Morgan Psenicka'ya el yazması düzenleme ve tartışma için ve Dr. Grahame Kidd'e şekil biçimlendirme konusundaki yardımları için teşekkür ederiz. Bu çalışma NIAID K22 AI125466 (JLW) tarafından desteklenmiştir.

NOT: Tüm hayvan çalışmaları Cleveland Clinic Lerner Araştırma Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından yetkilendirilmiş ve onaylanmıştır.
1. Diseksiyon için ortam ve malzeme hazırlayın
NOT: Tüm tampon ve ortam tarifleri Tablo 1'de verilmiştir. Bu prosedür, biyogüvenlik kabini olarak adlandırılan bir doku kültüründe steril koşullar altında yapılır.
<ol><li>Karışık glia ortamını (MGM) hazırlayın ve sterilize edin. Bu, bir gün önce yapılabilir ve 4 ° C'de saklanabilir.</li>
	<li>Fibronektin'i sterilH2O ile 1:100 konsantrasyonda seyreltin. Seyreltilmiş fibronektinin hacmi, deney için kullanılan yavru sayısına ve CNS bölgesine bağlı olacaktır. 1 korteks için bir T25 şişe, 2-4 serebella için bir T25 şişe, 2-4 beyin sapı için bir T25 şişe ve 2-4 omurilik için bir T25 şişe kullanın. NOT: Yukarıda listelenen kriterleri kullanarak aynı bölgedeki dokuyu birleştirmek, aşağıda açıklanan protokolü değiştirmeden yeterli ayrışmaya izin verecektir. Adım 1.2'de açıklanandan daha fazla dokunun birleştirilmesi, ayrışma reaktif konsantrasyonlarının daha fazla optimizasyonunu gerektirecektir.</li>
	<li>Pipet 3 mL seyreltilmiş fibronektin T25 şişelere oda sıcaklığında ve 2 dakika bekletin.</li>
	<li>Fibronektini aspire edin ve şişelerin şişe kapağı gevşetilerek gece boyunca kurumasına izin verin.</li>
</ol>2. Korteks, beyincik, beyin sapı ve omurilik diseksiyonu
NOT: Bu prosedür tezgah üstünde yapılabilir ve diseksiyon kapsamı gerektirir. İşlemin tüm adımları için sıkı aseptik teknik kullanın ve oda havasına doku maruziyetini en aza indirin. Maksimum doku korumasını sağlamak için diseksiyon sırasında tüm ortamları buz üzerinde soğutulmuş halde tutun. Alternatif olarak, bu prosedür bir iç diseksiyon kapsamının kullanılmasına izin veren bir davlumbazda yapılabilir.
<ol><li>Tüm alanları% 70 etanol ile silin.</li>
	<li>10 cm'lik bir Petri kabına 10 mL PBS/antibiyotik çözeltisi (PAS) pipetin. Her yavru için disseke edilecek bir Petri kabı hazırlayın. Çözeltiyi soğuk tutmak için buz üzerine koyun.</li>
	<li>Dezenfekte edilmiş bir doku kültürü başlığında, her CNS bölgesi için bir tane olmak üzere 4 ayrı 15 mL konik tüpe 9 mL DMEM (katkı maddesi içermeyen) pipetin, tüp kapaklarını değiştirin ve buz üzerine koyun. Tüplerle buz kovasını diseksiyon kapsamından ulaşacak mesafeye yerleştirin.</li>
	<li>Adım 2.2'de hazırlanan 10 cm Petri kabını dezenfekte diseksiyon kapsamı aşamasına yerleştirin.</li>
	<li>Fare yavrusunu kurumsal protokole göre anestezi ve ötenazi yapar ve keskin makasla hızlı bir şekilde kafa keserek kafayı çıkarır. NOT: Doğum sonrası gün (P) 3-5 yavru kullanılır. Yaşlı yavrular daha gelişmiş bir CNS'ye sahiptir ve genişleyen glial hücreler için yeterli bir kaynak olmayabilir. Daha genç yavrular (P) 0-2 daha fazla sayıda glia verebilir ve kullanılabilir; ancak omurilik dokusunun büyüklüğü nedeniyle bu genç yaşta diseke edilmesi çok zordur.</li>
	<li>Yavrunun cildini% 70 etanol kullanarak temizleyin.</li>
	<li>İnce makas kullanarak, kutanöz tabakayı hayvanın başının orta çizgisi boyunca kesin, kaudal olarak başlayın ve buruna ulaşana kadar rostral hareket ettirin. Herhangi bir doku hasarını önlemek için kafatasını derinlemesine kesmekten kaçının.</li>
	<li>Kafayı aşağı doğru açılandırmak, kafatasının her iki tarafına kutanöz tabakayı çekmek ve yay makası kullanmak, kafatası orta hattı boyunca bir kesi yapın, foramen magnumundan başlayarak, yine kaudalden rostral'a kesin.</li>
	<li>İnce uçlu forsepslerle, kafatası yarısını sağ ve sol taraflara çekerek korteks, beyincik ve beyin sapını açığa çıkarın.</li>
	<li>Maruz kaldıktan sonra, beyni yavaşça kafatasından çıkarın ve Adım 2.2'de hazırlanan 10 cm'lik Petri kabına kaldırın. Arka beyin bağlı olarak anatomik yapıyı korumak için beynin hasar görmediğinden emin olun.</li>
	<li>Forsepslerin noktası yukarı bakacak şekilde ince, kavisli uçlu forseps kullanarak, beyinciği sıkıştırın. Meninksleri çıkarın ve buz kovasında belirlenmiş 15 mL konik tüpe yerleştirin.</li>
	<li>Beyin sapının doğrudan beyinciğin ventral olduğundan ve beyincik çıkarıldıktan sonra görülebildiğinden emin olun. İnce uçlu forsepslerle çıkarın, meninksleri çıkarın ve buz kovasında belirlenmiş 15 mL konik tüpe yerleştirin.</li>
	<li>Orta beyni korteksten ayırın, kortikal meninksleri çıkarın ve buz kovasında belirlenmiş 15 mL konik tüpe yerleştirin.</li>
	<li>Omuriliği çıkarmak için, kafası kesilmiş fare yavrusunu sırtüstü pozisyonda (yukarı doğru uzanan) yerleştirin ve kopmuş vertebral kolon araştırmacıya doğru yükseltilir.</li>
	<li>% 70 etanol ile tekrar püskürtün.</li>
	<li>Vertebral kolonun yanal tarafları boyunca, rostral ila kaudal yönde, göğüs kafesinden arka bacaklara ulaşana kadar kesin. Kesim yaparken, vertebral kolon görünene kadar iç organları geri itin.</li>
	<li>Vertebral kolonun her bir yan tarafı boyunca izole edilene kadar kesin ve Adım 2.2'de hazırlanan 10 cm'lik Petri kabına yerleştirin.</li>
	<li>Ventral tarafı yukarı, ince yay makası kullanarak, omurilik dokusunu açığa çıkarmak için bel bölgesine ulaşana kadar her omurların sağ ve sol taraflarını alternatif olarak kesin.</li>
	<li>Omuriliği ve meninksleri diseksiyon mikroskobu altında ince uçlu forseps ile nazikçe çıkarın. Buz kovasında belirlenmiş 15 mL konik tüpe yerleştirin.</li>
	<li>Her yavru için 2.5.-2.19 adımlarını tekrarlayın ve hazırlanan her T25 şişesi için adım 1.2'de belirtilen kriterlere uyacak şekilde aynı bölgedeki dokuyu birleştirin. NOT: Meninksleri mümkün olduğunca tamamen çıkarın. Önemli miktarda meninks kalırsa, meningeal hücrelerin fibroblast benzeri fenomeni büyüyecek ve hücre kültürünü ezecektir. Eşit fenotipteki çoklu omurilikler, spesifik bir hücre kültürü oluşturmak için birleştirilebilir. Hücrelerin aşırı kalabalıklaşmasının meydana gelmediğinden emin olun, bu da glial apoptoza ve diferansiyel fenotiplere yol açabilir.</li>
</ol>3. Doku ayrışması
NOT: Aşağıdaki tüm prosedürler, aseptik teknik ve steril malzemeler kullanılarak biyogüvenlik kabini olarak belirlenmiş steril doku kültüründe gerçekleştirilir.
<ol><li>Doku lizisine başlamak için her 15 mL'lik 9 mL DMEM konik tüpüne ve dokuya 0.53 mM EDTA içeren 1 mL% 0.05 tripsin ekleyin. NOT: DMEM, tripsin inhibitörü olarak işlev görebilen yüksek miktarda kalsiyum klorür içerir. Belirtilen adımları izleyerek ayrışma tamamlanmazsa, Hanks'in kalsiyum veya magnezyum içermeyen Dengeli Tuz Çözeltisi kullanılabilir. Tripsinizasyondan sonra, enzim bir tripsin inhibitörü eklenerek nötralize edilebilir, ancak sonraki adımlarda kullanılan DNaz I için bir kofaktör olduğu için çözeltiye kalsiyum tekrar eklenmelidir.</li>
	<li>10 mL'lik bir pipetle yaklaşık 20x tritüratlayın.</li>
	<li>Hücre süspansiyonlarını boş 50 mL konik tüplere aktarın.</li>
	<li>Çözeltiyi 37 ° C'de, 15 dakika boyunca% 5 CO2'de inkübe edin, 8 dakika sonra lizatları hafifçe çalkalayın.</li>
	<li>50 μg / mL'lik bir son konsantrasyon için her tüpe 5 mL MGM ve 200 μL (5 mg / mL) DNaz I ekleyin.</li>
	<li>Her lizatı 10 mL'lik pipet 10x ile tritüre edin.</li>
	<li>Ayrışmamış dokunun tüplerin dibine yerleşmesine izin vermek için hücre süspansiyonlarının oda sıcaklığında 3 dakika oturmasına izin verin.</li>
	<li>Hücre süspansiyonlarını yeni 50 mL konik tüplere aktarın ve ayrışmamış dokuyu geride bırakın. NOT: Yukarıda açıklanan lizis ve tritürasyon adımları, ayrışmamış doku miktarını önemli ölçüde sınırlar.</li>
	<li>Tüpleri frensiz 4 °C'de 3 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.</li>
	<li>Süpernatantı aspire edin ve kalan hücre peletlerini 5 mL MGM'de yeniden askıya alın.</li>
