We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Cam lameller hazırlanması 1. <ol><li> Etanol tüm lamelleri toplam pozlama sağlamak için zaman zaman ajitasyon ile en az 10 dakika süreyle% 70 etanol onları iliklerine cam lamelleri yuvarlak 12 mm çapında sterilize edin. Steril hücre kültürü kabı içine cam lamelleri ve etanol dökün (ya da 6 cm ya da 10 cm çapında). </li><li> Steril ince 5B forseps bir çift ile, pick up ve 24 de küme plaka bir kuyuya her cam lamel yerleştirin. Lamelleri Kuyunun taraflarına dokunarak ve kuyunun ortasında yaklaşık olarak emin olmak için özen gösterin. </li><li> Akış kabinede kurumaya cam lamelleri ile un kaplı 24 kuyu küme plaka bırakın. Bu yaklaşık 10 dakika sürer </li><li> Bu süre içinde, 0.1 mg / ml Hank&#39;in dengeli tuz çözeltisi (HBSS) içinde 10 mg / ml insan fibronektin seyreltilmesi ile kaplama karışımı hazırlayın. </li><li> Lamelleri kuruduğunda, her bir cam co üstüne kaplama çözeltisi pipetle 100 ulböylece verslip çözüm de dış çevresindeki havuzu olmayan tek cam kaplar. En azından bir saat için bir hücre kültürü inkübatöründe kaplı 24 çukurlu toplu plaka koyun. </li><li> Sadece Kullanmadan önce, kaplama çözümü çıkarın. aynı kaplama çözeltisi steril bir tüpe transfer edilmiş ve etkinlik görünür bir kayıp ile üç kez kullanılabilir. </li></ol> Endotel Hücre Monolayer 2. Hazırlık <ol><li> 37 ° C &#39;de orta ve% 5 karbon dioksit Kültür insan koroner arter endotel hücreleri (EC). </li><li> Kültür ortamı aspire ve 10 ml HBSS ile AK tek tabaka durulayın </li><li> HBSS kapalı aspire ve 2 ml% 0.5 tripsin,% 0.2 EDTA çözeltisi. Yaklaşık olarak 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> AT şişeye tarafına bir musluk tarafından yerinden edilebilir olduğunda, soya fasulyesi tripsin inhibitörü 5 ml ilave edilir ve pipet ile daha da hücreleri çıkarmak için şişenin yüzeyi fışkırtma. </li><li> 15 ml&#39;lik bir tüp ve santrifüj tüpü içine aktarın hücreleri5 dakika boyunca 200 x g&#39;de. </li><li> Süpernatant kapalı aspire ve medya 5 ml AK pelletini. Bir haemocytometer ile hücre sayımı ve AT medya ml başına 50.000 EC hücre konsantrasyonunu ayarlamak. </li><li> Kaplanmış cam lamelleri içeren 24 çukurlu bir levhanın her bir çukuruna hücre süspansiyonu 1 ml koyun. 37 ° C artı% 5 karbon dioksit, hücre kültürü inkübatöründe hücreleri O / N inkübe edin. </li><li> konfluent tek tabaka 3 gün içinde, meydana getirildiği zaman hücreler, deneylerde kullanılmak üzere hazırdır. </li></ol> Monositler 3. hazırlanması <ol><li> RPMI içinde kültürlenir transfer HL-60 hücreleri bir 15 ml tüp içine, süspansiyon kültürü olarak% 10 fetal dana serumu ile takviye edilmiştir. 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de santrifüjleyin hücreleri. </li><li> 5 mi ortam içinde yüzer ve tekrar süspansiyon hücreleri çıkarın ve 2.000.000 hücre / ml ortam hücre konsantrasyonunu ayarlamak. HL-60 floresan etiketleme isteniyorsa, serum ve PR olmadan RPMI hücreleri tekrar süspansiyonbölüm 4&#39;te tarif edildiği gibi oceed. </li><li> 1 ile 3 arasında bir zaman seçilen sabit bir süre için AT tek tabaka ihtiva eden 24 çukurlu toplu plakanın her oyuğuna HL-60 hücre süspansiyonu, 0.5 ml ilave edilir ve 37 ° C&#39;de ve% 5 karbon dioksit, bir hücre kültürü inkübatöründe inkübe plaka hr. Küçük bir fark bağlama doygunluk elde edilir, 1 saat, 3 saat zaman noktası arasında