Name: Vídeo: Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions
Uploaded: 2020-06-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min

Agradecemos a Morgan Psenicka pela edição e discussão do manuscrito e ao Dr. Grahame Kidd pela assistência na formatação das figuras. Este trabalho foi apoiado pelo NIAID K22 AI125466 (JLW).

NOTA: Todos os estudos em animais foram autorizados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Cleveland Clinic Lerner Research Institute.
1. Preparar meios e suprimentos para dissecação
NOTA: Todas as receitas de buffer e mídia são fornecidas na Tabela 1. Este procedimento é feito em condições estéreis em um gabinete de biossegurança designado por cultura de tecidos.
<ol><li>Preparar e filtrar estérile o meio de glia mista (MGM). Isso pode ser feito no dia anterior e armazenado a 4 °C.</li>
	<li>Diluir a fibronectina numa concentração de 1:100 com H2O estéril. O volume de fibronectina diluída dependerá do número de filhotes e da região do SNC utilizada para o experimento. Use um frasco T25 para 1 córtex, um frasco T25 para 2-4 cerebeles, um frasco T25 para 2-4 caules cerebrais e um frasco T25 para 2-4 medula espinhal. NOTA: A combinação de tecido da mesma região utilizando os critérios listados acima permitirá uma dissociação adequada sem alterar o protocolo descrito abaixo. A combinação de mais tecido do que o descrito na Etapa 1.2 exigirá uma otimização adicional das concentrações de reagentes de dissociação.</li>
	<li>Pipetar 3 ml de fibronectina diluída para balões T25 à temperatura ambiente e deixar descansar durante 2 min.</li>
	<li>Aspirar a fibronectina e deixar secar os frascos durante a noite com a tampa do balão solta.</li>
</ol>2. Córtex, cerebelo, tronco encefálico e dissecção da medula espinhal
NOTA: Este procedimento pode ser feito na bancada e requer um escopo de dissecação. Use uma técnica asséptica rigorosa para todas as etapas do procedimento e minimize a exposição do tecido ao ar ambiente. Mantenha todos os meios resfriados no gelo durante a dissecção para garantir a máxima preservação do tecido. Alternativamente, esse procedimento pode ser feito em um exaustor que permita o uso de um escopo de dissecação interna.
<ol><li>Limpe todas as áreas com etanol a 70%.</li>
	<li>Pipetar 10 mL de PBS/solução antibiótica (PAS) em uma placa de Petri de 10 cm. Prepare uma placa de Petri para cada filhote a ser dissecado. Coloque no gelo para manter a solução resfriada.</li>
	<li>Em um exaustor de cultura de tecidos desinfetados, pipete 9 mL de DMEM (sem aditivos) em 4 tubos cônicos separados de 15 mL, um para cada região do SNC, substitua as tampas do tubo e coloque no gelo. Coloque o balde de gelo com tubos a uma curta distância do escopo de dissecação.</li>
	<li>Colocar uma placa de Petri de 10 cm preparada no passo 2.2 na fase de escoamento da dissecação desinfetada.</li>
	<li>Anestesiar e eutanasiar filhotes de camundongos de acordo com o protocolo institucional e remover a cabeça por decapitação rápida com tesoura afiada. NOTA: Dia pós-natal (P) 3-5 filhotes são usados. Filhotes mais velhos têm um SNC mais desenvolvido e podem não ser uma fonte adequada de expansão das células gliais. Filhotes mais jovens (P) 0-2 podem produzir um maior número de glias e podem ser usados; no entanto, o tecido da medula espinhal é muito difícil de dissecar nesta idade jovem devido ao tamanho.</li>
	<li>Limpe a pele do filhote usando etanol a 70%.</li>
	<li>Usando uma tesoura fina, corte a camada cutânea ao longo da linha média da cabeça do animal, iniciando caudalmente e movendo-se rostral, até chegar ao focinho. Evite cortar profundamente o crânio para evitar qualquer dano tecidual.</li>
	<li>Inclinando a cabeça para baixo, puxe a camada cutânea para cada lado do crânio e usando uma tesoura de mola, faça uma incisão ao longo da linha média do crânio, começando pelo forame magno, novamente cortando caudal a rostral.</li>
	<li>Com pinças de ponta fina, puxe as metades do crânio para os lados direito e esquerdo, expondo o córtex, o cerebelo e o tronco encefálico.</li>
	<li>Uma vez exposto, levante suavemente o cérebro para fora do crânio e para a placa de Petri de 10 cm preparada na Etapa 2.2. Certifique-se de que o cérebro permaneça intacto para preservar a estrutura anatômica, com o rombencéfalo ligado.</li>
	<li>Usando pinças finas e curvas com o ponto da pinça voltada para cima, pinch o cerebelo. Retire as meninges e coloque em tubo cônico designado de 15 mL no balde de gelo.</li>
	<li>Certifique-se de que o tronco encefálico é diretamente ventral ao cerebelo e é visível após a remoção do cerebelo. Removê-lo com pinça de ponta fina, remover meninges e colocar em tubo cônico designado 15 mL no balde de gelo.</li>
	<li>Separe o mesencéfalo do córtex, remova as meninges corticais e coloque no tubo cônico designado de 15 mL no balde de gelo.</li>
	<li>Para remover a medula espinhal, coloque o filhote de rato decapitado em decúbito dorsal (deitado de bruços para cima) com a coluna vertebral cortada elevada em direção ao investigador.</li>
	<li>Pulverize novamente com etanol a 70%.</li>
	<li>Corte ao longo dos lados laterais da coluna vertebral, no sentido rostral a caudal, através da caixa torácica até atingir os membros posteriores. Durante o corte, empurre para trás os órgãos internos até que a coluna vertebral seja visível.</li>
	<li>Cortar ao longo de cada lado lateral da coluna vertebral até que esteja isolado e colocar na placa de Petri de 10 cm preparada na Etapa 2.2.</li>
	<li>Com o lado ventral para cima, usando uma tesoura de mola fina, alterne o corte dos lados direito e esquerdo de cada vértebra até atingir a região lombar para expor o tecido medular.</li>
	<li>Remova suavemente a medula espinhal e as meninges com pinças de ponta fina sob o microscópio de dissecação. Coloque no tubo cônico designado de 15 mL no balde de gelo.</li>
	<li>Repetir os passos 2.5.-2.19 para cada filhote, combinando tecido da mesma região de modo a se adequarem aos critérios descritos no passo 1.2 para cada balão T25 preparado. NOTA: Remova as meninges o mais completamente possível. Se uma quantidade significativa de meninges permanecer, o fenótipo semelhante a fibroblastos das células meníngeas irá crescer mais e sobrecarregar a cultura celular. Múltiplas medula espinhal, de fenótipo igual, podem ser combinadas para gerar uma cultura celular específica. Tome cuidado para garantir que a superlotação das células não ocorra, o que pode levar à apoptose glial e fenótipos diferenciais.</li>
</ol>3. Dissociação tecidual
NOTA: Todos os procedimentos a seguir são realizados em um gabinete de biossegurança designado por cultura de tecidos estéreis usando técnica asséptica e materiais estéreis.
<ol><li>Adicione 1 mL de tripsina a 0,05% contendo 0,53 mM EDTA a cada tubo cônico de 15 mL de DMEM de 9 mL e tecido para iniciar a lise tecidual. NOTA: DMEM contém uma grande quantidade de cloreto de cálcio, que pode atuar como um inibidor da tripsina. Se a dissociação não estiver completa seguindo as etapas descritas, a Solução Salar Balanceada de Hanks sem cálcio ou magnésio pode ser usada. Após a tripsinização, a enzima pode ser neutralizada pela adição de um inibidor de tripsina, embora o cálcio deva ser adicionado de volta à solução, pois é um cofator para a DNase I, que é usado nas etapas subsequentes.</li>
	<li>Triturar com uma pipeta de 10 mL aproximadamente 20x.</li>
	<li>Transfira as suspensões celulares para tubos cônicos vazios de 50 mL.</li>
	<li>Incubar a solução a 37 °C, CO2 a 5% durante 15 min, agitando suavemente os lisados após 8 min.</li>
	<li>Adicionar 5 mL de MGM e 200 μL (5 mg/mL) de DNase I a cada tubo para uma concentração final de 50 μg/mL.</li>
	<li>Triturar cada lisado com uma pipeta de 10 mL 10x.</li>
	<li>Deixe as suspensões celulares ficarem por 3 minutos à temperatura ambiente para permitir que o tecido não dissociado se deposite no fundo dos tubos.</li>
	<li>Transfira as suspensões celulares para novos tubos cônicos de 50 mL, deixando para trás o tecido não dissociado. NOTA: As etapas de lise e trituração descritas acima limitam significativamente a quantidade de tecido não dissociado.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 300 x g durante 3 min a 4 °C sem travagem.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e ressuspender os pellets celulares restantes em 5 mL de MGM.</li>