	<li>Peleti 5 mL pipet 20x ile tritüre edin.</li>
	<li>5 mL hücre süspansiyonlarını kaplamalı T25 şişelere plakalayın.</li>
	<li>Hücreleri 37 ° C'de,% 5 CO2'de inkübe edin ve hücre kalıntılarını gidermek için başlangıçta 24 saat sonra ortamı değiştirin. NOT: Bazı protokoller 72 saatten sonra ilk ortam değişikliğini önerir. Bu adımın optimizasyonu gerekebilir.</li>
	<li>MGM ile hücreler% 80 kaynaşana kadar (yaklaşık 5-7 gün) her 48-72 saatte bir% 100 ortam değişikliği yapın. NOT: Ortam değişmeden önce tüm ortamlar 37 °C'ye ısıtılmalıdır.</li>
</ol>4. Mikroglia izolasyonu
<ol><li>Karışık glia kültürleri% 80 akıcılığa ulaştığında, kapakları sıkarak ve parafin filmle kapatarak sallamak için şişeler hazırlayın.</li>
	<li>Mikroglia'yı karışık glial kültürlerden çıkarmak için, şişeleri 37 ° C'lik bir inkübatörün içindeki yörüngesel bir çalkalayıcıya yatay olarak sabitleyin. Şişeleri 1 saat boyunca 15 x g'de sallayın.</li>
	<li>Ortam ve pipeti 15 mL'lik konik bir tüpe çıkarın. Şişeleri 3 mL ılık MGM ile iki kez durulayın, 15 mL konik tüplere yıkama ekleyin. Bunlar mikroglia.</li>
	<li>Kültür şişelerine 5 mL sıcak, taze MGM ekleyin.</li>
	<li>Şişeleri parafin filmle yeniden kapatın, şişeleri çalkalayıcı üzerinde yatay olarak sabitleyin ve OPC'lerin astrositlerden ayrılması için 15 saat boyunca 37 ° C'de 15 x g'de çalkalayın. NOT: Bu adım gece boyunca yapılabilir, ancak 15 saatlik sarsıntı süresi kritik öneme sahiptir, çünkü fazla zaman hücre ölümüne neden olabilir.</li>
	<li>Süpernatantı adım 4.3'ten itibaren santrifüj edin. 3 dakika boyunca 300 x g'da ve standart protokollere göre kültür mikroglia16 veya biyolojik bir tahlil için kullanın.</li>
</ol>5. Oligodendrosit öncü hücre izolasyonu
NOT: OPC'leri ilk izolasyondan sonra kaplarken, poli-D-lizin kaplı bir yüzeye (steril plaka veya kapak kayması) kaplanmalıdır. Bu bölümü tamamlamadan önce bu materyalleri hazırlayın.
<ol><li>15 saatlik sallamanın ardından, süpernatantı şişelerden çıkarın ve steril 100 mm Petri kabı üzerindeki plakayı çıkarın.</li>
	<li>Süpernatantı 37 ° C'de, 30 dakika boyunca% 5 CO2'de kuluçkaya yatırın, kalan mikroglia'yı çıkarmak için 15 dakika sonra döndürün, çünkü bunlar yemeğe çok hızlı bir şekilde yapışacaktır. Bu adım için doku kültürü ile tedavi edilmemiş Petri kapları kullanılabilir.</li>
	<li>Poli-D-lizin kaplı bir yüzeydeki yapışkan olmayan hücre süpernatanı, sayımını ve plakasını çıkarın. Tipik olarak, 7.500-10.000 OPC kaplanır /cm2.</li>
	<li>37 °C'de, en az 1 saat (6 saate kadar) için% 5 CO2'yi inkübe edin, ardından ortamın% 95'ini yavaşça aspire edin ve OPC'lerin bozulmasını en aza indirmek için ortamı kuyunun duvarına pipetleyerek yavaşça sıcak OPC Ortamı ekleyin. Hücreler kullanıma hazır olana kadar medyayı her 48 saatte bir değiştirin. NOT: Aynı anda yalnızca bir kuyunun değiştirilmesi çok önemlidir. OPC'ler hassastır ve özellikle kuru koşullara karşı toleranssızdır. OPC ortamına PDGF-AA'nın eklenmesi, OPC olgunlaşmasını oligodendrositlere geciktirmektir. Bu faktör, deneysel odak olgun oligodendrositler ise kültür medyasından dışlanabilir.</li>
</ol>6. Astrosit izolasyonu
<ol><li>15 saatlik sallamanın ardından, süpernatantı çıkarın ve şişeleri ılık 1x PBS ile 2x durulayın.</li>
	<li>0.53 mM EDTA içeren 4 mL% 0.05 tripsin ekleyin ve 37 ° C'de,% 5 CO2'de 5 dakika veya hücreler kalkana kadar inkübe edin. Astrositlerin kalktığından emin olmak için, standart bir geniş alan mikroskobu kullanarak onları görselleştirin. Astrositler tripsinizasyondan sonra küresel olarak görünecektir.</li>
	<li>Astrositler ayrıldıktan sonra, şişeyi dikey olarak durun ve 4 mL MGM ekleyin. Karıştırmak için tritürat.</li>
	<li>Pipet astrositleri 15 mL'lik konik bir tüpe yerleştirin, 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.</li>
	<li>Astrosit Ortamındaki astrositleri ve fibronektin kaplı yüzeydeki plakayı adım 1.2'de açıklandığı gibi yeniden askıya alın. veya biyolojik tahlil için kullanın. NOT: 20 ng / mL murin fibroblast büyüme faktörü, astrosit kültürünün oluşturulmasına yardımcı olmak için ilk ortam değişikliği sırasında eklenebilir. Ek olarak, standart jelatin kaplama, fibronektin'e düşük maliyetli bir alternatif olabilir.</li>
</ol>7. İmmünositokimya kullanılarak mikroglia, OPC'ler, astrositler ve olgun oligodendrositlerin tanımlanması ve izolasyonu
<ol><li>Kaplanmış hücreler uygun akıcılığa ulaştığında, ortamı nazikçe çıkarın ve 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehit (PFA) kullanarak yapışkan hücreleri sabitleyin. Bu adımı bir biyogüvenlik kabininde yapın. NOT: Aspire ederken veya çözelti eklerken, hücre ayrılmasını önlemek için hafif basınçlı pipet.</li>
	<li>PFA'yı yavaşça aspire edin, ardından hücreleri 5 dakika boyunca 1x PBS ile 3 kat yıkayın.</li>
	<li>1x PBS'de% 10 serum ve% 0.1 Triton X-100 kullanarak uygun blokaj çözeltisi hazırlayın. NOT: Serum kaynağı, sekonder antikorun yükseldiği konakçı hayvanı yansıtır. Örneğin, ikincil antikor keçi anti-tavşanı ise, uygun bloke edici serum normal keçi serumudur. Aynı şekilde, ikincil antikor eşek anti-tavşanı ise, bloke edici serum normal eşek serumu olmalıdır.</li>
	<li>Hücreler tamamen kaplanana kadar bloke edici çözelti ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca bloke edin.</li>
	<li>Bir antikor seyreltici çözeltisi hazırlayın (9 mL 1x PBS, 0.01 g sığır serum albümini, 30 μL Triton X-100). Alternatif olarak, antikorlar adım 6.3'te açıklanan blokaj çözeltisinde seyreltilebilir.</li>
	<li>Antikor seyreltici veya bloke edici çözeltide aşağıdakilere özgü birincil antikorları seyreltin:<ol><li>Mikroglia: 1:250 seyreltmede (2.4 μg / mL) iyonize kalsiyum bağlayıcı adaptör molekülü 1 (Iba1).</li>
		<li>OPC'ler: 1:200 seyreltmede (5 μg / mL) nöral / glial antijen 2 (NG2).</li>
		<li>Olgun oligodendrositler: 1:400 seyreltmede miyelin bazik proteini (MBP) (konsantrasyon çok bağımlıdır ve optimizasyon gerekli olabilir).</li>
		<li>Astrositler: 1:400 seyreltmede glial fibriler asidik protein (GFAP) (0.25 μg / mL)17. NOT: Aynı türde yetiştirilen birincil antikorları karıştırmayın. NOT: GFAP beyaz cevher astrositlerini güvenilir bir şekilde etiketleyecektir. Gri madde astrositleri için alternatif bir işaretleyici kullanılması gerekebilir.</li>
	</ol></li>
	<li>Primer antikoru gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin (hafif ajitasyon tercih edilir).</li>
	<li>Birincil antikoru çıkarmak için 5 dakika boyunca 1x PBS ile 3x yıkayın.</li>
	<li>Uygun sekonder antikorlara sahip hücreleri, ışıktan korunan antikor seyrelticisinde veya bloke edici çözeltide 1:400 seyreltmede inkübe edin. NOT: Sekonder antikorlar, mevcut mikroskop parametrelerine bağlı olarak değiştirilebilen bir florofora konjuge edilir. Floresan sekonder antikorlar uygulandıktan sonra, mümkün olduğunca ışıktan koruyun.</li>
	<li>Sekonder antikoru oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe ederek ışığa maruz kalmayı sınırlayın.</li>
	<li>Fazla sekonder antikoru çıkarmak için 5 dakika boyunca 1x PBS ile 3 kez yıkayın.</li>
	<li>Çekirdekleri etiketlemek için 1:1.000 DAPI/PBS çözeltisi kullanın ve karanlıkta oda sıcaklığında hücreleri 5 dakika boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Karanlıkta 5 dakika boyunca 1x PBS ile 3x yıkayın.</li>