görülmektedir. </li><li> Hücre Yıkama / toplama için hazırlayın: HBSS, 100 ml ile 120 ml tüp doldurun. Taze 24 yuvalı plakanın her oyuğuna formalin 1 ml koyun. </li><li> Dokunmamaya özen kuluçka döneminden sonra, keskin forseps bir çift kullanın ve kuyudan cam lamel pick up ve dikey lamel tutun ve 3 sn bankta doku parçasının üzerine lamel kenarına dab doku ile lamel hücre kaplı yüzeyi. </li><li> Forseps bir çift ile sıkıca lamel tutarak, ve HBSS beş kez dışarı lamel dunk. </li><li> Beşinci dunk sonraHBSS, 3 saniye boyunca doku üzerinde lamel kenarına hafifçe sürün. </li><li> Bir dab izledi 5 dunks üç set toplam yapım, 3.6 ve 3.7 &#39;de açıklandığı smaç vurma ve prosedürleri tekrarlayın. </li><li> RT&#39;de hücreleri gidermek için iyi içeren% 10 formalin içine lamel aktarın. Lamel, numaralandırma hazır uzun süreli depolama için ya da aşağıda tarif edilen diğer prosedürler tabi etmektir. </li></ol> Hücre Tracker ile HL-60 hücrelerinin 4. Etiketleme (isteğe bağlı) <ol><li> Sayım bir 15 ml santrifüj tüpüne HL-60 hücreleri (örneğin, 10000000) uygun miktarda aktarın. Santrifüj HL-60, 5 dakika boyunca 200 x g&#39;de hücreleri. Süpernatantı. </li><li> 1.000.000 hücre / ml&#39;lik bir konsantrasyonda serumsuz RPMI ortamı içinde hücre Tracker tekrar süspansiyon hücre peleti. 1 saat süre ile hücre kültürü inkübatöründe inkübe hücreleri. </li><li> 200 x g&#39;de santrifüjleyin hücreler, 5 dakika süreyle tavlandı ve süpernatant atılır. 2.000.000 C&#39;lik bir konsantrasyona kadar ortam içinde tekrar süspansiyon hücre peletiarşın / ml olmuştur. </li><li> Cam lamel üzerinde büyümüş içeren her endotel hücrelerine hücre Takibi etiketli HL-60, 0.5 ml ilave edilir. 3.3 devam edin. </li></ol> Yapıştırıcı endotel hücrelerinin 5. numaralandırma <ol><li> Mikroskop bireysel hücreleri belirlemek için DAPI karşı boyası ile slaytlar Mount lamelleri. </li><li> Bir 4X veya 10X amacı ile ters bir mikroskop kullanılarak, çeşitli alanlarda (örneğin, 5 alanlar) görüntülerini almak ve un-ışınlanmış endotel hücreleri üzerinde agrega monositlerin en çok (Bu genellikle 3-5 olmalıdır) saymak. </li><li> Endotel hücre monositlerin eşik olarak iki kez bu sayısını ayarlayın bir küme olarak tanımlanabilir için. Eğer gerekirse, farklı bir kriter, deney doğasına bağlı olarak bir küme tanımlamak için kullanılabilir. </li><li> Kümelerinin sayısını ve alan endotel hücre sayısı. Yapışkan endotel hücrelerinin yüzdesini elde etmek rezistans tarafından önceki bölün. GolÇok sayıda alanları sayısı arasında bir ortalama ve standart sapma elde edilmiştir. </li></ol> Antikorlar 6. counterstaining <ol><li> Lamel yapışma deneyi ve hücreler oda sıcaklığında 15 dakika için% 10 formalin içinde sabitlenir sonra, standart bir prosedür 10 ve seçim antikorlar kullanılarak immünofloresans lamelleri maruz. </li><li> Ekle ve endotel hücrelerine bağlı monositler yerinden oynatmamaya önlemek için çok çeşitli çözümler yavaşça çıkarın. </li></ol> Yaşlanmayla bağlantılı beta-galaktosidaz aktivitesi bakımından 7. counterstaining <ol><li> Lamel yapışma deneyi ve hücreler yaşlanmayla ilişkili beta-galaktosidaz faaliyeti için 15 dakika, leke için formalin sabit edildikten sonra boyama seti eşlik kılavuzunda açıklandığı gibi. Ekle ve endotel hücrelerine bağlı monositler yerinden oynatmamaya önlemek için çok çeşitli çözümler yavaşça çıkarın. </li></ol>