	<li>Triturar o pellet com uma pipeta de 5 mL 20x.</li>
	<li>Chapear as suspensões celulares de 5 ml em balões T25 revestidos.</li>
	<li>Incubar as células a 37 °C, 5% de CO2 e trocar o meio inicialmente após 24 h para remover os detritos celulares. Observação : alguns protocolos recomendam uma alteração de mídia inicial após 72 h. A otimização desta etapa pode ser necessária.</li>
	<li>Realize uma troca de mídia de 100% com MGM a cada 48-72 h até que as células estejam 80% confluentes (aproximadamente 5-7 dias). NOTA: Todos os suportes têm de ser aquecidos a 37 °C antes de serem alterados pelos suportes.</li>
</ol>4. Isolamento da micróglia
<ol><li>Uma vez que as culturas mistas de glia tenham atingido 80% de confluência, prepare frascos para agitação apertando as tampas e selando com filme de parafina.</li>
	<li>Para remover a micróglia de culturas gliais mistas, fixar os frascos horizontalmente num agitador orbital no interior de uma incubadora a 37 °C. Agitar os balões a 15 x g durante 1 h.</li>
	<li>Remova o meio e a pipeta em um tubo cônico de 15 mL. Enxaguar os frascos duas vezes com 3 mL de MGM morno, adicionando lavagem aos tubos cônicos de 15 mL. Estes são os micróglios.</li>
	<li>Adicionar 5 ml de MGM quente e fresca aos frascos de cultura.</li>
	<li>Voltar a selar os frascos com película de parafina, fixar os frascos horizontalmente no agitador e agitar a 15 x g a 37 °C durante 15 h para separação dos OPC dos astrócitos. NOTA: Esta etapa pode ser feita durante a noite, mas o tempo de agitação de 15 horas é crítico, pois o excesso de tempo pode resultar em morte celular.</li>
	<li>Centrifugar o sobrenadante a partir do passo 4.3. a 300 x g por 3 min e cultura de micróglia de acordo com os protocolos padrão16 ou uso para um ensaio biológico.</li>
</ol>5. Isolamento celular precursor de oligodendrócitos
NOTA: Ao chapear OPCs após o isolamento inicial, eles devem ser banhados em uma superfície revestida de poli-D-lisina (placa estéril ou deslizamento da tampa). Prepare esses materiais antes da conclusão desta seção.
<ol><li>Após agitação de 15 h, retirar o sobrenadante dos frascos e da placa em placa de Petri estéril de 100 mm.</li>
	<li>Incubar o sobrenadante a 37 °C, 5% de CO2 durante 30 min, rodopiando após 15 min para remover a micróglia restante, uma vez que estas aderirão muito rapidamente ao prato. Placas de Petri não tratadas com cultura de tecidos podem ser usadas para esta etapa.</li>
	<li>Remova o sobrenadante, a contagem e a placa de células não aderentes em uma superfície revestida de poli-D-lisina. Normalmente, 7.500-10.000 OPCs são chapeados/cm2.</li>
	<li>Incubar a 37 °C, 5% de CO2 por pelo menos 1 h (até 6 h), em seguida, aspirar suavemente 95% da mídia e adicionar lentamente a mídia OPC quente, pipetando a mídia contra a parede do poço para minimizar a interrupção dos OPCs. Troque a mídia a cada 48 horas até que as células estejam prontas para uso. NOTA: É fundamental que apenas um poço seja alterado de cada vez. Os OPCs são sensíveis e são especialmente intolerantes a condições secas. A adição de PDGF-AA em meios OPC é para retardar a maturação do OPC em oligodendrócitos. Este fator pode ser excluído dos meios de cultura se o foco experimental forem oligodendrócitos maduros.</li>
</ol>6. Isolamento de astrócitos
<ol><li>Após 15 h de agitação, retire o sobrenadante e enxágue os frascos 2x com 1x PBS morno.</li>
	<li>Adicionar 4 ml de tripsina a 0,05% contendo 0,53 mM EDTA e incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 5 min ou até que as células tenham levantado. Para garantir que os astrócitos tenham levantado, visualize-os usando um microscópio de campo largo padrão. Os astrócitos aparecerão esféricos após a tripsinização.</li>
	<li>Uma vez que os astrócitos tenham se desprendido, coloque o frasco verticalmente e adicione 4 mL de MGM. Triturar para misturar.</li>
	<li>Pipetar astrócitos para um tubo cônico de 15 mL, centrífuga a 300 x g por 5 min.</li>
	<li>Ressuspender astrócitos em meio e placa de astrócitos na superfície revestida de fibronectina, conforme descrito na etapa 1.2. ou uso para ensaio biológico. NOTA: 20 ng/mL de fator de crescimento de fibroblastos murinos podem ser adicionados durante a primeira mudança de meio para ajudar a estabelecer a cultura de astrócitos. Além disso, o revestimento de gelatina padrão pode ser uma alternativa de baixo custo à fibronectina.</li>
</ol>7. Identificação e isolamento de micróglia, OPCs, astrócitos e oligodendrócitos maduros usando imunocitoquímica
<ol><li>Uma vez que as células chapeadas tenham atingido a confluência apropriada, remova suavemente os meios e fixe as células aderentes usando paraformaldeído a 4% (PFA) por 10 min. Faça esta etapa em um gabinete de biossegurança. NOTA: Ao aspirar ou adicionar soluções, pipetar com pressão suave para evitar o descolamento da célula.</li>
	<li>Aspirar lentamente o PFA e, em seguida, lavar as células 3x com 1x PBS por 5 min.</li>
	<li>Preparar a solução de bloqueio apropriada usando soro a 10% e Triton X-100 a 0,1% em PBS 1x. NOTA: A fonte sérica reflete o animal hospedeiro no qual o anticorpo secundário foi levantado. Por exemplo, se o anticorpo secundário for anti-coelho de cabra, o soro bloqueador apropriado é o soro de cabra normal. Da mesma forma, se o anticorpo secundário for anticoelho de burro, o soro bloqueador deve ser um soro de burro normal.</li>
	<li>Adicione a solução de bloqueio até que as células estejam completamente cobertas. Bloco por 1 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar uma solução diluente de anticorpos (9 mL de 1x PBS, 0,01 g de albumina sérica bovina, 30 μL de Triton X-100). Em alternativa, os anticorpos podem ser diluídos na solução de bloqueio descrita no passo 6.3.</li>
	<li>Diluir os anticorpos primários específicos para os seguintes em solução diluente ou bloqueadora de anticorpos:<ol><li>Microglia: molécula 1 do adaptador de ligação ao cálcio ionizado (Iba1) a uma diluição de 1:250 (2,4 μg/mL).</li>
		<li>OPCs: antígeno neural/glial 2 (NG2) em diluição de 1:200 (5 μg/mL).</li>
		<li>Oligodendrócitos maduros: proteína básica de mielina (MBP) a uma diluição de 1:400 (a concentração é dependente do lote e a otimização pode ser necessária).</li>
		<li>Astrócitos: proteína glial fibrilar ácida (GFAP) em diluição de 1:400 (0,25 μg/mL)17. NOTA: Não misture anticorpos primários criados na mesma espécie. NOTA: A GFAP rotulará de forma confiável os astrócitos da substância branca. Para os astrócitos da substância cinzenta, pode ser necessário utilizar um marcador alternativo.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar o anticorpo primário durante a noite a 4 °C (com agitação suave é preferível).</li>
	<li>Lave 3x com 1x PBS por 5 min para remover o anticorpo primário.</li>
	<li>Incubar células com anticorpos secundários apropriados a uma diluição de 1:400 em diluente de anticorpos ou solução bloqueadora protegida da luz. NOTA: Os anticorpos secundários são conjugados a um fluoróforo que pode ser trocado dependendo dos parâmetros de microscópio disponíveis. Uma vez que os anticorpos secundários fluorescentes tenham sido aplicados, proteja-se da luz o máximo possível.</li>
	<li>Incubar anticorpos secundários por 1 h à temperatura ambiente, limitando a exposição à luz.</li>
	<li>Lave 3 vezes com 1x PBS por 5 min para remover o excesso de anticorpos secundários.</li>
	<li>Para marcar núcleos, use uma solução DAPI/PBS 1:1.000 e incube as células por 5 minutos à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Lave 3x com 1x PBS por 5 min no escuro.</li>
	<li>Para montar, aplique o meio de montagem e deixe secar no escuro antes da imagem. NOTA: As lâminas montadas podem ser armazenadas à temperatura ambiente por 2-3 dias. Para armazenamento a longo prazo, mova as corrediças para 4 °C. Imagem dentro de uma semana para sinal máximo. Todas as imagens representativas foram fotografadas em microscópio confocal; no entanto, microscópios fluorescentes invertidos também são recomendados.</li>
</ol>

