Questo lavoro è sostenuto finanziariamente da NIH (Grants 1R01AR072027-01, 1R03AR069383-01), NSF Career Award (1653702) e University of Connecticut.

1. Sintesi dei JBNT
NOTA: Il monomero JBNT è stato preparato come pubblicato in precedenza11.
<ol><li>Sintesi del composto A1<ol>
<li>Preparare una soluzione contenente 8,50 g di acido 2-cianoacetico e 9,80 g di etilcarbamato in 25 mL di toluene e 2,5 mL di N, N-dimetilformamide. Aggiungere 4,90 mL di cloruro di fosforile dropwise. Quindi scaldare la miscela a 70 °C e continuare a mescolare per 1,5 ore.</li>
		<li>Raffreddare la miscela di reazione a temperatura ambiente e versare 100 g di acqua ghiacciata. Estrarre lo strato acquoso con acetato di etile (3 x 250 mL) e lavare con 100 mL di salamoia. Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per ottenere un solido giallo pallido.</li>
		<li>Sottosoggettare la cromatografia a colonna flash del solido giallo al gel di silice (3% di metanolo/diclorometano) per produrre 15,61 g di composto A1 come polvere bianca.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A2<ol>
<li>Mescolare 3,12 g di composto A1 e 2,75 g di carbonato di potassio in 50 mL di N, N-dimetilformamide. Mescolare a temperatura ambiente per 2 ore.</li>
		<li>Aggiungere 2,6 mL di disolfuro di carbonio alla sospensione di reazione. Continuare a mescolare per 4 ore.</li>
		<li>Aggiungere l'etanolo assoluto alla miscela di reazione a 0 °C. Filtrare il precipitato giallo e lavare con etere dietile. Asciugare sotto vuoto durante la notte per produrre 6,18 g di composto A2 come solido giallo pallido.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A3<ol>
<li>Aggiungere 2,7 mL di ioduro di metile in 15 mL di acetonitrile. Inoltre, preparare separatamente una soluzione di composto A2 aggiungendo 6,18 g di A2 a 80 mL di acqua / acetonitrile (rapporto 7:3). Mescolare entrambe le soluzioni e mescolare a temperatura ambiente per 30 minuti.</li>
		<li>Scaldare la miscela di reazione a 95 °C e continuare a mescolare per 3 ore.</li>
		<li>Raffreddare la miscela di reazione a temperatura ambiente, quindi evaporare i volatili sotto vuoto.</li>
		<li>Estrarre il residuo 3x con 100 mL di acetato di etile e lavare con salamoia. Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per ottenere un solido giallo.</li>
		<li>Sottosoggettare il solido giallo alla cromatografia della colonna flash del gel di silice (30% acetato/esani etilico) per produrre 4,52 g del composto A3 come solido giallo chiaro.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A4<ol>
<li>Preparare la soluzione di alleilamina aggiungendo 925 μL di alleilamina in 20 mL di etanolo. Aggiungere questa soluzione dropwise alla soluzione del composto A3, preparato aggiungendo 3,14 g di A3 in 75 mL di etanolo assoluto, oltre 30 min. Quindi riscaldare la miscela di reazione al reflusso per 16 ore.</li>
		<li>Raffreddare la miscela di reazione a temperatura ambiente ed evaporare i volatili per dare un solido giallo.</li>
		<li>Sottosoggettare la cromatografia a colonna flash del solido giallo al gel di silice (50% di acetato/esani etilico al 2% di metanolo/diclorometano) per produrre 1,80 g di composto A4 come cristallo bianco.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A5<ol>
<li>Aggiungere 2,05 g di cloridrato di guanidinio e 7,8 mL di etoossido di sodio (21 wt% in etanolo) in 14 mL di etanolo assoluto. Scaldare la miscela a 45 °C per 15 minuti.</li>
		<li>Filtrare il materiale insolubile e aggiungere il filtrato direttamente nella soluzione del composto A4, preparato aggiungendo 2,70 g di A4 in 40 mL di etanolo assoluto. Riscaldare la miscela di reazione al reflusso per 16 ore.</li>
		<li>Filtrare il precipitato per ottenere 2,65 g di composto A5 come solido bianco sconto.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A6<ol>
<li>Aggiungere lentamente 24,9 mL di trietilammina alla miscela di liquami ottenuta aggiungendo 2,11 g di composto A5 e 1,10 g di 4-dimetilaminopiridina in 120 mL di tetraidrofurano oltre 1 min. Mescolare a temperatura ambiente per 2 minuti.</li>
		<li>Aggiungere 20,7 mL di di-tert-butil dicarbonato dropwise alla miscela di reazione e continuare a mescolare a temperatura ambiente per 40 h.</li>
		<li>Aggiungere 20 mL di acqua per spegnere la reazione. Evaporare i volatili sotto vuoto.</li>
		<li>Estrarre il residuo viscoso rosso con 500 mL di acetato di etile. Quindi, lavarlo con 250 mL di acqua, 75 mL di acido citrico al 10%, 2x con 200 mL di acqua, 200 mL di bicarbonato di sodio saturo e 200 mL di salamoia. Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per dare un solido rosso/arancione.</li>
