Name: Video: Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions
Uploaded: 2020-06-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 3.1K vistas. Lerner Research Institute, Cleveland Clinic Foundation. Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento in vitro de múltiples poblaciones de células gliales de un SNC de ratón. Este método permite la segregación de microglía regional, células precursoras de oligodendrocitos y astrocitos para estudiar los fenotipos de cada uno en una variedad de sistemas de cultivo.

Agradecemos a Morgan Psenicka por la edición y discusión del manuscrito y al Dr. Grahame Kidd por su ayuda en el formato de la figura. Este trabajo fue apoyado por NIAID K22 AI125466 (JLW).

NOTA: Todos los estudios en animales fueron autorizados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Instituto de Investigación Lerner de la Clínica Cleveland.
1. Preparar los medios y suministros para la disección
NOTA: Todas las recetas de búfer y medios se proporcionan en la Tabla 1. Este procedimiento se realiza en condiciones estériles en un cultivo de tejidos designado gabinete de bioseguridad.
<ol><li>Preparar y filtrar estérilmente los medios gliales mixtos (MGM). Esto se puede hacer el día anterior y se almacena a 4 °C.</li>
	<li>Diluir la fibronectina a una concentración de 1:100 conH2Oestéril. El volumen de fibronectina diluida dependerá del número de cachorros y la región del SNC utilizada para el experimento. Utilice un matraz T25 para 1 corteza, un matraz T25 para 2-4 cerebella, un matraz T25 para 2-4 troncos cerebrales y un matraz T25 para 2-4 médula espinal. NOTA: La combinación de tejido de la misma región utilizando los criterios enumerados anteriormente permitirá una disociación adecuada sin alterar el protocolo descrito a continuación. La combinación de más tejido del descrito en el Paso 1.2 requerirá una mayor optimización de las concentraciones de reactivos de disociación.</li>
	<li>Pipetear 3 ml de fibronectina diluida en matraces T25 a temperatura ambiente y dejar reposar durante 2 min.</li>
	<li>Aspirar la fibronectina y dejar que los matraces se sequen durante la noche con la tapa del matraz aflojada.</li>
</ol>2. Disección de corteza, cerebelo, tronco encefálico y médula espinal
NOTA: Este procedimiento se puede realizar en la mesa de trabajo y requiere un alcance de disección. Use una técnica aséptica estricta para todos los pasos del procedimiento y minimice la exposición del tejido al aire ambiente. Mantenga todos los medios fríos en hielo durante la disección para garantizar la máxima preservación del tejido. Alternativamente, este procedimiento podría realizarse en una campana que permita el uso de un alcance de disección interna.
<ol><li>Limpie todas las áreas con etanol al 70%.</li>
	<li>Pipetear 10 ml de PBS/solución antibiótica (PAS) en una placa de Petri de 10 cm. Prepara una placa de Petri para cada cachorro a diseccionar. Coloque en hielo para mantener la solución fría.</li>
	<li>En una campana de cultivo de tejidos desinfectada, pipetear 9 ml de DMEM (sin aditivos) en 4 tubos cónicos separados de 15 ml, uno para cada región del SNC, reemplazar las tapas de los tubos y poner en hielo. Coloque el cubo de hielo con tubos a una distancia de alcance del alcance de la disección.</li>
	<li>Colocar una placa de Petri de 10 cm preparada en el paso 2.2 en la etapa de endoscopio de disección desinfectada.</li>
	<li>Anestesiar y sacrificar a la cría de ratón de acuerdo con el protocolo institucional y retirar la cabeza por decapitación rápida con tijeras afiladas. NOTA: Día postnatal (P) Se utilizan 3-5 cachorros. Los cachorros mayores tienen un SNC más desarrollado y pueden no ser una fuente adecuada de células gliales en expansión. Los cachorros más jóvenes (P) 0-2 pueden producir un mayor número de glía y pueden ser utilizados; Sin embargo, el tejido de la médula espinal es muy difícil de diseccionar a esta temprana edad debido al tamaño.</li>
	<li>Limpia la piel del cachorro con etanol al 70%.</li>
	<li>Usando tijeras finas, cortar la capa cutánea a lo largo de la línea media de la cabeza del animal, comenzando caudalmente y moviendo rostral, hasta llegar al hocico. Evite cortar profundamente en el cráneo para evitar cualquier daño tisular.</li>