<ol>
	<li>Ortega-Gomez, A., Perretti, M., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+inflammation:+an+integrated+view.">Resolution of inflammation: an integrated view.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 661-674 (2013).</li><li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+cardiovascular+disease+mechanisms.">Inflammation and cardiovascular disease mechanisms.</a> Am J Clin Nutr. 83 (2), 456S-460S (2006).</li><li>Ikuta, S., Kirby, J. A., Shenton, B. K., Givan, A. L., Lennard, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cells:+effect+of+TNF-alpha+on+peripheral+blood+mononuclear+cell+adhesion.">Human endothelial cells: effect of TNF-alpha on peripheral blood mononuclear cell adhesion.</a> Immunology. 73 (1), 71-76 (1991).</li><li>Watson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-6+acts+on+endothelial+cells+to+preferentially+increase+their+adherence+for+lymphocytes.">IL-6 acts on endothelial cells to preferentially increase their adherence for lymphocytes.</a> Clin Exp Immunol. 105 (1), 112-119 (1996).</li><li>Sans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VCAM-1+and+ICAM-1+mediate+leukocyte-endothelial+cell+adhesion+in+rat+experimental+colitis.">VCAM-1 and ICAM-1 mediate leukocyte-endothelial cell adhesion in rat experimental colitis.</a> Gastroenterology. 116 (4), 874-883 (1999).</li><li>Su, Y., Lei, X., Wu, L., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+cell+adhesion+molecules+P-selectin,+E-selectin+and+intercellular+adhesion+molecule-1+in+leucocyte+recruitment+induced+by+exogenous+methylglyoxal.">The role of endothelial cell adhesion molecules P-selectin, E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 in leucocyte recruitment induced by exogenous methylglyoxal.</a> Immunology. 137 (1), 65-79 (2012).</li><li>Hallahan, D., Kuchibhotla, J., Wyble, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+mediate+radiation-induced+leukocyte+adhesion+to+the+vascular+endothelium.">Cell adhesion molecules mediate radiation-induced leukocyte adhesion to the vascular endothelium.</a> Cancer Res. 56 (22), 5150-5155 (1996).</li><li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion.">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> J Immunol Methods. 159 (1-2), 93-100 (1993).</li><li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature.">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvasc Res. 82, 210-220 (2011).</li><li>Lowe, D., Raj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+aging+induced+by+radiation+exhibits+pro-atherosclerotic+effects+mediated+by+epigenetic+activation+of+CD44+expression.">Premature aging induced by radiation exhibits pro-atherosclerotic effects mediated by epigenetic activation of CD44 expression.</a> Aging Cell. 13 (5), 900-910 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Yukarıda tarif edilen monosit yapışma deneyi endotel mono tabakaları 10 iyonizan radyasyon biyolojik etkilerini incelemek amacıyla tasarlanan deneylerde başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Bu endotel tek tabaka yapışkanlığını değerlendirmek için tek yöntem değildir, ancak, bu yapıştırıcı, bir tek tabaka içindeki oranı veya endotelyal hücrelerin yüzdesi ölçümü sağlayan tek bir yöntemdir. Bu monositler yapışmasının küresel bir niceliksel değişiklik olarak önemli bir fark, diğer yöntemlerle ölçülen endotel tek tabaka ya da endotel hücrelerinin bir alt-nüfusa artışı yapışkanlık tüm hücre yapışma genel bir artışa ya da atfedilebilir tek tabaka içinde yukarıdaki örnekte gösterilmiştir. Bu bilgiye sahip değer ışınlama ines neden sonra yeteneği gelişmiş yapışkanlığı sergiledi endotel hücrelerinin yüzdesini ölçmek için gerçeği ile örneklenmiştirBu etki, yapışkan olan hücrelerin yüzdesi olarak belirli bir genin, genetik mutasyona bağlı değildir sahip sonuç, bu dozda X-radyasyon ile bir genin rastgele mutasyon beklenebilecek olanı (1000 kat daha fazla) büyük ölçüde yukarıda edildi . Sonuçların iyi tekrarlanabilirlik sağlayan faktörü yıkama rejimidir. Yıkama işlemi, bir doku üzerinde dabbing ardından yıkama tamponu içine cam lamel daldırma içerdiğinden, kaçınılmaz olarak kuyuya yıkama tamponu pipetleme gelen eski yöntem ortaya tamponu türbülansa değişkenliği önlenir. Aslında yıkama adımından değişkenlik elemanı kaldırılmış bir yıkama işlemi hazırlamak için bize mecbur pipet yöntemi kullanılarak elde edilen çoğaltır arasındaki aşırı değişkenlik gözlem oldu. Kuşkusuz, muhtaç bu testte yalan sınırlamalar n do monosit kümeleri manuel sayısı, yürütmek içinOT yüksek verimlilik analizleri için adapte edilmesini sağlar. İkincisi, birçok monositler bir küme oluşturan nasıl karar yarı keyfi belirlenmelidir ve düzeyi çok yüksek ayarlanmış ve bazı orijinal kümeler dışlanmasına neden olabilir. bu yöntemde, kesme kuvveti eksikliği, aynı zamanda, endotelyal hücrelerin ağır gelişmiş yapışkanlık neden olduğu deneylerde (örneğin, + TNFa) bir sınırlama olarak görülebilir. Bu yapışkanlık az abartılmış büyütme algılanmasını sağlar diğer durumlarda ancak, kesme kuvveti eksikliği bir avantajdır. Monosit yapışkanlık mütevazı bir artış özellikle önemlidir ve ilgili olabilir. İn vivo koşullarında, monositler (tipik bir deney zamanında) kırma gücüne karşı büyük ölçüde yapışkanlık mütevazı bir artış ile endotelial hücrelere büyük sayılarda takmak için beklenmez. Zaman içinde, ancak bazı monositler olasılıkla olur ve bu kronik iltihaplanma ortamı temsil etmek için daha olasıdır. Gibi,o yapışkanlık artışının makaslama stres altında uyulması gereken izin tipik olarak kısa ve muhtemelen çok kısacık deneysel zaman dilimlerinde ortaya endotel hücre yapışkanlık küçük artışlar için fırsat sağlar olarak kesme kuvveti bulunmaması bir avantaj olabilir. Yukarıda gösterildiği gibi, belirli hücresel proteinlerin ya da hücresel devletlere özgü endotel hücrelerinin yapışkanlık ilişkisini veriyor gibi yaşlanma tahlil ve immünofloresan boyama gibi diğer analizlere bu tahlilde sonra hücrelerin maruz yeteneği, bir özellik bu yöntemin yararını artırır Eski yapışma deneyleri ile mevcut değildir. Bu yöntem, EST2-ölümsüzleştirilmiş insan koroner endotel hücreleri ve benzer sonuçlar ile kullanılmıştır da sadece özel bir hücre hattına özgü olmadığını gösteren, primer insan koroner endotel hücreleri 10 ile elde edilmiştir. Ayrıca, adoendotel hücrelerinin yapışkanlığı tahlil bu yöntemin ption etiketli immünositlerin floresan ölçer standart yapışma deneyi aynı hücrelerin maruz engel değildir. Birlikte, bu rapor, bu yöntem, kapsayıcı, çok yönlü ve standart yapışma deneyinde çok daha fazla bilgi sağladığını göstermektedir.

