2.2 avec le TEM.</li>
</ol>6. Analyse de la fonction biologique in vitro
<ol><li>Ajouter 200 μL de contrôles négatifs (NC, PBS), JBNTs, FN et les solutions JBNT/FN NM dans un puits d’une diapositive de 8 puits, respectivement.</li>
	<li>Congelez le verre de couverture 8 bien chambé avec l’instrument lyophilisé pour enduire les matériaux au fond des puits. Le protocole de séchage au gel est le même que l’étape 3.5.</li>
	<li>Ajoutez ensuite 10 000 cellules/puits hMSCs (Passage 3) dans les puits et incubez-les pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO2.</li>
	<li>Après l’incubation, pipette le milieu de culture cellulaire des puits et rincer la culture avec 1x solution PBS.</li>
	<li>Ajouter 100 μL de la solution fixative à chaque puits avec des cellules et laisser pendant 5 min. Rincer délicatement les cellules avec 1x PBS deux fois.</li>
	<li>Diluer 1% Triton-X 100 à 0,1%. Ajouter 100 μL de 0,1% Triton-X 100 à chaque puits avec des cellules et laisser pendant 10 min. Rincer délicatement les cellules avec 1x PBS deux fois.</li>
	<li>Diluer la rhodamine phalloidine à 1,65 μM. Ajouter 100 μL de rhodamine phalloidine à chaque puits avec des cellules et incuber le verre de couverture chambé à l’abri de la lumière à température ambiante pendant 30 min. Rincer délicatement les cellules avec 1x PBS deux fois.</li>
	<li>Capturez les images cellulaires à l’aide d’un microscope fluorescent.</li>
	<li>Comptez les numéros de cellule sur les images fluorescentes pour chaque groupe. Calculer la densité d’adhérence cellulaire en moyenne de trois zones aléatoires dans chaque puits.</li>
	<li>Présenter toutes les données comme moyen ± écart type (DD). Effectuer des analyses statistiques à l’aide d’un t-test à une queue, suivi de l’analyse de la variance (ANOVA) avec p<0,05, qui est considéré comme statistiquement significatif.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+mobilization+of+exogenous+mesenchymal+stem+cells+to+bone+for+fracture+healing+and+sex+difference.">Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference.</a> Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).</li><li>Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+vitronectin+and+collagen+I+promotes+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).</li><li>Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+convergence+of+fracture+repair+and+stem+cells:+interplay+of+genes,+aging,+environmental+factors+and+disease.">The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).</li><li>De Becker, A., Riet, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homing+and+migration+of+mesenchymal+stromal+cells:+How+to+improve+the+efficacy+of+cell+therapy.">Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy.</a> World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).</li><li>Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+encapsulate+and+slowly+release+dexamethasone.">Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).</li><li>Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+for+incorporating+hydrophobic+drugs+in+physiological+environments.">Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).</li><li>Fenniri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+Rosette+Nanotubes:+Design,+Self-Assembly,+and+Characterization.">Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotube/hydrogel+composites+for+cartilage+tissue+engineering.">Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).</li><li>Van den Bogaerdt, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+cross-linking+by+adipose-derived+mesenchymal+stromal+cells+and+scar-derived+mesenchymal+cells:+Are+mesenchymal+stromal+cells+involved+in+scar+formation.">Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).</li><li>Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+molecule+visualized+in+electron+microscopy:+a+long,+thin,+flexible+strand.">Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand.</a> Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).</li><li>Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> U. S. Patent. , (2017).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+biomimetic+Nano-Matrix+for+stem+cell+Anchorage.">Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage.</a> Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).</li><li>Jones, M., Leroux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+micelles+-+a+new+generation+of+colloidal+drug+carriers.">Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).</li><li>Singh, P., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+and+stem+cell+differentiation+-+lessons+from+chondrogenesis.">Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis.</a> Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).</li><li>Martino, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+integrin+specificity+and+stem+cell+differentiation+in+2D+and+3D+environments+through+regulation+of+fibronectin+domain+stability.">Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability.</a> Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).</li><li>Somaiah, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+promotes+higher+adhesion,+survival+and+proliferation+of+mesenchymal+stem+cells.">Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells.</a> PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).</li><li>Ogura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow+and+enhancement+of+cell+attachment+by+fibronectin.">Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin.</a> Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).</li><li>Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Printing+of+scaffolds+for+tissue+regeneration+applications.">3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+and+functionally+optimized+silk-fibroin-gelatin+scaffold+using+3D+printing+to+repair+cartilage+injury+in+vitro+and+in+vivo.">Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo.</a> Advanced Material. 29, 1701089 (2017).</li><li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+inflammatory+activation+by+self-assembling+Rosette+nanotubes+in+human+Calu-3+pulmonary+epithelial+cells.">Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells.</a> Small. 4 (6), 817-823 (2008).</li><li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosette+nanotubes+show+low+acute+pulmonary+toxicity+in+vivo.">Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).</li></ol>

Le Dr Yupeng Chen est cofondateur de NanoDe Therapeutics, Inc.

