Diese Arbeit wird finanziell unterstützt durch NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) und University of Connecticut.

1. Synthese von JBNTs
HINWEIS: JBNT monomer wurde wie zuvor veröffentlicht11erstellt.
<ol><li>Synthese der Verbindung A1<ol>
<li>Bereiten Sie eine Lösung vor, die 8,50 g 2-Cyanoessigsäure und 9,80 g Ethylcarbamat in 25 ml Toluin und 2,5 ml N, N-Dimethylformamid enthält. 4,90 ml Phosphorylchlorid tropfenweise hinzufügen. Dann die Mischung auf 70 °C erhitzen und 1,5 h rühren.</li>
		<li>Kühlen Sie das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur und gießen Sie 100 g Eiswasser ein. Die wässrige Schicht mit Ethylacetat (3 x 250 ml) abziehen und mit 100 ml Sole waschen. Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Flüchtige unter Vakuum, um einen hellgelben Feststoff zu erhalten.</li>
		<li>Den gelben Feststoff der Kieselgel-Flashsäulenchromatographie (3% Methanol/Dichlormethan) unterziehen, um 15,61 g Verbindung A1 als weißes Pulver zu ergeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A2<ol>
<li>3,12 g Verbindung A1 und 2,75 g Kaliumcarbonat in 50 ml N, N-Dimethylformamid mischen. Bei Raumtemperatur 2 h umrühren.</li>
		<li>Fügen Sie der Reaktionssuspension 2,6 ml Kohlenstoffdisulfid hinzu. Halten Sie rühren für 4 h.</li>
		<li>Absolutes Ethanol bei 0 °C in das Reaktionsgemisch geben. Filtern Sie den gelben Niederschlag heraus und waschen Sie ihn mit dem Ethylether. Unter Vakuum über Nacht trocknen, um 6,18 g Verbindung A2 als hellgelb fest zu ergeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A3<ol>
<li>2,7 ml Methyljodid in 15 ml Acetonitril hinzufügen. Außerdem eine Lösung der Verbindung A2 separat vorbereiten, indem 6,18 g A2 bis 80 ml Wasser/Acetonitril (7:3-Verhältnis) hinzugefügt werden. Mischen Sie beide Lösungen und rühren Sie bei Raumtemperatur für 30 min.</li>
		<li>Das Reaktionsgemisch auf 95 °C erhitzen und 3 h rühren.</li>
		<li>Kühlen Sie das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur, und verdampfen Sie dann die Flüchtigen unter Vakuum.</li>
		<li>Den Rückstand 3x mit 100 ml Ethylacetat extrahieren und mit Salzlake waschen. Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum, um einen gelben Feststoff zu erhalten.</li>
		<li>Den gelben Feststoff der Kieselgel-Blitzsäulenchromatographie (30% Ethylacetat/Hexane) unterziehen, um 4,52 g der Verbindung A3 als hellgelben Feststoff zu ergeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A4<ol>
<li>Bereiten Sie die Allylaminlösung vor, indem Sie 925 L Allylamin in 20 ml Ethanol hinzufügen. Fügen Sie diese Lösung tropfenweise in die Lösung der Verbindung A3, vorbereitet durch Zugabe von 3,14 g A3 in 75 ml absolutem Ethanol, über 30 min. Dann erhitzen Sie das Reaktionsgemisch zu Reflux für 16 h.</li>
		<li>Kühlen Sie das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur und verdampfen Sie die Flüchtigen, um einen gelben Feststoff zu geben.</li>
		<li>Den gelben Feststoff der Kieselgel-Säulenchromatographie (50% Ethylacetat/Hexanen bis 2% Methanol/Dichlormethan) unterziehen, um 1,80 g Verbindung A4 als weißen Kristall zu ergeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A5<ol>
<li>2,05 g Guanidiniumhydrochlorid und 7,8 ml Natriumethoxid (21 Gew.-% in Ethanol) in 14 ml absolutes Ethanol hinzufügen. Das Gemisch 15 min auf 45 °C erhitzen.</li>
		<li>Filtern Sie das unlösliche Material ab und fügen Sie das Filtrat direkt in die Lösung der Verbindung A4 ein, die durch Zugabe von 2,70 g A4 in 40 ml absolutem Ethanol hergestellt wird. Erhitzen Sie das Reaktionsgemisch auf Reflux für 16 h.</li>
		<li>Filtern Sie den Niederschlag heraus, um 2,65 g Verbindung A5 als off-white Feststoff zu erhalten.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A6<ol>
<li>Fügen Sie 24,9 ml Triethylamin langsam in das Güllegemisch, das durch Zugabe von 2,11 g Verbindung A5 und 1,10 g 4-Dimethylaminopyridin in 120 ml Tetrahydrofuran über 1 min erhalten wird. Bei Raumtemperatur 2 min rühren.</li>
		<li>20,7 ml Di-Tert-Butyldicarbonat tropfenweise in das Reaktionsgemisch geben und bei Raumtemperatur 40 h rühren.</li>
		<li>Fügen Sie 20 ml Wasser hinzu, um die Reaktion zu löschen. Verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum.</li>
		<li>Extrahieren Sie den roten viskosen Rückstand mit 500 ml Ethylacetat. Dann mit 250 ml Wasser, 75 ml 10% Zitronensäure, 2x mit 200 ml Wasser, 200 ml gesättigtem Natriumbicarbonat und 200 ml Sole einwaschen. Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum, um einen rot/orange festen Körper zu geben.</li>
		<li>Den Feststoff der Kieselgel-Säulenchromatographie (0-20% Ethylacetat/Hexane) unterziehen, um 3,87 g Verbindung A6 als weißen Schaum zu ergeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A7<ol>
<li>N-Methylmorpholine N-Oxid (50 Gew.% in Wasser, 1,64 ml) tropfenweise in die Lösung der Verbindung A6 (2,93 g) in Aceton/Wasser (8:1, 58,5 ml) geben und bei Raumtemperatur 5 min rühren.</li>
		<li>Osmiumtetraoxid (4% wässrige Lösung) über einen Zeitraum von 3 min tropfenweise in das Gemisch geben und bei Raumtemperatur 24 h rühren.</li>
