Name: Vídeo: Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions
Uploaded: 2020-06-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min

Agradecemos a Morgan Psenicka pela edição e discussão do manuscrito e ao Dr. Grahame Kidd pela assistência na formatação das figuras. Este trabalho foi apoiado pelo NIAID K22 AI125466 (JLW).

NOTA: Todos os estudos em animais foram autorizados e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais do Cleveland Clinic Lerner Research Institute.
1. Preparar meios e suprimentos para dissecação
NOTA: Todas as receitas de buffer e mídia são fornecidas na Tabela 1. Este procedimento é feito em condições estéreis em um gabinete de biossegurança designado por cultura de tecidos.
<ol><li>Preparar e filtrar estérile o meio de glia mista (MGM). Isso pode ser feito no dia anterior e armazenado a 4 °C.</li>
	<li>Diluir a fibronectina numa concentração de 1:100 com H2O estéril. O volume de fibronectina diluída dependerá do número de filhotes e da região do SNC utilizada para o experimento. Use um frasco T25 para 1 córtex, um frasco T25 para 2-4 cerebeles, um frasco T25 para 2-4 caules cerebrais e um frasco T25 para 2-4 medula espinhal. NOTA: A combinação de tecido da mesma região utilizando os critérios listados acima permitirá uma dissociação adequada sem alterar o protocolo descrito abaixo. A combinação de mais tecido do que o descrito na Etapa 1.2 exigirá uma otimização adicional das concentrações de reagentes de dissociação.</li>
	<li>Pipetar 3 ml de fibronectina diluída para balões T25 à temperatura ambiente e deixar descansar durante 2 min.</li>
	<li>Aspirar a fibronectina e deixar secar os frascos durante a noite com a tampa do balão solta.</li>
</ol>2. Córtex, cerebelo, tronco encefálico e dissecção da medula espinhal
NOTA: Este procedimento pode ser feito na bancada e requer um escopo de dissecação. Use uma técnica asséptica rigorosa para todas as etapas do procedimento e minimize a exposição do tecido ao ar ambiente. Mantenha todos os meios resfriados no gelo durante a dissecção para garantir a máxima preservação do tecido. Alternativamente, esse procedimento pode ser feito em um exaustor que permita o uso de um escopo de dissecação interna.
<ol><li>Limpe todas as áreas com etanol a 70%.</li>
	<li>Pipetar 10 mL de PBS/solução antibiótica (PAS) em uma placa de Petri de 10 cm. Prepare uma placa de Petri para cada filhote a ser dissecado. Coloque no gelo para manter a solução resfriada.</li>
	<li>Em um exaustor de cultura de tecidos desinfetados, pipete 9 mL de DMEM (sem aditivos) em 4 tubos cônicos separados de 15 mL, um para cada região do SNC, substitua as tampas do tubo e coloque no gelo. Coloque o balde de gelo com tubos a uma curta distância do escopo de dissecação.</li>
	<li>Colocar uma placa de Petri de 10 cm preparada no passo 2.2 na fase de escoamento da dissecação desinfetada.</li>
	<li>Anestesiar e eutanasiar filhotes de camundongos de acordo com o protocolo institucional e remover a cabeça por decapitação rápida com tesoura afiada. NOTA: Dia pós-natal (P) 3-5 filhotes são usados. Filhotes mais velhos têm um SNC mais desenvolvido e podem não ser uma fonte adequada de expansão das células gliais. Filhotes mais jovens (P) 0-2 podem produzir um maior número de glias e podem ser usados; no entanto, o tecido da medula espinhal é muito difícil de dissecar nesta idade jovem devido ao tamanho.</li>
	<li>Limpe a pele do filhote usando etanol a 70%.</li>
	<li>Usando uma tesoura fina, corte a camada cutânea ao longo da linha média da cabeça do animal, iniciando caudalmente e movendo-se rostral, até chegar ao focinho. Evite cortar profundamente o crânio para evitar qualquer dano tecidual.</li>
	<li>Inclinando a cabeça para baixo, puxe a camada cutânea para cada lado do crânio e usando uma tesoura de mola, faça uma incisão ao longo da linha média do crânio, começando pelo forame magno, novamente cortando caudal a rostral.</li>
	<li>Com pinças de ponta fina, puxe as metades do crânio para os lados direito e esquerdo, expondo o córtex, o cerebelo e o tronco encefálico.</li>
	<li>Uma vez exposto, levante suavemente o cérebro para fora do crânio e para a placa de Petri de 10 cm preparada na Etapa 2.2. Certifique-se de que o cérebro permaneça intacto para preservar a estrutura anatômica, com o rombencéfalo ligado.</li>
	<li>Usando pinças finas e curvas com o ponto da pinça voltada para cima, pinch o cerebelo. Retire as meninges e coloque em tubo cônico designado de 15 mL no balde de gelo.</li>
	<li>Certifique-se de que o tronco encefálico é diretamente ventral ao cerebelo e é visível após a remoção do cerebelo. Removê-lo com pinça de ponta fina, remover meninges e colocar em tubo cônico designado 15 mL no balde de gelo.</li>
	<li>Separe o mesencéfalo do córtex, remova as meninges corticais e coloque no tubo cônico designado de 15 mL no balde de gelo.</li>
	<li>Para remover a medula espinhal, coloque o filhote de rato decapitado em decúbito dorsal (deitado de bruços para cima) com a coluna vertebral cortada elevada em direção ao investigador.</li>
	<li>Pulverize novamente com etanol a 70%.</li>
	<li>Corte ao longo dos lados laterais da coluna vertebral, no sentido rostral a caudal, através da caixa torácica até atingir os membros posteriores. Durante o corte, empurre para trás os órgãos internos até que a coluna vertebral seja visível.</li>
	<li>Cortar ao longo de cada lado lateral da coluna vertebral até que esteja isolado e colocar na placa de Petri de 10 cm preparada na Etapa 2.2.</li>