Kan damarlarını kaplayan endotel hücre tabakası boyunca monositler gibi immün hücrelerin infiltrasyonu iltihabı 1 sürecinde önemli bir adımdır. Bu yaralanmanın bir siteye bağışıklık hücreleri (imünositler) homing sağlar. Örneğin, koroner ve karotis arter gibi durumlarda ve yerlerde, endotel tabaka boyunca monosit sızması potansiyel istilanın 2 oluşumuna yol, arter çeperinde bu hücrelerin istenmeyen uzun süreli ikamet yol açabilir. Immünosit infiltrasyonu Her durumda, ilk adım, kan damarının lokal bir bölgedeki endotel hücrelerinin aktivasyonunu içermektedir. Endotel hücreleri, endotel hücre yüzeyi 3- üzerine immünositlerin görevlendirilmesini ve bağlanmasını kolaylaştırmak örneğin, VCAM, ICAM ve E-selektin gibi hücre yüzeyi proteinlerinin ifadesini geliştirmek için, TNF-α ve IL-6 pro-enflamatuvar sitokinler tarafından aktive edilir 6. 7 endotel yapışık monositler sayımı sureti ile ifa edilmiştir. hassasiyet açısından bu yönteminin sınırlamaları lenfositler ve monositler yapışma 4 karşılık gelen radyoaktif madde miktarının, ardından radyo işaretli lenfosit veya monosit kullanımına yol açmıştır. Bu yöntem, sonuçta 8 ölçülür ilgi imünositler farkı yerine radyoaktivite bu floresans olduğu yukarıdaki ile aynı prosedüre floresans boya ile etiketlenir ve tabi tutuldu ve böylece bir floresans bazlı yöntem, değiştirildi. Halen bu yöntem en uygun olarak ortaya çıkmıştır ve çok sayıda ticari tedarikçiler tarafından kit halinde satılmaktadır. Bu deney, kontrol ve deney numuneleri arasındaki yapışkanlık göreli düzeylerini ölçmek mümkün olmakla birlikte, floresan bir değişiklik bütün e boyunca yapışkanlık üniform bir değişikliğe bağlı olup olmadığı ortaya koymamaktadırndothelial hücre topluluğu veya değişiklik, hücre alt-popülasyonu içinde yapışkanlık bir farka ise. Bu yıkama darlığı sonucu üzerinde derin etki gösterir ve daha da önemlisi, farklı endotel hücre mono tabakaları arasındaki ilişkisiz monositler kapalı durulama tekdüzelik numuneler arasında sonuçların çoğaltır sonuçlarının yakınlık ve tekrarlanabilirlik büyük ölçüde etkileyeceğini de açıktır . Daha yakın zamanda, bir endotelyal hücre tek tabaka boyunca ortam içinde monositleri pompa çeşitli sistemler, bu sorunu çözmek 9 için kullanılmıştır. Buna ek olarak, bu akış sistemleri de endotelyal hücreler üzerinde kesme kuvvetinin etkisi özetlemek. Bu sistemlerin avantajı net ve çok cazip olmakla birlikte, akut iltihap durumunda olduğu gibi, bu örneğin iyonize edici radyasyon gibi TNFa, başka bir aktivatörleri, gibi faktörler ile, endotelial hücre yapışkanlığı önemli ölçüde artar edilebilir ise gerçekleştirmek için de önemlidir 10 meydana çıkarmak t değiştirirşapka kolaylıkla bunlar çok sıkı sistemlerinin in vitro deneysel süreler dahilinde tespit edilmez. Endotel hücre yapışma gibi dakika değişiklikleri kolayca cevapsız veya in vitro ilişiği kesilen iken, kronik inflamasyon özelliği olan bir yaşam süresi içinde böyle küçük değişiklikler, çok önemli sonuçlar uygulamayın in vivo, mutlaka iyi huylu değildir. Dolayısıyla sağlam, ancak duyarlı ve spesifik bir yöntem tespit ve endotel hücre yapışkanlık gereklidir ölçmek için. Burada, doğrudan endotel hücrelerinin yapışkanlığını ölçmek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yöntem, endotelyal hücre yapışma dolaylı taşıyıcı göstergesi olarak floresans ölçümleri dayanmaz. Bu yapışkanlık değişiklikler tüm hücrelerin tektip değişiklik nedeniyle ya da bir alt nüfusa sınırlı olup olmadığını ortaya koymaktadır. Bundan başka, bu örneğin yaşlanmayla ilişkili beta-galaktosidaz, hücre canlılığı, mar olarak işaretleri ile endotel hücrelerinin ko-lekeleme sağlarker, Calcien AM ve bazı hücre durumlar veya spesifik protein ekspresyonuna bireysel yapışkan endotel hücrelerinin ilişki sağlayan hücre yüzeyi ve hücre içi proteinlere karşı antikorlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hepes Buffered Saline Solution (HBSS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips Round 12mm Diameter</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>CB00120RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cluster plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meso-Endo Cell media</td>
			<td>Cell Applications</td>
			<td>212-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17075-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Calf Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta glasctosidase Assay kit&#160;&#160;</td>
			<td>CellSignaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro

