אנו מודים למורגן פסניקה על העריכה והדיון בכתב היד ולד"ר גרהאם קיד על הסיוע בעיצוב הדמויות. עבודה זו נתמכה על ידי NIAID K22 AI125466 (JLW).

<ol>
	<li>Fields, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Biology+in+Learning+and+Cognition.">Glial Biology in Learning and Cognition.</a> The Neuroscientist. 20 (5), 426-431 (2014).</li><li>Nuriya, M., Hirase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Involvement+of+astrocytes+in+neurovascular+communication.">Involvement of astrocytes in neurovascular communication.</a> Progress in Brain Research. 225, 41-62 (2016).</li><li>Nave, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia.">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468 (7321), 244-252 (2010).</li><li>Wake, H., Moorhouse, A. J., Miyamoto, A., Nabekura, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+actively+surveying+and+shaping+neuronal+circuit+structure+and+function.">Microglia: actively surveying and shaping neuronal circuit structure and function.</a> Trends in Neurosciences. 36 (4), 209-217 (2013).</li><li>Kierdorf, K., Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+steady+state.">Microglia in steady state.</a> The Journal of Clinical Investigation. 127 (9), 3201-3209 (2017).</li><li>Hertz, L., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+astrocytes+for+potassium+ion+(K(+))+homeostasis+in+brain+and+glial+effects+of+K(+)+and+its+transporters+on+learning.">Importance of astrocytes for potassium ion (K(+)) homeostasis in brain and glial effects of K(+) and its transporters on learning.</a> Neurosciences and Biobehavior Reviews. 71, 484-505 (2016).</li><li>Gordon, G. R., Howarth, C., MacVicar, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bidirectional+Control+of+Blood+Flow+by+Astrocytes:+A+Role+for+Tissue+Oxygen+and+Other+Metabolic+Factors.">Bidirectional Control of Blood Flow by Astrocytes: A Role for Tissue Oxygen and Other Metabolic Factors.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 903, 209-219 (2016).</li><li>Schneider, J., Karpf, J., Beckervordersandforth, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+Astrocytes+in+the+Neurogenic+Niches.">Role of Astrocytes in the Neurogenic Niches.</a> Methods Mol Biol. 1938, 19-33 (2019).</li><li>Sharif, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+brain+barrier:+A+review+of+its+anatomy+and+physiology+in+health+and+disease.">Blood brain barrier: A review of its anatomy and physiology in health and disease.</a> Clinical Anatomy. 31 (6), 812-823 (2018).</li><li>von Bernhardi, R., Eugenin-von Bernhardi, J., Flores, B., Eugenin Leon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+Cells+and+Integrity+of+the+Nervous+System.">Glial Cells and Integrity of the Nervous System.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 949, 1-24 (2016).</li><li>Gordon, J., Amini, S., White, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+overview+of+neuronal+cell+culture.">General overview of neuronal cell culture.</a> Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).</li><li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics.">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li><li>Bayraktar, O. A., Fuentealba, L. C., Alvarez-Buylla, A., Rowitch, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocyte+development+and+heterogeneity.">Astrocyte development and heterogeneity.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (1), 020362 (2015).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+and+stage-dependent+regulation+of+Olig+gene+expression+and+oligodendrogenesis+by+Nkx6.1+homeodomain+transcription+factor.">Region-specific and stage-dependent regulation of Olig gene expression and oligodendrogenesis by Nkx6.1 homeodomain transcription factor.</a> Development. 130 (25), 6221-6231 (2003).</li><li>Tan, Y. L., Yuan, Y., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+regional+heterogeneity+and+its+role+in+the+brain.">Microglial regional heterogeneity and its role in the brain.</a> Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).</li><li>Witting, A., Moller, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+cell+culture:+a+primer+for+the+novice.">Microglia cell culture: a primer for the novice.</a> Methods in Molecular Biology. 758, 49-66 (2011).