	<li>Montaj için, montaj ortamını uygulayın ve görüntülemeden önce karanlıkta kurumaya bırakın. NOT: Monte edilmiş kızaklar oda sıcaklığında 2-3 gün saklanabilir. Uzun süreli depolama için slaytları 4 °C'ye taşıyın. Maksimum sinyal için bir hafta içinde görüntü. Tüm temsili görüntüler konfokal mikroskopta görüntülenmiştir; Bununla birlikte, ters floresan mikroskoplar da önerilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Fields, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Biology+in+Learning+and+Cognition.">Glial Biology in Learning and Cognition.</a> The Neuroscientist. 20 (5), 426-431 (2014).</li><li>Nuriya, M., Hirase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+astrocytes+in+neurovascular+communication.">Involvement of astrocytes in neurovascular communication.</a> Progress in Brain Research. 225, 41-62 (2016).</li><li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia.">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).</li><li>Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+actively+surveying+and+shaping+neuronal+circuit+structure+and+function.">Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2013).</li><li>Kierdorf, K., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+steady+state.">Microglia in steady state.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3201-3209 (2017).</li><li>Hertz, L., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+astrocytes+for+potassium+ion+(K(+))+homeostasis+in+brain+and+glial+effects+of+K(+)+and+its+transporters+on+learning.">Importance of astrocytes for potassium ion (K(+)) homeostasis in brain and glial effects of K(+) and its transporters on learning.</a> Neurosciences and Biobehavior Reviews. 71, 484-505 (2016).</li><li>Gordon, G. R., Howarth, C., MacVicar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+Control+of+Blood+Flow+by+Astrocytes:+A+Role+for+Tissue+Oxygen+and+Other+Metabolic+Factors.">Bidirectional Control of Blood Flow by Astrocytes: A Role for Tissue Oxygen and Other Metabolic Factors.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, 209-219 (2016).</li><li>Schneider, J., Karpf, J., Beckervordersandforth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Astrocytes+in+the+Neurogenic+Niches.">Role of Astrocytes in the Neurogenic Niches.</a> Methods Mol Biol. 1938, 19-33 (2019).</li><li>Sharif, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+brain+barrier:+A+review+of+its+anatomy+and+physiology+in+health+and+disease.">Blood brain barrier: A review of its anatomy and physiology in health and disease.</a> Clinical Anatomy. 31 (6), 812-823 (2018).</li><li>von Bernhardi, R., Eugenin-von Bernhardi, J., Flores, B., Eugenin Leon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Cells+and+Integrity+of+the+Nervous+System.">Glial Cells and Integrity of the Nervous System.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 949, 1-24 (2016).</li><li>Gordon, J., Amini, S., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).</li><li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics.">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li><li>Bayraktar, O. A., Fuentealba, L. C., Alvarez-Buylla, A., Rowitch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+development+and+heterogeneity.">Astrocyte development and heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020362 (2015).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+and+stage-dependent+regulation+of+Olig+gene+expression+and+oligodendrogenesis+by+Nkx6.1+homeodomain+transcription+factor.">Region-specific and stage-dependent regulation of Olig gene expression and oligodendrogenesis by Nkx6.1 homeodomain transcription factor.</a> Development. 130 (25), 6221-6231 (2003).</li><li>Tan, Y. L., Yuan, Y., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+regional+heterogeneity+and+its+role+in+the+brain.">Microglial regional heterogeneity and its role in the brain.</a> Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).</li><li>Witting, A., Moller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+cell+culture:+a+primer+for+the+novice.">Microglia cell culture: a primer for the novice.</a> Methods in Molecular Biology. 758, 49-66 (2011).</li><li>Williams, J. L., Patel, J. R., Daniels, B. P., Klein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+CXCR7/ACKR3+as+a+therapeutic+strategy+to+promote+remyelination+in+the+adult+central+nervous+system.">Targeting CXCR7/ACKR3 as a therapeutic strategy to promote remyelination in the adult central nervous system.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (5), 791-799 (2014).</li><li>Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte,+Astrocyte,+and+Microglia+Crosstalk+in+Myelin+Development,+Damage,+and+Repair.">Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).</li><li>Tanner, D. C., Cherry, J. D., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+progenitors+reversibly+exit+the+cell+cycle+and+give+rise+to+astrocytes+in+response+to+interferon-gamma.">Oligodendrocyte progenitors reversibly exit the cell cycle and give rise to astrocytes in response to interferon-gamma.</a> Journal of Neuroscience. 31 (16), 6235-6246 (2011).</li><li>Stansley, B., Post, J., Hensley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+review+of+cell+culture+systems+for+the+study+of+microglial+biology+in+Alzheimer's+disease.">A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).</li><li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics.">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li><li>Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Overview+of+in+vitro+Methods+to+Study+Microglia.">An Overview of in vitro Methods to Study Microglia.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12 (242), (2018).</li><li>Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia:+much+more+than+the+neuron's+side-kick.">Glia: much more than the neuron's side-kick.</a> Current Biology. 13 (12), 469-472 (2003).</li><li>Fields, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+biology+in+learning+and+cognition.">Glial biology in learning and cognition.</a> Neuroscientist. 20 (5), 426-431 (2014).</li><li>Yamamuro, K., Kimoto, S., Rosen, K. M., Kishimoto, T., Makinodan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+primary+roles+of+glial+cells+in+the+mechanisms+of+psychiatric+disorders.">Potential primary roles of glial cells in the mechanisms of psychiatric disorders.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (154), (2015).</li><li>Hartenstein, V., Giangrande, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+the+nervous+and+the+immune+systems+in+evolution.">Connecting the nervous and the immune systems in evolution.</a> Communications Biology. 1 (1), 64 (2018).</li><li>Emsley, J. G., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+heterogeneity+closely+reflects+the+neuronal-defined+anatomy+of+the+adult+murine+CNS.">Astroglial heterogeneity closely reflects the neuronal-defined anatomy of the adult murine CNS.</a> Neuron Glia Biology. 2 (3), 175-186 (2006).</li><li>Chaboub, L. S., Deneen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Origins+of+Astrocyte+Heterogeneity:+The+Final+Frontier+of+CNS+Development.">Developmental Origins of Astrocyte Heterogeneity: The Final Frontier of CNS Development.</a> Developmental Neuroscience. 34 (5), 379-388 (2012).</li><li>Tan, Y. L., Yuan, Y., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+regional+heterogeneity+and+its+role+in+the+brain.">Microglial regional heterogeneity and its role in the brain.</a> Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).</li><li>Bottcher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microglia+regional+heterogeneity+and+phenotypes+determined+by+multiplexed+single-cell+mass+cytometry.">Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry.</a> Nature Neurosciences. 22 (1), 78-90 (2019).</li><li>Marques, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+heterogeneity+in+the+mouse+juvenile+and+adult+central+nervous+system.">Oligodendrocyte heterogeneity in the mouse juvenile and adult central nervous system.</a> Science. 352 (6291), 1326-1329 (2016).</li></ol>