	<li>Inclinando la cabeza hacia abajo, tire de la capa cutánea a cada lado del cráneo y usando tijeras de resorte, haga una incisión a lo largo de la línea media del cráneo, comenzando en el foramen magnum, nuevamente cortando caudal a rostral.</li>
	<li>Con pinzas de punta fina, tire de las mitades del cráneo hacia los lados derecho e izquierdo, exponiendo la corteza, el cerebelo y el tronco encefálico.</li>
	<li>Una vez expuesto, levante suavemente el cerebro fuera del cráneo y dentro de la placa de Petri de 10 cm preparada en el Paso 2.2. Asegúrese de que el cerebro permanezca intacto para preservar la estructura anatómica, con el cerebro posterior unido.</li>
	<li>Usando pinzas finas de punta curva con la punta de los fórceps hacia arriba, pellizque el cerebelo. Retire las meninges y colóquelas en un tubo cónico designado de 15 ml en un cubo de hielo.</li>
	<li>Asegúrese de que el tronco encefálico sea directamente ventral al cerebelo y sea visible después de la extracción del cerebelo. Retírelo con pinzas de punta fina, retire las meninges y colóquelo en un tubo cónico designado de 15 ml en un cubo de hielo.</li>
	<li>Separe el mesencéfalo de la corteza, retire las meninges corticales y colóquelo en un tubo cónico designado de 15 ml en un cubo de hielo.</li>
	<li>Para extirpar la médula espinal, coloque el cachorro de ratón decapitado en posición supina (acostado boca arriba) con la columna vertebral cortada elevada hacia el investigador.</li>
	<li>Rocíe nuevamente con etanol al 70%.</li>
	<li>Cortar a lo largo de los lados laterales de la columna vertebral, en dirección rostral a caudal, a través de la caja torácica hasta llegar a las extremidades posteriores. Mientras corta, empuje hacia atrás los órganos internos hasta que la columna vertebral sea visible.</li>
	<li>Cortar a lo largo de cada lado lateral de la columna vertebral hasta aislarla y colocar en la placa de Petri de 10 cm preparada en el paso 2.2.</li>
	<li>Con el lado ventral hacia arriba, utilizando tijeras finas de resorte, alterna el corte de los lados derecho e izquierdo de cada vértebra hasta llegar a la región lumbar para exponer el tejido de la médula espinal.</li>
	<li>Retire suavemente la médula espinal y las meninges con pinzas de punta fina bajo el microscopio de disección. Coloque en un tubo cónico designado de 15 ml en cubitera.</li>
	<li>Repita los pasos 2.5.-2.19 para cada cachorro, combinando tejido de la misma región para ajustarse a los criterios descritos en el paso 1.2 para cada matraz T25 preparado. NOTA: Retire las meninges lo más completamente posible. Si queda una cantidad significativa de meninges, el fenotipo similar a los fibroblastos de las células meníngeas crecerá y abrumará el cultivo celular. Múltiples médulas espinales, de igual fenotipo, se pueden combinar para generar un cultivo celular específico. Tenga cuidado de asegurarse de que no se produzca un hacinamiento de las células, lo que puede conducir a la apoptosis glial y fenotipos diferenciales.</li>
</ol>3. Disociación tisular
NOTA: Todos los siguientes procedimientos se llevan a cabo en un cultivo de tejido estéril designado gabinete de bioseguridad utilizando técnica aséptica y materiales estériles.
<ol><li>Agregue 1 ml de tripsina al 0,05% que contenga 0,53 mM de EDTA a cada tubo cónico de 15 ml de 9 ml de DMEM y tejido para comenzar la lisis tisular. NOTA: DMEM contiene una alta cantidad de cloruro de calcio, que puede actuar como un inhibidor de la tripsina. Si la disociación no se completa siguiendo los pasos descritos, se puede usar la solución salina equilibrada de Hanks sin calcio ni magnesio. Después de la tripsinización, la enzima puede neutralizarse agregando un inhibidor de tripsina, aunque el calcio debe agregarse nuevamente a la solución, ya que es un cofactor para la DNasa I, que se usa en los pasos posteriores.</li>
	<li>Triturar con una pipeta de 10 ml aproximadamente 20x.</li>
	<li>Transfiera las suspensiones celulares a tubos cónicos vacíos de 50 ml.</li>
	<li>Incubar la solución a 37 °C, 5% deCO2 durante 15 min, agitando suavemente los lisados después de 8 min.</li>
	<li>Agregue 5 ml de MGM y 200 μL (5 mg/ml) de DNasa I a cada tubo para obtener una concentración final de 50 μg/ml.</li>
	<li>Triturar cada lisado con una pipeta de 10 ml 10x.</li>
	<li>Deje que las suspensiones celulares reposen durante 3 minutos a temperatura ambiente para permitir que el tejido no disociado se asiente en la parte inferior de los tubos.</li>