<ol>
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M., Kishimoto, T., Makinodan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+primary+roles+of+glial+cells+in+the+mechanisms+of+psychiatric+disorders.">Potential primary roles of glial cells in the mechanisms of psychiatric disorders.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9 (154), (2015).</li><li>Hartenstein, V., Giangrande, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connecting+the+nervous+and+the+immune+systems+in+evolution.">Connecting the nervous and the immune systems in evolution.</a> Communications Biology. 1 (1), 64 (2018).</li><li>Emsley, J. G., Macklis, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglial+heterogeneity+closely+reflects+the+neuronal-defined+anatomy+of+the+adult+murine+CNS.">Astroglial heterogeneity closely reflects the neuronal-defined anatomy of the adult murine CNS.</a> Neuron Glia Biology. 2 (3), 175-186 (2006).</li><li>Chaboub, L. S., Deneen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+Origins+of+Astrocyte+Heterogeneity:+The+Final+Frontier+of+CNS+Development.">Developmental Origins of Astrocyte Heterogeneity: The Final Frontier of CNS Development.</a> Developmental Neuroscience. 34 (5), 379-388 (2012).</li><li>Tan, Y. L., Yuan, Y., Tian, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+regional+heterogeneity+and+its+role+in+the+brain.">Microglial regional heterogeneity and its role in the brain.</a> Molecular Psychiatry. 25 (2), 351-367 (2020).</li><li>Bottcher, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microglia+regional+heterogeneity+and+phenotypes+determined+by+multiplexed+single-cell+mass+cytometry.">Human microglia regional heterogeneity and phenotypes determined by multiplexed single-cell mass cytometry.</a> Nature Neurosciences. 22 (1), 78-90 (2019).</li><li>Marques, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendrocyte+heterogeneity+in+the+mouse+juvenile+and+adult+central+nervous+system.">Oligodendrocyte heterogeneity in the mouse juvenile and adult central nervous system.</a> Science. 352 (6291), 1326-1329 (2016).</li></ol>

Os autores têm conflitos de interesse a divulgar.