Dans cette étude, nous avons développé un NM biomimétique auto-assemblé, qui a été formé avec des JBNTs inspirés de l’ADN et fn. Lors de la préparation de la solution JBNT, la poudre lyophilisée JBNT devrait être dissoute dans l’eau au lieu de PBS parce que PBS provoquera l’agglomération de JBNTs, ce qui inhibe leur assemblage. En outre, le NM devrait également être assemblé dans l’eau si nous voulons observer les structures nano-fibriles du NM, parce que le sel dans PBS se regroupera avec des fib...

Les cellules souches mésenchymales humaines (HMSCs) ont montré le potentiel d’auto-renouvellement et d’auto-différenciation le long de différentes lignées mésenchymales, ce qui contribue à la régénération et à l’entretien destissus 1. Basé sur le potentiel de différenciation, hMSCs sont considérés comme candidats pour des dommages mésenchymal de tissu et thérapie hématopoieticde désordre 2. HMSCs ont montré la capacité de favoriser la guérison des plaies en augmentant la réparation des tissus, l’angiogenèse, et la réduction de l’inflammation3. Toutefois, sans l’aide biochimique ou biomatériaux, l’efficacité pour les HMC d’atteindre un tissu cible et de fonctionner à l’endroit désiré est faible4. Bien que divers échafaudages d’ingénierie aient été utilisés pour attirer les HMSC à adhérer aux lésions, certains sites tels que la rupture de plaque de croissance, au milieu d’un os long, ne sont pas facilement accessibles par les échafaudages préfabriqués conventionnels, qui peuvent ne pas s’adapter parfaitement dans un emplacement blessé irrégulièrement formé.
Ici, nous avons développé un nanomatériau biomimétique qui peut s’auto-assembler in situ et être injecté dans une zone cible difficile à atteindre. Le bio-échafaudage injectable NM est composé de nanotubes de base Janus (JBNTs) et de fibronectine (FN). JBNTs, également connu sous le nom nanotubes rosette (RNTs), sont dérivés de paires de base d’ADN, en particulier la thymine et l’adénine,ici 5,6,7. Comme on le voit dans la figure 1, les nanotubes sont formés lorsque six molécules des paires de base d’ADN dérivées s’auto-assemblent par liaisons hydrogène pour former unplan 6. Six molécules sont ensuite empilées les unes sur les autres dans un plan via une forte interaction pi-empilage7, qui peut être jusqu’à 200-300 μm de longueur. Les JBNTs sont conçus pour imiter morphologiquement les fibres de collagène afin que FN réagisse avec eux.
Le FN est une glycoprotéine adhésive à poids moléculaire élevé, que l’on retrouve dans la matrice extracellulaire (ECM)9. Ceux-ci peuvent jouer un rôle de médiateur dans l’attachement des cellules souches à d’autres composants de l’ECM, en particulier lecollagène 10. Nous avons conçu des JBNTs pour imiter morphologiquement les fibres de collagène afin que FN puisse réagir avec eux pour former NM en quelques secondes par liaison noncovalente. Par conséquent, NM est un bio-échafaudage prometteur à injecter dans un site de fracture osseuse qui ne pouvait pas être accessible par les échafaudages fabriqués de façon conventionnelle. Ici, le NM injectable présente une excellente capacité à améliorer l’ancrage hMSC in vitro, présentant leur potentiel à servir d’échafaudage pour la régénération des tissus.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dichloroethane</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>39121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-cyanoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C88505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dimethylaminopyridine</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>D1450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 wells Chambered Coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>allylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>145831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentrated hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15230147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl dicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>361941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethyl acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>319902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylcarbamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHE0023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R37814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A13543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hexanes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>227064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human mesenchymal stem cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A17114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylformamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>227056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methylmorpholine N-oxide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A19802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetraoxide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>45385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>20012050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoryl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>347825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse phase column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25305-154630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silica gel</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>S0821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium ethoxide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L13083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium periodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium sulfite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium triacetoxyborohydride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer(NanoDrop One/One&#7580; UV-Vis)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem Cell Growth Medium BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thioanisole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T28002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>toluene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triethylamine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HFH10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion

Un NM biomimétique a été développé pour servir d’échafaudage biologique d’ingénierie tissulaire, qui peut améliorer l’ancrage des cellules souches. Le NM biomimétique est formé à partir de JBNTs et FN par auto-assemblage dans une solution aqueuse. Les JBNT mesurent de 200 à 300 μm de longueur avec des canaux creux hydrophobes intérieurs et des surfaces hydrophiliques extérieures. Les JBNT sont facturés positivement et les NF sont facturés négativement. Par conséquent, lorsqu’ils sont injectés dans une solution aqueuse neutre, ils sont collés entre eux par liaison non rentable pour former les faisceaux NM. Le processus d’auto-assemblage est terminé en quelques secondes sans aucun initiateur chimique, source de chaleur ou lumière UV. Lorsque le pH de la solution NM est inférieur au point isoélectrique des FN (pI 5.5-6.0), les faisceaux NM s’auto-libèrent en raison de la présence d’un FN chargé positivement.
NM est connu pour imiter la matrice extracellulaire (ECM) morphologiquement et, par conséquent, peut être utilisé comme un échafaudage injectable, qui fournit une excellente plate-forme pour améliorer l’adhérence hMSC. L’analyse de la densité cellulaire et les expériences d’imagerie par fluorescence ont indiqué que les MR augmentaient considérablement l’ancrage des HMC par rapport au contrôle négatif.