	<li>Transfiera las suspensiones celulares a nuevos tubos cónicos de 50 ml, dejando atrás el tejido no disociado. NOTA: Los pasos de lisis y trituración descritos anteriormente limitan significativamente la cantidad de tejido no disociado.</li>
	<li>Centrifugar los tubos a 300 x g durante 3 min a 4 °C sin freno.</li>
	<li>Aspirar el sobrenadante y resuspender los gránulos celulares restantes en 5 ml de MGM.</li>
	<li>Triturar el pellet con una pipeta de 5 ml 20x.</li>
	<li>Colocar en placa las suspensiones de 5 ml de células en matraces T25 recubiertos.</li>
	<li>Incubar las células a 37 °C, 5% deCO2 y cambiar de medio inicialmente después de 24 h para eliminar los restos celulares. NOTA: Algunos protocolos recomiendan un cambio inicial de medios después de 72 h. Es posible que sea necesario optimizar este paso.</li>
	<li>Realizar un cambio de media del 100% con MGM cada 48-72 h hasta que las células sean 80% confluentes (aproximadamente 5-7 días). NOTA: Todos los soportes deben calentarse a 37 °C antes de que cambien los medios.</li>
</ol>4. Aislamiento de microglía
<ol><li>Una vez que los cultivos gliales mezclados hayan alcanzado el 80% de confluencia, prepare los matraces para agitar apretando las tapas y sellando con una película de parafina.</li>
	<li>Para eliminar la microglía de cultivos gliales mixtos, fijar los matraces horizontalmente en un agitador orbital dentro de una incubadora a 37 °C. Agitar matraces a 15 x g durante 1 h.</li>
	<li>Retire el medio y la pipeta en un tubo cónico de 15 ml. Enjuague los matraces dos veces con 3 ml de MGM caliente, agregando lavado a los tubos cónicos de 15 ml. Estas son las microglías.</li>
	<li>Agregue 5 ml de MGM caliente y fresco a los matraces de cultivo.</li>
	<li>Volver a sellar los matraces con película de parafina, fijar los matraces horizontalmente en el agitador y agitar a 15 x g a 37 °C durante 15 h para separar los OPC de los astrocitos. NOTA: Este paso se puede hacer durante la noche, pero el tiempo de agitación de 15 h es crítico ya que el exceso de tiempo puede provocar la muerte celular.</li>
	<li>Centrifugar el sobrenadante a partir del paso 4.3. a 300 x g durante 3 min y cultivo de microglía según protocolos estándar16 o uso para un ensayo biológico.</li>
</ol>5. Aislamiento de células precursoras de oligodendrocitos
NOTA: Al chapar OPC después del aislamiento inicial, deben estar chapados en una superficie recubierta de poli-D-lisina (placa estéril o cubreba). Prepare estos materiales antes de completar esta sección.
<ol><li>Después de agitar 15 h, retirar el sobrenadante de los matraces y colocar en placa una placa de Petri estéril de 100 mm.</li>
	<li>Incubar el sobrenadante a 37 °C, 5% deCO2 durante 30 min, agitando después de 15 min para eliminar la microglía restante, ya que estos se adherirán muy rápidamente al plato. Se pueden usar placas de Petri no tratadas con cultivo de tejidos para este paso.</li>
	<li>Retire el sobrenadante celular no adherente, el recuento y la placa en una superficie recubierta de poli-D-lisina. Normalmente, 7.500-10.000 OPC están chapados/cm2.</li>
	<li>Incubar a 37 °C, 5% deCO2 durante al menos 1 h (hasta 6 h), luego aspirar suavemente el 95% de los medios y agregar lentamente medios OPC calientes, pipeteando los medios contra la pared del pozo para minimizar la interrupción de los OPC. Cambie los medios cada 48 h hasta que las celdas estén listas para su uso. NOTA: Es fundamental que solo se cambie un pozo a la vez. Los OPC son sensibles y son especialmente intolerantes a las condiciones secas. La adición de PDGF-AA en medios OPC es para retrasar la maduración de OPC en oligodendrocitos. Este factor puede excluirse de los medios de cultivo si el foco experimental son los oligodendrocitos maduros.</li>
</ol>6. Aislamiento de astrocitos
<ol><li>Después de 15 h de agitación, retire el sobrenadante y enjuague los matraces 2x con 1x PBS tibio.</li>
	<li>Añadir 4 ml de tripsina al 0,05% que contenga 0,53 mM de EDTA e incubar a 37 °C, 5% deCO2 durante 5 min o hasta que las células se hayan levantado. Para asegurarse de que los astrocitos se hayan levantado, visualícelos usando un microscopio estándar de campo amplio. Los astrocitos aparecerán esféricos después de la tripsinización.</li>
	<li>Una vez que los astrocitos se hayan desprendido, coloque el matraz verticalmente y agregue 4 ml de MGM. Triturar para mezclar.</li>