</li><li>Williams, J. L., Patel, J. R., Daniels, B. P., Klein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+CXCR7/ACKR3+as+a+therapeutic+strategy+to+promote+remyelination+in+the+adult+central+nervous+system.">Targeting CXCR7/ACKR3 as a therapeutic strategy to promote remyelination in the adult central nervous system.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (5), 791-799 (2014).</li><li>Domingues, H. S., Portugal, C. C., Socodato, R., Relvas, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte,+Astrocyte,+and+Microglia+Crosstalk+in+Myelin+Development,+Damage,+and+Repair.">Oligodendrocyte, Astrocyte, and Microglia Crosstalk in Myelin Development, Damage, and Repair.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 4, 71 (2016).</li><li>Tanner, D. C., Cherry, J. D., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+progenitors+reversibly+exit+the+cell+cycle+and+give+rise+to+astrocytes+in+response+to+interferon-gamma.">Oligodendrocyte progenitors reversibly exit the cell cycle and give rise to astrocytes in response to interferon-gamma.</a> Journal of Neuroscience. 31 (16), 6235-6246 (2011).</li><li>Stansley, B., Post, J., Hensley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparative+review+of+cell+culture+systems+for+the+study+of+microglial+biology+in+Alzheimer's+disease.">A comparative review of cell culture systems for the study of microglial biology in Alzheimer's disease.</a> Journal of Neuroinflammation. 9 (1), 115 (2012).</li><li>Spaethling, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+Cell+Culture+of+Live+Neurosurgically+Resected+Aged+Adult+Human+Brain+Cells+and+Single+Cell+Transcriptomics.">Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics.</a> Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).</li><li>Timmerman, R., Burm, S. M., Bajramovic, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Overview+of+in+vitro+Methods+to+Study+Microglia.">An Overview of in vitro Methods to Study Microglia.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12 (242), (2018).</li><li>Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glia:+much+more+than+the+neuron's+side-kick.">Glia: much more than the neuron's side-kick.</a> Current Biology. 13 (12), 469-472 (2003).</li><li>Fields, R. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+biology+in+learning+and+cognition.">Glial biology in learning and cognition.</a> Neuroscientist. 20 (5), 426-431 (2014).</li><li>Yamamuro, K., Kimoto, S., Rosen, K. M., Kishimoto, T., Makinodan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+primary+roles+of+glial+cells+in+the+mechanisms+of+psychiatric+disorders.">Potential primary roles of glial cells in the mechanisms of psychiatric disorders.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (154), (2015).</li><li>Hartenstein, V., Giangrande, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+the+nervous+and+the+immune+systems+in+evolution.">Connecting the nervous and the immune systems in evolution.</a> Communications Biology. 1 (1), 64 (2018).</li><li>Emsley, J. G., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+heterogeneity+closely+reflects+the+neuronal-defined+anatomy+of+the+adult+murine+CNS.">Astroglial heterogeneity closely reflects the neuronal-defined anatomy of the adult murine CNS.</a> Neuron Glia Biology. 2 (3), 175-186 (2006).</li><li>Chaboub, L. S., Deneen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Origins+of+Astrocyte+Heterogeneity:+The+Final+Frontier+of+CNS+Development.">Developmental Origins of Astrocyte Heterogeneity: The Final Frontier of CNS Development.</a> Developmental Neuroscience. 34 (5), 379-388 (2012).</li><li>Tan, Y. L., Yuan, Y., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+regional+heterogeneity+and+its+role+in+the+brain.">Microglial regional heterogeneity and its role in the brain.</a> Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).</li><li>Bottcher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microglia+regional+heterogeneity+and+phenotypes+determined+by+multiplexed+single-cell+mass+cytometry.">Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry.</a> Nature Neurosciences. 22 (1), 78-90 (2019).</li><li>Marques, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+heterogeneity+in+the+mouse+juvenile+and+adult+central+nervous+system.">Oligodendrocyte heterogeneity in the mouse juvenile and adult central nervous system.</a> Science. 352 (6291), 1326-1329 (2016).</li></ol>