	<li>Com o lado ventral para cima, usando uma tesoura de mola fina, alterne o corte dos lados direito e esquerdo de cada vértebra até atingir a região lombar para expor o tecido medular.</li>
	<li>Remova suavemente a medula espinhal e as meninges com pinças de ponta fina sob o microscópio de dissecação. Coloque no tubo cônico designado de 15 mL no balde de gelo.</li>
	<li>Repetir os passos 2.5.-2.19 para cada filhote, combinando tecido da mesma região de modo a se adequarem aos critérios descritos no passo 1.2 para cada balão T25 preparado. NOTA: Remova as meninges o mais completamente possível. Se uma quantidade significativa de meninges permanecer, o fenótipo semelhante a fibroblastos das células meníngeas irá crescer mais e sobrecarregar a cultura celular. Múltiplas medula espinhal, de fenótipo igual, podem ser combinadas para gerar uma cultura celular específica. Tome cuidado para garantir que a superlotação das células não ocorra, o que pode levar à apoptose glial e fenótipos diferenciais.</li>
</ol>3. Dissociação tecidual
NOTA: Todos os procedimentos a seguir são realizados em um gabinete de biossegurança designado por cultura de tecidos estéreis usando técnica asséptica e materiais estéreis.
<ol><li>Adicione 1 mL de tripsina a 0,05% contendo 0,53 mM EDTA a cada tubo cônico de 15 mL de DMEM de 9 mL e tecido para iniciar a lise tecidual. NOTA: DMEM contém uma grande quantidade de cloreto de cálcio, que pode atuar como um inibidor da tripsina. Se a dissociação não estiver completa seguindo as etapas descritas, a Solução Salar Balanceada de Hanks sem cálcio ou magnésio pode ser usada. Após a tripsinização, a enzima pode ser neutralizada pela adição de um inibidor de tripsina, embora o cálcio deva ser adicionado de volta à solução, pois é um cofator para a DNase I, que é usado nas etapas subsequentes.</li>
	<li>Triturar com uma pipeta de 10 mL aproximadamente 20x.</li>
	<li>Transfira as suspensões celulares para tubos cônicos vazios de 50 mL.</li>
	<li>Incubar a solução a 37 °C, CO2 a 5% durante 15 min, agitando suavemente os lisados após 8 min.</li>
	<li>Adicionar 5 mL de MGM e 200 μL (5 mg/mL) de DNase I a cada tubo para uma concentração final de 50 μg/mL.</li>
	<li>Triturar cada lisado com uma pipeta de 10 mL 10x.</li>
	<li>Deixe as suspensões celulares ficarem por 3 minutos à temperatura ambiente para permitir que o tecido não dissociado se deposite no fundo dos tubos.</li>
	<li>Transfira as suspensões celulares para novos tubos cônicos de 50 mL, deixando para trás o tecido não dissociado. NOTA: As etapas de lise e trituração descritas acima limitam significativamente a quantidade de tecido não dissociado.</li>
	<li>Centrifugar os tubos a 300 x g durante 3 min a 4 °C sem travagem.</li>
	<li>Aspirar o sobrenadante e ressuspender os pellets celulares restantes em 5 mL de MGM.</li>
	<li>Triturar o pellet com uma pipeta de 5 mL 20x.</li>
	<li>Chapear as suspensões celulares de 5 ml em balões T25 revestidos.</li>
	<li>Incubar as células a 37 °C, 5% de CO2 e trocar o meio inicialmente após 24 h para remover os detritos celulares. Observação : alguns protocolos recomendam uma alteração de mídia inicial após 72 h. A otimização desta etapa pode ser necessária.</li>
	<li>Realize uma troca de mídia de 100% com MGM a cada 48-72 h até que as células estejam 80% confluentes (aproximadamente 5-7 dias). NOTA: Todos os suportes têm de ser aquecidos a 37 °C antes de serem alterados pelos suportes.</li>
</ol>4. Isolamento da micróglia
<ol><li>Uma vez que as culturas mistas de glia tenham atingido 80% de confluência, prepare frascos para agitação apertando as tampas e selando com filme de parafina.</li>
	<li>Para remover a micróglia de culturas gliais mistas, fixar os frascos horizontalmente num agitador orbital no interior de uma incubadora a 37 °C. Agitar os balões a 15 x g durante 1 h.</li>
	<li>Remova o meio e a pipeta em um tubo cônico de 15 mL. Enxaguar os frascos duas vezes com 3 mL de MGM morno, adicionando lavagem aos tubos cônicos de 15 mL. Estes são os micróglios.</li>
	<li>Adicionar 5 ml de MGM quente e fresca aos frascos de cultura.</li>
	<li>Voltar a selar os frascos com película de parafina, fixar os frascos horizontalmente no agitador e agitar a 15 x g a 37 °C durante 15 h para separação dos OPC dos astrócitos. NOTA: Esta etapa pode ser feita durante a noite, mas o tempo de agitação de 15 horas é crítico, pois o excesso de tempo pode resultar em morte celular.</li>
	<li>Centrifugar o sobrenadante a partir do passo 4.3. a 300 x g por 3 min e cultura de micróglia de acordo com os protocolos padrão16 ou uso para um ensaio biológico.</li>
</ol>5. Isolamento celular precursor de oligodendrócitos
NOTA: Ao chapear OPCs após o isolamento inicial, eles devem ser banhados em uma superfície revestida de poli-D-lisina (placa estéril ou deslizamento da tampa). Prepare esses materiais antes da conclusão desta seção.
<ol><li>Após agitação de 15 h, retirar o sobrenadante dos frascos e da placa em placa de Petri estéril de 100 mm.</li>
	<li>Incubar o sobrenadante a 37 °C, 5% de CO2 durante 30 min, rodopiando após 15 min para remover a micróglia restante, uma vez que estas aderirão muito rapidamente ao prato. Placas de Petri não tratadas com cultura de tecidos podem ser usadas para esta etapa.</li>
	<li>Remova o sobrenadante, a contagem e a placa de células não aderentes em uma superfície revestida de poli-D-lisina. Normalmente, 7.500-10.000 OPCs são chapeados/cm2.</li>