Yazarların ifşa etmesi gereken çıkar çatışmaları vardır.

Bu protokolde, üç büyük glial hücre alt popülasyonunun fare CNS'sinden izolasyonunu açıklıyoruz: mikroglia, OPC'ler ve astrositler. Nörodejeneratif ve nöroinflamatuar SSS hastalıklarının araştırılmasında önemli bir gerileme, birincil insan hücrelerinin ve dokularının, özellikle de bölgesel ve aynı hastadan gelenlerin eksikliğidir. Çoğu durumda, insan CNS hücre çizgileri, normal fizyolojik davranışlarının doğru temsilleri olmayabilecek dönüştürülmüş, ölümsüzleşmiş kanser hücrelerinden türetilir20,21,22. Bu nedenle, CNS hücre fenotiplerini kontrollü bir şekilde incelemek için alternatif yöntemler gereklidir. Ayrıca, nörolojik glial hücre popülasyonlarının çeşitliliği, her bir alt tipin hem birbirinden bağımsız olarak hem de hem hücre özerk hem de otonom olmayan işlevlerini özetlemek için ortak kültür koşullarında araştırılmasını gerekli kılmaktadır. Glial hücreler, CNS'de nöronal destek23, öğrenme / biliş 24,25 ve CNS immünolojik yanıtları26 arasında değişen çok çeşitli kritik fonksiyonlara sahiptir. Bu nedenle, her bir glial alt popülasyonun moleküler ve hücresel fonksiyonlarını fizyolojik ve patolojik bir bağlamda anlamak gerekir. Bunu yapmak için, burada canlı glia alt tiplerinin ekstraksiyonu ve izolasyonu için güvenilir bir yöntem sunuyoruz. İnsan deneğin araştırmasındaki pratik ve etik kısıtlamalar nedeniyle, hayvan modelleri şu anda insan glial hücre biyolojisi için en uygun vekillerdir. Özellikle, fareler ideal model hayvanlardır, çünkü genomları sağlık ve hastalığın altında yatan belirli moleküler mekanizmaları daha da incelemek için manipüle edilebilir ve analiz edilebilir. Bu nedenle, murin mikroglia, OPC'ler ve astrositlerin başarılı bir şekilde çıkarılması ve ayrılması, fizyolojik, nörodejeneratif veya nöroinflamatuar durumlar sırasında glia'nın işlevlerini araştırmak için önemli bir araçtır.
Bu protokol, CNS hücresinin bölgesel heterojenliğini keşfetmek için optimize edilebilir. Glia'nın biçim ve işlev olarak bölgesel heterojenlik sergilediği giderek daha açık hale gelmektedir. Astrositler bölgesel olarak çeşitlidir ve CNS27 içindeki konumlarına bağlı olarak farklı morfoloji gösterirler. Ayrıca, astrositlerin yoğunluğu ve mitotik indeksleri anatomik bölgeleri tanımlayabilir ve bölgesel astrosit heterojenliğinin CNS28 içindeki konumlarına bağlı olarak moleküler ve fonksiyonel farklılıkları yansıtabileceği hipotezini destekleyebilir. Mikroglial bölgesel heterojenite de aktif olarak araştırılmaktadır, ancak MSS gelişimi veya davranışındaki mikroglia çeşitliliğinin altında yatan mekanizmalar ve fonksiyonel sonuçlar şu anda belirsizdir. Bununla birlikte, yetişkin mikroglia'nın hücre sayısında, hücre ve hücre altı yapılarında ve moleküler imzalarda çeşitlilik gösterdiği bilinmektedir29. Ayrıca, çoklanmış kütle sitometrisindeki son gelişmeler, dokuz insan donörünün beş farklı CNS bölgesinden hücresel fenotipi analiz ederek, insan mikroglia30'un büyük ölçekli immünofenotipine izin vererek, mikroglia'nın bölgesel heterojenliğini daha da tanımlamıştır. Şu anda, bu tür yaklaşımlar yeni ortaya çıkma aşamalarındadır ve hayvan çalışmalarını CNS hastalığı gelişiminde bölgesel glia çalışması için uygun bir çözüm haline getirmektedir. Son olarak, bölgesel heterojenite son zamanlarda oligodendrositlerde de tanımlanmıştır. Juvenil ve yetişkin CNS'nin 10 bölgesinden 5072 bireysel hücre üzerinde tek hücreli RNA dizilimi, farklılaşmanın farklı aşamalarında 13 farklı alt popülasyon tanımladı31. Önemli olarak, oligodendrositlerin OPC'lerden olgunlaştıkça, transkripsiyonel profillerinin farklılaştığı ve fonksiyonel fenotiplerinin değiştiği ve CNS31 içindeki oligodendrosit heterojenliğini vurguladığı bulunmuştur.
Bu nedenle, çeşitli yerleşik CNS hücrelerinin bölgesel heterojenliğini, çeşitli komşu nöronları ve diğer gliaları bağlamında anlamak, nöroinflamatuar ve nörodejeneratif bozuklukları tedavi etmek için yeni tedavilerin gelecekteki gelişimi için önemli bir gerekçe sağlayabilir. Bu protokol, glial alt popülasyonların ekstraksiyonu, izolasyonu ve tanımlanmasına odaklanırken, işlevlerinin incelenmesi için uygun bir başlangıç noktası sağlar. Ayrıca, glial hücre biyolojisi ile ilişkili genetik mekanizmaları incelemek için transgenik fare modelleriyle uyarlanabilir ve birleştirilebilir. Ayrıca, glial hücrelerin ko-kültür tahlillerinde birbirlerine verdikleri yanıtları incelemek için de kullanılabilir. Özetlenen adımlar, daha sonra çok çeşitli deneysel parametrelere uyarlanabilen farklı CNS glial popülasyonlarının çıkarılması ve izole edilmesi için uygun maliyetli ve yüksek verimli bir yöntemi temsil etmektedir. Unutulmamalıdır ki; Bununla birlikte, burada açıklanan yöntem, daha düşük miyelinasyon seviyeleri ve çoğalan gliaların yüksek yoğunluğu nedeniyle yenidoğanları kullanır. Bu nedenlerden dolayı, canlı glia'yı yenidoğanlardan izole etmek yetişkin hayvanlara kıyasla teknik olarak daha uygundur. Bu nedenle, yenidoğan gliasındaki yetişkin gliaya kıyasla fenotipik farklılıklar deneysel tasarım ve veri yorumlama sırasında göz önünde bulundurulmalıdır.