		<li>Die Reaktion mit 1,0 M wässrigem Natriumsulfit ablöschen, bis die Lösung farblos wird. Entfernen Sie die flüchtigen Stoffe unter Vakuum, um eine weiße Gülle in Wasser zu führen. Den Rückstand mit 350 ml Dichlormethan abziehen und dann mit 150 ml Wasser waschen, gefolgt von einer Wäsche mit 150 ml Sole.</li>
		<li>Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum, um 2,45 g Verbindung A7 als weißen Feststoff zu ergeben.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A8<ol>
<li>760 g Natriumperiodid in 35 ml Dichlormethan/Wasser (6:1, 35 ml) in das Gemisch von 1,36 g Verbindung A7 geben und bei Raumtemperatur 42 h rühren.</li>
		<li>Filtern Sie das unlösliche Material ab und konzentrieren Sie das Filtrat unter Vakuum. Die resultierenden Rückstände mit 250 ml Dichlormethan extrahieren und dann mit 100 ml Wasser und 100 ml Sole waschen. Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum, um das Rohprodukt zu erhalten.</li>
		<li>Das Rohprodukt der Kieselgel-Säulenchromatographie (5-40% Ethylacetat/Hexane, dann 5% Methanol/Dichlormethan) auf 1,08 g Verbindung A8 auferliegen.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese der Verbindung A9<ol>
<li>Bereiten Sie eine Lösung von 830 mg Verbindung A8 in 15 ml 1,2-Dichlorethan vor. Fügen Sie die Lösung tropfenweise in das Gemisch aus 6-Benzyloxycarbonylamino-2-L-Amino-Hexanosäure-Trimethylsilyl-Ethylester (649,5 mg) und N,N-Diisopropylethylamin (591 l) in 24 ml von 1,2-Dichlorethan über 3 min und rühren bei Raumtemperatur für 15 min.</li>
		<li>360,3 mg Natriumtriacetoxyborohydrid in die Lösung geben und bei Raumtemperatur 24 h rühren.</li>
		<li>Das Reaktionsgemisch mit 6 ml Wasser ablöschen. Das Reaktionsgemisch 3x mit 200 ml Dichlormethan extrahieren und mit 200 ml 10% Zitronensäure in Wasser, 2x mit 200 ml Wasser, 200 ml gesättigtem Natriumbicarbonat und 200 ml Sole in dieser Reihenfolge waschen. Trocknen Sie die organische Schicht über wasserfreiem Natriumsulfat, filtern und verdampfen Sie die Flüchtigen unter Vakuum, um das Rohprodukt zu erhalten.</li>
		<li>Das Rohprodukt der Kieselgel-Flashsäulenchromatographie (5-30% Ethylacetat/Hexane) auf 885 mg Verbindung A9 aussetzen.</li>
	</ol></li>
	<li>Synthese von JBNT-Monomer<ol>
<li>0,54 g Verbindung A9 (0,54 g) in 10 ml 94% Trifluoressigsäure/Thioanisollösung auflösen und bei Raumtemperatur 72 h rühren.</li>
		<li>Diethylether (80 ml) dem Reaktionsgemisch hinzufügen und den Niederschlag zentrieren. Gießen Sie die klare Trifluoressigsäure, die Überstand enthält, und waschen Sie den weißen Niederschlag mit Demethylether und Methanol, um 168,6 mg Roh-JBNT-Monomer(Ergänzungsdatei 1) zu ergeben.</li>
		<li>Reinigen Sie das rohe JBNT-Monomer durch eine hochleistungsreiche Flüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einer Reverse-Phase-Säule. Das Isolationsprogramm ist unten aufgeführt: Lösungsmittel A: 100% Wasser; Lösungsmittel B: 100% Acetonitril; Lösungsmittel C: pH=1 HCl-Wasserlösung; Durchfluss: 3 ml/min (siehe Tabelle 1).</li>
		<li>Sammeln Sie den größten Gipfel in etwa 7,2 min.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Herstellung für JBNT/FN
<ol><li>Fügen Sie die wässrige Lösung JBNT mit 80 l von 1 mg/ml mehrmals in eine 1 mg/ml FN-Wässerlösung und Pipette.</li>
	<li>Prüfen Sie, ob eine weiße Feststoffsuspension nach dem Pipetieren ca. 10 s ist. HINWEIS: Ein Video wurde aufgenommen, um den Selbstmontageprozess von NM (Supplemental File 2) zu erfassen.</li>
</ol>3. Beobachtung lyophilisierter Proben
HINWEIS: Dieser Schritt wird ausgeführt, um die Gerüststruktur von NM aus JBNTs und FN anzuzeigen.
<ol><li>Bereiten Sie FN-, JBNT- und FN/JBNT NM-Lösungen für die Lyophilisierte Materialbeobachtung vor. Verdünnen Sie 10 l von 100 g/ml FN mit 40 l destilliertem Wasser, um eine 20-g/ml-Lösung von FN herzustellen.</li>
	<li>Bereiten Sie 100 mg/ml Lösung von JBNTs durch Verdünnung von 5 l von 1 mg/ml JBNTs in 45 l DI-Wasser vor.</li>
	<li>Mischen Sie 10 l von 100 g/ml FN und 5 x l von 1 mg/ml JBNTs in 35 l DI-Wasser, um die NM-Lösung zu bilden.</li>
	<li>Beschichten Sie drei Bohrungen mit 96-gut klaren rundrunden Boden-Mikroplatten mit der FN-, JBNT-Lösung bzw. NM-Lösung. Jeder Brunnen erhält 50 l der Lösung.</li>
	<li>Führen Sie eine Lyophilisierung durch, wie unten beschrieben, um die Gerüststruktur des NM zu visualisieren.<ol>
<li>Einfrieren der Platte bei -80 °C über Nacht.</li>
		<li>Schalten Sie das lyophilisierte Instrument und die Vakuumpumpe ein.</li>
		<li>Drücken Sie die Abkühltaste, um die Temperatur des Systems auf -50 °C zu reduzieren.</li>
		<li>Legen Sie die gefrorene Platte in das lyophilisierte Instrument und schließen Sie alle Öffnungen der Instrumente.</li>
		<li>Klicken Sie auf die Starttaste, um den Systemdruck auf 0,9 mbar zu reduzieren.</li>
		<li>Nach 4 h drücken Sie die Belüftungstaste und öffnen Sie das Ventil, um den Systemdruck auf den atmosphärischen Druck zu erhöhen.</li>
		<li>Nehmen Sie die Platte aus dem lyophilisierten Instrument.</li>
		<li>Verwenden Sie ein Mikroskop, um die FN, JBNTs und das resultierende selbstmontierte NM zu beobachten. Nehmen Sie mehrere Fotos mit einer Kamera für die Materialien.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Absorptionsspektrenmessung