	<li>Incubar a 37 °C, 5% de CO2 por pelo menos 1 h (até 6 h), em seguida, aspirar suavemente 95% da mídia e adicionar lentamente a mídia OPC quente, pipetando a mídia contra a parede do poço para minimizar a interrupção dos OPCs. Troque a mídia a cada 48 horas até que as células estejam prontas para uso. NOTA: É fundamental que apenas um poço seja alterado de cada vez. Os OPCs são sensíveis e são especialmente intolerantes a condições secas. A adição de PDGF-AA em meios OPC é para retardar a maturação do OPC em oligodendrócitos. Este fator pode ser excluído dos meios de cultura se o foco experimental forem oligodendrócitos maduros.</li>
</ol>6. Isolamento de astrócitos
<ol><li>Após 15 h de agitação, retire o sobrenadante e enxágue os frascos 2x com 1x PBS morno.</li>
	<li>Adicionar 4 ml de tripsina a 0,05% contendo 0,53 mM EDTA e incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 5 min ou até que as células tenham levantado. Para garantir que os astrócitos tenham levantado, visualize-os usando um microscópio de campo largo padrão. Os astrócitos aparecerão esféricos após a tripsinização.</li>
	<li>Uma vez que os astrócitos tenham se desprendido, coloque o frasco verticalmente e adicione 4 mL de MGM. Triturar para misturar.</li>
	<li>Pipetar astrócitos para um tubo cônico de 15 mL, centrífuga a 300 x g por 5 min.</li>
	<li>Ressuspender astrócitos em meio e placa de astrócitos na superfície revestida de fibronectina, conforme descrito na etapa 1.2. ou uso para ensaio biológico. NOTA: 20 ng/mL de fator de crescimento de fibroblastos murinos podem ser adicionados durante a primeira mudança de meio para ajudar a estabelecer a cultura de astrócitos. Além disso, o revestimento de gelatina padrão pode ser uma alternativa de baixo custo à fibronectina.</li>
</ol>7. Identificação e isolamento de micróglia, OPCs, astrócitos e oligodendrócitos maduros usando imunocitoquímica
<ol><li>Uma vez que as células chapeadas tenham atingido a confluência apropriada, remova suavemente os meios e fixe as células aderentes usando paraformaldeído a 4% (PFA) por 10 min. Faça esta etapa em um gabinete de biossegurança. NOTA: Ao aspirar ou adicionar soluções, pipetar com pressão suave para evitar o descolamento da célula.</li>
	<li>Aspirar lentamente o PFA e, em seguida, lavar as células 3x com 1x PBS por 5 min.</li>
	<li>Preparar a solução de bloqueio apropriada usando soro a 10% e Triton X-100 a 0,1% em PBS 1x. NOTA: A fonte sérica reflete o animal hospedeiro no qual o anticorpo secundário foi levantado. Por exemplo, se o anticorpo secundário for anti-coelho de cabra, o soro bloqueador apropriado é o soro de cabra normal. Da mesma forma, se o anticorpo secundário for anticoelho de burro, o soro bloqueador deve ser um soro de burro normal.</li>
	<li>Adicione a solução de bloqueio até que as células estejam completamente cobertas. Bloco por 1 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar uma solução diluente de anticorpos (9 mL de 1x PBS, 0,01 g de albumina sérica bovina, 30 μL de Triton X-100). Em alternativa, os anticorpos podem ser diluídos na solução de bloqueio descrita no passo 6.3.</li>
	<li>Diluir os anticorpos primários específicos para os seguintes em solução diluente ou bloqueadora de anticorpos:<ol><li>Microglia: molécula 1 do adaptador de ligação ao cálcio ionizado (Iba1) a uma diluição de 1:250 (2,4 μg/mL).</li>
		<li>OPCs: antígeno neural/glial 2 (NG2) em diluição de 1:200 (5 μg/mL).</li>
		<li>Oligodendrócitos maduros: proteína básica de mielina (MBP) a uma diluição de 1:400 (a concentração é dependente do lote e a otimização pode ser necessária).</li>
		<li>Astrócitos: proteína glial fibrilar ácida (GFAP) em diluição de 1:400 (0,25 μg/mL)17. NOTA: Não misture anticorpos primários criados na mesma espécie. NOTA: A GFAP rotulará de forma confiável os astrócitos da substância branca. Para os astrócitos da substância cinzenta, pode ser necessário utilizar um marcador alternativo.</li>
	</ol></li>
	<li>Incubar o anticorpo primário durante a noite a 4 °C (com agitação suave é preferível).</li>
	<li>Lave 3x com 1x PBS por 5 min para remover o anticorpo primário.</li>
	<li>Incubar células com anticorpos secundários apropriados a uma diluição de 1:400 em diluente de anticorpos ou solução bloqueadora protegida da luz. NOTA: Os anticorpos secundários são conjugados a um fluoróforo que pode ser trocado dependendo dos parâmetros de microscópio disponíveis. Uma vez que os anticorpos secundários fluorescentes tenham sido aplicados, proteja-se da luz o máximo possível.</li>
	<li>Incubar anticorpos secundários por 1 h à temperatura ambiente, limitando a exposição à luz.</li>
	<li>Lave 3 vezes com 1x PBS por 5 min para remover o excesso de anticorpos secundários.</li>
	<li>Para marcar núcleos, use uma solução DAPI/PBS 1:1.000 e incube as células por 5 minutos à temperatura ambiente no escuro.</li>
	<li>Lave 3x com 1x PBS por 5 min no escuro.</li>
	<li>Para montar, aplique o meio de montagem e deixe secar no escuro antes da imagem. NOTA: As lâminas montadas podem ser armazenadas à temperatura ambiente por 2-3 dias. Para armazenamento a longo prazo, mova as corrediças para 4 °C. Imagem dentro de uma semana para sinal máximo. Todas as imagens representativas foram fotografadas em microscópio confocal; no entanto, microscópios fluorescentes invertidos também são recomendados.</li>
</ol>