Neste protocolo, descrevemos o isolamento das três principais subpopulações de células gliais do SNC de camundongos: micróglia, OPCs e astrócitos. Um grande revés para a investigação de doenças neurodegenerativas e neuroinflamatórias do SNC é a falta de células e tecidos humanos primários, particularmente aqueles que são regionais e do mesmo paciente. Na maioria dos casos, as linhagens celulares humanas do SNC são derivadas de células cancerígenas transformadas e imortalizadas que podem não ser representações precisas de seu comportamento fisiológico normal20,21,22. Assim, métodos alternativos são necessários para estudar os fenótipos celulares do SNC de forma controlada. Além disso, a diversidade de populações de células gliais neurológicas torna necessário investigar cada subtipo tanto independentemente um do outro, bem como em condições de co-cultura, a fim de recapitular suas funções celulares autônomas e não autônomas. As células gliais têm uma grande variedade de funções críticas no SNC, desde o suporte neuronal23, aprendizagem/cognição 24,25 e respostas imunológicas do SNC26. Como tal, é necessário compreender as funções moleculares e celulares de cada subpopulação glial em um contexto fisiológico e patológico. Para isso, fornecemos aqui um método confiável para a extração e isolamento de subtipos viáveis de glia. Devido a restrições práticas e éticas na pesquisa do sujeito humano, os modelos animais são atualmente os substitutos mais relevantes para a biologia celular glial humana. Em particular, os ratos são animais modelo ideais, pois seu genoma pode ser manipulado e analisado para dissecar ainda mais os mecanismos moleculares específicos subjacentes à saúde e à doença. Portanto, a remoção e separação bem-sucedidas de micróglias murinas, OPCs e astrócitos é uma ferramenta fundamental para investigar as funções da glia durante condições fisiológicas, neurodegenerativas ou neuroinflamatórias.
Este protocolo pode ser otimizado para explorar a heterogeneidade regional das células do SNC. Está se tornando cada vez mais claro que a glia exibe heterogeneidade regional em forma e função. Os astrócitos são regionalmente diversos e exibem morfologia distinta dependendo de sua localização dentro do CNS27. Além disso, a densidade de astrócitos e seu índice mitótico podem definir regiões anatômicas, apoiando a hipótese de que a heterogeneidade regional de astrócitos pode refletir diferenças moleculares e funcionais com base em sua localização dentro do SNC28. A heterogeneidade regional microglial também está sob investigação ativa, embora os mecanismos subjacentes e as consequências funcionais da diversidade da micróglia no desenvolvimento ou comportamento do SNC sejam atualmente incertos. No entanto, sabe-se que a micróglia adulta apresenta diversidade no número celular, estruturas celulares e subcelulares e assinaturas moleculares29. Além disso, avanços recentes na citometria de massa multiplexada definiram ainda mais a heterogeneidade regional da micróglia, analisando o fenótipo celular de cinco regiões diferentes do SNC de nove doadores humanos, permitindo a imunofenotipagem em larga escala da micróglia humana30. Atualmente, tais abordagens estão em seus estágios iniciais, tornando os estudos em animais uma solução viável para o estudo da glia regional no desenvolvimento da doença do SNC. Finalmente, a heterogeneidade regional também foi recentemente descrita em oligodendrócitos. O sequenciamento de RNA unicelular em 5072 células individuais de 10 regiões do SNC juvenil e adulto identificou 13 subpopulações distintas em diferentes estágios de diferenciação31. É importante ressaltar que, à medida que os oligodendrócitos amadureceram a partir de OPCs, seus perfis transcricionais divergiram e seus fenótipos funcionais mudaram, destacando a heterogeneidade dos oligodendrócitos dentro do SNC31.
Assim, a compreensão da heterogeneidade regional das várias células residentes do SNC no contexto de seus diversos neurônios vizinhos e outras glias pode fornecer uma justificativa importante para o desenvolvimento futuro de novas terapias para tratar distúrbios neuroinflamatórios e neurodegenerativos. Embora este protocolo se concentre na extração, isolamento e identificação de subpopulações gliais, ele fornece um ponto de partida conveniente para o exame de sua função. Além disso, pode ser adaptado e combinado com modelos de camundongos transgênicos, a fim de estudar os mecanismos genéticos associados à biologia celular glial. Também pode ser usado para examinar as respostas das células gliais umas às outras em ensaios de co-cultura. As etapas descritas representam um método econômico e de alto rendimento de extração e isolamento de diferentes populações gliais do SNC, que podem ser adaptadas a uma ampla variedade de parâmetros experimentais. Deve-se notar; no entanto, que o método aqui descrito utiliza neonatos devido aos níveis mais baixos de mielinização e alta densidade de glia proliferante. Por estas razões, é tecnicamente mais viável isolar a glia viável dos neonatos em comparação com os animais adultos. As diferenças fenotípicas na glia neonatal em comparação com a glia adulta devem, portanto, ser consideradas durante o delineamento experimental e a interpretação dos dados.