Glia, CNS'de uygun nöronal fonksiyon için gereklidir. Her biri farklı, ancak vazgeçilmez bir role sahip üç ana alt popülasyon, astrositler, oligodendrositler ve mikroglia'dan oluşurlar1. Uygun glial hücre çeşitliliği ve aktivitesi olmadan, nöronal fonksiyon ciddi şekilde etkilenecek ve CNS bozukluğuna yol açacaktır. Glia nörotransmisyonunu etkileyebilir ve her hücre tipi bunu benzersiz bir şekilde yapar. Beyindeki glial hücreler, uygun CNS fonksiyonunu kolaylaştırmak için kendi aralarında ve nöronal hücrelerle iletişim kurma kapasitesine sahiptir2. Oligodendrositler, nöronal aksiyon potansiyeli nesil3'ün bölgeleri olan Ranvier'in düğümlerinde iyon kanallarının kümelenmesini kolaylaştıran bir miyelin kılıfının oluşumu yoluyla elektriksel iletim hızını arttırır. Mikroglia, sinaptik iletimi izleyerek ve yaralanma sonrası nöronal bağlantıları "yeniden kablolayarak" sinapsların budaması için kritiköneme sahiptir 4. Ek olarak, mikroglia, CNS'nin en bol bulunan yerleşik bağışıklık hücresidir ve patojenlere karşı konakçı savunmasının birincil formu olarak işlev görür5. Astrositler, hücre dışı potasyum6 konsantrasyonunu değiştirerek nöronlar arasındaki sinaptik iletimi düzenleyebilir. Ayrıca lokal kan akışını kontrol etmede7, nöromodülatör elementlerin salınmasında ve alınmasındarollere sahiptirler 8 ve kan-beyin bariyeri bakımı9'da kilit bir role sahiptirler. Bu nedenle, her glial alt tip CNS fonksiyonu için kritiktir, çünkü herhangi bir tipteki kusurlar uzun zamandır psikiyatrik hastalıklar, epilepsi ve nörodejeneratif durumlar dahil olmak üzere çok çeşitli patolojik durumlarla ilişkilendirilmiştir10.
CNS patobiyolojisinin incelenmesindeki en büyük engel, insan hücrelerinin mikroçevresel nişleri bağlamında araştırılamamasıdır. İnsan biyopsi dokusu en çok ölüm sonrası toplanır ve hücreler ekstraksiyon ve işleme sırasında kolayca hasar görebilir veya kaybolabilir. Dahası, insan hücrelerini tümörlerden ölümsüzleştirilmiş hücre hatları elde etmeden herhangi bir süre boyunca in vitro olarak canlı ve canlı tutmak bir zorluktur, bu noktada artık normal fizyolojik özelliklerini doğru bir şekilde yansıtmamaktadırlar11,12. Ek olarak, bireysel glia hücre tipleri13,14,15 arasında önemli miktarda bölgesel heterojenlik vardır ve bireysel hastalardan bölgesel CNS örnekleri almak neredeyse imkansızdır. Bu nedenle, spesifik CNS bozukluklarında bölgesel glia'nın katkısını incelemek için alternatif modeller geliştirmek gerekir.
Burada, çoklu glial alt popülasyonların fare CNS bölgesine özgü izolasyonunu kullanarak, olgun oligodendrositlere ve astrositlere yol açan mikroglia, oligodendrosit öncü hücrelerinin (OPC'ler) manipülasyonuna ve nicelleştirilmesine izin veren in vitro bir sistemi tanımlamaktayız. Her popülasyon bağımsız olarak izole edilebilir ve deneysel gerekliliğe bağlı olarak ilaç veya molekül tedavisi, immünositokimya, protein / RNA ekstraksiyonu ve analizi ve diğer ko-kültür sistemleri dahil olmak üzere çok çeşitli deneysel tekniklere tabi tutulabilir. Ek olarak, bu izolasyon tekniği yüksek hücre sayısı verir ve her glial popülasyonun yüksek verimli bir şekilde karakterize edilmesine ve araştırılmasına izin verir. Ayrıca, tipik olarak in vivo bir ortamda bulunan kafa karıştırıcı faktörlerden kaçınmak için çok çeşitli mikroçevresel uyaranlara yanıt olarak CNS hücre farklılaşmasının, büyümesinin ve çoğalmasının kontrollü bir şekilde incelenmesini sağlar. Son olarak, bu hücre izolasyon tekniği, bölgesel glia'nın birbirleriyle nasıl etkileşime girdiğini araştırmak ve değişen uyaranlara nasıl tepki verdiğini araştırmak için farklı CNS bölgelerindeki glial hücre popülasyonlarının manipülasyonunu kolaylaştırır, bu da hassasiyet ve tekrarlanabilirliğe izin verir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665 180</td>
			<td>Cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td>Standard reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL, 25 cm2 cell culture flask</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>690 175</td>
			<td>Cell culture (T25) flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-096</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement 50X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-50G</td>
			<td>Antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td>Confocal for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995040</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3840001</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-1MG</td>
			<td>Cell adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine stitch Scissors</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>64-3260</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Secondary staining antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21434</td>
			<td>Secondary staining antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170120</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20530081</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine epidermal growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PMG8044</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-05-20UG</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine PDGF-AA</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-17</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Blocking solution component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>Surgi-OR</td>
			<td>95-272</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip</td>
			<td>Corning Biocoatt</td>
			<td>354086</td>
			<td>Cell adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9071S</td>
			<td>Mounting Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Iba1</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab5320</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-GFAP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>13-0300</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-myelin basic protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7349</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Tip Scissors</td>
			<td>Surgi-OR</td>
			<td>95-104</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S4 E Stereo Zoom Microscope</td>
			<td>Microscope for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>66-7644</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Cell permabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor (from chicken egg white)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10109878001</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and isolation of murine glia from multiple central nervous system regions