למחברים יש ניגודי עניינים לחשוף.

בפרוטוקול זה אנו מתארים את הבידוד של שלוש תת-אוכלוסיות תאי הגליה העיקריות ממערכת העצבים המרכזית של העכבר: מיקרוגליה, OPCs ואסטרוציטים. מכשלה מרכזית בחקר מחלות CNS ניווניות ונוירו-דלקתיות היא היעדר תאים ורקמות אנושיים ראשוניים, במיוחד אלה שהם אזוריים ומאותו חולה. ברוב המקרים, קווי תאי CNS אנושיים נגזרים מתאים סרטניים שעברו טרנספורמציה ואימורטליזציה אשר עשויים שלא להיות ייצוגים מדויקים של התנהגותם הפיזיולוגית הרגילה20,21,22. לפיכך, יש צורך בשיטות חלופיות כדי לחקור פנוטיפים של תאי CNS באופן מבוקר. יתר על כן, המגוון של אוכלוסיות תאי גליה נוירולוגיים מחייב לחקור כל תת-סוג הן באופן בלתי תלוי זה בזה, והן בתנאי תרבית משותפת על מנת לשחזר הן את תפקודי התא האוטונומיים והן את תפקודיהם הלא אוטונומיים. לתאי גליה יש מגוון רחב של תפקודים קריטיים במערכת העצבים המרכזית, החל מתמיכה עצבית23, למידה/קוגניציה 24,25, ותגובות אימונולוגיות של מערכת העצבים המרכזית26. ככזה, יש צורך להבין את הפונקציות המולקולריות והתאיות של כל תת-אוכלוסייה גלית בהקשר פיזיולוגי ופתולוגי. על מנת לעשות זאת, אנו מספקים כאן שיטה אמינה למיצוי ובידוד של תת-סוגים בני קיימא של גליה. בשל אילוצים מעשיים ואתיים במחקרם של בני אדם, מודלים של בעלי חיים הם כיום הפונדקאים הרלוונטיים ביותר לביולוגיה של תאי גליה אנושיים. בפרט, עכברים הם חיות מודל אידיאליות מכיוון שניתן לתמרן ולנתח את הגנום שלהם כדי לנתח עוד יותר מנגנונים מולקולריים מסוימים העומדים בבסיס בריאות ומחלות. לכן, הסרה והפרדה מוצלחת של מיקרוגליה מורין, OPCs ואסטרוציטים היא כלי מפתח לחקר התפקודים של גליה במהלך מצבים פיזיולוגיים, נוירודגנרטיביים או נוירו-דלקתיים.
פרוטוקול זה יכול להיות ממוטב כדי לחקור הטרוגניות אזורית של תאי CNS. זה הופך להיות ברור יותר ויותר כי glia להפגין הטרוגניות אזורית בצורה ובתפקוד. אסטרוציטים הם מגוונים אזורית ומציגים מורפולוגיה שונה בהתאם למיקומם בתוך CNS27. יתר על כן, צפיפות האסטרוציטים והאינדקס המיטוטי שלהם יכולים להגדיר אזורים אנטומיים, מה שתומך בהשערה שהטרוגניות של אסטרוציטים אזוריים עשויה לשקף הבדלים מולקולריים ותפקודיים בהתבסס על מיקומם בתוך CNS28. גם ההטרוגניות האזורית של מיקרוגליה נמצאת תחת חקירה פעילה, אם כי המנגנונים הבסיסיים וההשלכות התפקודיות של גיוון המיקרוגליה בפיתוח או בהתנהגות של CNS אינם ברורים בשלב זה. עם זאת, ידוע כי מיקרוגליה בוגרת מציגה גיוון במספר התא, במבנים התאיים והתת-תאיים, ובחתימות מולקולריות29. יתר על כן, ההתקדמות האחרונה בציטומטריה של מסה מרובבת הגדירה עוד יותר את ההטרוגניות האזורית של מיקרוגליה, תוך ניתוח פנוטיפ תאי מחמישה אזורי CNS שונים של תשעה תורמים אנושיים, מה שמאפשר אימונופנוטיפ בקנה מידה גדול של מיקרוגליה אנושית30. נכון לעכשיו, גישות כאלה נמצאות בשלבים המתהווים שלהן, מה שהופך את המחקרים בבעלי חיים לפתרון בר קיימא לחקר גליה אזורית בהתפתחות מחלות CNS. לבסוף, הטרוגניות אזורית תוארה לאחרונה גם באוליגודנדרוציטים. ריצוף RNA חד-תאי על 5072 תאים בודדים מ-10 אזורים של CNS צעירים ובוגרים זיהה 13 תת-אוכלוסיות שונות בשלבים שונים של התמיינות31. חשוב לציין כי ככל שהאוליגודנדרוציטים התבגרו מ-OPCs, פרופילי השעתוק שלהם התפצלו והפנוטיפים הפונקציונליים שלהם השתנו, מה שמדגיש את ההטרוגניות של אוליגודנדרוציטים בתוך CNS31.
לפיכך, הבנת ההטרוגניות האזורית של תאי CNS המתגוררים השונים בהקשר של תאי העצב השכנים המגוונים שלהם וגליה אחרת עשויה לספק רציונל חשוב לפיתוח עתידי של טיפולים חדשניים לטיפול בהפרעות נוירו-דלקתיות וניווניות של מערכת העצבים. בעוד שפרוטוקול זה מתמקד במיצוי, בידוד וזיהוי של תת-אוכלוסיות גליות, הוא מספק נקודת התחלה נוחה לבחינת תפקידן. יתר על כן, ניתן להתאים אותו ולשלב אותו עם מודלים של עכברים מהונדסים על מנת לחקור מנגנונים גנטיים הקשורים לביולוגיה של תאי גליה. ניתן להשתמש בו גם כדי לבחון את התגובות של תאי גליה זה לזה במבחני תרבית משותפת. הצעדים המתוארים מייצגים שיטה חסכונית ובעלת תפוקה גבוהה של חילוץ ובידוד אוכלוסיות גליות CNS שונות, אשר לאחר מכן ניתן להתאים למגוון רחב של פרמטרים ניסיוניים. יש לציין; עם זאת, השיטה המתוארת כאן משתמשת בילודים בשל הרמות הנמוכות יותר של מיאלינציה וצפיפות גבוהה של גליה מתפשטת. מסיבות אלה, מבחינה טכנית ניתן יותר לבודד גליה בת קיימא מילודים בהשוואה לבעלי חיים בוגרים. לפיכך, יש לקחת בחשבון את ההבדלים הפנוטיפיים בגליה ילודים בהשוואה לגליה בוגרת במהלך תכנון הניסוי ופענוח הנתונים.