A glia é necessária para a função neuronal adequada no SNC. São compostas por três grandes subpopulações, astrócitos, oligodendrócitos e micróglia, cada uma com um papel diferente, porém indispensável1. Sem a diversidade e a atividade das células gliais adequadas, a função neuronal seria severamente afetada, levando ao comprometimento do SNC. As glias são capazes de influenciar a neurotransmissão, e cada tipo de célula o faz de uma maneira única. As células gliais do cérebro têm a capacidade de se comunicar entre si, bem como com as células neuronais, a fim de facilitar a função adequada do SNC2. Os oligodendrócitos aumentam a velocidade de transmissão elétrica através da formação de uma bainha de mielina, o que facilita o agrupamento de canais iônicos nos nós de Ranvier, os locais de geração do potencial de ação neuronal3. As micróglias são críticas para a poda das sinapses, monitorando a transmissão sináptica e "reconectando" as conexões neuronais após a lesão4. Além disso, a micróglia é a célula imune residente mais abundante do SNC, atuando como a principal forma de defesa do hospedeiro contra patógenos5. Os astrócitos podem regular a transmissão sináptica entre neurônios modificando a concentração de potássio extracelular6. Eles também têm papéis no controle do fluxo sanguíneo local7, liberando e absorvendo elementos neuromoduladores8, e têm um papel fundamental na manutenção da barreira hematoencefálica9. Assim, cada subtipo glial é crítico para a função do SNC, pois defeitos em qualquer tipo têm sido associados a uma ampla variedade de estados patológicos, incluindo doenças psiquiátricas, epilepsia e condições neurodegenerativas10.
O maior obstáculo no estudo da patobiologia do SNC é a incapacidade de investigar células humanas no contexto de seu nicho microambiental. O tecido da biópsia humana é mais coletado post-mortem e as células podem ser facilmente danificadas ou perdidas durante a extração e o processamento. Além disso, é um desafio manter as células humanas vivas e viáveis in vitro por qualquer período de tempo sem derivar linhagens celulares imortalizadas de tumores, momento em que elas não refletem mais com precisão suas propriedades fisiológicas normais11,12. Além disso, há uma quantidade significativa de heterogeneidade regional entre os tipos individuais de células gliais13,14,15, e a obtenção de amostras regionais do SNC de pacientes individuais é quase impossível. Como tal, é necessário desenvolver modelos alternativos para estudar a contribuição da glia regional em distúrbios específicos do SNC.
Aqui, descrevemos um sistema in vitro usando o isolamento específico da região do SNC de camundongos de múltiplas subpopulações gliais, permitindo a manipulação e quantificação de microglia, células precursoras de oligodendrócitos (OPCs), que dão origem a oligodendrócitos maduros e astrócitos. Cada população pode ser isolada de forma independente e submetida a uma ampla variedade de técnicas experimentais, incluindo tratamento de drogas ou moléculas, imunocitoquímica, extração e análise de proteínas/RNA e outros sistemas de cocultura, dependendo da necessidade experimental. Além disso, essa técnica de isolamento produz alto número de células, permitindo a caracterização e investigação de cada população glial de maneira de alto rendimento. Também permite o estudo da diferenciação, crescimento e proliferação de células do SNC em resposta a uma ampla variedade de estímulos microambientais de forma controlada, a fim de evitar fatores de confusão que estão tipicamente presentes em um ambiente in vivo. Por fim, esta técnica de isolamento celular facilita a manipulação de populações de células gliais dentro de diferentes regiões do SNC para investigar como a glia regional interage entre si e responde a estímulos variados, permitindo precisão e reprodutibilidade.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300054</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12-Well Plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>665 180</td>
			<td>Cell culture plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X PBS pH 7.4</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010031</td>
			<td>Standard reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>32% Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714-S</td>
			<td>Fixative</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL, 25 cm2 cell culture flask</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>690 175</td>
			<td>Cell culture (T25) flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic 100X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240-096</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-27 Supplement 50X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9647-50G</td>
			<td>Antibody diluent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td>Confocal for imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D1306</td>
			<td>Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995040</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dnase I</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>A3840001</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F1141-1MG</td>
			<td>Cell adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine stitch Scissors</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>64-3260</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A11008</td>
			<td>Secondary staining antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A21434</td>
			<td>Secondary staining antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks&#39; Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>14170120</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine, 200mM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>20530081</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine epidermal growth factor</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>PMG8044</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine IFN-&#947;</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-05-20UG</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Murine PDGF-AA</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>315-17</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103-049</td>
			<td>Media component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9023</td>
			<td>Blocking solution component</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Operating Scissors</td>
			<td>Surgi-OR</td>
			<td>95-272</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip</td>
			<td>Corning Biocoatt</td>
			<td>354086</td>
			<td>Cell adherent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prolong Gold Antifade Reagent</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>9071S</td>
			<td>Mounting Media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-Iba1</td>
			<td>Wako</td>
			<td>019-19741</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>ab5320</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-GFAP</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>13-0300</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-myelin basic protein</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab7349</td>
			<td>Primary antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sharp Tip Scissors</td>
			<td>Surgi-OR</td>
			<td>95-104</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S4 E Stereo Zoom Microscope</td>
			<td>Microscope for dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Forceps</td>
			<td>Sklar</td>
			<td>66-7644</td>
			<td>Dissection tools</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP151-100</td>
			<td>Cell permabilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin Inhibitor (from chicken egg white)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>10109878001</td>
			<td>Tissue dissociation</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dissection and isolation of murine glia from multiple central nervous system regions

Os métodos aqui apresentados demonstram procedimentos laboratoriais para a dissecção de quatro diferentes regiões do sistema nervoso central (SNC) de neonatos murinos para o isolamento de subpopulações gliais. O objetivo do procedimento é dissociar a micróglia, as células progenitoras de oligodendrócitos (OPCs) e os astrócitos dos tecidos corticais, cerebelares, do tronco encefálico e da medula espinhal para facilitar análises in vitro adicionais. Os procedimentos de isolamento da região do SNC permitem a determinação da heterogeneidade regional entre a glia em múltiplos sistemas de cultura celular. O isolamento rápido da região do SNC é realizado, seguido pela remoção mecânica das meninges para evitar a contaminação das células meníngeas da glia. Este protocolo combina dissociação tecidual suave e chapeamento em uma matriz especificada projetada para preservar a integridade e a aderência celular. O isolamento de glia mista de várias regiões do SNC fornece uma análise abrangente da glia potencialmente heterogênea, maximizando o uso de animais experimentais individuais. Além disso, após a dissociação do tecido regional, a glia mista é dividida em vários tipos de células, incluindo microglia, OPCs e astrócitos para uso em qualquer tipo de célula única, inserções de placas de cultura celular ou sistemas de cocultura. No geral, as técnicas demonstradas fornecem um protocolo abrangente de ampla aplicabilidade para a dissecção cuidadosa de quatro regiões individuais do SNC de neonatos murinos e inclui métodos para o isolamento de três tipos individuais de células glia para examinar a heterogeneidade regional em qualquer número de sistemas ou ensaios de cultura celular in vitro.