Inflamasyon ana işlemlerden biri, çevredeki dokuya kan damarı lümeninden bağışıklık hücrelerinin sızıntıdır. Kan damarları kaplayan endotel hücreler, monositler gibi bağışıklık hücreleri, dolaşımdaki yapışkan olduğunda ortaya çıkar. Bu yapışkanlık in vitro ölçülmesi artık yeni bir doğrudan sayısı olarak ya bir endotel katmana yapışık monositler sayısı miktarının yapılır kadar veya yapışık monositler floresan dolaylı ölçümü ile saptanmıştır. Bu ölçümler endotel hücre popülasyonunun ortalama yapışma gösterir ise de, bu tür hücre sayısı gibi faktörler, bir dizi eleştirilmiştir edilir ve aslında yapışkandır endotel hücrelerinin oranını göstermez. Burada tarif ve endotel tek tabaka bir test nüfus içinde yapışkan hücrelerin numaralandırma sağlayan bir yöntem ortaya koymaktadır. Endotel hücreleri cam lamelleri üzerinde yetiştirilen ve istenen aşağıdakitedavisi (yani, floresanla işaretlenmiş olabilir) monositler ile tehdit edilir. Daldırma ve drenaj birden mermi içeren inkübasyon, bir durulama prosedürü, sonra hücreler sabittir. Monositler çevrili Yapıştırıcı endotel hücreleri, kolayca tespit ve yapışkan olan nüfus içindeki endotel hücrelerinin gerçek oranını ortaya bir yapışma indeksi vererek, numaralandırılan.