גליה נחוצה לתפקוד עצבי תקין במערכת העצבים המרכזית. הם מורכבים משלוש תת-אוכלוסיות עיקריות, אסטרוציטים, אוליגודנדרוציטים ומיקרוגליה, שלכל אחד מהם תפקיד שונה, אך הכרחי1. ללא המגוון והפעילות התקינה של תאי גליה, תפקוד תאי העצב ייפגע קשות, מה שיוביל לפגיעה במערכת העצבים המרכזית. גליה מסוגלים להשפיע על העברה עצבית, וכל סוג תא עושה זאת באופן ייחודי. לתאי גליה במוח יש את היכולת לתקשר בינם לבין עצמם, כמו גם עם תאים עצביים, על מנת להקל על תפקוד תקין של מערכת העצבים המרכזית2. אוליגודנדרוציטים מגבירים את מהירות ההעברה החשמלית באמצעות היווצרות נדן מיאלין, המאפשר את התקבצות תעלות היונים בצמתים של Ranvier, האתרים של פוטנציאל הפעולה העצבית דור3. מיקרוגליה הם קריטיים לגיזום של סינפסות על ידי ניטור העברה סינפטית ו"חיווט מחדש" של קשרים עצביים לאחר פציעה4. בנוסף, מיקרוגליה הם תאי החיסון המקומיים הנפוצים ביותר במערכת העצבים המרכזית, הפועלים כצורה העיקרית של הגנה על המארח מפני פתוגנים5. אסטרוציטים יכולים לווסת את ההעברה הסינפטית בין נוירונים על ידי שינוי הריכוז של אשלגן חוץ תאי6. יש להם גם תפקידים בשליטה על זרימת הדם המקומית7, שחרור וקליטה של אלמנטים נוירומודולטוריים8, ויש להם תפקיד מפתח בתחזוקת מחסום דם-מוח9. לפיכך, כל תת-סוג גליה הוא קריטי לתפקוד מערכת העצבים המרכזית, שכן פגמים בכל סוג נקשרו זה מכבר למגוון רחב של מצבים פתולוגיים, כולל מחלות פסיכיאטריות, אפילפסיה ומצבים נוירודגנרטיביים10.
המכשול הגדול ביותר בחקר הפתוביולוגיה של מערכת העצבים המרכזית הוא חוסר היכולת לחקור תאים אנושיים בהקשר של הנישה המיקרו-סביבתית שלהם. רקמת הביופסיה האנושית נאספת ביותר לאחר המוות ותאים יכולים בקלות להינזק או ללכת לאיבוד במהלך המיצוי והעיבוד. יתר על כן, זהו אתגר לשמור על תאים אנושיים חיים וברי קיימא במבחנה לאורך זמן מבלי לגזור קווי תאים אימורטליים מגידולים, ואז הם כבר לא משקפים במדויק את התכונות הפיזיולוגיות הרגילות שלהם11,12. בנוסף, קיימת כמות משמעותית של הטרוגניות אזורית בקרב סוגי תאי גליהבודדים 13,14,15, והשגת דגימות CNS אזוריות מחולים בודדים היא כמעט בלתי אפשרית. ככזה, יש צורך לפתח מודלים חלופיים כדי לחקור את התרומה של גליה אזורית בהפרעות CNS ספציפיות.
כאן אנו מתארים מערכת חוץ גופית המשתמשת בבידוד ספציפי לאזור CNS של עכברים של תת-אוכלוסיות גליה מרובות, המאפשרת מניפולציה וכימות של מיקרוגליה, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים (OPCs), אשר מולידים אוליגודנדרוציטים בוגרים, ואסטרוציטים. כל אוכלוסייה יכולה להיות מבודדת באופן עצמאי ונתונה למגוון רחב של טכניקות ניסיוניות, כולל טיפול בתרופות או במולקולות, אימונוציטוכימיה, מיצוי וניתוח חלבונים/רנ"א ומערכות אחרות של תרביות משותפות בהתאם לצורך הניסויי. בנוסף, טכניקת בידוד זו מניבה מספר תאים גבוה, ומאפשרת אפיון וחקירה של כל אוכלוסיית גליות באופן בעל תפוקה גבוהה. הוא גם מאפשר לחקור התמיינות של תאי CNS, גדילה ושגשוג בתגובה למגוון רחב של גירויים מיקרו-סביבתיים באופן מבוקר על מנת למנוע גורמים מבלבלים אשר בדרך כלל נוכחים בסביבה in vivo. לבסוף, טכניקת בידוד תאים זו מאפשרת מניפולציה של אוכלוסיות תאי גליה בתוך אזורי CNS שונים כדי לחקור כיצד גליה אזורית מתקשרת זו עם זו ומגיבה לגירויים משתנים, מה שמאפשר דיוק ושכפול.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665 180</td>
			<td>Cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td>Standard reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL, 25 cm2 cell culture flask</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>690 175</td>
			<td>Cell culture (T25) flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-096</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement 50X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-50G</td>
			<td>Antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td>Confocal for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995040</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3840001</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-1MG</td>
			<td>Cell adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine stitch Scissors</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>64-3260</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Secondary staining antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21434</td>
			<td>Secondary staining antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170120</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20530081</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine epidermal growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PMG8044</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-05-20UG</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine PDGF-AA</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-17</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Blocking solution component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>Surgi-OR</td>
			<td>95-272</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip</td>
			<td>Corning Biocoatt</td>
			<td>354086</td>
			<td>Cell adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9071S</td>
			<td>Mounting Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Iba1</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab5320</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-GFAP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>13-0300</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-myelin basic protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7349</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Tip Scissors</td>
			<td>Surgi-OR</td>
			<td>95-104</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S4 E Stereo Zoom Microscope</td>
			<td>Microscope for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>66-7644</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Cell permabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor (from chicken egg white)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10109878001</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and isolation of murine glia from multiple central nervous system regions