Os dados representativos mostrados abaixo ilustram que a sinalização IFNγ influencia a diferenciação e a maturação do OPC. Sem a presença do receptor IFNγ (IFNγR), as OPCs corticais não se diferenciam em oligodendrócitos mielinizantes maduros tão prontamente, o que é evidenciado pela ausência de coloração de PAM (Figura 1). Como oligodendrócitos e astrócitos são derivados de um progenitor comum, analisamos a expressão de GFAP, que rotula os astrócitos. Descobrimos que as células deficientes em IFNγR expressam fortemente a GFAP, sugerindo que podem estar adotando um fenótipo astrocítico, corroborando relatos anteriores19.
Evidências adicionais de heterogeneidade regional em células do SNC são evidenciadas pela morfologia variada dos astrócitos, como visto em astrócitos do córtex, cerebelo, tronco encefálico e medula espinhal (Figura 2). Digno de nota, astrócitos da mesma região também podem apresentar heterogeneidade morfológica, apoiando a noção de que este subtipo glial é altamente dinâmico. As diferenças na arquitetura celular são sugestivas de diversidade funcional e, portanto, a capacidade de isolar populações gliais é necessária para estudar as respostas fenotípicas na ausência e presença de estímulos microambientais.
Os oligodendrócitos são críticos para a mielinização dos axônios neuronais e são necessários para o reparo e a função adequados do SNC. Os OPCs dão origem às suas contrapartes maduras, tornando fundamental entender a biologia por trás de sua capacidade de diferenciar. A sinalização de citocinas influencia significativamente o comportamento das células-tronco e do sistema imunológico. Assim, é importante compreender como as respostas regionais das OPCs podem variar para a estimulação diferencial de citocinas (Figura 3), o que pode afetar sua capacidade de se diferenciar em oligodendrócitos mielinizantes maduros.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig01.jpg"> Figura 1: Dados representativos mostrando a diferenciação do OPC em camundongos WT e IFNγR-/- na presença de IFNγ exógeno. OPCs corticais foram isolados de filhotes de camundongos (A ) WT e (B) IFNγR-/- P4 seguindo o procedimento descrito acima. As células foram tratadas com 1 ng/mL de IFNγ por 48 h, depois fixadas e coradas para delinear a diferenciação celular. OPCs foram marcadas para NG2 e GFAP para identificar aqueles que estavam adotando um fenótipo astrocítico. Da mesma forma, OPCs também foram marcados para NG2 e MBP para identificar aqueles que estavam se diferenciando em oligodendrócitos maduros. Barra de escala = 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig02.jpg"> Figura 2: Dados representativos demonstrando heterogeneidade regional na morfologia dos astrócitos. Astrócitos do córtex, cerebelo, tronco encefálico e medula espinhal foram isolados de filhotes de camundongos P4 usando o protocolo descrito acima e marcados para GFAP (verde) por imunocitoquímica após 48 h em cultura. Barra de escala = 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig03.jpg"> Figura 3: Dados representativos demonstrando respostas diferenciais de OPCs regionais às citocinas. OPCs foram isolados do tronco encefálico e da medula espinhal de filhotes de camundongos P4 usando o protocolo descrito acima. As células foram tratadas com concentrações crescentes (1-10 ng/mL) de ( A ) IFNγ ou (B) interleucina (IL) -17, a fim de investigar a influência diferencial da citocina na capacidade das OPCs regionais de se diferenciarem em oligodendrócitos mielinizantes. Após uma incubação de 48 h com citocinas especificadas, as OPCs foram fixadas e marcadas para NG2 (verde) e MBP (vermelho). Barra de escala = 20 μM. Os dados representam médias ± EPM. **, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001 por ANOVA de 2 vias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">PBS/Solução Antibiótica (PAS):</td>
		</tr><tr><td>1,0 mL</td>
			<td colspan="2">100X Antibiótico/Antimicótico contendo 10.000 unidades/mL de penicilina e 10.000 mg/mL de estreptomicina</td>
		</tr><tr><td>25 mg/mL</td>
			<td colspan="2">Anfotericina B</td>
		</tr><tr><td>99 mL</td>
			<td colspan="2">1X PBS</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Mídia de Glia Mista (MGM)</td>
		</tr><tr><td>88 mL</td>
			<td colspan="2">1X DMEM (glicose elevada, c/L-glutamina, c/Na piruvato)</td>
		</tr><tr><td>10 mL</td>
			<td colspan="2">FBS inativado pelo calor</td>
		</tr><tr><td>1,0 mL</td>
			<td colspan="2">L-Glutamina (100X)</td>
		</tr><tr><td>1,0 mL</td>
			<td colspan="2">Antibiótico/Antimicótico</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Meios OPC (50mL)</td>
		</tr><tr><td>49 mL</td>
			<td colspan="2">Meios neurobasais</td>
		</tr><tr><td>1,0 mL</td>
			<td colspan="2">Suplemento de B27 (50X)</td>
		</tr><tr><td>10 ng/ml</td>
			<td colspan="2">PDGF-AA</td>
		</tr><tr><td colspan="3">NOTA: PDGF-AA é adicionado fresco antes de cada alteração de mídia.</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Meios de astrócitos (1 L)</td>
		</tr><tr><td>764 mL</td>
			<td colspan="2">MEM com sais de Earle contendo glutamina</td>
		</tr><tr><td>36 mL</td>
			<td colspan="2">Glicose (utilizar estoque de 100 mg/mL para a concência final de 20 mM)</td>
		</tr><tr><td>100 mL</td>
			<td colspan="2">FBS inativado pelo calor</td>
		</tr><tr><td>100 mL</td>
			<td colspan="2">Soro de cavalo inativado pelo calor</td>
		</tr><tr><td>10 mL</td>
			<td colspan="2">Glutamina (utilizar 200 mM de existências se não estiver incluída no meio de existência)</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">OPCIONAL: 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico recombinante de camundongo</td>
		</tr><tr><td colspan="3">NOTA: Filtro estéril de todos os suportes e conservar a 4°C até serem utilizados.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Buffer e receitas de mídia.

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Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

Aqui apresentamos um protocolo para isolamento in vitro de múltiplas populações de células gliais de um SNC de camundongo. Este método permite a segregação de micróglias regionais, células precursoras de oligodendrócitos e astrócitos para estudar os fenótipos de cada um em uma variedade de sistemas de cultura.

Dissecção e isolamento da glia murina de múltiplas regiões do sistema nervoso central

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

dissection-isolation-murine-glia-from-multiple-central-nervous-system

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JoVE Journal

Neuroscience

3.1K visualizações.  Lerner Research Institute, Cleveland Clinic Foundation. Aqui apresentamos um protocolo para isolamento in vitro de múltiplas populações de células gliais de um SNC de camundongo. Este método permite a segregação de micróglias regionais, células precursoras de oligodendrócitos e astrócitos para estudar os fenótipos de cada um em uma variedade de sistemas de cultura.

