Bu protokol, moleküler düzeyde yuvarlanan yapışma ve uzamsal haritalama ve ölçmeye izin vermenin yanı sıra moleküler kuvvet ve hücre yuvarlanma davranışı arasındaki bağlantıyı kurmaya yardımcı olur. Bu teknik, gerçek hücre yuvarlanması sırasında bireysel yapışma olaylarını incelememizi sağlayarak fizyolojik ilgili moleküler yapışma kuvvetini doğrudan ölçmemizi sağlar. Her adımda uygun konsantrasyon ve kuluçka süresini kullanarak yüzey hazırlığı, yüksek kaliteli yüzey fonksiyonelleştirmesi elde etmek için çok önemlidir.
Biyokonjugasyonların kalitesi ve uygun koşullar da çok önemlidir. Görsel gösterim, araştırmacıların bu protokolü çoğaltmasına yardımcı olmak için kritik öneme sahiptir. Özellikle, akış odası montajı ve işlem sonrası görüntüler gibi adımlar görsel bir gösteriden büyük fayda sağlayacaktır.
Çift taraflı bandın her iki tarafına jiletle az miktarda epoksi serperek başlayın. Lazer kullanarak, dört kanal oluşturmak için epoksi kaplı bandı kesin. Epoksi bandı dört delikli bir slayt ve PEG kapak kapağı arasına sıkıştırarak akış çipini oluşturun.
Pipet ucu kullanarak, iyi bir conta oluşturmak için kanalların uzunluğu boyunca hafif basınç uygulayın, ardından epoksiyi en az bir saat boyunca iyileştirin. Çipi, her kanalın açılması adaptörün merkezlerine yer olacak şekilde hizalayın. Ardından çipin üzerine iki şeffaf akrilik ara parça yerleştirin.
Bloğun ortasına sıkı basınç uygulayın ve her ara çubuğun uçlarını vidalayın. Girişleri braketin diğer tarafındaki dişli deliklere vidaleyin ve şeffaf akrilik blok aracılığıyla sızdırmazlık durumunu izleyin. Sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için hazneye 200 mikrolitre yıkama tamponu akışı.
Kanalda kabarcıklar oluşursa, kabarcıkları çıkarmak için agresif bir şekilde 200 mikrolitrelik ek bir yıkama tamponu itin. Spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için akış odasına 40 mikrolitre BSA ekleyin ve nem odasında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, akış odasına Tween 20'de 40 mikrolitre ekleyin ve spesifik olmayan bağlamayı daha da azaltmak için 10 dakika boyunca tekrar kuluçkaya yatırın.
Ardından, tüm pasivasyon maddelerini çıkarmak için kanalı 200 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın. Oda yüzeyi fonksiyonelleştirme için, akış odasına 40 mikrolitre Streptavidin ekleyin ve 20 dakika kuluçkaya yatırın, ardından odayı 200 mikrolitre yıkama tamponu ile yıkayın. Şimdi, akış odasına 40 mikrolitre melezlenmiş protein G-TGT ekleyin ve 20 dakika kuluçkaya yatırın.
Yıkama tamponu ile yıkadıktan sonra, 40 mikrolitre protein G-TGT üst iplikçik ekleyin ve yüzeydeki herhangi bir yibridize edilmemiş TGT alt telini tamamlamak için 20 dakika kuluçkaya yatırın ve ardından yıkama tamponu ile yıkayın. Son olarak, akış odasına 40 mikrolitre P-selectin-Fc ekleyin ve yıkama tamponu ile yıkamadan önce 60 dakika kuluçkaya yatırın. Beş mililitrelik bir cam şırınnayı yuvarlanan tamponla doldurun ve şırınnanın kenarlarına dokunarak dışarı çıkın ve kabarcıkları ulaya doğru yüzerken dışarı itin.
200 milimetrelik bir polietilen boru parçasına steril bir iğne yerleştirdikten sonra, iğneyi cam şırıngaya bağlayın. Şırınd'ı şırındıcı pompaya sabitleyin ve şırınna pompasını, hava kabarcıklarının kanala girmesini önlemek için piston tarafı yükselecek şekilde eğin. Tüpün ucını akış odası girişine yerleştirin.
Polietilen borunun 200 milimetrelik başka bir parçasının bir ucunu prize yerleştirin ve diğer ucunu atık bir kabın içine batırın. Hücreleri peletmek için hücre süspansiyon örneğinden bir ila iki mililitre alın ve santrifüj alın. Ortamı çıkarın ve hücreleri yuvarlanan tamponun 500 mikrolitresinde hafifçe yeniden biriktirin.