<ol>
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Os autores têm conflitos de interesse a divulgar.

Neste protocolo, descrevemos o isolamento das três principais subpopulações de células gliais do SNC de camundongos: micróglia, OPCs e astrócitos. Um grande revés para a investigação de doenças neurodegenerativas e neuroinflamatórias do SNC é a falta de células e tecidos humanos primários, particularmente aqueles que são regionais e do mesmo paciente. Na maioria dos casos, as linhagens celulares humanas do SNC são derivadas de células cancerígenas transformadas e imortalizadas que podem não ser representações precisas de seu comportamento fisiológico normal20,21,22. Assim, métodos alternativos são necessários para estudar os fenótipos celulares do SNC de forma controlada. Além disso, a diversidade de populações de células gliais neurológicas torna necessário investigar cada subtipo tanto independentemente um do outro, bem como em condições de co-cultura, a fim de recapitular suas funções celulares autônomas e não autônomas. As células gliais têm uma grande variedade de funções críticas no SNC, desde o suporte neuronal23, aprendizagem/cognição 24,25 e respostas imunológicas do SNC26. Como tal, é necessário compreender as funções moleculares e celulares de cada subpopulação glial em um contexto fisiológico e patológico. Para isso, fornecemos aqui um método confiável para a extração e isolamento de subtipos viáveis de glia. Devido a restrições práticas e éticas na pesquisa do sujeito humano, os modelos animais são atualmente os substitutos mais relevantes para a biologia celular glial humana. Em particular, os ratos são animais modelo ideais, pois seu genoma pode ser manipulado e analisado para dissecar ainda mais os mecanismos moleculares específicos subjacentes à saúde e à doença. Portanto, a remoção e separação bem-sucedidas de micróglias murinas, OPCs e astrócitos é uma ferramenta fundamental para investigar as funções da glia durante condições fisiológicas, neurodegenerativas ou neuroinflamatórias.
Este protocolo pode ser otimizado para explorar a heterogeneidade regional das células do SNC. Está se tornando cada vez mais claro que a glia exibe heterogeneidade regional em forma e função. Os astrócitos são regionalmente diversos e exibem morfologia distinta dependendo de sua localização dentro do CNS27. Além disso, a densidade de astrócitos e seu índice mitótico podem definir regiões anatômicas, apoiando a hipótese de que a heterogeneidade regional de astrócitos pode refletir diferenças moleculares e funcionais com base em sua localização dentro do SNC28. A heterogeneidade regional microglial também está sob investigação ativa, embora os mecanismos subjacentes e as consequências funcionais da diversidade da micróglia no desenvolvimento ou comportamento do SNC sejam atualmente incertos. No entanto, sabe-se que a micróglia adulta apresenta diversidade no número celular, estruturas celulares e subcelulares e assinaturas moleculares29. Além disso, avanços recentes na citometria de massa multiplexada definiram ainda mais a heterogeneidade regional da micróglia, analisando o fenótipo celular de cinco regiões diferentes do SNC de nove doadores humanos, permitindo a imunofenotipagem em larga escala da micróglia humana30. Atualmente, tais abordagens estão em seus estágios iniciais, tornando os estudos em animais uma solução viável para o estudo da glia regional no desenvolvimento da doença do SNC. Finalmente, a heterogeneidade regional também foi recentemente descrita em oligodendrócitos. O sequenciamento de RNA unicelular em 5072 células individuais de 10 regiões do SNC juvenil e adulto identificou 13 subpopulações distintas em diferentes estágios de diferenciação31. É importante ressaltar que, à medida que os oligodendrócitos amadureceram a partir de OPCs, seus perfis transcricionais divergiram e seus fenótipos funcionais mudaram, destacando a heterogeneidade dos oligodendrócitos dentro do SNC31.
Assim, a compreensão da heterogeneidade regional das várias células residentes do SNC no contexto de seus diversos neurônios vizinhos e outras glias pode fornecer uma justificativa importante para o desenvolvimento futuro de novas terapias para tratar distúrbios neuroinflamatórios e neurodegenerativos. Embora este protocolo se concentre na extração, isolamento e identificação de subpopulações gliais, ele fornece um ponto de partida conveniente para o exame de sua função. Além disso, pode ser adaptado e combinado com modelos de camundongos transgênicos, a fim de estudar os mecanismos genéticos associados à biologia celular glial. Também pode ser usado para examinar as respostas das células gliais umas às outras em ensaios de co-cultura. As etapas descritas representam um método econômico e de alto rendimento de extração e isolamento de diferentes populações gliais do SNC, que podem ser adaptadas a uma ampla variedade de parâmetros experimentais. Deve-se notar; no entanto, que o método aqui descrito utiliza neonatos devido aos níveis mais baixos de mielinização e alta densidade de glia proliferante. Por estas razões, é tecnicamente mais viável isolar a glia viável dos neonatos em comparação com os animais adultos. As diferenças fenotípicas na glia neonatal em comparação com a glia adulta devem, portanto, ser consideradas durante o delineamento experimental e a interpretação dos dados.