Vídeo: Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

Multimodal Imaging of Stem Cell Implantation in the Central Nervous System of Mice

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, both in preclinical and clinical studies. However, to date results regarding functional outcome and/or tissue regeneration following stem cell transplantation are quite diverse. Generally, a clinical benefit is observed without profound understanding of the underlying mechanism(s)1. Therefore, multiple efforts have led to the development of different molecular imaging modalities to monitor stem cell grafting with the ultimate aim to accurately evaluate survival, fate and physiology of grafted stem cells and/or their micro-environment. Changes observed in one or more parameters determined by molecular imaging might be related to the observed clinical effect. In this context, our studies focus on the combined use of bioluminescence imaging (BLI), magnetic resonance imaging (MRI) and histological analysis to evaluate stem cell grafting.
BLI is commonly used to non-invasively perform cell tracking and monitor cell survival in time following transplantation2-7, based on a biochemical reaction where cells expressing the Luciferase-reporter gene are able to emit light following interaction with its substrate (e.g. D-luciferin)8, 9. MRI on the other hand is a non-invasive technique which is clinically applicable10 and can be used to precisely locate cellular grafts with very high resolution11-15, although its sensitivity highly depends on the contrast generated after cell labeling with an MRI contrast agent. Finally, post-mortem histological analysis is the method of choice to validate research results obtained with non-invasive techniques with highest resolution and sensitivity. Moreover end-point histological analysis allows us to perform detailed phenotypic analysis of grafted cells and/or the surrounding tissue, based on the use of fluorescent reporter proteins and/or direct cell labeling with specific antibodies.
In summary, we here visually demonstrate the complementarities of BLI, MRI and histology to unravel different stem cell- and/or environment-associated characteristics following stem cell grafting in the CNS of mice. As an example, bone marrow-derived stromal cells, genetically engineered to express the enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) and firefly Luciferase (fLuc), and labeled with blue fluorescent micron-sized iron oxide particles (MPIOs), will be grafted in the CNS of immune-competent mice and outcome will be monitored by BLI, MRI and histology (Figure 1).

This article describes an optimized sequence of events for multimodal imaging of cellular grafts in rodent brain using: (i) in vivo bioluminescence and magnetic resonance imaging, and (ii) post mortem histological analysis. Combining these imaging modalities on a single animal allows cellular graft evaluation with high resolution, sensitivity and specificity.

Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos

During the past decade, stem cell transplantation has gained increasing interest as primary or secondary therapeutic modality for a variety of diseases, ...

Neurociência

Production of Lentiviral Vectors for Transducing Cells from the Central Nervous System

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing therapeutic approaches. Lentiviral vectors are attractive tools in transduction of neurons and other cell types in CNS as they transduce both dividing and non-dividing cells, support sustained expression of transgenes, and have relatively large packaging capacity and low toxicity 1-3. Lentiviral vectors have been successfully used in transducing many neural cell types in vitro 4-6 and in animals 7-10.
Great efforts have been made to develop lentiviral vectors with improved biosafety and efficiency for gene delivery. The current third generation replication-defective and self-inactivating (SIN) lentiviral vectors are depicted in Figure 1. The required elements for vector packaging are split into four plasmids. In the lentiviral transfer plasmid, the U3 region in the 5' long terminal repeat (LTR) is replaced with a strong promoter from another virus. This modification allows the transcription of the vector sequence independent of HIV-1 Tat protein that is normally required for HIV gene expression 11. The packaging signal (&Psi;) is essential for encapsidation and the Rev-responsive element (RRE) is required for producing high titer vectors. The central polypurine tract (cPPT) is important for nuclear import of the vector DNA, a feature required for transducing non-dividing cells 12. In the 3' LTR, the cis-regulatory sequences are completely removed from the U3 region. This deletion is copied to 5' LTR after reverse transcription, resulting in transcriptional inactivation of both LTRs. Plasmid pMDLg/pRRE contains HIV-1 gag/pol genes, which provide structural proteins and reverse transcriptase. pRSV-Rev encodes Rev which binds to the RRE for efficient RNA export from the nucleus. pCMV-G encodes the vesicular stomatitis virus glycoprotein (VSV-G) that replaces HIV-1 Env. VSV-G expands the tropism of the vectors and allows concentration via ultracentrifugation 13. All the genes encoding the accessory proteins, including Vif, Vpr, Vpu, and Nef are excluded in the packaging system. The production and manipulation of lentiviral vectors should be carried out according to NIH guidelines for research involving recombinant DNA (<a href="http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf" target="_blank">http://oba.od.nih.gov/oba/rac/Guidelines/NIH_Guidelines.pdf</a>). An approval from individual Institutional Biological and Chemical Safety Committee may be required before using lentiviral vectors. Lentiviral vectors are commonly produced by cotransfection of 293T cells with lentiviral transfer plasmid and the helper plasmids encoding the proteins required for vector packaging. Many lentiviral transfer plasmids and helper plasmids can be obtained from Addgene, a non-profit plasmid repository (<a href="http://www.addgene.org/" target="_blank">http://www.addgene.org/</a>). Some stable packaging cell lines have been developed, but these systems provide less flexibility and their packaging efficiency generally declines over time 14, 15. Commercially available transfection kits may support high efficiency of transfection 16, but they can be very expensive for large scale vector preparations. Calcium phosphate precipitation methods provide highly efficient transfection of 293T cells and thus provide a reliable and cost effective approach for lentiviral vector production.
In this protocol, we produce lentiviral vectors by cotransfection of 293T cells with four plasmids based on the calcium phosphate precipitation principle, followed by purification and concentration with ultracentrifugation through a 20% sucrose cushion. The vector titers are determined by fluorescence- activated cell sorting (FACS) analysis or by real time qPCR. The production and titration of lentiviral vectors in this protocol can be finished with 9 days. We provide an example of transducing these vectors into murine neocortical cultures containing both neurons and astrocytes. We demonstrate that lentiviral vectors support high efficiency of transduction and cell type-specific gene expression in primary cultured cells from CNS.

In this protocol we describe production, purification and titration of lentiviral vectors. We provide an example of lentiviral vector-mediated gene delivery in primary cultured neurons and astrocytes. Our methods may also apply to other cell types in vitro and in vivo.

Produção de lentivirais para Células Transdução do Sistema Nervoso Central

Efficient gene delivery in the central nervous system (CNS) is important in studying gene functions, modeling neurological diseases and developing ...

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Marcação de células individuais no Sistema Nervoso Central de<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. Understanding repair and regeneration in animals is a key question in biology. The damaged human CNS does not regenerate, and understanding how to promote the regeneration is one of main goals of medical neuroscience. The powerful genetic toolkit of Drosophila can be used to tackle the problem of CNS regeneration.
A lesion to the CNS ventral nerve cord (VNC, equivalent to the vertebrate spinal cord) is applied manually with a tungsten needle. The VNC can subsequently be filmed in time-lapse using laser scanning confocal microscopy for up to 24 hr to follow the development of the lesion over time. Alternatively, it can be cultured, then fixed and stained using immunofluorescence to visualize neuron and glial cells with confocal microscopy. Using appropriate markers, changes in cell morphology and cell state as a result of injury can be visualized. With ImageJ and purposely developed plug-ins, quantitative and statistical analyses can be carried out to measure changes in wound size over time and the effects of injury in cell proliferation and cell death. These methods allow the analysis of large sample sizes. They can be combined with the powerful genetics of Drosophila to investigate the molecular mechanisms underlying CNS regeneration and repair.