Burada sunulan yöntemler, glial alt popülasyonların izolasyonu için merkezi sinir sisteminin (CNS) dört farklı bölgesinin murin yenidoğanlardan diseksiyonu için laboratuvar prosedürlerini göstermektedir. İşlemin amacı, in vitro analizi kolaylaştırmak için mikroglia, oligodendrosit progenitör hücreleri (OPC'ler) ve astrositleri kortikal, serebellar, beyin sapı ve omurilik dokusundan ayırmaktır. CNS bölgesi izolasyon prosedürleri, çoklu hücre kültürü sistemlerinde glia arasında bölgesel heterojenliğin belirlenmesine izin verir. Hızlı CNS bölgesi izolasyonu gerçekleştirilir, ardından glia'nın meningeal hücre kontaminasyonunu önlemek için meninkslerin mekanik olarak çıkarılması gerçekleştirilir. Bu protokol, hücre bütünlüğünü ve yapışkanlığını korumak için tasarlanmış belirli bir matris üzerinde nazik doku ayrışmasını ve kaplamayı birleştirir. Karışık glia'yı birden fazla CNS bölgesinden izole etmek, bireysel deney hayvanlarının kullanımını en üst düzeye çıkarırken, potansiyel olarak heterojen glia'nın kapsamlı bir analizini sağlar. Ek olarak, bölgesel dokunun ayrışmasını takiben, karışık glia, tek hücre tipi, hücre kültürü plakası ekleri veya ko-kültür sistemlerinde kullanılmak üzere mikroglia, OPC'ler ve astrositler dahil olmak üzere çoklu hücre tiplerine ayrılır. Genel olarak, gösterilen teknikler, dört ayrı CNS bölgesinin murin yenidoğanlardan dikkatli bir şekilde diseksiyonu için kapsamlı bir uygulanabilirlik protokolü sağlar ve herhangi bir sayıda in vitro hücre kültürü sisteminde veya tahlilinde bölgesel heterojenliği incelemek için üç ayrı glia hücre tipinin izolasyonu için yöntemler içerir.