		<li>Sottosoggettare la cromatografia a colonna flash in gel di silice (acetato/esani di etile allo 0-20%) per produrre 3,87 g di composto A6 come schiuma bianca.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A7<ol>
<li>Aggiungere N-metilmorfolina N-ossido (50 wt.% in acqua, 1,64 mL) dropwise alla soluzione di composto A6 (2,93 g) in acetone/acqua (8:1, 58,5 mL) e mescolare a temperatura ambiente per 5 min.</li>
		<li>Aggiungere tetraossido di osmio (soluzione acquosa al 4%) dropwise alla miscela per un periodo di 3 minuti e continuare a mescolare a temperatura ambiente per 24 ore.</li>
		<li>Spegnere la reazione con solfito di sodio acquoso da 1,0 M fino a quando la soluzione diventa incolore. Rimuovere i volatili sotto vuoto per provocare un liquame bianco in acqua. Estrarre il residuo con 350 mL di diclorometano e quindi lavare con 150 mL di acqua seguito da un lavaggio con 150 mL di salamoia.</li>
		<li>Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per produrre 2,45 g di composto A7 come solido bianco.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A8<ol>
<li>Aggiungere 760 g di perioduro di sodio alla miscela di 1,36 g di composto A7 in 35 mL di diclorometano/acqua (6:1, 35 mL) e mescolare a temperatura ambiente per 42 ore.</li>
		<li>Filtrare il materiale insolubile e concentrare il filtrato sotto vuoto. Estrarre il residuo risultante con 250 mL di diclorometano, quindi lavare con 100 mL di acqua e 100 mL di salamoia. Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per dare il prodotto grezzo.</li>
		<li>Sottosoggettare il prodotto grezzo alla cromatografia a colonna flash in gel di silice (5-40% acetato/esani etilico, quindi 5% metanolo/diclorometano) per produrre 1,08 g di composto A8.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del composto A9<ol>
<li>Preparare una soluzione di 830 mg di composto A8 in 15 mL di 1,2-dicloroetano. Aggiungere la soluzione di dropwise alla miscela di 6-benzilossicarbonilamino-2-L-acido ammino-esanoico trimetilsilil estere etilico (649,5 mg) e N N-diisopropiletililammina (591 μL) in 24 mL di 1,2-dicloroetano oltre 3 min e mescolare a temperatura ambiente per 15 min.</li>
		<li>Aggiungere 360,3 mg di triacetossiboroidro di sodio alla soluzione e continuare a mescolare a temperatura ambiente per 24 ore.</li>
		<li>Dissetare la miscela di reazione con 6 mL di acqua. Estrarre la miscela di reazione 3x con 200 mL di diclorometano e lavare con 200 mL di acido citrico 10% in acqua, 2x con 200 mL di acqua, 200 mL di bicarbonato di sodio saturo e 200 mL di salamoia in questo ordine. Asciugare lo strato organico su solfato di sodio anidro, filtrare ed evaporare i volatili sotto vuoto per ottenere il prodotto grezzo.</li>
		<li>Sottosoggettare il prodotto grezzo alla cromatografia a colonna flash in gel di silice (acetato/esani etilico al 5-30%) per produrre 885 mg di composto A9.</li>
	</ol></li>
	<li>Sintesi del monomero JBNT<ol>
<li>Sciogliere 0,54 g di composto A9 (0,54 g) in 10 mL di acido trifluoroacetico/soluzione di tioanisole al 94% e mescolare a temperatura ambiente per 72 ore.</li>
		<li>Aggiungere l'etere dietile (80 mL) alla miscela di reazione e centrifugare il precipitato verso il basso. Versare l'acido trifluoroacetico chiaro contenente supernatante e lavare il precipitato bianco con etere dietile e metanolo per produrre monomero JBNT grezzo da 168,6 mg(File supplementare 1).</li>
		<li>Purificare il monomero JBNT grezzo da una cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) con una colonna in fase inversa. Il programma di isolamento è elencato di seguito: SolventE A: 100% acqua; solvente B: acetonitrile al 100%; solvente C: pH=1 soluzione d'acqua HCl; portata: 3 mL/min (cfr. tabella 1).</li>
		<li>Raccogli il picco più grande a circa 7,2 minuti.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Fabbricazione per JBNT/FN
<ol><li>Aggiungere 80 μL di soluzione acquosa JBNT da 1 mg/mL a 40 μL di soluzione acquosa FN da 1 mg/mL e pipetta più volte.</li>
	<li>Verificare la presenza di sospensioni solide bianche dopo pipettazione per circa 10 s. NOTA: è stato girato un video per acquisire il processo di auto-assemblaggio di NM (Supplemental File 2).</li>
</ol>3. Osservazione di esemplari lyophilizzati
NOTA: Questo passaggio viene eseguito per mostrare la struttura dell'impalcatura della MN realizzata con JBNT e FN.
<ol><li>Preparare soluzioni FN, JBNT e FN/JBNT NM per l'osservazione dei materiali lyophilizzati. Diluire 10 μL di 100 μg/mL di FN con 40 μL di acqua distillata per fare una soluzione di 20 μg/mL di FN.</li>