	<li>Pipetear los astrocitos en un tubo cónico de 15 ml, centrifugar a 300 x g durante 5 min.</li>
	<li>Resuspender los astrocitos en medios de astrocitos y placa en la superficie recubierta de fibronectina como se describe en el paso 1.2. o uso para ensayo biológico. NOTA: Se pueden agregar 20 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos murinos durante el primer cambio de medios para ayudar a establecer el cultivo de astrocitos. Además, el recubrimiento de gelatina estándar puede ser una alternativa de bajo costo a la fibronectina.</li>
</ol>7. Identificación y aislamiento de microglía, OPC, astrocitos y oligodendrocitos maduros mediante inmunocitoquímica
<ol><li>Una vez que las células en placa hayan alcanzado la confluencia adecuada, retire suavemente los medios y fije las células adherentes con paraformaldehído al 4% (PFA) durante 10 minutos. Haga este paso en un gabinete de bioseguridad. NOTA: Al aspirar o añadir soluciones, pipetear con una presión suave para evitar el desprendimiento de células.</li>
	<li>Aspire lentamente PFA y luego lave las células 3x con 1x PBS durante 5 min.</li>
	<li>Prepare la solución de bloqueo adecuada utilizando suero al 10% y Triton X-100 al 0,1% en 1x PBS. NOTA: La fuente de suero refleja el animal huésped en el que se crió el anticuerpo secundario. Por ejemplo, si el anticuerpo secundario es anti-conejo de cabra, el suero de bloqueo apropiado es suero de cabra normal. Del mismo modo, si el anticuerpo secundario es anti-conejo burro, el suero de bloqueo debe ser suero de burro normal.</li>
	<li>Agregue solución de bloqueo hasta que las células estén completamente cubiertas. Bloquear durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar una solución diluyente de anticuerpos (9 ml de 1x PBS, 0,01 g de albúmina sérica bovina, 30 μL Triton X-100). Alternativamente, los anticuerpos pueden diluirse en la solución bloqueante descrita en el paso 6.3.</li>
	<li>Diluir anticuerpos primarios específicos para lo siguiente en diluyente de anticuerpos o solución bloqueante:<ol><li>Microglia: molécula adaptadora de unión al calcio ionizado 1 (Iba1) en una dilución 1:250 (2,4 μg/ml).</li>
		<li>OPC: antígeno neuronal/glial 2 (NG2) en una dilución 1:200 (5 μg/mL).</li>
		<li>Oligodendrocitos maduros: proteína básica de mielina (MBP) en una dilución 1:400 (la concentración depende del lote y puede ser necesaria la optimización).</li>
		<li>Astrocitos: proteína ácida fibrilar glial (GFAP) en una dilución 1:400 (0,25 μg/mL)17. NOTA: No mezcle anticuerpos primarios criados en la misma especie. NOTA: GFAP etiquetará de manera confiable los astrocitos de la sustancia blanca. Para los astrocitos de materia gris, puede ser necesario usar un marcador alternativo.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar el anticuerpo primario durante la noche a 4 °C (es preferible agitar suavemente).</li>
	<li>Lave 3x con 1x PBS durante 5 minutos para eliminar el anticuerpo primario.</li>
	<li>Incubar células con anticuerpos secundarios apropiados en una dilución 1:400 en diluyente de anticuerpos o solución bloqueante protegida de la luz. NOTA: Los anticuerpos secundarios se conjugan con un fluoróforo que puede intercambiarse dependiendo de los parámetros del microscopio disponibles. Una vez que se hayan aplicado anticuerpos secundarios fluorescentes, protéjalos de la luz tanto como sea posible.</li>
	<li>Incubar el anticuerpo secundario durante 1 h a temperatura ambiente, limitando la exposición a la luz.</li>
	<li>Lavar 3 veces con 1x PBS durante 5 minutos para eliminar el exceso de anticuerpos secundarios.</li>
	<li>Para etiquetar los núcleos, use una solución 1:1,000 DAPI/PBS e incube las células durante 5 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.</li>
	<li>Lave 3x con 1x PBS durante 5 minutos en la oscuridad.</li>
	<li>Para montar, aplique los medios de montaje y deje secar en la oscuridad antes de la obtención de imágenes. NOTA: Los portaobjetos montados se pueden almacenar a temperatura ambiente durante 2-3 días. Para un almacenamiento prolongado, mueva las diapositivas a 4 °C. Imagen dentro de una semana para una señal máxima. Todas las imágenes representativas han sido fotografiadas en un microscopio confocal; sin embargo, también se recomiendan microscopios fluorescentes invertidos.</li>
</ol>