A glia é necessária para a função neuronal adequada no SNC. São compostas por três grandes subpopulações, astrócitos, oligodendrócitos e micróglia, cada uma com um papel diferente, porém indispensável1. Sem a diversidade e a atividade das células gliais adequadas, a função neuronal seria severamente afetada, levando ao comprometimento do SNC. As glias são capazes de influenciar a neurotransmissão, e cada tipo de célula o faz de uma maneira única. As células gliais do cérebro têm a capacidade de se comunicar entre si, bem como com as células neuronais, a fim de facilitar a função adequada do SNC2. Os oligodendrócitos aumentam a velocidade de transmissão elétrica através da formação de uma bainha de mielina, o que facilita o agrupamento de canais iônicos nos nós de Ranvier, os locais de geração do potencial de ação neuronal3. As micróglias são críticas para a poda das sinapses, monitorando a transmissão sináptica e "reconectando" as conexões neuronais após a lesão4. Além disso, a micróglia é a célula imune residente mais abundante do SNC, atuando como a principal forma de defesa do hospedeiro contra patógenos5. Os astrócitos podem regular a transmissão sináptica entre neurônios modificando a concentração de potássio extracelular6. Eles também têm papéis no controle do fluxo sanguíneo local7, liberando e absorvendo elementos neuromoduladores8, e têm um papel fundamental na manutenção da barreira hematoencefálica9. Assim, cada subtipo glial é crítico para a função do SNC, pois defeitos em qualquer tipo têm sido associados a uma ampla variedade de estados patológicos, incluindo doenças psiquiátricas, epilepsia e condições neurodegenerativas10.
O maior obstáculo no estudo da patobiologia do SNC é a incapacidade de investigar células humanas no contexto de seu nicho microambiental. O tecido da biópsia humana é mais coletado post-mortem e as células podem ser facilmente danificadas ou perdidas durante a extração e o processamento. Além disso, é um desafio manter as células humanas vivas e viáveis in vitro por qualquer período de tempo sem derivar linhagens celulares imortalizadas de tumores, momento em que elas não refletem mais com precisão suas propriedades fisiológicas normais11,12. Além disso, há uma quantidade significativa de heterogeneidade regional entre os tipos individuais de células gliais13,14,15, e a obtenção de amostras regionais do SNC de pacientes individuais é quase impossível. Como tal, é necessário desenvolver modelos alternativos para estudar a contribuição da glia regional em distúrbios específicos do SNC.
Aqui, descrevemos um sistema in vitro usando o isolamento específico da região do SNC de camundongos de múltiplas subpopulações gliais, permitindo a manipulação e quantificação de microglia, células precursoras de oligodendrócitos (OPCs), que dão origem a oligodendrócitos maduros e astrócitos. Cada população pode ser isolada de forma independente e submetida a uma ampla variedade de técnicas experimentais, incluindo tratamento de drogas ou moléculas, imunocitoquímica, extração e análise de proteínas/RNA e outros sistemas de cocultura, dependendo da necessidade experimental. Além disso, essa técnica de isolamento produz alto número de células, permitindo a caracterização e investigação de cada população glial de maneira de alto rendimento. Também permite o estudo da diferenciação, crescimento e proliferação de células do SNC em resposta a uma ampla variedade de estímulos microambientais de forma controlada, a fim de evitar fatores de confusão que estão tipicamente presentes em um ambiente in vivo. Por fim, esta técnica de isolamento celular facilita a manipulação de populações de células gliais dentro de diferentes regiões do SNC para investigar como a glia regional interage entre si e responde a estímulos variados, permitindo precisão e reprodutibilidade.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin and 0.53 mM EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td>Tissue dissociation</td></tr><tr><td>12-Well Plates</td><td>Greiner Bio-One</td><td>665 180</td><td>Cell culture plate</td></tr><tr><td>1X PBS pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010031</td><td>Standard reagent</td></tr><tr><td>32% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714-S</td><td>Fixative</td></tr><tr><td>50 mL, 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt; cell culture flask</td><td>Greiner Bio-One</td><td>690 175</td><td>Cell culture (T25) flask</td></tr><tr><td>Antibiotic-Antimycotic 100X</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td>Media component</td></tr><tr><td>B-27 Supplement 50X</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Sigma</td><td>A9647-50G</td><td>Antibody diluent</td></tr><tr><td>Confocal Microscope</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td>Confocal for imaging</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td>Nuclear stain</td></tr><tr><td>DMEM (1X), high glucose with Na pyruvate</td><td>Gibco</td><td>11995040</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td>Tissue dissociation</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum heat inactivated</td><td>Gibco</td><td>A3840001</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Fibronectin from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>F1141-1MG</td><td>Cell adherent</td></tr><tr><td>Fine stitch Scissors</td><td>Sklar</td><td>64-3260</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Secondary staining antibody</td></tr><tr><td>Goat anti-rat IgG Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A21434</td><td>Secondary staining antibody</td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt Solution (w/o Ca or Mg)</td><td>ThermoFisher</td><td>14170120</td><td>Tissue dissociation</td></tr><tr><td>L-glutamine, 200mM</td><td>Gibco</td><td>20530081</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Murine epidermal growth factor</td><td>ThermoFisher</td><td>PMG8044</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Murine IFN-&amp;gamma;</td><td>Peprotech</td><td>315-05-20UG</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Murine PDGF-AA</td><td>Peprotech</td><td>315-17</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td>Media component</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Sigma</td><td>G9023</td><td>Blocking solution component</td></tr><tr><td>Operating Scissors</td><td>Surgi-OR</td><td>95-272</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Poly-D-Lysine 12 mm #1 German Glass Coverslip</td><td>Corning Biocoatt</td><td>354086</td><td>Cell adherent</td></tr><tr><td>Prolong Gold Antifade Reagent</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9071S</td><td>Mounting Media</td></tr><tr><td>Rabbit anti-Iba1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>Rabbit anti-NG2 Chondroitin Proteoglycan</td><td>Millipore</td><td>ab5320</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>Rat anti-GFAP</td><td>ThermoFisher</td><td>13-0300</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>Rat anti-myelin basic protein</td><td>Abcam</td><td>ab7349</td><td>Primary antibody</td></tr><tr><td>Sharp Tip Scissors</td><td>Surgi-OR</td><td>95-104</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Stereo Microscope</td><td>Leica</td><td>S4 E Stereo Zoom Microscope</td><td>Microscope for dissection</td></tr><tr><td>Tissue Forceps</td><td>Sklar</td><td>66-7644</td><td>Dissection tools</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Bioreagents</td><td>BP151-100</td><td>Cell permabilization</td></tr><tr><td>Trypsin Inhibitor (from chicken egg white)</td><td>Sigma</td><td>10109878001</td><td>Tissue dissociation</td></tr></tbody></table>

dissection and isolation of murine glia from multiple central nervous system regions