An Injury Paradigm to Investigate Central Nervous System Repair in Drosophila

An injury paradigm using the Drosophila larval ventral nerve cord to investigate central nervous system regeneration and repair is described. Stabbing followed by laser scanning confocal microscopy in time-lapse and fixed specimens, combined with quantitative analysis with purposefully developed software and genetics, are used to investigate the molecular mechanisms of CNS regeneration and repair.

Um Paradigma para Investigar Lesão de reparação do sistema nervoso central em<em&gt; Drosophila</em

An experimental method has been developed to investigate the cellular responses to central nervous system (CNS) injury using the fruit-fly Drosophila. ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Entrega intraventricular direta de medicamentos para o Sistema Nervoso Central Rodent

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based multicolor labeling is challenging, especially when utilized for assessing interrelations between target proteins in the tissue with a high fat content such as the central nervous system (CNS).
Our protocol represents a refinement of the standard immunolabeling technique particularly adjusted for detection of both structural and soluble proteins in the rat CNS and peripheral lymph nodes (LN) affected by neuroinflammation. Nonetheless, with or without further modifications, our protocol could likely be used for detection of other related protein targets, even in other organs and species than here presented.

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Análise imuno-histoquímica no sistema nervoso central e periférico Rat linfonodo Tissue Secções

Immunohistochemistry (IHC) provides highly specific, reliable and attractive protein visualization. Correct performance and interpretation of an IHC-based ...

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are tightly regulated, affecting the final dynamics of protein abundance. Various regulatory mechanisms exist at the translation step, rendering mRNA levels alone an unreliable indicator of gene expression. In addition, local regulation of mRNA translation has been particularly implicated in neuronal functions, shifting &#39;translatomics&#39; to the focus of attention in neurobiology. The presented method can be used to bridge transcriptomics and proteomics.
Here we describe essential modifications to the technique of polyribosome fractionation, which interrogates the translatome based on the association of actively translated mRNAs to multiple ribosomes and their differential sedimentation in sucrose gradients. Traditionally, working with in vivo samples, particularly of the central nervous system (CNS), has proven challenging due to the restricted amounts of material and the presence of fatty tissue components. In order to address this, the described protocol is specifically optimized for use with minimal amount of CNS material, as demonstrated by the use of single mouse spinal cord and brain. Briefly, CNS tissues are extracted and translating ribosomes are immobilized on mRNAs with cycloheximide. Myelin flotation is then performed to remove lipid rich components. Fractionation is performed on a sucrose gradient where mRNAs are separated according to their ribosomal loading. Isolated fractions are suitable for a range of downstream assays, including new genome wide assay technologies.

In vivo Interrogation of Central Nervous System Translatome by Polyribosome Fractionation

This protocol illustrates essential modifications of polyribosome fractionation in order to study the translatome of in vivo CNS samples. It allows global assessment of translation and transcription regulation through the isolation and comparison of total RNA to ribosome bound RNA fractions.

In vivo Interrogatório de Sistema Nervoso Central Translatome por Polyribosome Fracionamento

Multiple processes are involved in gene expression including transcription, translation and stability of mRNAs and proteins. Each of these steps are ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo Optogenetic estimulação do sistema nervoso central de roedores

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optical Clearing of the Mouse Central Nervous System Using Passive CLARITY

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique non-linear deformations, dramatically hampering one's ability to evaluate cellular morphology, distribution and connectivity in the central nervous system (CNS). However, optical clearing techniques are changing the way tissues are visualized. These approaches permit one to probe deeply into intact organ preparations, providing tremendous insight into the structural organization of tissues in health and disease. Techniques such as Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) achieve this goal by providing a matrix that binds important biomolecules while permitting light-scattering lipids to freely diffuse out. Lipid removal, followed by refractive index matching, renders the tissue transparent and readily imaged in 3 dimensions (3D). Nevertheless, the electrophoretic tissue clearing (ETC) used in the original CLARITY protocol can be challenging to implement successfully and the use of a proprietary refraction index matching solution makes it expensive to use the technique routinely. This report demonstrates the implementation of a simple and inexpensive optical clearing protocol that combines passive CLARITY for improved tissue integrity and 2,2&#8242;-thiodiethanol (TDE), a previously described refractive index matching solution.

Optical clearing techniques are revolutionizing the way tissues are visualized. In this report we describe modifications of the original Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging-compatible Tissue-hYdrogel (CLARITY) protocol that yields more consistent and less expensive results.

Clearing óptica do Sistema Nervoso Central Rato Usando a claridade passiva

Traditionally, tissue visualization has required that the tissue of interest be serially sectioned and imaged, subjecting each tissue section to unique ...

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield deleterious consequences, yet the current methods for recording nervous system activity of an individual animal is costly and laborious. This suction electrode preparation of the third-instar larval central nervous system of Drosophila melanogaster, is a tractable system for testing the physiological effects of neuroactive agents, determining the physiological role of various neural pathways to CNS activity, as well as the influence of genetic mutations to neural function. This ex vivo preparation requires only moderate dissecting skill and electrophysiological expertise to generate reproducible recordings of insect neuronal activity. A wide variety of chemical modulators, including peptides, can then be applied directly to the nervous system in solution with the physiological saline to measure the influence on the CNS activity. Further, genetic technologies, such as the GAL4/UAS system, can be applied independently or in tandem with pharmacological agents to determine the role of specific ion channels, transporters, or receptors to arthropod CNS function. In this context, the assays described herein are of significant interest to insecticide toxicologists, insect physiologists, and developmental biologists for which D. melanogaster is an established model organism. The goal of this protocol is to describe an electrophysiological method to enable the measurement of electrogenesis of the central nervous system in the model insect, Drosophila melanogaster, which is useful for testing a diversity of scientific hypotheses.

Electrophysiological Recording of The Central Nervous System Activity of Third-Instar  Drosophila Melanogaster

This protocol describes a method to record the descending electrical activity of the Drosophila melanogaster central nervous system to enable the cost-efficient and convenient testing of pharmacological agents, genetic mutations of neural proteins, and/or the role of unexplored physiological pathways.

Eletrofisiológica gravação da atividade do sistema nervoso Central de terceiro ínstar Drosophila Melanogaster

The majority of the currently available insecticides target the nervous system and genetic mutations of invertebrate neural proteins oftentimes yield ...