<ol>
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M., Kishimoto, T., Makinodan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+primary+roles+of+glial+cells+in+the+mechanisms+of+psychiatric+disorders.">Potential primary roles of glial cells in the mechanisms of psychiatric disorders.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (154), (2015).</li><li>Hartenstein, V., Giangrande, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+the+nervous+and+the+immune+systems+in+evolution.">Connecting the nervous and the immune systems in evolution.</a> Communications Biology. 1 (1), 64 (2018).</li><li>Emsley, J. G., Macklis, J. 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L., Yuan, Y., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+regional+heterogeneity+and+its+role+in+the+brain.">Microglial regional heterogeneity and its role in the brain.</a> Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).</li><li>Bottcher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microglia+regional+heterogeneity+and+phenotypes+determined+by+multiplexed+single-cell+mass+cytometry.">Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry.</a> Nature Neurosciences. 22 (1), 78-90 (2019).</li><li>Marques, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+heterogeneity+in+the+mouse+juvenile+and+adult+central+nervous+system.">Oligodendrocyte heterogeneity in the mouse juvenile and adult central nervous system.</a> Science. 352 (6291), 1326-1329 (2016).</li></ol>

Los autores tienen conflictos de intereses que revelar.

En este protocolo, describimos el aislamiento de las tres principales subpoblaciones de células gliales del SNC del ratón: microglía, OPC y astrocitos. Un revés importante para la investigación de enfermedades neurodegenerativas y neuroinflamatorias del SNC es la falta de células y tejidos humanos primarios, particularmente aquellos que son regionales y del mismo paciente. En la mayoría de los casos, las líneas celulares del SNC humano se derivan de células cancerosas transformadas e inmortalizadas que pueden no ser representaciones precisas de su comportamiento fisiológico normal20,21,22. Por lo tanto, se necesitan métodos alternativos para estudiar los fenotipos de células del SNC de manera controlada. Además, la diversidad de las poblaciones neurológicas de células gliales hace necesario investigar cada subtipo, tanto independientemente entre sí, como en condiciones de cocultivo para recapitular sus funciones celulares autónomas y no autónomas. Las células gliales tienen una amplia variedad de funciones críticas en el SNC que van desde el soporte neuronal23, el aprendizaje/cognición 24,25 y las respuestas inmunológicas del SNC26. Como tal, es necesario comprender las funciones moleculares y celulares de cada subpoblación glial en un contexto fisiológico y patológico. Para ello, proporcionamos aquí un método fiable para la extracción y aislamiento de subtipos de glía viables. Debido a las limitaciones prácticas y éticas en la investigación de sujetos humanos, los modelos animales son actualmente los sustitutos más relevantes para la biología de las células gliales humanas. En particular, los ratones son animales modelo ideales, ya que su genoma puede ser manipulado y analizado para diseccionar aún más los mecanismos moleculares particulares que subyacen a la salud y la enfermedad. Por lo tanto, la eliminación y separación exitosa de la microglía murina, OPC y astrocitos es una herramienta clave para investigar las funciones de la glía durante afecciones fisiológicas, neurodegenerativas o neuroinflamatorias.
Este protocolo se puede optimizar para explorar la heterogeneidad regional de las células del SNC. Cada vez está más claro que la glía exhibe heterogeneidad regional en forma y función. Los astrocitos son regionalmente diversos y muestran una morfología distinta dependiendo de su ubicación dentro del SNC27. Además, la densidad de los astrocitos y su índice mitótico pueden definir regiones anatómicas, apoyando la hipótesis de que la heterogeneidad regional de los astrocitos puede reflejar diferencias moleculares y funcionales basadas en su ubicación dentro del SNC28. La heterogeneidad regional microglial también está bajo investigación activa, aunque los mecanismos subyacentes y las consecuencias funcionales de la diversidad de microglia en el desarrollo o comportamiento del SNC actualmente no están claros. Sin embargo, se sabe que la microglía adulta muestra diversidad en número celular, estructuras celulares y subcelulares, y firmas moleculares29. Además, los avances recientes en citometría de masas multiplexadas han definido aún más la heterogeneidad regional de la microglía, analizando el fenotipo celular de cinco regiones diferentes del SNC de nueve donantes humanos, lo que permite el inmunofenotipado a gran escala de la microglía humana30. Actualmente, tales enfoques se encuentran en sus etapas iniciales, lo que hace que los estudios en animales sean una solución viable para el estudio de la glía regional en el desarrollo de enfermedades del SNC. Finalmente, recientemente también se ha descrito heterogeneidad regional en oligodendrocitos. La secuenciación de ARN unicelular en 5072 células individuales de 10 regiones del SNC juvenil y adulto identificó 13 subpoblaciones distintas en diferentes etapas de diferenciación31. Es importante destacar que también se encontró que a medida que los oligodendrocitos maduraron a partir de OPC, sus perfiles transcripcionales divergieron y sus fenotipos funcionales cambiaron, destacando la heterogeneidad de oligodendrocitos dentro del SNC31.
Por lo tanto, comprender la heterogeneidad regional de las diversas células residentes del SNC en el contexto de sus diversas neuronas vecinas y otras glías puede proporcionar una justificación importante para el desarrollo futuro de nuevas terapias para tratar trastornos neuroinflamatorios y neurodegenerativos. Si bien este protocolo se centra en la extracción, aislamiento e identificación de subpoblaciones gliales, proporciona un punto de partida conveniente para el examen de su función. Además, se puede adaptar y combinar con modelos de ratón transgénico para estudiar los mecanismos genéticos asociados con la biología de las células gliales. También se puede utilizar para examinar las respuestas de las células gliales entre sí en ensayos de cocultivo. Los pasos descritos representan un método rentable y de alto rendimiento para extraer y aislar diferentes poblaciones gliales del SNC que luego se pueden adaptar a una amplia variedad de parámetros experimentales. Cabe señalar; Sin embargo, que el método descrito aquí utiliza neonatos debido a los niveles más bajos de mielinización y la alta densidad de la glía proliferante. Por estas razones, es técnicamente más factible aislar la glía viable de los recién nacidos en comparación con los animales adultos. Por lo tanto, las diferencias fenotípicas en la glía neonatal en comparación con la glía adulta deben considerarse durante el diseño experimental y la interpretación de los datos.