Os métodos aqui apresentados demonstram procedimentos laboratoriais para a dissecção de quatro diferentes regiões do sistema nervoso central (SNC) de neonatos murinos para o isolamento de subpopulações gliais. O objetivo do procedimento é dissociar a micróglia, as células progenitoras de oligodendrócitos (OPCs) e os astrócitos dos tecidos corticais, cerebelares, do tronco encefálico e da medula espinhal para facilitar análises in vitro adicionais. Os procedimentos de isolamento da região do SNC permitem a determinação da heterogeneidade regional entre a glia em múltiplos sistemas de cultura celular. O isolamento rápido da região do SNC é realizado, seguido pela remoção mecânica das meninges para evitar a contaminação das células meníngeas da glia. Este protocolo combina dissociação tecidual suave e chapeamento em uma matriz especificada projetada para preservar a integridade e a aderência celular. O isolamento de glia mista de várias regiões do SNC fornece uma análise abrangente da glia potencialmente heterogênea, maximizando o uso de animais experimentais individuais. Além disso, após a dissociação do tecido regional, a glia mista é dividida em vários tipos de células, incluindo microglia, OPCs e astrócitos para uso em qualquer tipo de célula única, inserções de placas de cultura celular ou sistemas de cocultura. No geral, as técnicas demonstradas fornecem um protocolo abrangente de ampla aplicabilidade para a dissecção cuidadosa de quatro regiões individuais do SNC de neonatos murinos e inclui métodos para o isolamento de três tipos individuais de células glia para examinar a heterogeneidade regional em qualquer número de sistemas ou ensaios de cultura celular in vitro.

Os dados representativos mostrados abaixo ilustram que a sinalização IFNγ influencia a diferenciação e a maturação do OPC. Sem a presença do receptor IFNγ (IFNγR), as OPCs corticais não se diferenciam em oligodendrócitos mielinizantes maduros tão prontamente, o que é evidenciado pela ausência de coloração de PAM (Figura 1). Como oligodendrócitos e astrócitos são derivados de um progenitor comum, analisamos a expressão de GFAP, que rotula os astrócitos. Descobrimos que as células deficientes em IFNγR expressam fortemente a GFAP, sugerindo que podem estar adotando um fenótipo astrocítico, corroborando relatos anteriores19.
Evidências adicionais de heterogeneidade regional em células do SNC são evidenciadas pela morfologia variada dos astrócitos, como visto em astrócitos do córtex, cerebelo, tronco encefálico e medula espinhal (Figura 2). Digno de nota, astrócitos da mesma região também podem apresentar heterogeneidade morfológica, apoiando a noção de que este subtipo glial é altamente dinâmico. As diferenças na arquitetura celular são sugestivas de diversidade funcional e, portanto, a capacidade de isolar populações gliais é necessária para estudar as respostas fenotípicas na ausência e presença de estímulos microambientais.
Os oligodendrócitos são críticos para a mielinização dos axônios neuronais e são necessários para o reparo e a função adequados do SNC. Os OPCs dão origem às suas contrapartes maduras, tornando fundamental entender a biologia por trás de sua capacidade de diferenciar. A sinalização de citocinas influencia significativamente o comportamento das células-tronco e do sistema imunológico. Assim, é importante compreender como as respostas regionais das OPCs podem variar para a estimulação diferencial de citocinas (Figura 3), o que pode afetar sua capacidade de se diferenciar em oligodendrócitos mielinizantes maduros.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig01.jpg"> Figura 1: Dados representativos mostrando a diferenciação do OPC em camundongos WT e IFNγR-/- na presença de IFNγ exógeno. OPCs corticais foram isolados de filhotes de camundongos (A ) WT e (B) IFNγR-/- P4 seguindo o procedimento descrito acima. As células foram tratadas com 1 ng/mL de IFNγ por 48 h, depois fixadas e coradas para delinear a diferenciação celular. OPCs foram marcadas para NG2 e GFAP para identificar aqueles que estavam adotando um fenótipo astrocítico. Da mesma forma, OPCs também foram marcados para NG2 e MBP para identificar aqueles que estavam se diferenciando em oligodendrócitos maduros. Barra de escala = 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig01large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig02.jpg"> Figura 2: Dados representativos demonstrando heterogeneidade regional na morfologia dos astrócitos. Astrócitos do córtex, cerebelo, tronco encefálico e medula espinhal foram isolados de filhotes de camundongos P4 usando o protocolo descrito acima e marcados para GFAP (verde) por imunocitoquímica após 48 h em cultura. Barra de escala = 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig02large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61345/61345fig03.jpg"> Figura 3: Dados representativos demonstrando respostas diferenciais de OPCs regionais às citocinas. OPCs foram isolados do tronco encefálico e da medula espinhal de filhotes de camundongos P4 usando o protocolo descrito acima. As células foram tratadas com concentrações crescentes (1-10 ng/mL) de ( A ) IFNγ ou (B) interleucina (IL) -17, a fim de investigar a influência diferencial da citocina na capacidade das OPCs regionais de se diferenciarem em oligodendrócitos mielinizantes. Após uma incubação de 48 h com citocinas especificadas, as OPCs foram fixadas e marcadas para NG2 (verde) e MBP (vermelho). Barra de escala = 20 μM. Os dados representam médias ± EPM. **, p < 0,01; , p < 0,001; , p < 0,0001 por ANOVA de 2 vias. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61345/61345fig03large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">PBS/Solução Antibiótica (PAS):</td>
		</tr><tr><td>1,0 mL</td>
			<td colspan="2">100X Antibiótico/Antimicótico contendo 10.000 unidades/mL de penicilina e 10.000 mg/mL de estreptomicina</td>
		</tr><tr><td>25 mg/mL</td>
			<td colspan="2">Anfotericina B</td>
		</tr><tr><td>99 mL</td>
			<td colspan="2">1X PBS</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Mídia de Glia Mista (MGM)</td>
		</tr><tr><td>88 mL</td>
			<td colspan="2">1X DMEM (glicose elevada, c/L-glutamina, c/Na piruvato)</td>
		</tr><tr><td>10 mL</td>
			<td colspan="2">FBS inativado pelo calor</td>
		</tr><tr><td>1,0 mL</td>
			<td colspan="2">L-Glutamina (100X)</td>
		</tr><tr><td>1,0 mL</td>
			<td colspan="2">Antibiótico/Antimicótico</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Meios OPC (50mL)</td>
		</tr><tr><td>49 mL</td>
			<td colspan="2">Meios neurobasais</td>
		</tr><tr><td>1,0 mL</td>
			<td colspan="2">Suplemento de B27 (50X)</td>
		</tr><tr><td>10 ng/ml</td>
			<td colspan="2">PDGF-AA</td>
		</tr><tr><td colspan="3">NOTA: PDGF-AA é adicionado fresco antes de cada alteração de mídia.</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">Meios de astrócitos (1 L)</td>
		</tr><tr><td>764 mL</td>
			<td colspan="2">MEM com sais de Earle contendo glutamina</td>
		</tr><tr><td>36 mL</td>
			<td colspan="2">Glicose (utilizar estoque de 100 mg/mL para a concência final de 20 mM)</td>
		</tr><tr><td>100 mL</td>
			<td colspan="2">FBS inativado pelo calor</td>
		</tr><tr><td>100 mL</td>
			<td colspan="2">Soro de cavalo inativado pelo calor</td>
		</tr><tr><td>10 mL</td>
			<td colspan="2">Glutamina (utilizar 200 mM de existências se não estiver incluída no meio de existência)</td>
		</tr><tr><td colspan="3"></td>
		</tr><tr><td colspan="3">OPCIONAL: 10 ng/mL de fator de crescimento epidérmico recombinante de camundongo</td>
		</tr><tr><td colspan="3">NOTA: Filtro estéril de todos os suportes e conservar a 4°C até serem utilizados.</td>
		</tr></tbody></table>Tabela 1: Buffer e receitas de mídia.