Bu yöntem, bir popülasyon içindeki bireysel yapışkan endotelyal hücrelerin saptanmasını sağlar. Örneğin, un ışınlanmış endotelyal hücre tek-tabakalı (önceki bağımsız endotel hücreleri çevresinde en kümelerdeki monositler bağlı edildi monositler ile kuluçkalamadan 7 gün sonrası 10Gy ışınlama ile inkübasyon ve yıkama, endotel tek tabakalı sonra birkaç sporadik HL-60 monositler muhafaza ederken Şekil 1). Bu fenomen faz kontrast mikroskobu altında kolaylıkla gözlemlenebilir olmasına rağmen, floresan mikroskopi monosit kümeleri daha da net bir görüntü ortaya koyuyor. Tarif edilen yapışma tahlili gerçekleştirdikten sonra, standart yöntemler ile immünofloresan uygun antikorlar kullanılarak membran, sitoplazmik ya da nükleer (Şekil 2) proteinlerin hücrelerin boyanması devam etmek mümkündür. Bundan başka, örneğin yaşlanmayla ilişkili beta-galaktosidaz (Şekil 3) gibi enzim-bazlı analiz aynı zamanda PE olabilirrformed. Her bir monosit, küme bağımsız bir endotelyal hücreye karşılık geldiğinden, kümelerin numaralandırma tek tabaka içinde yapışkan endotelyal hücrelerin sayısı ortaya çıkaracaktır (Şekil 4) ve popülasyon içindeki yapışkan endotel hücreleri bu nedenle oranı (Tablo 1, Şekil 6) . Bu endotel hücre yapışma gibi ölçümü sağlar bugüne kadar tek yöntemdir. Burada yapılan deneylerde kullanılan endotel hücreleri temas inhibe ve kaplayana kadar sayısındaki artış yoktur dikkat çekicidir. Bu daha sonraki zaman noktalarında artmış endotel hücre sayısına göre yarattığı potansiyel karmaşıklığı ortadan kaldırır. Eğer arzu edilirse, endotelyal monokatmanlarına bağlanmış monositler (3.9 yerine tespiti)% 0.5 tripsin% 0.2 EDTA çözeltisi ile yerinden alınabilir ve modern yöntemler durumda (Şekil 5) olduğu gibi floresans bir plaka okuyucusu kullanılarak ölçüldü. </p&gt; <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> Endotel hücrelerinin tek tabaka üzerinde monositlerin Şekil 1. yapışması. Un-ışınlanmış endotel hücreleri üzerinde, monositler sporadik ve rastgele bir şekilde tek tek hücrelerin (paneller sol) olarak ve post-10 Gy ışınlanmış 7 gün bireysel endotel hücreleri üzerinde kümeler halinde yapıştırılır tek tabaka (sağ paneller). Alt paneller faz kontrast altında görülebilen, küçük ve parlak bir küresel hücrelerin gerçekten de hücre-Tracker Green ile ön-etiketli monositler olduğunu teyit üst panellerin floresans görüntüleri bulunmaktadır. Monosit kümeleri Bazı beyaz oklarla gösterilir. Görüntüler 10X objektif kullanılarak alınmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <html><img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> Proteinler sonrası yapışma deneyi için, endotel hücrelerinin Şekil 2. boyanması. Anlatılan yapışma deneyi gerçekleştirmek sonra, cam lameller üzerine hücreler (A), membran proteinin (CD44) için immünofloresan tabi tutuldu, b) Sitoplazmik protein (tubulin) veya c) nükleer protein (γ-H2AX). (A) ve gösteri monositler Hücre Tracker Green ve sağ panellerde benzer bir görüntü ile önceden etiketlenmiş (20X amacı ile görülen) (B) Sol panel CD44 ve mikrotübüller (kırmızı) ve DAPI lekeli çekirdekleri (mavi) ortaya koymaktadır. Γ-H2AX karşı antikorlar ile boyandı ışınlanmış endotel hücre çekirdekleri için (C) noktasında beyaz oklar. DAPI tarafından parlak bir mavi lekeli Monosit çekirdekleri kolayca endotel hücrelerinin oval biçimli çekirdekleri ayırt edilir. Görüntüler 20X amacı ile alınmıştır.