	<li>Preparare 100 mg/mL di soluzione di JBNT diluire 5 μL di 1 mg/mL di JBNT in 45 μL di acqua DI.</li>
	<li>Mescolare 10 μL di 100 μg/mL FN e 5 μL di 1 mg/mL di JBNT in 35 μL di acqua DI per formare la soluzione di MN.</li>
	<li>Rivestire tre pozzi di micropiatte inferiori rotonde a 96 ben chiare rispettivamente con la soluzione FN, JBNT e NM. Ogni pozzo riceve 50 μL della soluzione.</li>
	<li>Eseguire la liofilizzazione, come descritto di seguito, per visualizzare la struttura dell'impalcatura della MN.<ol>
<li>Congelare la piastra a -80 °C durante la notte.</li>
		<li>Accendere lo strumento lyophilized e la pompa per vuoto.</li>
		<li>Premere il pulsante di raffreddamento per ridurre la temperatura del sistema a -50 °C.</li>
		<li>Mettere la piastra congelata nello strumento liofilizzato e chiudere tutte le aperture degli strumenti.</li>
		<li>Fare clic sul pulsante start per ridurre la pressione del sistema a 0,9 mbar.</li>
		<li>Dopo 4 ore, premere il pulsante di aerazione e aprire la valvola per aumentare la pressione del sistema alla pressione atmosferica.</li>
		<li>Estraere il piatto dal lyophilized instrument.</li>
		<li>Utilizzare un microscopio per osservare l'FN, i JBNT e la MN autoassemblata risultante. Scatta diverse fotografie con una fotocamera per i materiali.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Misurazione degli spettri di assorbimento
NOTA: utilizzare la modifica degli spettri per FN e JBNT per presentare il JBNT/FN NM12 autoassemblato.
<ol><li>Mescolare 30 μL di 100 μg/mL FN con 15 μL di acqua distillata e 5 μL di 1 mg/mL di JBNT per preparare la soluzione JBNT/FN NM. Le sospensioni solide bianche possono essere viste più volte dopo aver pipettato la soluzione. NOTA: Le concentrazioni finali di JBNT e FN nella soluzione sono rispettivamente di 100 μg/mL e 60 μg/mL. Sono state inoltre preparate come soluzioni di controllo le soluzioni JBNT e FN alla stessa concentrazione a quella utilizzata nella soluzione NM.</li>
	<li>Diluire 5 μL di 1 mg/mL di JBNT con 45 μL di acqua distillata per preparare la soluzione di controllo JBNT.</li>
	<li>Diluire 30 μL di 100 μg/mL FN con 20 μL di acqua distillata per preparare la soluzione di controllo FN.</li>
	<li>Misurare gli spettri di assorbimento UV-vis delle soluzioni FN, JBNT e JBNT/FN NM con lo spettrofotometro (vedi Tabella dei materiali)per caratterizzare l'assemblaggio di NM.<ol>
<li>Fate clic sul pulsante UV-Vis. Pulire la superficie di prova dello spettrofotometro e rilasciarvi 2 μL di acqua distillata. Misuralo come vuoto da 190-850 nm.</li>
		<li>Pulire la superficie di prova dello spettrofotometro e rilasciarla 2 μL di soluzione FN. Misurare gli spettri di assorbimento UV-Vis della soluzione FN da 190 nm a 850 nm.</li>
		<li>Pulire la superficie di prova dello spettrofotometro e rilasciarla 2 μL di soluzione JBNT. Misurare gli spettri di assorbimento della soluzione JBNT da 190 nm a 850 nm.</li>
		<li>Pulire la superficie di prova dello spettrofotometro e rilasciarla 2 μL di soluzione di NM JBNT/FN. Misurare gli spettri di assorbimento della soluzione di NM JBNT/FN da 190 nm a 850 nm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Preparazione della MN JBNT/FN per la microscopia elettronica a trasmissione (TEM)
<ol><li>Pulire diverse griglie prima della colorazione negativa con un detergente al plasma di base (vedere Tabella dei materiali).</li>
	<li>Eseguire la colorazione negativa per i campioni seguendo due diversi processi.<ol>
<li>Far cadere 3 μL di 1 mg/mL di soluzione acquosa di JBNT e 3 μL di soluzione di MN JBNT/FN su griglie separate e lasciarlo per 2 min. Quindi sciacquare ogni griglia con soluzione di 100 μL di acetato di uranile (UA) 0,5%. Scolare la soluzione in eccesso con carta da filtro e asciugare all'aria le griglie.</li>
		<li>Mescolare 9 μL di soluzione di NM JBNT/FN con 3 μL di soluzione di UA al 2,0% e pipettarla più volte. Pipettare la soluzione mista sulle griglie e tenerla sulle griglie per 2 minuti. Utilizzare una carta da filtro per rimuovere la soluzione mista dalle griglie e asciugare le griglie a temperatura ambiente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infine, caratterizzare l'esemplare per JBNT, JBNT/FN NM macchiato con passo 5.2.1 e JBNT/FN NM macchiato con passo 5.2.2 con il TEM.</li>
</ol>6. Saggio di funzione biologica in vitro
<ol><li>Aggiungere 200 μL di controlli negativi (NC, PBS), JBNT, FN e le soluzioni NM JBNT/FN in un unico pozzo di una diapositiva a camera a 8 pozzi, rispettivamente.</li>
	<li>Congelare asciugare il coverglass a camera a 8 elementi con lo strumento liofilizzato per rivestire i materiali sul fondo dei pozzi. Il protocollo per la liofilizzazione è lo stesso del passaggio 3.5.</li>