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Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

Aqui apresentamos um protocolo para isolamento in vitro de múltiplas populações de células gliais de um SNC de camundongo. Este método permite a segregação de micróglias regionais, células precursoras de oligodendrócitos e astrócitos para estudar os fenótipos de cada um em uma variedade de sistemas de cultura.

Dissecção e isolamento da glia murina de múltiplas regiões do sistema nervoso central

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

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3.2K visualizações.  Lerner Research Institute, Cleveland Clinic Foundation. Aqui apresentamos um protocolo para isolamento in vitro de múltiplas populações de células gliais de um SNC de camundongo. Este método permite a segregação de micróglias regionais, células precursoras de oligodendrócitos e astrócitos para estudar os fenótipos de cada um em uma variedade de sistemas de cultura.

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Isolation of Cortical Microglia with Preserved Immunophenotype and Functionality From Murine Neonates

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure for isolation of microglia from neonatal murine cortices by mechanical agitation with a rotary shaker. This microglia isolation method yields highly pure cortical microglia that exhibit morphological and functional characteristics indicative of quiescent microglia in normal, nonpathological conditions in vivo. This procedure also preserves the microglial immunophenotype and biochemical functionality as demonstrated by the induction of morphological changes, nuclear translocation of the p65 subunit of NF-&#954;B (p65), and secretion of the hallmark proinflammatory cytokine, tumor necrosis factor-&#945; (TNF-&#945;), upon lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam) challenges. Therefore, the present isolation procedure preserves the immunophenotype of both quiescent and activated microglia, providing an experimental method of investigating microglia biology in ex vivo conditions.

One key to successful investigation of microglial biology is the preservation of microglial immunofunction ex vivo during isolation from CNS tissue. Isolating microglia via rotary shaking results in highly pure and immunofunctional cell cultures as assessed by fluorescent imaging, immunocytochemistry, and ELISA following microglia activation with the proinflammatory stimuli lipopolysaccharide (LPS) and Pam3CSK4 (Pam).

Isolamento de Cortical Microglia com Imunofenótipo preservada e funcionalidades de murino Os recém-nascidos

Isolation of microglia from CNS tissue is a powerful investigative tool used to study microglial biology ex vivo. The present method details a procedure ...

Imunologia e Infecção

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

Caracterização e isolamento de Mouse Microglia primária por centrifugação gradiente de densidade

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Neurociência

Isolation and Culture of Rodent Microglia to Promote a Dynamic Ramified Morphology in Serum-free Medium

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during development, homeostasis, and disease. Although macrophages have been studied in detail for decades, specialized features of microglia, the tissue-resident macrophages of the CNS, have remained largely mysterious, in part due to limitations in the ability to recapitulate mature microglial properties in culture. Here, we illustrate a straightforward procedure for the rapid isolation of pure microglia from the mature rodent brain. We also describe serum-free culture conditions that support high levels of microglial viability over time. Microglia cultured under these defined-medium conditions exhibit elaborate ramified processes and dynamic surveillance behavior. We illustrate some effects of serum exposure on cultured microglia and discuss how these serum-free cultures compare to both serum-exposed cultures as well as microglia in vivo.