La glía es necesaria para la función neuronal adecuada en el SNC. Están compuestos por tres subpoblaciones principales, astrocitos, oligodendrocitos y microglía, cada uno con un papel diferente, pero indispensable1. Sin la diversidad y actividad adecuada de las células gliales, la función neuronal se vería gravemente afectada, lo que llevaría al deterioro del SNC. Las glías son capaces de influir en la neurotransmisión, y cada tipo de célula lo hace de una manera única. Las células gliales en el cerebro tienen la capacidad de comunicarse entre sí, así como con las células neuronales, con el fin de facilitar la función adecuada del SNC2. Los oligodendrocitos aumentan la velocidad de transmisión eléctrica a través de la formación de una vaina de mielina, lo que facilita la agrupación de canales iónicos en los nodos de Ranvier, los sitios de generación potencial de acción neuronal3. La microglía es crítica para la poda de las sinapsis mediante el monitoreo de la transmisión sináptica y el "recableado" de las conexiones neuronales después de la lesión4. Además, la microglía es la célula inmune residente más abundante del SNC, actuando como la forma primaria de defensa del huésped contra los patógenos5. Los astrocitos pueden regular la transmisión sináptica entre neuronas modificando la concentración de potasio extracelular6. También tienen un papel en el control del flujo sanguíneo local7, la liberación y absorción de elementos neuromoduladores8, y tienen un papel clave en el mantenimiento de la barrera hematoencefálica9. Por lo tanto, cada subtipo glial es crítico para la función del SNC, ya que los defectos en cualquier tipo se han asociado durante mucho tiempo con una amplia variedad de estados patológicos, incluyendo enfermedades psiquiátricas, epilepsia y condiciones neurodegenerativas10.
El mayor obstáculo en el estudio de la patobiología del SNC es la incapacidad de investigar las células humanas en el contexto de su nicho microambiental. El tejido de biopsia humana se recolecta más post mortem y las células pueden dañarse o perderse fácilmente durante la extracción y el procesamiento. Además, es un desafío mantener las células humanas vivas y viables in vitro durante cualquier período de tiempo sin derivar líneas celulares inmortalizadas de tumores, momento en el cual ya no reflejan con precisión sus propiedades fisiológicas normales11,12. Además, existe una cantidad significativa de heterogeneidad regional entre los tipos individuales de células gliales13,14,15, y la obtención de muestras regionales del SNC de pacientes individuales es casi imposible. Como tal, es necesario desarrollar modelos alternativos para estudiar la contribución de la glía regional en trastornos específicos del SNC.
Aquí, describimos un sistema in vitro que utiliza el aislamiento específico de la región del SNC del ratón de múltiples subpoblaciones gliales, lo que permite la manipulación y cuantificación de microglía, células precursoras de oligodendrocitos (OPC), que dan lugar a oligodendrocitos maduros, y astrocitos. Cada población puede ser aislada independientemente y sometida a una amplia variedad de técnicas experimentales que incluyen tratamiento farmacológico o molecular, inmunocitoquímica, extracción y análisis de proteínas / ARN y otros sistemas de cocultivo según la necesidad experimental. Además, esta técnica de aislamiento produce un alto número de células, lo que permite la caracterización e investigación de cada población glial de una manera de alto rendimiento. También permite el estudio de la diferenciación, el crecimiento y la proliferación de células del SNC en respuesta a una amplia variedad de estímulos microambientales de manera controlada para evitar factores de confusión que suelen estar presentes en un entorno in vivo. Por último, esta técnica de aislamiento celular facilita la manipulación de las poblaciones de células gliales dentro de diferentes regiones del SNC para investigar cómo la glía regional interactúa entre sí y responde a estímulos variables, lo que permite precisión y reproducibilidad.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665 180</td>
			<td>Cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td>Standard reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL, 25 cm2 cell culture flask</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>690 175</td>
			<td>Cell culture (T25) flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-096</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement 50X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-50G</td>
			<td>Antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td>Confocal for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995040</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3840001</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-1MG</td>
			<td>Cell adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine stitch Scissors</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>64-3260</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Secondary staining antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21434</td>
			<td>Secondary staining antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170120</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20530081</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine epidermal growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PMG8044</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-05-20UG</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine PDGF-AA</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-17</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Blocking solution component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>Surgi-OR</td>
			<td>95-272</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip</td>
			<td>Corning Biocoatt</td>
			<td>354086</td>
			<td>Cell adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9071S</td>
			<td>Mounting Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Iba1</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab5320</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-GFAP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>13-0300</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-myelin basic protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7349</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Tip Scissors</td>
			<td>Surgi-OR</td>
			<td>95-104</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S4 E Stereo Zoom Microscope</td>
			<td>Microscope for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>66-7644</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Cell permabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor (from chicken egg white)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10109878001</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and isolation of murine glia from multiple central nervous system regions