	<li>Quindi aggiungere 10.000 cellule/pozzi hSPC (Passaggio 3) nei pozzi e incubarli per 24 ore a 37 °C con il 5% di CO2.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, pipettare il mezzo di coltura cellulare dai pozzi e risciacquare la coltura con soluzione 1x PBS.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL della soluzione fissante ad ogni bene con le cellule e lasciare per 5 minuti. Risciacquare delicatamente le cellule con 1x PBS due volte.</li>
	<li>Diluire dall'1% Triton-X 100 allo 0,1%. Aggiungere 100 μL dello 0,1% di Tritone-X 100 ad ogni pozzo con le cellule e lasciare per 10 minuti. Risciacquare delicatamente le cellule con 1x PBS due volte.</li>
	<li>Diluire la rodimina Phalloidin a 1,65 μM. Aggiungere 100 μL di rodimina Phalloidin ad ogni pozzo con cellule e incubare il vetro di copertura a camera tenuto lontano dalla luce a temperatura ambiente per 30 minuti. Risciacquare delicatamente le cellule con 1x PBS due volte.</li>
	<li>Cattura le immagini cellulari con un microscopio fluorescente.</li>
	<li>Contare i numeri di cella nelle immagini fluorescenti per ogni gruppo. Calcolare la densità di adesione cellulare calcolando in media tre aree casuali in ogni pozzo.</li>
	<li>Presentare tutti i dati come ± deviazione standard (SD). Eseguire analisi statistiche utilizzando un test t a una coda, seguito da un'analisi della varianza (ANOVA) con p<0.05, che è considerata statisticamente significativa.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+mobilization+of+exogenous+mesenchymal+stem+cells+to+bone+for+fracture+healing+and+sex+difference.">Improved mobilization of exogenous mesenchymal stem cells to bone for fracture healing and sex difference.</a> Stem Cells. 34 (10), 2587-2600 (2016).</li><li>Salasznyk, R. M., Williams, W. A., Boskey, A., Batorsky, A., Plopper, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+to+vitronectin+and+collagen+I+promotes+osteogenic+differentiation+of+human+mesenchymal+stem+cells.">Adhesion to vitronectin and collagen I promotes osteogenic differentiation of human mesenchymal stem cells.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 1 (2004), 24-34 (2004).</li><li>Hadjiargyrou, M., O'Keefe, R. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+integrin+specificity+and+stem+cell+differentiation+in+2D+and+3D+environments+through+regulation+of+fibronectin+domain+stability.">Controlling integrin specificity and stem cell differentiation in 2D and 3D environments through regulation of fibronectin domain stability.</a> Biomaterials. 30 (6), 1089-1097 (2009).</li><li>Somaiah, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collagen+promotes+higher+adhesion,+survival+and+proliferation+of+mesenchymal+stem+cells.">Collagen promotes higher adhesion, survival and proliferation of mesenchymal stem cells.</a> PLoS One. 10 (12), 0145068 (2015).</li><li>Ogura, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+the+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow+and+enhancement+of+cell+attachment+by+fibronectin.">Differentiation of the human mesenchymal stem cells derived from bone marrow and enhancement of cell attachment by fibronectin.</a> Journal of Oral Science. 46 (4), 207-213 (2004).</li><li>Do, A. V., Khorsand, B., Geary, S. M., Salem, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+Printing+of+scaffolds+for+tissue+regeneration+applications.">3D Printing of scaffolds for tissue regeneration applications.</a> Advanced Healthcare Materials. 4 (12), 1742-1762 (2015).</li><li>Shi, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structurally+and+functionally+optimized+silk-fibroin-gelatin+scaffold+using+3D+printing+to+repair+cartilage+injury+in+vitro+and+in+vivo.">Structurally and functionally optimized silk-fibroin-gelatin scaffold using 3D printing to repair cartilage injury in vitro and in vivo.</a> Advanced Material. 29, 1701089 (2017).</li><li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+inflammatory+activation+by+self-assembling+Rosette+nanotubes+in+human+Calu-3+pulmonary+epithelial+cells.">Low inflammatory activation by self-assembling Rosette nanotubes in human Calu-3 pulmonary epithelial cells.</a> Small. 4 (6), 817-823 (2008).</li><li>Journeay, W. S., Suri, S. S., Moralez, J. G., Fenniri, H., Singh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rosette+nanotubes+show+low+acute+pulmonary+toxicity+in+vivo.">Rosette nanotubes show low acute pulmonary toxicity in vivo.</a> International Journal of Nanomedicine. 3 (3), 373-383 (2008).</li></ol>