Aşağıda gösterilen temsili veriler, IFNγ sinyallemesinin OPC farklılaşmasını ve olgunlaşmasını etkilediğini göstermektedir. IFNγ reseptörü (IFNγR) varlığı olmadan, kortikal OPC'ler olgun miyelinizan oligodendrositlere kolayca farklılaşmaz, bu da MBP boyamasının yokluğu ile kanıtlanır (Şekil 1). Oligodendrositler ve astrositler ortak bir progenitörden türetildiğinden, astrositleri etiketleyen GFAP ekspresyonunu analiz ettik. IFNγR eksikliği olan hücrelerin, GFAP'yi güçlü bir şekilde eksprese ettiklerini, astrositik bir fenotipi benimsemiş olabileceklerini ve daha önceki raporları19'u doğruladıklarını düşündürdüğünü bulduk.
CNS hücrelerinde bölgesel heterojenite için ek kanıtlar, korteks, beyincik, beyin sapı ve omurilikten astrositlerde görüldüğü gibi değişen astrosit morfolojisi ile kanıtlanmıştır (Şekil 2). Aynı bölgedeki astrositler de morfolojik heterojenlik sergileyebilir ve bu glial alt tipin oldukça dinamik olduğu fikrini destekleyebilir. Hücresel mimarideki farklılıklar fonksiyonel çeşitliliği düşündürmektedir ve bu nedenle glial popülasyonları izole etme yeteneği, mikroçevresel uyaranların yokluğunda ve varlığında fenotipik yanıtları incelemek için gereklidir.
Oligodendrositler, nöronal aksonların miyelinasyonu için kritik öneme sahiptir ve uygun CNS onarımı ve fonksiyonu için gereklidir. OPC'ler olgun meslektaşlarına yol açar ve farklılaşma yeteneklerinin arkasındaki biyolojiyi anlamayı kritik hale getirir. Sitokin sinyalizasyonu kök ve immün hücre davranışını önemli ölçüde etkiler. Bu nedenle, OPC'lerin bölgesel tepkilerinin diferansiyel sitokin stimülasyonuna nasıl değişebileceğini anlamak önemlidir (Şekil 3), bu da olgun miyelinizan oligodendrositlere farklılaşma yeteneklerini etkileyebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig01.jpg"> Şekil 1: Eksojen IFNγ varlığında WT ve IFNγR-/- farelerde OPC farklılaşmasını gösteren temsili veriler. Kortikal OPC'ler, yukarıda özetlenen prosedürü izleyerek (A ) WT ve (B) IFNγR-/- P4 fare yavrularından izole edildi. Hücreler 48 saat boyunca 1 ng / mL IFNγ ile tedavi edildi, daha sonra hücre farklılaşmasını tanımlamak için sabitlendi ve boyandı. OPC'ler, astrositik bir fenotipi benimseyenleri tanımlamak için NG2 ve GFAP için etiketlendi. Benzer şekilde, OPC'ler de olgun oligodendrositlere farklılaşanları tanımlamak için NG2 ve MBP için etiketlendi. Ölçek çubuğu = 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig02.jpg"> Şekil 2: Astrosit morfolojisinde bölgesel heterojenliği gösteren temsili veriler. Korteks, beyincik, beyin sapı ve omurilikten astrositler, yukarıda açıklanan protokol kullanılarak P4 fare yavrularından izole edildi ve kültürde 48 saat sonra immünositokimya ile GFAP (yeşil) için etiketlendi. Ölçek çubuğu = 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig03.jpg"> Şekil 3: Bölgesel OPC'lerin sitokinlere ayırıcı yanıtlarını gösteren temsili veriler. OPC'ler, yukarıda açıklanan protokol kullanılarak P4 fare yavrularının beyin sapından ve omuriliğinden izole edildi. Hücreler, sitokinin bölgesel OPC'lerin miyelinizan oligodendrositlere farklılaşma yeteneği üzerindeki diferansiyel etkisini araştırmak için artan konsantrasyonlarda (1-10 ng / mL) ( A ) IFNγ veya (B ) interlökin (IL)-17 ile tedavi edildi. Belirtilen sitokinlerle 48 saatlik bir inkübasyonun ardından, OPC'ler sabitlendi ve NG2 (yeşil) ve MBP (kırmızı) için etiketlendi. Ölçek çubuğu = 20 μM. Veriler, SEM ± anlamına gelir. **, p < 0,01; , p < 0,001; , p 0.0001 < 2-yönlü ANOVA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">PBS / Antibiyotik Çözeltisi (PAS):</td>
		</tr><tr><td>1,0 mL</td>
			<td colspan="2">10.000 ünite/mL penisilin ve 10.000 mg/mL streptomisin içeren 100X Antibiyotik/Antimikotik</td>
		</tr><tr><td>25 mg/mL</td>
			<td colspan="2">Amfoterisin B</td>
		</tr><tr><td>99 mL</td>
			<td colspan="2">1X PBS</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Karışık glia Medya (MGM)</td>
		</tr><tr><td>88 mL</td>
			<td colspan="2">1X DMEM (yüksek glukoz, L-glutamin, Na piruvat ile)</td>
		</tr><tr><td>10 mL</td>
			<td colspan="2">Isı ile inaktive edilmiş FBS</td>
		</tr><tr><td>1,0 mL</td>
			<td colspan="2">L-Glutamin (100X)</td>
		</tr><tr><td>1,0 mL</td>
			<td colspan="2">Antibiyotik/Antimikotik</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">OPC Medya (50mL)</td>
		</tr><tr><td>49 mL</td>
			<td colspan="2">Nörobazal medya</td>
		</tr><tr><td>1,0 mL</td>
			<td colspan="2">B27 takviyesi (50X)</td>
		</tr><tr><td>10 ng/ml</td>
			<td colspan="2">PDGF-AA</td>
		</tr><tr><td colspan="3">NOT: PDGF-AA, her medya değişikliğinden önce yeni eklenir.</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Astrosit Medya (1 L)</td>
		</tr><tr><td>764 mL</td>
			<td colspan="2">Glutamin içeren Earle tuzları ile MEM</td>
		</tr><tr><td>36 mL</td>
			<td colspan="2">Glikoz (20 mM'lik son konsantrasyon için 100 mg/mL stok kullanın)</td>
		</tr><tr><td>100 mL</td>
			<td colspan="2">Isı ile inaktive edilmiş FBS</td>
		</tr><tr><td>100 mL</td>
			<td colspan="2">Isı ile inaktive edilmiş at serumu</td>
		</tr><tr><td>10 mL</td>
			<td colspan="2">Glutamin (stok ortamına dahil değilse 200 mM stok kullanın)</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">İSTEĞE BAĞLI: 10 ng/mL rekombinant fare epidermal büyüme faktörü</td>
		</tr><tr><td colspan="3">NOT: Tüm ortamları steril olarak filtreleyin ve kullanılıncaya kadar 4°C'de saklayın.</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Tampon ve Medya Tarifleri.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions at JoVE.com