Los métodos presentados aquí demuestran procedimientos de laboratorio para la disección de cuatro regiones diferentes del sistema nervioso central (SNC) de neonatos murinos para el aislamiento de subpoblaciones gliales. El propósito del procedimiento es disociar la microglía, las células progenitoras de oligodendrocitos (OPC) y los astrocitos del tejido cortical, cerebeloso, del tronco encefálico y de la médula espinal para facilitar el análisis in vitro adicional. Los procedimientos de aislamiento de la región del SNC permiten determinar la heterogeneidad regional entre las glías en múltiples sistemas de cultivo celular. Se realiza un aislamiento rápido de la región del SNC, seguido de la extirpación mecánica de las meninges para evitar la contaminación de la glía por células meníngeas. Este protocolo combina una disociación suave del tejido y el recubrimiento en una matriz específica diseñada para preservar la integridad y la adherencia celular. El aislamiento de la glía mixta de múltiples regiones del SNC proporciona un análisis exhaustivo de la glía potencialmente heterogénea al tiempo que maximiza el uso de animales de experimentación individuales. Además, después de la disociación del tejido regional, la glía mixta se divide en múltiples tipos de células, incluidas la microglía, las OPC y los astrocitos para su uso en un solo tipo de célula, inserciones de placas de cultivo celular o sistemas de cocultivo. En general, las técnicas demostradas proporcionan un protocolo integral de amplia aplicabilidad para la disección cuidadosa de cuatro regiones individuales del SNC de neonatos murinos e incluye métodos para el aislamiento de tres tipos individuales de células gliales para examinar la heterogeneidad regional en cualquier número de sistemas de cultivo celular in vitro o ensayos.