Il Dr. Yupeng Chen è co-fondatore di NanoDe Therapeutics, Inc.

In questo studio, abbiamo sviluppato una MN biomimetica auto-assemblata, che è stata formata con JBNT e FN ispirati al DNA. Durante la preparazione della soluzione JBNT, la polvere liofilizzata JBNT deve essere sciolta nell'acqua al posto del PBS perché pbs causerà l'agglomerazione di JBNT, che inibisce il loro assemblaggio. Inoltre, la MN dovrebbe anche essere assemblata in acqua se vogliamo osservare le strutture nano-fibrille della MN, perché il sale in PBS si impacchelerà con le fibre nm, il che può ridurre not...

Le cellule staminali mesenchimali umane (hSPC) hanno mostrato il potenziale di auto-rinnovamento e auto-differenziazione lungo diversi lignaggi mesenchimali, il che aiuta nella rigenerazione e nel mantenimento dei tessuti1. In base al potenziale di differenziazione, gli hMSC sono considerati candidati per lesioni mesenchimali del tessuto e terapia del disturbo ematopoietico2. hSPC hanno dimostrato la capacità di promuovere la guarigione delle ferite aumentando la riparazione dei tessuti, l'angiogenesi e riducendo l'infiammazione3. Tuttavia, senza assistenza biochimica o biomateriale, l'efficienza per gli hMSC di raggiungere un tessuto bersaglio e funzionare nella posizione desiderata è bassa4. Sebbene varie impalcature ingegnerizzate siano state utilizzate per attirare gli HMSC ad aderire alle lesioni, alcuni siti come la frattura della piastra di crescita, nel mezzo di un osso lungo, non sono facilmente accessibili dalle impalcature prefabburate convenzionali, che potrebbero non adattarsi perfettamente a un sito ferito di forma irregolare.
Qui, abbiamo sviluppato un nanomateriale biomimetico che può auto-assemblarsi in situ ed essere iniettato in un'area bersaglio difficile da raggiungere. La bio-impalcatura iniettabile NM è composta da nanotubi di base janus (JBNT) e fibronectina (FN). I JBNT, noti anche come Nanotubi di Rosetta (RTT), derivano da coppie di basi di DNA, in particolare timina e adenina,qui 5,6,7. Come si vede nella Figura 1, i nanotubi si formano quando sei molecole delle coppie di basi di DNA derivate si auto-assemblano tramite legami idrogeno per formare unpiano 6. Sei molecole vengono quindi impilate l'una sull'altra in un piano attraverso una forte interazione di pi-stacking7, che può essere lunga fino a 200-300 μm. I JBNT sono progettati per imitare morfologicamente le fibre di collagene in modo che FN reagisca con loro.
FN è una glicoproteina adesiva ad alto peso molecolare, che può essere trovata nella matrice extracellulare (ECM)9. Questi possono mediare l'attaccamento delle cellule staminali ad altri componenti dell'ECM, in particolarecollagene 10. Abbiamo progettato JBNT per imitare morfologicamente le fibre di collagene in modo che FN possa reagire con loro per formare la MN in pochi secondi attraverso il legame non covalente. Pertanto, la MN è una promettente bio-impalcatura da iniettare in un sito di frattura ossea che non potrebbe essere accessibile dalle impalcature fabbricate convenzionalmente. Qui, la MN iniettabile presenta un'eccellente capacità di migliorare l'ancoraggio hMSC in vitro, esibendo il loro potenziale di servire come impalcatura per la rigenerazione dei tessuti.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dichloroethane</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>39121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-cyanoacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C88505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-Dimethylaminopyridine</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>D1450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 wells Chambered Coverglass</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>155409</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>353072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>absolute ethanol</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>BP2818500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34851</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>allylamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>145831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic Plasma Cleaner</td>
			<td>Harrick Plasma</td>
			<td>PDC32G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>citric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>251275</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>concentrated hydrochloric acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H1758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deionized water</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15230147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dichloromethane</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270997</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diethyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>296082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Di-tert-butyl dicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>361941</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethyl acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>319902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylcarbamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U2500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>PHE0023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative Solution (4 % formaldehyde prepared in PBS)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R37814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidinium hydrochloride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A13543</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hexanes</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>227064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human mesenchymal stem cells</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-2501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>methyl iodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>289566</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-Diisopropylethylamine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A17114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N,N-dimethylformamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>227056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-Methylmorpholine N-oxide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A19802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetraoxide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>45385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>15140163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>20012050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphoryl chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>201170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium carbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>347825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>reverse phase column</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25305-154630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rhodamine Phalloidin</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>R415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>silica gel</td>
			<td>TCI America</td>
			<td>S0821</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium ethoxide</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>L13083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium periodide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>239313</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium sulfite</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium triacetoxyborohydride</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>B22060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>spectrophotometer(NanoDrop One/One&#7580; UV-Vis)</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>ND-ONE-W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stem Cell Growth Medium BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>PT-3001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetrahydrofuran</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>401757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>thioanisole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T28002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>toluene</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>triethylamine</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>trifluoroacetic acid</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A12198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>HFH10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication of a biomimetic nano-matrix with janus base nanotubes and fibronectin for stem cell adhesion