Boruyu girişlerden ve hücre süspansiyonunun 40 mikrolitresini akış odasına çıkış ve pipetten dikkatlice çıkarın. Kabarcıkların akış kanalına sokulmamasını sağlamak için boruyu daha önce açıklandığı gibi yeniden bağlayın. Şırınd pompasını istediğiniz akış hızlarında başlatarak hücre haddeleme deneyine başlayın.
10X hedefi olan karanlık alan mikroskobu kullanarak hücre yuvarlanma gözlemleyin. Deneme tamamlandıktan sonra, yüzey hücre serbest kalana kadar yuvarlanan arabelleği saatte 100 mililitrede aşılayarak hücreleri kanaldan çıkarın. Yerel parçaları DNA-PAINT ile görüntülemek için kanala DNA-PAINT tamponunda hazırlanmış 40 mikrolitre DNA-PAINT görüntüleyiç teli ekleyin.
Metin el yazmasında belirtilen koşulları kullanarak toplam iç yansıma floresan mikroskopisi gerçekleştirin. Süper çözünürlüklü görüntüleri yerelleştirin ve işleyin. Uzun parçaları kalıcı etiketleme ile görüntülemek için kalıcı görüntüleyicİ telini ekleyin ve T50M5 tamponunda 120 saniye kuluçkaya yatırın.
Daha sonra 200 mikrolitre yıkama tamponu aşılayarak kanalı yıkayın. Arka plan kamerası gürültüsü elde etmek için heyecan lazeri kapalıyken bir görüntü kaydedin. TIRF mikroskopisi ile ızgara deseninde geniş bir alanı görüntüleyin.
Mikroskobu 400'e 50 görüntü alanını taramak ve raw verileri ImageJ programını kullanarak her biri en fazla 10.000 görüntü içeren tek tek TIP dosyalarına bölmek için programlayın. Aydınlatma profilini kullanarak tüm görüntüleri düzleştirin ve görüntüleri dikmek için MIST eklentisini kullanın. Protein G ssDNA biyokonjugasyon karakterizasyonu için sonuç, G Maleimide ssDNA ve imidazol elution tampon spektrumunun biyokonjugasyon ürün spektrumuna uyum sağlamak için ortogonal temelden geldiği protein G'nin ssDNA'ya bir oranına yakın olduğunu göstermiştir.
Native PAGE, başarılı konjugasyon ve iyi verim gösteren monomerik protein G bandına denk gelen parlak yeşil bantları gösteren biyokonjugasyonu doğrulamak için kullanıldı. Tek modlu fiberden sunulan TIRF aydınlatma profili genellikle görüş alanının ortasında daha parlaktır ve kenarların etrafında karartıcıdır. Düzensiz aydınlatmayı telafi etmek ve nicel analiz için görüntüleri düzleştirmek için aydınlatma profili, ortalama binlerce ayrı çerçeve ile belirlendi.
Düzleştirilmiş görüntüler, kamera gürültüsünün hem ham hem de aydınlatma profillerinden çıkarılması ve daha sonra aydınlatma profili ile normalleştirilmesiyle üretildi. Ham dikiş, düzeltilmemiş görüntülere karşılık gelen net periyodik desenler gösterirken, düzleştirilmiş görüntülerden dikilen aynı görüş alanı düz bir arka plan oluşturdu. Hücre yuvarlanması ve tipik bir tek hücreli yapışıklık ayak izinin görülebileceği floresan izleri ile sonuçlanan kesme stresi aralığını belirlemek için bir rampa yukarı akış profili kullanılmıştır.
Yetersiz kontrast, aşırı iz yoğunluğu, optimum iz yoğunluğu ve kontrastı ile kırınım sınırlı ve DNA-PAINT görüntüleme ile floresan izlerin yetersiz ve optimum sonuçları gösterilmiştir. 60 dakikadan uzun kuluçka süresi, yüzey fonksiyonelleştirmesini sağlar ve uygun oda yapısı fonksiyonel yüzeye zarar veren kabarcıkların geçişini önler. Bu prosedür, yuvarlanan yapışmada rol oynayan moleküler kuvvetin nicel analizi için geçerlidir ve araştırmacıların farklı hücre tiplerinin yuvarlanma davranışını anlamalarını sağlar.
Bu teknik, araştırmacıların tek molekül ve mekanobiyoloji araştırmalarının daha da ilerlemesine yol açan hızlı yapışma olaylarıyla ilgili yeni soruları keşfetmelerini sağlar.