<html> jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 3," src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> Endotel hücresindeki açıkça görüldüğü gibi endotel hücrelerinin Şekil 3. yaşlanmayla bağlantılı beta-galaktosidaz boyama. Adezyon deneyinde sonra lamelleri hücreler, yaşlanmış hücrelerin lizozom mavi dönmesine neden olur yaşlanmayla bağlantılı beta-galaktosidaz için boyama maruz kaldığı seçici nedeniyle küçük boyutu ve küresel şekle kolayca tespit sayısız monositler, ile bağlıdır. 20X objektif görünen görüntü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> 2924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; Bireysel endotelyal hücreler üzerinde monosit kümelerinin Şekil 4. numaralandırma. Adezyon deneyinde sonra hücrelerin görüntüleri alan birçok farklı pozisyonlarda ve monosit kümelerden alındı ​​ve (yeşil) çember. Bir küme, bir endotelyal hücre 10 veya daha fazla veya monositlerin bir aglomerasyon olarak tanımlandı. Görüntüdeki Monosit kümeleri ve 12 gün sonrası ışınlanmış endotel hücreleri sayısı sayısı (kırmızı noktalı) sayıldı ve hesaplanan yapışık endotel hücrelerin yüzdesi 10X objektif ile çekilen Tablo 1. Görüntü gösterildiği gibi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük bir sürümü.</a> <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> Şekil yapışık monositler floresansının 5. miktarının belirlenmesi. Aşağıdaki Adhe<html> sion deneyi, cam lameller üzerine hücreler tripsinize edildi ve monositlerin endotelyal floresan tek tabaka yapışkanlık dolaylı bir göstergesi olarak, bir floresan plaka okuyucu kullanılarak ölçülmüştür CellTracker Green ile önceden etiketlenir. Belirtilen gün sonrası ışınlama tür ölçümlerden elde edilen sonuçlar ve yukarıdaki grafikte platted bulundu. <img alt="Şekil 6," src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> Şekil 4&#39;te tarif edilen sonuçlar, ışınlanmış de 12 gün sonra 10 Gy ışınlama, 8-10 oranında gösteren yukarıdaki tabloda verilen üç cam lameller üzerine beş farklı konumlarda 1. Yapışkan endotel hücreleri skorlandı Tablosundan yapışma deneyi skoru Şekil 6. Temsil Endotel hücreler, Yapışkan olmuştur. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; yapıştırıcı yüzdesi endotel hücreleri </td></tr><tr><td></td><td> Disc 1 </td><td> Disc 2 </td><td> Disk 3 </td></tr><tr><td> Tarla 1 </td><td> 8.65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> Alan 2 </td><td> 10.44 </td><td> 7.27 </td><td> 7.21 </td></tr><tr><td> Alan 3 </td><td> 9.63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> Alan 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7.09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> Alan 5 </td><td> 10.55 </td><td> 9.4 </td><td> 11.61 </td></tr><tr><td> Ortalama </td><td> 10.07 </td><td> 8.22 </td><td> 8.75 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Yapışma deneyi puanları. F de tarif edildiği gibi, üç cam lameller üzerine beş farklı konumlarda Yapışkan endoteliyal hücreler skorlandıŞEKIL 4 ve sonuçlar, 12 gün, 10 Gy ışımadan sonra, ışınlanmış endotel hücrelerinin 8-10 oranında yapıştırıcı haline geldiğini gösteren yukarıdaki tablo.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro at JoVE.com