Una MN biomimetica è stata sviluppata per fungere da impalcatura biologica di ingegneria tissutale, che può migliorare l'ancoraggio delle cellule staminali. La MN biomimetica è formata da JBNT e FN attraverso l'auto-assemblaggio in una soluzione acquosa. I JBNT misurano 200-300 μm di lunghezza con canali cavi idrofobici interni e superfici idrofile esterne. I JBNT sono caricati positivamente e le FN sono addebitate negativamente. Pertanto, quando iniettati in una soluzione acquosa neutra, vengono legati insieme tramite incollaggio non covalente per formare i fasci di MN. Il processo di auto-assemblaggio viene completato in pochi secondi senza alcun iniziatore chimico, fonte di calore o luce UV. Quando il pH della soluzione NM è inferiore al punto isoelettrico delle FN (pI 5.5-6.0), i bundle nm si auto-rilasciano a causa della presenza di FN caricato positivamente.
La MN è nota per imitare morfologicamente la matrice extracellulare (ECM) e quindi può essere utilizzata come impalcatura iniettabile, che fornisce un'eccellente piattaforma per migliorare l'adesione hMSC. L'analisi della densità cellulare e gli esperimenti di imaging a fluorescenza hanno indicato che gli NMS hanno aumentato significativamente l'ancoraggio degli HMS rispetto al controllo negativo.

I nostri studi hanno scoperto che la formazione della MN di JBNT e FN è veloce, cosa che è avvenuta in 10 secondi. Come illustrato nella figura 2, il floccule bianco è stato ottenuto quando la soluzione JBNT è stata miscelata con la soluzione FN e pipettata più volte. Il processo di formazione della MN è completamente biomimetico. Non sono necessari stimoli esterni. Il processo di fabbricazione è molto più facile di quello di alcuni biomateriali emergenti, che si basa sulla luce ultr...

Watch this Scientific Journal Video about Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion at JoVE.com

Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

L'obiettivo di questo protocollo è mostrare l'assemblaggio di una nanomatrice biomimetica (NM) con nanotubi di base Janus (JBNT) e fibronectina (FN). Quando sono co-coltivate con cellule staminali mesenchimali umane (hSPC), le TM mostrano un'eccellente bioattività nell'incoraggiare l'adesione degli HMSC.

Fabbricazione di una nanoma matrice biomimetica con nanotubi di base Janus e fibronectina per l'adesione delle cellule staminali

A biomimetic NM was developed to serve as a tissue-engineering biological scaffold, which can enhance stem cell anchorage. The biomimetic NM is formed ...

fabrication-biomimetic-nano-matrix-with-janus-base-nanotubes

Research

JoVE Journal

Bioengineering

4.0K Views.  University of Connecticut. L'obiettivo di questo protocollo è mostrare l'assemblaggio di una nanomatrice biomimetica (NM) con nanotubi di base Janus (JBNT) e fibronectina (FN). Quando sono co-coltivate con cellule staminali mesenchimali umane (hSPC), le TM mostrano un'eccellente bioattività nell'incoraggiare l'adesione degli HMSC.