השיטות המוצגות כאן מדגימות נהלי מעבדה לנתיחה של ארבעה אזורים שונים במערכת העצבים המרכזית (CNS) מילודים מורין לבידוד תת-אוכלוסיות גליה. מטרת ההליך היא לנתק את תאי האב של מיקרוגליה, אוליגודנדרוציטים (OPCs) ואסטרוציטים מרקמת קליפת המוח, המוח הקטן, גזע המוח וחוט השדרה כדי להקל על ניתוח נוסף במבחנה. נהלי הבידוד של אזור CNS מאפשרים לקבוע הטרוגניות אזורית בקרב גליה במערכות מרובות של תרביות תאים. בידוד מהיר של אזור CNS מבוצע, ואחריו הסרה מכנית של קרום המוח כדי למנוע זיהום תאי קרום המוח של גליה. פרוטוקול זה משלב דיסוציאציה עדינה של רקמות וציפוי על מטריצה מוגדרת שנועדה לשמור על שלמות התא ודבקותו. בידוד גליה מעורבת מאזורי CNS מרובים מספק ניתוח מקיף של גליה הטרוגנית פוטנציאלית תוך מקסום השימוש בחיות ניסוי בודדות. בנוסף, לאחר דיסוציאציה של רקמה אזורית, גליה מעורבת מחולקת לסוגי תאים מרובים, כולל מיקרוגליה, OPCs ואסטרוציטים לשימוש בסוג תא בודד, בתוספות צלחת תרבית תאים או במערכות תרבית משותפת. בסך הכל, הטכניקות שהודגמו מספקות פרוטוקול מקיף של ישימות רחבה לניתוח זהיר של ארבעה אזורי CNS בודדים מילודים מורין וכוללות שיטות לבידוד של שלושה סוגי תאי גליה בודדים כדי לבחון הטרוגניות אזורית בכל מספר של מערכות תרביות תאים במבחנה או מבחנים.