HINWEIS: Verwenden Sie den Spektrenwechsel für FN und JBNTs, um den selbst montierten JBNT/FN NM12vorzustellen.
<ol><li>Mischen Sie 30 l von 100 g/ml FN mit 15 l destilliertem Wasser und 5 l von 1 mg/ml JBNTs, um die JBNT/FN NM-Lösung vorzubereiten. Weiße feste Suspension kann nach dem Pipettieren der Lösung mehrmals gesehen werden. ANMERKUNG: Die Endkonzentrationen von JBNTs und FN in der Lösung betragen 100 g/ml bzw. 60 g/ml. JBNTs und FN-Lösungen in der gleichen Konzentration wie in der NM-Lösung wurden ebenfalls als Steuerungslösungen vorbereitet.</li>
	<li>Verdünnen Sie 5 l von 1 mg/ml JBNTs mit 45 l destilliertem Wasser, um die JBNT-Kontrolllösung vorzubereiten.</li>
	<li>Zur Herstellung der FN-Kontrolllösung 30 l von 100 g/ml FN mit 20 l destilliertem Wasser verdünnen.</li>
	<li>Messen Sie die UV-Vis-Absorptionsspektren von FN-, JBNT- und JBNT/FN NM-Lösungen mit dem Spektralphotometer (siehe Materialtabelle), um die Montage von NM zu charakterisieren.<ol>
<li>Klicken Sie auf die Schaltfläche UV-Vis. Reinigen Sie die Testfläche des Spektralphotometers und lassen Sie 2 l destilliertes Wasser darauf fallen. Messen Sie es als Leerzeichen von 190-850 nm.</li>
		<li>Reinigen Sie die Testfläche des Spektralphotometers und lassen Sie 2 L FN-Lösung darauf fallen. Messen Sie die UV-Vis Absorptionsspektren der FN-Lösung von 190 nm bis 850 nm.</li>
		<li>Reinigen Sie die Testfläche des Spektralphotometers und lassen Sie 2 L JBNT-Lösung darauf fallen. Messen Sie die Absorptionsspektren der JBNT-Lösung von 190 nm bis 850 nm.</li>
		<li>Reinigen Sie die Testoberfläche des Spektralphotometers und lassen Sie 2 L JBNT/FN NM-Lösung darauf fallen. Messen Sie die Absorptionsspektren der JBNT/FN NM-Lösung von 190 nm bis 850 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Vorbereitung von JBNT/FN NM für die elektronische Übertragungsmikroskopie (TEM)
<ol><li>Reinigen Sie mehrere Gitter vor negativer Färbung mit einem grundlegenden Plasmareiniger (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Führen Sie die negative Färbung für die Proben nach zwei verschiedenen Prozessen durch.<ol>
<li>Lassen Sie 3 l von 1 mg/ml jbNTs wässrige Lösung und 3 l JBNT/FN NM-Lösung auf getrennten Gittern fallen und lassen Sie es für 2 min. Spülen Sie dann jedes Gitter mit 100 l 0,5% Uranylacetat (UA) Lösung. Entleeren Sie die überschüssige Lösung mit Filterpapier und trocknen Sie die Gitter lufttrocken.</li>
		<li>Mischen Sie die JBNT/FN NM-Lösung mit einer Lösung von 3 l mit einer UA-Lösung von 2,0 % und führen Sie sie mehrmals durch. Pipette die gemischte Lösung auf den Gittern und halten Sie es auf den Gittern für 2 min. Verwenden Sie ein Filterpapier, um die gemischte Lösung aus den Gittern zu entfernen und die Gitter bei Raumtemperatur zu trocknen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schließlich charakterisieren Sie die Probe für JBNTs, JBNT/FN NM mit Schritt 5.2.1 und JBNT/FN NM mit Schritt 5.2.2 mit dem TEM gebeizt.</li>
</ol>6. In-vitro-Biologische Funktion Assay
<ol><li>Fügen Sie 200 L Negativsteuerungen (NC, PBS), JBNTs, FN und die JBNT/FN NM-Lösungen in einen Brunnen einer 8-Well-Kammerrutsche ein.</li>
	<li>Das 8-well-kammerförmige Deckglas mit dem lyophilisierten Instrument trocknen, um Materialien auf dem Boden der Brunnen zu beschichten. Das Protokoll zum Gefriertrocknen entspricht Schritt 3.5.</li>
	<li>Dann 10.000 Zellen/Brunnen hMSCs (Passage 3) in die Brunnen geben und 24 h bei 37 °C mit 5%CO2bebrüten.</li>
	<li>Nach der Inkubation das Zellkulturmedium aus den Brunnen herauspipetten und die Kultur mit 1x PBS-Lösung abspülen.</li>
	<li>Fügen Sie 100 l der fixativen Lösung zu jedem Brunnen mit Zellen hinzu und lassen Sie sie 5 min. Spülen Sie zellen vorsichtig mit 1x PBS zweimal.</li>
	<li>1% Triton-X 100 bis 0,1% verdünnen. Fügen Sie 100 l von 0,1% Triton-X 100 zu jedem Brunnen mit Zellen hinzu und lassen Sie es 10 min. Spülen Sie zellen vorsichtig mit 1x PBS zweimal.</li>
	<li>Verdünnen Sie das Rhodamine Phalloidin auf 1,65 m. Fügen Sie 100 L Rhodamine Phalloidin zu jedem Brunnen mit Zellen hinzu und inkubieren Sie das kammerförmige Deckglas, das bei Raumtemperatur 30 min vom Licht gehalten wird. Spülen Sie zellen vorsichtig mit 1x PBS zweimal.</li>
	<li>Erfassen Sie die Zellbilder mit einem Fluoreszenzmikroskop.</li>
	<li>Zählen Sie die Zellennummern für fluoreszierende Bilder für jede Gruppe. Berechnen Sie die Zellhaftungsdichte, indem Sie in jedem Brunnen drei zufällige Bereiche durchschnittlich umstellen.</li>