Efforts to understand microglial function in detail have been hindered by the lack of microglial culture models that recapitulate the properties of mature in vivo microglia. This protocol describes an isolation and culture approach designed to maintain robust survival of highly ramified mature rat microglia under defined-medium conditions.

Isolamento e cultura de roedor Microglia para promover uma dinâmica ramificada morfologia em meio livre de soro

Microglia represent 5 - 10% of all central nervous system (CNS) cells and are increasingly drawing attention due to their contributions during ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive human diseases. Considerable advances have been made to uncover the molecular signatures of homeostatic microglia as well as alterations of their gene expression in response to environmental stimuli. With the advent and maturation of single-cell genomic methodologies, it is increasingly recognized that heterogenous microglia may underlie the diverse roles they play in different developmental and pathological conditions. Further dissection of such heterogeneity can be achieved through efficient isolation of microglia from a given region of interest, followed by sensitive profiling of individual cells. Here, we provide a detailed protocol for the rapid isolation of microglia from different brain regions in a single adult mouse brain hemisphere. We also demonstrate how to use these sorted microglia for plate-based deep single-cell RNA sequencing. We discuss the adaptability of this method to other scenarios and provide guidelines for improving the system to accommodate large-scale studies.

We provide a protocol for isolation of microglia from different dissected regions of an adult mouse brain hemisphere, followed by semi-automated library preparation for deep single-cell RNA sequencing of full-length transcriptomes. This method will help to elucidate functional heterogeneity of microglia in health and disease.

Isolamento da Microglia específica da Região de um hemisfério cerebral de camundongo adulto para sequenciamento profundo de RNA unicelular

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). Microglia can be divided into resting state and activated state and can rapidly change state in response to the microenvironment of the brain. Microglia will be activated under different pathological conditions and exhibit different phenotypes. In addition, there are many different subgroups of activated microglia and great heterogeneity between different subgroups. The heterogeneity mainly depends on the molecular specificity of microglia. Studies have revealed that microglia will be activated and play an important role in the pathological process of inflammatory demyelination. To better understand the characteristics of microglia in inflammatory demyelinating diseases such as multiple sclerosis and neuromyelitis optica spectrum disorder, we propose a perilesional primary microglial sorting protocol. This protocol utilizes columnar magnetic-activated cell sorting (MACS) to obtain highly purified primary microglia and preserve the molecular characteristics of microglia to investigate the potential effects of microglia in inflammatory demyelinating diseases.

Here, we present a protocol to isolate and purify primary microglia in animal models of demyelinating diseases, utilizing columnar magnetic-activated cell sorting.

Isolamento da Microglia Primária do Rato por Triagem celular ativada por magnético em modelos animais de desmielinização

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

Isolamento de células gliais entéricas da Submucosa e Propria do Lamina do rato adulto

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...

Biologia

Isolation of Microglia from the Cortex of an Adult Mouse Brain

Source: Zhou, L., et al., <a href="https://app.jove.com/v/60347">Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing.</a> J. Vis. Exp. (2019)
The video demonstrates a technique for isolating microglia from the cortex of an adult mouse brain. First, the cortex undergoes segmentation and homogenization to remove neurons and other glial cells, preserving microglia. Following that, the cell suspension is exposed to anti-myelin magnetic microbeads and a magnetic field, effectively separating microglia and myeloid cells from myelin debris and cells containing myelin.

Isolamento da microglia do córtex de um cérebro de camundongo adulto

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Mechanical Tissue Dissociation
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JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuronal Culture Techniques

Primary Neuronal Culture

Magnetic Isolation of Microglia from Mouse Pup Brains

Source: Bokobza, C. et al., <a href="https://app.jove.com/v/62964">Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures.</a> J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we describe a protocol for isolating CD11b cells, including microglia, from mouse pup brains using magnetic-activated cell sorting. The brain tissues are homogenized to obtain single-cell suspensions, which are incubated with anti-CD11b antibody-coated microbeads, followed by a magnetic column-based separation to purify the CD11b+ cell population.

Isolamento magnético de microglia de cérebros de filhotes de camundongos

Source: Bokobza, C. et al., Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures. J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we ...

Imunologia

Sistemas e Componentes Imunológicos

Isolamento e Cultura Celular

Isolating Microglia from Mouse Brain Demyelinating Lesions Using Magnetic Activated Cell Sorting

Source: Zhang, H. et al. <a href="https://app.jove.com/v/63511">Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination.</a> J. Vis. Exp. (2022).
This video demonstrates a protocol for extracting microglial cells from demyelinating lesions in mouse brains using magnetic cell sorting. The protocol involves dissecting the lesioned brain tissue containing microglial cells, treating the tissue with specific enzymes to obtain a single-cell suspension, and utilizing microglial receptor-specific magnetic beads to isolate the microglial cells.

Isolando a microglia de lesões desmielinizantes do cérebro de camundongos usando classificação de células ativadas por magnetismo

 All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee. 
1. Materials

	&#160;Prepare ...

Obtaining a Mixed Glial Cell Culture from a Neonatal Mouse Brain

Source: Sarkar, S. et al., <a href="https://app.jove.com/v/55364">Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility.</a> J. Vis. Exp. (2017)
The video demonstrated the method of isolating and culturing cells from a neonatal mouse brain. It involved enzymatic and mechanical dissociation of the brain, followed by culturing in growth media lacking neuronal growth factor to obtain a mixed glial population.

Obtenção de uma cultura de células gliais mistas de um cérebro de camundongo neonatal

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee. 
1. Growing of Mixed Glial ...