נתונים מייצגים המוצגים להלן ממחישים כי איתות IFNγ משפיע על בידול OPC והבשלה. ללא נוכחות של קולטן IFNγ (IFNγR), OPCs בקליפת המוח אינם מתמיינים לאוליגודנדרוציטים מיאלינים בוגרים בקלות, מה שמעיד על היעדר צביעת MBP (איור 1). מאחר שאוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים נגזרים מאב משותף, ניתחנו את ביטוי GFAP, המתייג אסטרוציטים. מצאנו שתאים עם מחסור ב-IFNγR מבטאים באופן חזק GFAP מה שמרמז על כך שייתכן שהם מאמצים פנוטיפ אסטרוציטי, מה שאישש דיווחים קודמים19.
עדות נוספת להטרוגניות אזורית בתאי CNS מוכחת על ידי מורפולוגיה משתנה של אסטרוציטים כפי שניתן לראות באסטרוציטים מקליפת המוח, המוח הקטן, גזע המוח וחוט השדרה (איור 2). יש לציין כי אסטרוציטים מאותו אזור עשויים גם להפגין הטרוגניות מורפולוגית, מה שתומך ברעיון שתת-סוג גליה זה הוא דינמי מאוד. ההבדלים בארכיטקטורה התאית מרמזים על גיוון תפקודי ולכן היכולת לבודד אוכלוסיות גליה נחוצה כדי לחקור תגובות פנוטיפיות בהיעדר ונוכחות של גירויים מיקרו-סביבתיים.
אוליגודנדרוציטים הם קריטיים למיאלינציה של אקסונים עצביים והם נחוצים לתיקון ותפקוד תקין של מערכת העצבים המרכזית. OPCs מולידים את עמיתיהם הבוגרים, מה שהופך את זה קריטי כדי להבין את הביולוגיה מאחורי היכולת שלהם להבדיל. איתות ציטוקינים משפיע באופן משמעותי על התנהגות תאי הגזע ומערכת החיסון. לכן, חשוב להבין כיצד תגובות אזוריות של OPCs עשויות להשתנות לגירוי ציטוקינים דיפרנציאלי (איור 3), מה שעשוי להשפיע על יכולתם להתמיין לאוליגודנדרוציטים מיאלינים בוגרים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig01.jpg"> איור 1: נתונים מייצגים המראים התמיינות OPC בעכברי WT ו- IFNγR-/- בנוכחות IFNγ אקסוגני. OPCs קורטיקליים בודדו מ-( A ) WT ו- (B) גורי עכברים IFNγR-/- P4 בעקבות ההליך שתואר לעיל. התאים טופלו ב-1 ng/mL IFNγ במשך 48 שעות, ולאחר מכן תוקנו והוכתמו כדי להגדיר את התמיינות התאים. OPCs תויגו עבור NG2 ו- GFAP כדי לזהות את אלה שאימצו פנוטיפ אסטרוציטי. באופן דומה, OPCs סומנו גם עבור NG2 ו- MBP כדי לזהות את אלה שהתמידו לאוליגודנדרוציטים בוגרים. סרגל קנה מידה = 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig02.jpg"> איור 2: נתונים מייצגים המדגימים הטרוגניות אזורית במורפולוגיה של אסטרוציטים. אסטרוציטים מקליפת המוח, המוח הקטן, גזע המוח וחוט השדרה בודדו מגורי עכברי P4 באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל וסומנו עבור GFAP (ירוק) על ידי אימונוציטוכימיה לאחר 48 שעות בתרבית. סרגל קנה מידה = 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig03.jpg"> איור 3: נתונים מייצגים המדגימים תגובות דיפרנציאליות של OPCs אזוריים לציטוקינים. OPCs בודדו מגזע המוח ומחוט השדרה של גורי עכברי P4 