	<li>Präsentieren Sie alle Daten als durchschnittliche ± Standardabweichung (SD). Führen Sie statistische Analysen mit einem einseitigen t-Test durch, gefolgt von einer Varianzanalyse (ANOVA) mit p<0.05, die als statistisch signifikant angesehen wird.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+mobilization+of+exogenous+mesenchymal+stem+cells+to+bone+for+fracture+healing+and+sex+difference.">Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference.</a> Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).</li><li>Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+vitronectin+and+collagen+I+promotes+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).</li><li>Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+convergence+of+fracture+repair+and+stem+cells:+interplay+of+genes,+aging,+environmental+factors+and+disease.">The convergence of fracture repair and stem cells: interplay of genes, aging, environmental factors and disease.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 29 (11), 2307-2322 (2014).</li><li>De Becker, A., Riet, I. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homing+and+migration+of+mesenchymal+stromal+cells:+How+to+improve+the+efficacy+of+cell+therapy.">Homing and migration of mesenchymal stromal cells: How to improve the efficacy of cell therapy.</a> World Journal of Stem Cells. 8 (3), 73-87 (2016).</li><li>Chen, Y., Song, S., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+encapsulate+and+slowly+release+dexamethasone.">Self-assembled rosette nanotubes encapsulate and slowly release dexamethasone.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 1035-1044 (2011).</li><li>Song, S., Chen, Y., Yan, Z., Fenniri, H., Webster, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotubes+for+incorporating+hydrophobic+drugs+in+physiological+environments.">Self-assembled rosette nanotubes for incorporating hydrophobic drugs in physiological environments.</a> International Journal of Nanomedicine. 6, 101-107 (2011).</li><li>Fenniri, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+Rosette+Nanotubes:+Design,+Self-Assembly,+and+Characterization.">Helical Rosette Nanotubes: Design, Self-Assembly, and Characterization.</a> Journal of the American Chemical Society. 123 (16), 3854-3855 (2001).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+rosette+nanotube/hydrogel+composites+for+cartilage+tissue+engineering.">Self-assembled rosette nanotube/hydrogel composites for cartilage tissue engineering.</a> Tissue Engineering Part C Methods. 16 (6), 1233-1243 (2010).</li><li>Van den Bogaerdt, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+cross-linking+by+adipose-derived+mesenchymal+stromal+cells+and+scar-derived+mesenchymal+cells:+Are+mesenchymal+stromal+cells+involved+in+scar+formation.">Collagen cross-linking by adipose-derived mesenchymal stromal cells and scar-derived mesenchymal cells: Are mesenchymal stromal cells involved in scar formation.</a> Wound Repair and Regeneration. 17 (4), 548-558 (2009).</li><li>Erickson, H. P., Carrell, N., McDonagh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+molecule+visualized+in+electron+microscopy:+a+long,+thin,+flexible+strand.">Fibronectin molecule visualized in electron microscopy: a long, thin, flexible strand.</a> Journal of Cell Biology. 91 (3), 673-678 (1981).</li><li>Chen, Q., Yu, H. C., Chen, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> U. S. Patent. , (2017).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembled+biomimetic+Nano-Matrix+for+stem+cell+Anchorage.">Self-assembled biomimetic Nano-Matrix for stem cell Anchorage.</a> Journal of Biomedical Materials and Research. 108, 984-991 (2020).</li><li>Jones, M., Leroux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymeric+micelles+-+a+new+generation+of+colloidal+drug+carriers.">Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers.</a> European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 48 (2), 101-111 (1999).</li><li>Singh, P., Schwarzbauer, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin+and+stem+cell+differentiation+-+lessons+from+chondrogenesis.">Fibronectin and stem cell differentiation - lessons from chondrogenesis.</a> Journal of Cell Science. 125, 3703-3712 (2012).</li><li>Martino, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+integrin+specificity+and+stem+cell+differentiation+in+2D+and+3D+environments+through+regulation+of+fibronectin+domain+stability.">Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability.</a> Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).</li><li>Somaiah, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+promotes+higher+adhesion,+survival+and+proliferation+of+mesenchymal+stem+cells.">Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells.</a> PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).</li><li>Ogura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow+and+enhancement+of+cell+attachment+by+fibronectin.">Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin.</a> Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).</li><li>Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Printing+of+scaffolds+for+tissue+regeneration+applications.">3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+and+functionally+optimized+silk-fibroin-gelatin+scaffold+using+3D+printing+to+repair+cartilage+injury+in+vitro+and+in+vivo.">Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo.</a> Advanced Material. 29, 1701089 (2017).</li><li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+inflammatory+activation+by+self-assembling+Rosette+nanotubes+in+human+Calu-3+pulmonary+epithelial+cells.">Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells.</a> Small. 4 (6), 817-823 (2008).</li><li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosette+nanotubes+show+low+acute+pulmonary+toxicity+in+vivo.">Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).</li></ol>