Video: Fabrication of a Biomimetic Nano-Matrix with Janus Base Nanotubes and Fibronectin for Stem Cell Adhesion

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Fabbricazione microfluidica di fibre polimeriche e bioibride con dimensioni e forma predesignate

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Ricerca

Bioingegneria

Helical Organization of Blood Coagulation Factor VIII on Lipid Nanotubes

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and membrane environment2.
Coagulation Factor VIII (FVIII)3 is a multi-domain blood plasma glycoprotein. Defect or deficiency of FVIII is the cause for Hemophilia type A&#160;-&#160;a severe bleeding disorder. Upon proteolytic activation, FVIII binds to the serine protease Factor IXa on the negatively charged platelet membrane, which is critical for normal blood clotting4. Despite the pivotal role FVIII plays in coagulation, structural information for its membrane-bound state is incomplete5. Recombinant FVIII concentrate is the most effective drug against Hemophilia type A and commercially available FVIII can be expressed as human or porcine, both forming functional complexes with human Factor IXa6,7.
In this study we present a combination of Cryo-electron microscopy (Cryo-EM), lipid nanotechnology and structure analysis applied to resolve the membrane-bound structure of two highly homologous FVIII forms: human and porcine. The methodology developed in our laboratory to helically organize the two functional recombinant FVIII forms on negatively charged lipid nanotubes (LNT) is described.&#160;The representative results demonstrate that our approach is sufficiently sensitive to define the differences in the helical organization between the two highly homologous in sequence (86% sequence identity) proteins. Detailed protocols for the helical organization, Cryo-EM and electron tomography (ET) data acquisition are given. The two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) structure analysis applied to obtain the 3D reconstructions of human and porcine FVIII-LNT is discussed. The presented human and porcine FVIII-LNT structures show the potential of the proposed methodology to calculate the functional, membrane-bound organization of blood coagulation Factor VIII at high resolution.

We present a combination of Cryo-electron microscopy, lipid nanotechnology, and structure analysis applied to resolve the membrane-bound structure of two highly homologous FVIII forms: human and porcine. The methodology developed in our laboratory&#160;to helically organize the two functional recombinant FVIII forms on negatively charged lipid nanotubes (LNT) is described.

Elicoidale Organization of Blood fattore VIII della coagulazione su Lipid nanotubi

Cryo-electron microscopy (Cryo-EM)1 is a powerful approach to investigate the functional structure of proteins and complexes in a hydrated state and ...

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and other matrix-modifying oxidants/enzymes released during inflammation) are implicated in triggering pathological changes in cellular function, phenotype and viability in a number of diseases. Here, we describe how cell-substrate impedance and live cell imaging approaches can be readily employed to accurately quantify real-time changes in cell adhesion and de-adhesion induced by matrix modification (using endothelial cells and myeloperoxidase as a pathophysiological matrix-modifying stimulus) with high temporal resolution and in a non-invasive manner. The xCELLigence cell-substrate impedance system continuously quantifies the area of cell-matrix adhesion by measuring the electrical impedance at the cell-substrate interface in cells grown on gold microelectrode arrays. Image analysis of time-lapse differential interference contrast movies quantifies changes in the projected area of individual cells over time, representing changes in the area of cell-matrix contact. Both techniques accurately quantify rapid changes to cellular adhesion and de-adhesion processes. Cell-substrate impedance on microelectrode biosensor arrays provides a platform for robust, high-throughput measurements. Live cell imaging analyses provide additional detail regarding the nature and dynamics of the morphological changes quantified by cell-substrate impedance measurements. These complementary approaches provide valuable new insights into how myeloperoxidase-catalyzed oxidative modification of subcellular extracellular matrix components triggers rapid changes in cell adhesion, morphology and signaling in endothelial cells. These approaches are also applicable for studying cellular adhesion dynamics in response to other matrix-modifying stimuli and in related adherent cells (e.g., epithelial cells).

Here, we present a protocol to continuously quantify cell adhesion and de-adhesion processes with high temporal resolution in a non-invasive manner by cell-substrate impedance and live cell imaging analyses. These approaches reveal the dynamics of cell adhesion/de-adhesion processes triggered by matrix modification and their temporal relationship to adhesion-dependent signaling events.