באמצעות הפרוטוקול שתואר לעיל. התאים טופלו בריכוזים הולכים וגדלים (1-10 ננוגרם/מ"ל) של (A) IFNγ או (B) אינטרלוקין ( IL ) -17 על מנת לחקור את ההשפעה הדיפרנציאלית של ציטוקינים על יכולתם של OPCs אזוריים להתמיין לאוליגודנדרוציטים מיאלינים. לאחר דגירה של 48 שעות עם ציטוקינים מוגדרים, OPCs תוקנו וסומנו עבור NG2 (ירוק) ו- MBP (אדום). סרגל קנה מידה = 20 μM. נתונים מייצגים פירושו ± SEM. **, p < 0.01; עמ' < 0.001;, עמ' < 0.0001 על ידי ANOVA דו-כיווני., <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">PBS/פתרון אנטיביוטי (PAS):</td>
		</tr><tr><td>1.0 מ"ל</td>
			<td colspan="2">100X אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטית המכילה 10,000 יחידות/מ"ל פניצילין ו-10,000 מ"ג/מ"ל סטרפטומיצין</td>
		</tr><tr><td>25 מ"ג/מ"ל</td>
			<td colspan="2">אמפוטריצין B</td>
		</tr><tr><td>99 מ"ל</td>
			<td colspan="2">1X PBS</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">מדיה גליה מעורבת (MGM)</td>
		</tr><tr><td>88 מ"ל</td>
			<td colspan="2">1X DMEM (גלוקוז גבוה, עם L-גלוטמין, עם Na פירובט)</td>
		</tr><tr><td>10 מ"ל</td>
			<td colspan="2">FBS מומת בחום</td>
		</tr><tr><td>1.0 מ"ל</td>
			<td colspan="2">ל-גלוטמין (100X)</td>
		</tr><tr><td>1.0 מ"ל</td>
			<td colspan="2">אנטיביוטיקה/אנטי-מיקוטי</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">מדיה OPC (50 מ"ל)</td>
		</tr><tr><td>49 מ"ל</td>
			<td colspan="2">מדיה נוירובסלית</td>
		</tr><tr><td>1.0 מ"ל</td>
			<td colspan="2">תוסף B27 (50X)</td>
		</tr><tr><td>10 נ"ג/מ"ל</td>
			<td colspan="2">PDGF-AA</td>
		</tr><tr><td colspan="3">הערה: PDGF-AA מתווסף טרי לפני כל שינוי מדיה.</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">אסטרוציטים מדיה (1 L)</td>
		</tr><tr><td>764 מ"ל</td>
			<td colspan="2">MEM עם מלחי ארל המכילים גלוטמין</td>
		</tr><tr><td>36 מ"ל</td>
			<td colspan="2">גלוקוז (יש להשתמש במלאי של 100 מ"ג/מ"ל לריכוז סופי של 20 מ"מ)</td>
		</tr><tr><td>100 מ"ל</td>
			<td colspan="2">FBS מומת בחום</td>
		</tr><tr><td>100 מ"ל</td>
			<td colspan="2">סרום סוסים מומת בחום</td>
		</tr><tr><td>10 מ"ל</td>
			<td colspan="2">גלוטמין (יש להשתמש במלאי של 200 מ"מ אם אינו כלול במדיום המלאי)</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">אופציונלי: גורם גדילה רקומביננטי של עכבר רקומביננטי של 10 ננוגרם/מ"ל</td>
		</tr><tr><td colspan="3">הערה: יש לסנן סטרילית את כל חומרי ההדפסה ולאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש.</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: מתכוני חיץ ומדיה.