Dr. Yupeng Chen ist Mitbegründer von NanoDe Therapeutics, Inc.

In dieser Studie entwickelten wir ein selbstzusammengesetztes biomimetisches NM, das mit DNA-inspirierten JBNTs und FN gebildet wurde. Bei der Herstellung der JBNT-Lösung sollte das lyophilisierte JBNT-Pulver anstelle von PBS ins Wasser aufgelöst werden, da PBS eine Agglomeration von JBNTs verursacht, was ihre Montage hemmt. Darüber hinaus sollte das NM auch in Wasser montiert werden, wenn wir die nanofibrilen Strukturen des NM beobachten wollen, da das Salz in PBS mit NM-Fasern gebündelt wird, was die Auflösung der...

Humane mesenchymale Stammzellen (hMSCs) haben das Potenzial für Selbsterneuerung und Selbstdifferenzierung entlang verschiedener mesenchymaler Abstammunggezeigt, was bei der Regeneration und Erhaltung von Geweben hilft1. Basierend auf dem Differenzierungspotenzial werden hMSCs als Kandidaten für mesenchymale Gewebeverletzungen und hämatopoetische Störungstherapie2betrachtet. hMSCs haben die Fähigkeit gezeigt, die Wundheilung durch Erhöhung der Gewebereparatur, Angiogenese und Verringerung der Entzündung3zu fördern. Ohne hilfe durch biochemische oder biomaterialien ist die Effizienz der hMSCs, ein Zielgewebe zu erreichen und am gewünschten Ort zu funktionieren, gering4. Obwohl verschiedene technische Gerüste verwendet wurden, um hMSCs anzuziehen, um an den Läsionen festzuhängen, sind einige Stellen wie Wachstumsplattenfrakturen in der Mitte eines langen Knochens nicht leicht zugänglich durch die herkömmlichen vorgefertigten Gerüste, die möglicherweise nicht perfekt in eine unregelmäßig geformte verletzte Stelle passen.
Hier haben wir ein biomimetisches Nanomaterial entwickelt, das sich vor Ort selbst zusammenbauen und in ein schwer erreichbares Zielgebiet injiziert werden kann. Das injizierbare Biogerüst NM besteht aus Janus-Basis-Nanoröhren (JBNTs) und Fibronectin (FN). JBNTs, auch bekannt als Rosette Nanotubes (RNTs), werden aus DNA-Basenpaaren abgeleitet, insbesondere Thymin und Adenin, hier5,6,7. Wie in Abbildung 1dargestellt, bilden sich die Nanoröhren, wenn sich sechs Moleküle der abgeleiteten DNA-Basenpaare selbst über Wasserstoffbindungen zu einer Ebene6zusammensetzen. Sechs Moleküle werden dann über eine starke Pi-Stacking-Wechselwirkung7,die bis zu 200-300 m lang sein kann, in einer Ebene übereinander gestapelt. Die JBNTs wurden entwickelt, um Kollagenfasern morphologisch nachzuahmen, so dass FN mit ihnen reagiert.
FN ist ein hochmolekulares Klebeglykoprotein, das in der extrazellulären Matrix (ECM)9zu finden ist. Diese können die Befestigung von Stammzellen an anderen Komponenten des ECM, insbesondere Kollagen10, vermitteln. Wir haben JBNTs entwickelt, um Kollagenfasern morphologisch nachzuahmen, so dass FN mit ihnen reagieren kann, um NM in wenigen Sekunden durch nicht kovalente Bindung zu bilden. Daher ist NM ein vielversprechendes Biogerüst, das in eine Knochenbruchstelle injiziert werden kann, die von den konventionell gefertigten Gerüsten nicht zugänglich ist. Hier präsentiert das injizierbare NM eine hervorragende Fähigkeit, die hMSC-Verankerung in vitro zu verbessern und zeigt ihr Potenzial, als Gerüst für die Geweberegeneration zu dienen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dichloroethane</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>39121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-cyanoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C88505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dimethylaminopyridine</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>D1450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 wells Chambered Coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>allylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>145831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentrated hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15230147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl dicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>361941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethyl acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>319902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylcarbamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHE0023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R37814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A13543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hexanes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>227064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human mesenchymal stem cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A17114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylformamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>227056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methylmorpholine N-oxide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A19802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetraoxide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>45385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>20012050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoryl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>347825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse phase column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25305-154630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silica gel</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>S0821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium ethoxide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L13083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium periodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium sulfite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium triacetoxyborohydride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer(NanoDrop One/One&#7580; UV-Vis)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem Cell Growth Medium BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thioanisole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T28002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>toluene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triethylamine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HFH10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion

