Bu protokol, iki boyutlu görüntüsünden hücre içi yapının alanının, çevresinin ve şeklinin nicelemesini sağlar. Bu teknik hızlı ve kolaydır, sadece standart laboratuvar ayarları ve konfokal mikroskop gerektirir ve açık kaynak yazılım kullanır. Prosedürü gösteren Anna Balcerak, benim laboratuvarımdan doktora öğrencisi olacak.
37 derece santigrat derece ve beş derece karbondioksit inkübatör 24 saatlik bir kültür için dört iyi kollajen bir kaplamalı oda slayt iyi başına kültür orta 0,5 mililitre beşinci hücrelere dört kez 10 tohumlama ile başlayın. Ertesi sabah, en az %90 eşzamanlı monokatmanın varlığını doğrulamak için optik ters mikroskop kullanın ve tek z dilimi görüntüleri elde etmek için konfokal mikroskop kullanın. Odak yapışma analizi için ImageJ'deki görüntüleri açın ve görüntü ölçeğini pikselolarak ayarlamak için analiz, ölçek ayarlama, ölçek kaldırma ve genel i
Dosya adını ve ilgi alanının ölçüm seçeneklerini eklemek için, analiz et ve ölçümleri ayarla ve alanı kontrol et ve etiket seçeneklerini görüntüle. Arka planı çıkarmak için işlemi seçin ve arka planı çıkarın. Yuvarlanan top yarıçapını 50 piksele ayarlayın ve kayan paraboliyi kontrol edin.
En küçük ilgi alanının alanını belirlemek için, en küçük tek odak yapışmasını ana hatlarını belirleyin ve alanı ölçmek için analiz et ve ölç'ü tıklatın. En az 20 ilgi alanı seçildiğinde ve ölçüldüğünde, elde edilen sonuçların ortalamasını hesaplayın ve kaydedin. Üst sınırı tipik bir hücre alanının %25'ine ayarlayın.
Görüntüyü ikili olarak vermek için görüntüyü tıklatın, ayarlayın ve eşiği tıklatın ve varsayılan, siyah beyaz ve koyu arka planı denetleyin. İlgi çekici bölgelerin sayısını ve alanlarını ölçmek için, parçacığı analiz etme ve analiz etme ve piksel birimlerini kontrol etme, sonuçları görüntüleme, sonuçları netle ve özetle. Dilim, sayım ve toplam alan ortalama boyutu verilerini özet penceresinden tercih edilen veri yönetim programına aktarın.
Odak yapışma ölçümü için, odak yapışması ImageJ makrosunu açın ve en küçük ilgi alanı nın alanını en küçük ilgi alanı olarak girin. Eşik türü değerini manuel veya otomatik olarak ayarlayın ve değişiklikleri kaydedin. Ardından ImageJ'den makroyu arayın ve işlenecek görüntüyü seçin.
Manuel hücre şekli analizi için, uygun bir görüntü işleme yazılımı programında bir görüntü açın ve ölçülecek parametreleri seçin. Hücre kenarlıklarını, tercih edilen bağlantı proteinleri tarafından işaretlenen el ile ifade etmek için serbest el seçim aracını kullanın. Seçilen parametreler her hücre için otomatik olarak hesaplanır.
Tüm hücreler ana hatlarıyla ana hatlarıyla belirtildiğinde, edit, seçim ve yöneticiye ekleyin'i seçin. Yalnızca kesintisiz kenarlıkları olan tamamen görünür hücrelerin tamamı seçilmelidir. Ölçümü yapmak için, ilgi alanı yöneticisinin bulunduğu bölgenin sol kutusunda görünen tüm sayıları işaretleyin ve ölçüyü tıklatın.
Sonuçlar sonuç kutusunda görünür ve tercih edilen elektronik tabloya aktarılabilir. Otomatik hücre analizi, çok sayıda hücrenin sayısallaştırılmasını kolaylaştırır. Her yeni hücre türü için, parametreleri belirlemek için önce makroyu çalıştırın.
Makro tamamlandığında, hücre boyutu sınırlarını ayarla'yı seçin. En küçük ve en büyük hücrelerin etiketini tıklatın ve ölçü'ye tıklayın. En küçük hücrenin ve en büyük hücre değişkenlerinin değerini ayarlayın ve değişiklikleri kaydedin.
Makro pencerelerinin tümünü kapatın ve gri tonlamada işlenecek görüntüyü seçin. Sonra makroyu yeniden çalıştırın. Makro, hücre şekli dizini, en boy oranı ve ilgi alanları seçim listesi verilerini içeren sonuçların bir tablosunu sağlar.
Burada, son numaralı anahatlar ve odak yapışmasının bindirmeleri de dahil olmak üzere ImageJ ile sayılan odak yapışıklıklarının temsili görüntüleri, hem kontrol hem de nakavt hücre hatları için orijinal görüntüile odak yapışmaanahatlarını gözlemleyebilir. Bu analizde gösterildiği gibi, knockdown hücreleri hücre başına yapışıklıkların daha fazla sayıda yanı sıra hücre hattı hücreleri kontrol göre boyutu daha büyük yapışıklıklar gösterdi. Bu görüntülerde tedavi edilmeyen ve kemoterapötik olarak tedavi edilen hücre monolayers'ın temsili bölgeleri gösterilmiştir.
Anahat hücreleri hücre şekil indeks değerlerine göre karakterize edildi, örneğin bu analizde son depo kutusunda bir artış ve tedavi edilmeyen kontrollere kıyasla ilaçla tedavi edilen hücreler için ana zirvelerin düzlemesi gösterildi. Daha sonra her hücre kültürü için bir frekans dağılımı ve kümülatif dağıtım oluşturulabilir. Gösterildiği gibi monolayers grayscale görüntüleme analiz ve görüntüleme 12 alanlardan 512 hücrelerin niceliksel hücre şekli indeksi göreli bir frekans dağılımı ortaya izin verdi.
Bu protokolün çalışması için, mümkün olan en iyi kalitede görüntüleri kullanmak önemlidir. Uygun hücre tohumlama, boyama ve görüntüleme yeterli deneysel kalitede görüntüleri sağlamalıdır.