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

Burada, bir fare CNS'sinden çoklu glial hücre popülasyonlarının in vitro izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, bölgesel mikroglia, oligodendrosit öncü hücreleri ve astrositlerin çeşitli kültür sistemlerinde her birinin fenotiplerini incelemek için ayrılmasına izin verir.

Murine glia'nın Multipl Merkezi Sinir Sistemi Bölgelerinden Diseksiyonu ve İzolasyonu

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

dissection-isolation-murine-glia-from-multiple-central-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.1K Görüntüleme.  Lerner Research Institute, Cleveland Clinic Foundation. Burada, bir fare CNS'sinden çoklu glial hücre popülasyonlarının in vitro izolasyonu için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, bölgesel mikroglia, oligodendrosit öncü hücreleri ve astrositlerin çeşitli kültür sistemlerinde her birinin fenotiplerini incelemek için ayrılmasına izin verir.

Video: Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Fareler ve Merkezi Sinir Sisteminde Kök Hücre İmplantasyonu Multimodal Görüntüleme

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Nörobilim

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Merkezi sinir sisteminin transducing Hücreleri için lentiviral Vektörler Üretimi

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Santral Sinir Sistemi Onarım İnceleyecek Bir Sakatlık Paradigma<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Kemirgen Merkezi Sinir Sistemi İlaçların doğrudan Intraventriküler teslim

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Sıçan Santral Sinir Sistemi immunohistokimyasal Analizi ve Çevresel lenf nodu Doku Bölümler

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

Polyribosome Fraksiyonu tarafından Santral Sinir Sistemi Translatome in vivo sorguluyor

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

Kemirgen Santral Sinir Sistemi vivo optogenetic Stimülasyon içinde

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Pasif kullanımı Netlik Fare Merkezi Sinir Sistemi Optik Takas

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Üçüncü-biçim Drosophila Melanogaster merkezi sinir sisteminin etkinliğinin elektrofizyolojik kayıt

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...