Ein biomimetisches NM wurde entwickelt, um als gewebetechnisches biologisches Gerüst zu dienen, das die Stammzellverankerung verbessern kann. Das biomimetische NM wird aus JBNTs und FN durch Selbstmontage in wässriger Lösung gebildet. JBNTs messen 200-300 m lang mit inneren hydrophoben Hohlkanälen und äußeren hydrophilen Oberflächen. JBNTs sind positiv geladen und FNs sind negativ geladen. Daher werden sie, wenn sie in eine neutrale wässrige Lösung injiziert werden, über nicht kovalente Bindungen zu den NM-Bündeln zusammengebunden. Der Selbstmontageprozess wird innerhalb weniger Sekunden ohne chemische Initiatoren, Wärmequelle oder UV-Licht abgeschlossen. Wenn der pH-Wert der NM-Lösung niedriger ist als der isoelektrische Punkt von FNs (pI 5.5-6.0), werden sich die NM-Bundles aufgrund des Vorhandenseins von positiv geladenem FN selbst freisetzen.
NM ist dafür bekannt, die extrazelluläre Matrix (ECM) morphologisch nachzuahmen und kann daher als injizierbares Gerüst verwendet werden, das eine hervorragende Plattform zur Verbesserung der hMSC-Haftung bietet. Zelldichteanalysen und Fluoreszenz-Bildgebungsexperimente zeigten, dass die NMs die Verankerung von hMSCs im Vergleich zur Negativkontrolle signifikant erhöhten.