Utilizzando impedenza Cell-substrato e imaging cellulare dal vivo per misurare i cambiamenti in tempo reale in Cellular Adesione e De-adesione indotta da Matrix Modifica

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Biomembrane Fabrication dal solvente assistita doppio strato lipidico (SALB) Metodo

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning e montaggio dei microvasi 3D

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

Nanotubi di DNA come un Versatile strumento per lo studio di polimeri semiflessibili

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful research tools for studying human health and disease. To characterize the barrier function of cell layers cultured inside organ-on-chip devices, often transendothelial or transepithelial electrical resistance (TEER) is measured. To this end, electrodes are usually integrated into the chip by micromachining methods to provide more stable measurements than is achieved with manual insertion of electrodes into the inlets of the chip. However, these electrodes frequently hamper visual inspection of the studied cell layer or require expensive cleanroom processes for fabrication. To overcome these limitations, the device described here contains four easily integrated electrodes that are placed and fixed outside of the culture area, making visual inspection possible. Using these four electrodes the resistance of six measurement paths can be quantified, from which the TEER can be directly isolated, independent of the resistance of culture medium-filled microchannels. The blood-brain barrier was replicated in this device and its TEER was monitored to show the device applicability. This chip, the integrated electrodes and the TEER determination method are generally applicable in organs-on-chips, both to mimic other organs or to be incorporated into existing organ-on-chip systems.

This publication describes the fabrication of an organ-on-chip device with integrated electrodes for direct quantification of transendothelial electrical resistance (TEER). For validation, the blood-brain barrier was mimicked inside this microfluidic device and its barrier function was monitored. The presented methods for electrode integration and direct TEER quantification are generally applicable.

Fabbricazione e validazione di un sistema di organo-on-chip con elettrodi integrati direttamente quantificare transendoteliale resistenza elettrica

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies of endothelial-epithelial bilayers have traditionally relied on permeable support models that enable bilayer culture, but permeable supports are limited in their ability to replicate the diversity of human basement membranes. In contrast, hydrogel models that require chemical synthesis are highly tunable and allow for modifications of both the material stiffness and the biochemical composition via incorporation of biomimetic peptides or proteins. However, traditional hydrogel models are limited in functionality because they lack pores for cell-cell contacts and functional in vitro migration studies. Additionally, due to the thickness of traditional hydrogels, incorporation of pores that span the entire thickness of hydrogels has been challenging. In the present study, we use poly-(ethylene-glycol) (PEG) hydrogels and a novel zinc oxide templating method to address the previous shortcomings of biomimetic hydrogels. As a result, we present an ultrathin, basement membrane-like hydrogel that permits the culture of confluent cellular bilayers on a customizable scaffold with variable pore architectures, mechanical properties, and biochemical composition.

Current bilayer culture models do not allow for functional in vitro studies that mimic in vivo microenvironments. Using polyethylene glycol and a zinc oxide templating method, this protocol describes the development of an ultrathin biomimetic basement membrane with tunable stiffness, porosity, and biochemical composition that closely mimics in vivo extracellular matrices.

Coltura di cellule di idrogeli ultrasottile Innova elastico come una membrana dello scantinato biomimetici per Dual

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

Fabrication of Custom Agarose Wells for Cell Seeding and Tissue Ring Self-assembly Using 3D-Printed Molds

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease modeling. Self-assembled tissues offer advantages over scaffold-based tissue engineering, such as enhanced matrix deposition, strength, and function. However, there are few available methods for fabricating 3D tissues without seeding cells on or within a supporting scaffold. Previously, we developed a system for fabricating self-assembled tissue rings by seeding cells into non-adhesive agarose wells. A polydimethylsiloxane (PDMS) negative was first cast in a machined polycarbonate mold, and then agarose was gelled in the PDMS negative to create ring-shaped cell seeding wells. However, the versatility of this approach was limited by the resolution of the tools available for machining the polycarbonate mold. Here, we demonstrate that 3D-printed plastic can be used as an alternative to machined polycarbonate for fabricating PDMS negatives. The 3D-printed mold and revised mold design is simpler to use, inexpensive to produce, and requires significantly less agarose and PDMS per cell seeding well. We have demonstrated that the resulting agarose wells can be used to create self-assembled tissue rings with customized diameters from a variety of different cell types. Rings can then be used for mechanical, functional, and histological analysis, or for fabricating larger and more complex tubular tissues.

This protocol describes a platform for fabricating self-assembled tissue rings in variable sizes using a customized 3D-printed plastic mold. PDMS negatives are cured in the 3D-printed mold; then agarose is cast in the cured PDMS negatives. Cells are seeded into the resulting agarose wells where they aggregate into tissue rings.

Fabbricazione di pozzi di agarosio personalizzato per la semina delle cellule e tessuto anello auto-assemblaggio utilizzando stampi 3D-stampato

Engineered tissues are being used clinically for tissue repair and replacement, and are being developed as tools for drug screening and human disease ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Sintesi di nanotubi di carbonio Multi-parete modificati con nanoparticelle di argento e valutazione dell'attività antibatterica e proprietà citotossiche

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...