Nos études ont découvert que la formation du NM des JBNT et du FN est rapide, ce qui s’est produit en 10 secondes. Comme le montre la figure 2,la floccule blanche a été obtenue lorsque la solution JBNT a été mélangée à la solution FN et pipetted à plusieurs reprises. Le processus de formation de NM est complètement biomimétique. Aucun stimulus externe n’est nécessaire. Le processus de fabrication est beaucoup plus facile que celui de certains biomatériaux émergents, qui es...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion at JoVE.com

Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

L’objectif de ce protocole est de montrer l’assemblage d’une nanomatrix biomimétique (NM) avec des nanotubes de base Janus (JBNTs) et de la fibronectine (FN). Lorsqu’ils sont co-cultivés avec des cellules souches mésenchymales humaines (HMSCs), les MR présentent une excellente bioactivité en encourageant l’adhérence hMSCs.

Fabrication d’une nanomatrice biomimétique avec nanotubes de base Janus et fibronectine pour l’adhérence aux cellules souches

A biomimetic NM was developed to serve as a tissue-engineering biological scaffold, which can enhance stem cell anchorage. The biomimetic NM is formed ...

fabrication-biomimetic-nano-matrix-with-janus-base-nanotubes

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.0K vues.  University of Connecticut. L’objectif de ce protocole est de montrer l’assemblage d’une nanomatrix biomimétique (NM) avec des nanotubes de base Janus (JBNTs) et de la fibronectine (FN). Lorsqu’ils sont co-cultivés avec des cellules souches mésenchymales humaines (HMSCs), les MR présentent une excellente bioactivité en encourageant l’adhérence hMSCs.

Vidéo: Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Fabrication microfluidique de fibres polymères et biohybrides avec une taille et une forme redessinées

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Recherche

Bio-ingénierie

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and membrane environment2.
Coagulation Factor VIII (FVIII)3 is a multi-domain blood plasma glycoprotein. Defect or deficiency of FVIII is the cause for Hemophilia type A&#160;-&#160;a severe bleeding disorder. Upon proteolytic activation, FVIII binds to the serine protease Factor IXa on the negatively charged platelet membrane, which is critical for normal blood clotting4. Despite the pivotal role FVIII plays in coagulation, structural information for its membrane-bound state is incomplete5. Recombinant FVIII concentrate is the most effective drug against Hemophilia type A and commercially available FVIII can be expressed as human or porcine, both forming functional complexes with human Factor IXa6,7.
In this study we present a combination of Cryo-electron microscopy (Cryo-EM), lipid nanotechnology and structure analysis applied to resolve the membrane-bound structure of two highly homologous FVIII forms: human and porcine. The methodology developed in our laboratory to helically organize the two functional recombinant FVIII forms on negatively charged lipid nanotubes (LNT) is described.&#160;The representative results demonstrate that our approach is sufficiently sensitive to define the differences in the helical organization between the two highly homologous in sequence (86% sequence identity) proteins. Detailed protocols for the helical organization, Cryo-EM and electron tomography (ET) data acquisition are given. The two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) structure analysis applied to obtain the 3D reconstructions of human and porcine FVIII-LNT is discussed. The presented human and porcine FVIII-LNT structures show the potential of the proposed methodology to calculate the functional, membrane-bound organization of blood coagulation Factor VIII at high resolution.

We present a combination of Cryo-electron microscopy, lipid nanotechnology, and structure analysis applied to resolve the membrane-bound structure of two highly homologous FVIII forms: human and porcine. The methodology developed in our laboratory&#160;to helically organize the two functional recombinant FVIII forms on negatively charged lipid nanotubes (LNT) is described.

Organisation hélicoïdale de facteur VIII de coagulation du sang sur les lipides nanotubes

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Utilisant une impédance Cell-substrat et imagerie de cellules vivantes pour mesurer les changements en temps réel dans adhésion cellulaire et De-adhérence induites par Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembrane Fabrication par le solvant assistée bicouche lipidique (SALB) Méthode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micromodelage et l&#39;Assemblée des microvaisseaux 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

Nanotubes d’ADN comme un outil polyvalent pour l’étude des polymères semi-flexibles

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Fabrication et Validation d’un système d’orgue-on-chip avec électrodes intégrées à quantifier directement transendothéliale résistance électrique

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

Hydrogels ultraminces évaluation élastique comme une Membrane de sous-sol biomimétiques pour Dual Culture cellulaire

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

Fabrication de puits d’Agarose personnalisé pour l’ensemencement de la cellule et l’anneau de tissu auto-assemblage à l’aide de moules 3D-imprimé

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Synthèse des Nanotubes de carbone Multi modifiés avec des nanoparticules d’argent et de l’évaluation de leurs activités antibactériennes et propriétés cytotoxiques

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...