Unsere Studien entdeckten, dass die Bildung des NM von JBNTs und FN schnell ist, was in 10 Sekunden geschah. Wie in Abbildung 2dargestellt, wurde weißes Flockel erhalten, wenn die JBNT-Lösung mit der FN-Lösung gemischt und mehrmals pipettiert wurde. Der Entstehungsprozess von NM ist vollständig biomimetisch. Es sind keine äußeren Reize erforderlich. Der Herstellungsprozess ist viel einfacher als der einiger aufkommenden Biomaterialien, die auf ultraviolettem Licht oder chemischem Initi...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion at JoVE.com

Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

Ziel dieses Protokolls ist es, die Montage einer biomimetischen Nanomatrix (NM) mit Janus-Basis-Nanoröhren (JBNTs) und Fibronectin (FN) zu zeigen. Bei der Kokultur mit humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) weisen die NMs eine ausgezeichnete Bioaktivität bei der Förderung der hMSCs Adhäsion auf.

Herstellung einer biomimetischen Nano-Matrix mit Janus Base Nanotubes und Fibronectin zur Stammzellhaftung

A biomimetic NM was developed to serve as a tissue-engineering biological scaffold, which can enhance stem cell anchorage. The biomimetic NM is formed ...

fabrication-biomimetic-nano-matrix-with-janus-base-nanotubes

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.0K Aufrufe.  University of Connecticut. Ziel dieses Protokolls ist es, die Montage einer biomimetischen Nanomatrix (NM) mit Janus-Basis-Nanoröhren (JBNTs) und Fibronectin (FN) zu zeigen. Bei der Kokultur mit humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSCs) weisen die NMs eine ausgezeichnete Bioaktivität bei der Förderung der hMSCs Adhäsion auf.

Serie: Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Mikrofluidische Herstellung von Polymer- und Biohybridfasern mit vorgefertigter Größe und Form

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Forschung

Biotechnik

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and membrane environment2.
Coagulation Factor VIII (FVIII)3 is a multi-domain blood plasma glycoprotein. Defect or deficiency of FVIII is the cause for Hemophilia type A&#160;-&#160;a severe bleeding disorder. Upon proteolytic activation, FVIII binds to the serine protease Factor IXa on the negatively charged platelet membrane, which is critical for normal blood clotting4. Despite the pivotal role FVIII plays in coagulation, structural information for its membrane-bound state is incomplete5. Recombinant FVIII concentrate is the most effective drug against Hemophilia type A and commercially available FVIII can be expressed as human or porcine, both forming functional complexes with human Factor IXa6,7.
In this study we present a combination of Cryo-electron microscopy (Cryo-EM), lipid nanotechnology and structure analysis applied to resolve the membrane-bound structure of two highly homologous FVIII forms: human and porcine. The methodology developed in our laboratory to helically organize the two functional recombinant FVIII forms on negatively charged lipid nanotubes (LNT) is described.&#160;The representative results demonstrate that our approach is sufficiently sensitive to define the differences in the helical organization between the two highly homologous in sequence (86% sequence identity) proteins. Detailed protocols for the helical organization, Cryo-EM and electron tomography (ET) data acquisition are given. The two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) structure analysis applied to obtain the 3D reconstructions of human and porcine FVIII-LNT is discussed. The presented human and porcine FVIII-LNT structures show the potential of the proposed methodology to calculate the functional, membrane-bound organization of blood coagulation Factor VIII at high resolution.

We present a combination of Cryo-electron microscopy, lipid nanotechnology, and structure analysis applied to resolve the membrane-bound structure of two highly homologous FVIII forms: human and porcine. The methodology developed in our laboratory&#160;to helically organize the two functional recombinant FVIII forms on negatively charged lipid nanotubes (LNT) is described.