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions at JoVE.com

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד חוץ גופי של אוכלוסיות תאי גליה מרובות ממערכת CNS של עכבר. שיטה זו מאפשרת הפרדה של מיקרוגליה אזורית, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים כדי לחקור את הפנוטיפים של כל אחד מהם במגוון מערכות תרבית.

דיסקציה ובידוד של מורין גליה ממספר אזורים במערכת העצבים המרכזית

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

dissection-isolation-murine-glia-from-multiple-central-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.2K Views.  Lerner Research Institute, Cleveland Clinic Foundation. כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד חוץ גופי של אוכלוסיות תאי גליה מרובות ממערכת CNS של עכבר. שיטה זו מאפשרת הפרדה של מיקרוגליה אזורית, תאים מבשרי אוליגודנדרוציטים ואסטרוציטים כדי לחקור את הפנוטיפים של כל אחד מהם במגוון מערכות תרבית.

Video: Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

Systemic and Local Drug Delivery for Treating Diseases of the Central Nervous System in Rodent Models

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution in assessing therapeutic efficacy. Between the two major classifications of administration, local vs. systemic, systemic delivery approaches are often preferred due to ease of administration. However, systemic delivery may result in suboptimal drug concentration being achieved in the CNS, and lead to erroneous conclusions regarding agent efficacy. Local drug delivery methods are more invasive, but may be necessary to achieve therapeutic CNS drug levels. Here, we demonstrate proper technique for three routes of systemic drug delivery: intravenous injection, intraperitoneal injection, and oral gavage. In addition, we show a method for local delivery to the brain: convection-enhanced delivery (CED). The use of fluorescently-labeled compounds is included for in vivo imaging and verification of proper drug administration. The methods are presented using murine models, but can easily be adapted for use in rats.

Thorough preclinical testing of drugs that act in the central nervous system often involves assessing and comparing drug biodistribution in association with specific routes of administration. Here, three commonly used methods of systemic delivery (intravenous, intraperitoneal, and oral) as well as a method for local delivery (convection-enhanced delivery) are demonstrated in mice.

תרופות משלוח מערכתית מקומי לטיפול במחלות של מערכת העצבים המרכזית מודלים מכרסמים

Thorough preclinical testing of central nervous system (CNS) therapeutics includes a consideration of routes of administration and agent biodistribution ...

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

הפקה של וקטורים lentiviral עבור תאים Transducing ממערכת העצבים המרכזית

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

תיוג של תאים בודדים במערכת העצבים המרכזית של<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

פרדיגמה פגיעה לחקור תיקון של מערכת עצבים מרכזי ב<em&gt; דרוזופילה</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

משלוח תוך חדרי ישיר של תרופות למערכת העצבים המרכזית מכרסם

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Immunohistochemical ניתוח של מערכת העצבים המרכזית עכברוש לימפה הפריפריה צומת סעיפים רקמות

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

בחקירתו vivo של Translatome מערכת עצבים המרכזי על ידי Polyribosome היפוך חלוק

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

בoptogenetic גירוי vivo של מערכת העצבים המרכזית מכרסם

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

סליקה אופטית של מערכת העצבים המרכזית עכבר שימוש CLARITY הפסיבי

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...