Los datos representativos que se muestran a continuación ilustran que la señalización de IFNγ influye en la diferenciación y maduración de OPC. Sin la presencia del receptor de IFNγ (IFNγR), las OPC corticales no se diferencian en oligodendrocitos mielinizantes maduros tan fácilmente, lo que se evidencia por la ausencia de tinción MBP (Figura 1). Dado que los oligodendrocitos y los astrocitos se derivan de un progenitor común, analizamos la expresión de GFAP, que etiqueta los astrocitos. Encontramos que las células deficientes en IFNγR expresan fuertemente GFAP, lo que sugiere que pueden estar adoptando un fenotipo astrocítico, corroborando informes anteriores19.
La evidencia adicional de heterogeneidad regional en las células del SNC se evidencia por la morfología variable de los astrocitos como se ve en los astrocitos de la corteza, el cerebelo, el tronco encefálico y la médula espinal (Figura 2). Cabe destacar que los astrocitos de la misma región también pueden exhibir heterogeneidad morfológica, lo que apoya la noción de que este subtipo glial es altamente dinámico. Las diferencias en la arquitectura celular sugieren diversidad funcional y, por lo tanto, la capacidad de aislar poblaciones gliales es necesaria para estudiar las respuestas fenotípicas en ausencia y presencia de estímulos microambientales.
Los oligodendrocitos son críticos para la mielinización de los axones neuronales y son necesarios para la reparación y función adecuada del SNC. Los OPC dan lugar a sus contrapartes maduras, por lo que es fundamental comprender la biología detrás de su capacidad para diferenciarse. La señalización de citoquinas influye significativamente en el comportamiento de las células madre e inmunes. Por lo tanto, es importante comprender cómo las respuestas regionales de las OPC pueden variar a la estimulación diferencial de citoquinas (Figura 3), lo que puede afectar su capacidad para diferenciarse en oligodendrocitos mielinizantes maduros.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig01.jpg"> Figura 1: Datos representativos que muestran la diferenciación de OPC en ratones WT e IFNγR-/- en presencia de IFNγ exógeno. Las OPC corticales se aislaron de ( A ) WT y (B) IFNγR-/- P4 crías de ratón siguiendo el procedimiento descrito anteriormente. Las células se trataron con 1 ng/ml de IFNγ durante 48 h, luego se fijaron y se tiñeron para delinear la diferenciación celular. Los OPC se etiquetaron para NG2 y GFAP para identificar aquellos que estaban adoptando un fenotipo astrocítico. Del mismo modo, los OPC también se etiquetaron para NG2 y MBP para identificar aquellos que se diferenciaban en oligodendrocitos maduros. Barra de escala = 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig02.jpg"> Figura 2: Datos representativos que demuestran heterogeneidad regional en la morfología de los astrocitos. Los astrocitos de la corteza, el cerebelo, el tronco encefálico y la médula espinal se aislaron de crías de ratón P4 utilizando el protocolo descrito anteriormente y se etiquetaron para GFAP (verde) por inmunocitoquímica después de 48 h en cultivo. Barra de escala = 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig03.jpg"> Figura 3: Datos representativos que demuestran respuestas diferenciales de OPC regionales a citocinas. Las OPC se aislaron del tronco encefálico y la médula espinal de crías de ratón P4 utilizando el protocolo descrito anteriormente. Las células se trataron con concentraciones crecientes (1-10 ng / ml) de ( A ) IFNγ o (B) interleucina (IL) -17 para investigar la influencia diferencial de las citoquinas en la capacidad de las OPC regionales para diferenciarse en oligodendrocitos mielinizantes. Después de una incubación de 48 h con citoquinas especificadas, las OPC se fijaron y marcaron para NG2 (verde) y MBP (rojo). Barra de escala = 20 μM. Los datos representan medias ± SEM. **, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001 por ANOVA de 2 vías. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">PBS/Solución antibiótica (PAS):</td>
		</tr><tr><td>1.0 ml</td>
			<td colspan="2">100X antibiótico/antimicótico que contiene 10.000 unidades/ml de penicilina y 10.000 mg/ml de estreptomicina</td>
		</tr><tr><td>25 mg/ml</td>
			<td colspan="2">Anfotericina B</td>
		</tr><tr><td>99 ml</td>
			<td colspan="2">1X PBS</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Medios Glia Mixtos (MGM)</td>
		</tr><tr><td>88 ml</td>
			<td colspan="2">1X DMEM (glucosa alta, con L-glutamina, con piruvato de Na)</td>
		</tr><tr><td>10 ml</td>
			<td colspan="2">FBS inactivado por calor</td>
		</tr><tr><td>1.0 ml</td>
			<td colspan="2">L-Glutamina (100X)</td>
		</tr><tr><td>1.0 ml</td>
			<td colspan="2">Antibiótico/Antimicótico</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Medios OPC (50 ml)</td>
		</tr><tr><td>49 ml</td>
			<td colspan="2">Medios neurobasales</td>
		</tr><tr><td>1.0 ml</td>
			<td colspan="2">Suplemento B27 (50X)</td>
		</tr><tr><td>10 ng/ml</td>
			<td colspan="2">PDGF-AA</td>
		</tr><tr><td colspan="3">NOTA: PDGF-AA se agrega nuevo antes de cada cambio de medios.</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Medios de astrocitos (1 L)</td>
		</tr><tr><td>764 ml</td>
			<td colspan="2">MEM con sales de Earle que contienen glutamina</td>
		</tr><tr><td>36 ml</td>
			<td colspan="2">Glucosa (use 100 mg/ml para la concentración final de 20 mM)</td>
		</tr><tr><td>100 ml</td>
			<td colspan="2">FBS inactivado por calor</td>
		</tr><tr><td>100 ml</td>
			<td colspan="2">Suero de caballo inactivado por calor</td>
		</tr><tr><td>10 ml</td>
			<td colspan="2">Glutamina (use 200 mM de caldo si no está incluido en el medio de stock)</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">OPCIONAL: 10 ng/ml de factor de crecimiento epidérmico recombinante de ratón</td>
		</tr><tr><td colspan="3">NOTA: Filtrar estéril todos los medios y almacenar a 4°C hasta que se utilice.</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Buffer y recetas de medios.

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Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento in vitro de múltiples poblaciones de células gliales de un SNC de ratón. Este método permite la segregación de microglía regional, células precursoras de oligodendrocitos y astrocitos para estudiar los fenotipos de cada uno en una variedad de sistemas de cultivo.

Disección y aislamiento de la glía murina de múltiples regiones del sistema nervioso central

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

dissection-isolation-murine-glia-from-multiple-central-nervous-system

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.1K vistas.  Lerner Research Institute, Cleveland Clinic Foundation. Aquí presentamos un protocolo para el aislamiento in vitro de múltiples poblaciones de células gliales de un SNC de ratón. Este método permite la segregación de microglía regional, células precursoras de oligodendrocitos y astrocitos para estudiar los fenotipos de cada uno en una variedad de sistemas de cultivo.

Video: Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagen multimodal de implante de células madre en el sistema nervioso central de ratones

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Investigación

Neurociencias

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

La producción de vectores lentivirales de células transductoras del Sistema Nervioso Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

El marcaje de células individuales en el Sistema Nervioso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Un paradigma de Lesiones de investigar reparación del sistema nervioso central en<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Entrega intraventricular directa de medicamentos al roedor Sistema Nervioso Central

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

El análisis inmunohistoquímico en el sistema nervioso central y periférico de la rata de nodo linfático secciones de tejido

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

En Interrogatorio vivo del Sistema Nervioso Central Translatome por Polyribosome Fraccionamiento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogenético la estimulación del sistema nervioso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing óptico del sistema nervioso central del ratón Utilizando CLARITY pasiva

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Registro electrofisiológico de la actividad del sistema nervioso Central de tercer estadio de Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...