Helical Organisation der Blutgerinnungsfaktor VIII auf Lipid-Nanotubes

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Fabrication of a Functionalized Magnetic Bacterial Nanocellulose with Iron Oxide Nanoparticles

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide nanoparticles (IONP) (Fe3O4) to yield a magnetic bacterial nanocellulose (MBNC). The synthesis of MBNC is a precise and specifically designed multi-step process. Briefly, bacterial nanocellulose (BNC) pellicles are formed from preserved G. xylinus strain according to our experimental requirements of size and morphology. A solution of iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3&#183;6H2O) and iron(II) chloride tetrahydrate (FeCl2&#183;4H2O) with a 2:1 molar ratio is prepared and diluted in deoxygenated high purity water. A BNC pellicle is then introduced in the vessel with the reactants. This mixture is stirred and heated at 80 &#176;C in a silicon oil bath and ammonium hydroxide (14%) is then added by dropping to precipitate the ferrous ions into the BNC mesh. This last step allows forming in situ magnetite nanoparticles (Fe3O4) inside the bacterial nanocellulose mesh to confer magnetic properties to BNC pellicle. A toxicological assay was used to evaluate the biocompatibility of the BNC-IONP pellicle. Polyethylene glycol (PEG) was used to cover the IONPs in order to improve their biocompatibility. Scanning electron microscopy (SEM) images showed that the IONP were located preferentially in the fibril interlacing spaces of the BNC matrix, but some of them were also found along the BNC ribbons. Magnetic force microscope measurements performed on the MBNC detected the presence magnetic domains with high and weak intensity magnetic field, confirming the magnetic nature of the MBNC pellicle. Young&#39;s modulus values obtained in this work are also in a reasonable agreement with those reported for several blood vessels in previous studies.

Here, we present a protocol to make a bacterial nanocellulose (BNC) magnetic for applications in damaged blood vessel reconstruction. The BNC was synthesized by G. xylinus strain. On the other hand, magnetization of the BNC was realized through in situ precipitation of Fe2+ and Fe3+ ferrous ions inside the BNC mesh.

Die Herstellung einer funktionalisierter magnetischer bakterielle Nanocellulose mit Eisenoxid-Nanopartikel

In this study, bacterial nanocellulose (BNC) produced by the bacteria Gluconacetobacter xylinus is synthesized and impregnated in situ with iron oxide ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembran Fabrication durch das Lösungsmittel-unterstützten Lipiddoppelschicht (SALB) Methode

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Mikrostrukturierung und Montage von 3D-Micro-Ader

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

DNA-Nanoröhren als ein vielseitiges Werkzeug, semiflexiblen Polymere zu studieren

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Herstellung und Validierung von einer Orgel-on-Chip-System mit integrierten Elektroden, direkt Transendothelial elektrischen Widerstand zu quantifizieren

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

Herstellung von benutzerdefinierten Agarose Brunnen für die Aussaat von Zelle und Gewebe Ring Selbstmontage mit 3D-Druck Formen

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are an emerging treatment for photoreceptor degenerative diseases that seek to restore vision by artificially stimulating the surviving retinal neurons in the hope of eliciting comprehensible visual perception in patients. Current retinal prostheses have demonstrated success in restoring limited vision to patients using an array of electrodes to electrically stimulate the retina but face substantial physical barriers in restoring high acuity, natural vision to patients. Chemical neurostimulation using native neurotransmitters is a biomimetic alternative to electrical stimulation and could bypass the fundamental limitations associated with retinal prostheses using electrical neurostimulation. Specifically, chemical neurostimulation has the potential to restore more natural vision with comparable or better visual acuities to patients by injecting very small quantities of neurotransmitters, the same natural agents of communication used by retinal chemical synapses, at much finer resolution than current electrical prostheses. However, as a relatively unexplored stimulation paradigm, there is no established protocol for achieving chemical stimulation of the retina in vitro. The purpose of this work is to provide a detailed framework for accomplishing chemical stimulation of the retina for investigators who wish to study the potential of chemical neuromodulation of the retina or similar neural tissues in vitro. In this work, we describe the experimental setup and methodology for eliciting retinal ganglion cell (RGC) spike responses similar to visual light responses in wild-type and photoreceptor-degenerated wholemount rat retinas by injecting controlled volumes of the neurotransmitter glutamate into the subretinal space using glass micropipettes and a custom multiport microfluidic device. This methodology and protocol are general enough to be adapted for neuromodulation using other neurotransmitters or even other neural tissues.

Methodology for Biomimetic Chemical Neuromodulation of Rat Retinas with the Neurotransmitter Glutamate In Vitro

This protocol describes a novel method for investigating a form of chemical neurostimulation of wholemount rat retinas in vitro with the neurotransmitter glutamate. Chemical neurostimulation is a promising alternative to the conventional electrical neurostimulation of retinal neurons for treating irreversible blindness caused by photoreceptor degenerative diseases.

Methodik für biomimetische Chemie Neuromodulation der Ratte Netzhaut mit dem Neurotransmitter Glutamat In-vitro-

Photoreceptor degenerative diseases cause irreparable blindness through the progressive loss of photoreceptor cells in the retina. Retinal prostheses are ...