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

quantitation-of-endothelial-cell-adhesiveness-in-vitro

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

11.4K Görüntüleme.  Centre for Radiation, Chemicals and Environmental Hazards, Public Health England. We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer. 

Video: Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm chromatin, cytosol, and light membrane fractions. Complete nuclei are formed, including nuclear membranes with pore complexes, and these reconstituted nuclei are capable of normal nuclear processes.

Vitro Nükleer Meclisi fraksiyonlara Xenopus Yumurta ayıklar kullanma

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Biyoloji

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult human peripheral blood within a mean of 12 days. After large scale expansion &gt;1x108 ECFCs can be obtained for further tests. Advantageously by using pHPL the contact of human cells with bovine serum antigens can be excluded. By flow cytometry and immunohistochemistry the isolated cells can be characterized as ECFC and their in vitro functionality to form vascular like structures can be tested in a matrigel assay. Further these cells can be subcutaneously injected in a mouse model to form functional, perfused vessels in vivo. After long term expansion and cryopreservation proliferation, function and genomic stability appear to be preserved. 3,4
This animal-protein free isolation and expansion method is easily applicable to generate a large quantity of ECFCs.

Endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) are a promising tool to study vascular homeostasis and repair.1,2 This paper introduces a novel animal-serum free method for isolation and expansion of ECFC from heparinised adult human peripheral blood with pooled human platelet lysate (pHPL) diminishing the risk of anti-bovine immunisation.

İzolasyon ve Büyük Ölçekli Genişleme Yetişkin İnsan Endotel Koloni Oluşturan Progenitör Hücreler

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional cuvette-based instruments for nucleic acid quantitation for those that can perform microvolume quantitation.
The NanoDrop microvolume sample retention system (Thermo Scientific NanoDrop Products) functions by combining fiber optic technology and natural surface tension properties to capture and retain minute amounts of sample independent of traditional containment apparatus such as cuvettes or capillaries. Furthermore, the system employs shorter path lengths, which result in a broad range of nucleic acid concentration measurements, essentially eliminating the need to perform dilutions. Reducing the volume of sample required for spectroscopic analysis also facilitates the inclusion of additional quality control steps throughout many molecular workflows, increasing efficiency and ultimately leading to greater confidence in downstream results.
The need for high-sensitivity fluorescent analysis of limited mass has also emerged with recent experimental advances. Using the same microvolume sample retention technology, fluorescent measurements may be performed with 2 &mu;L of material, allowing fluorescent assays volume requirements to be significantly reduced. Such microreactions of 10 &mu;L or less are now possible using a dedicated microvolume fluorospectrometer.
Two microvolume nucleic acid quantitation protocols will be demonstrated that use integrated sample retention systems as practical alternatives to traditional cuvette-based protocols. First, a direct A260 absorbance method using a microvolume spectrophotometer is described. This is followed by a demonstration of a fluorescence-based method that enables reduced-volume fluorescence reactions with a microvolume fluorospectrometer. These novel techniques enable the assessment of nucleic acid concentrations ranging from 1 pg/ &mu;L to 15,000 ng/ &mu;L with minimal consumption of sample.

The use of NanoDrop microvolume systems as practical and efficient alternatives to traditional nucleic acid quantitation methodology is described through the demonstration of two microvolume nucleic acid quantitation protocols.

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing myocardial infarction (MI) is largely driven by detecting cardiac-specific proteins in patients' serum or plasma as an indicator of myocardial injury. Having recently shown that cardiac myosin binding protein-C (cMyBP-C) is detectable in the serum after MI, we have proposed it as a potential biomarker for MI. Biomarkers are typically detected by traditional sandwich enzyme-linked immunosorbent assays. However, this technique requires a large sample volume, has a small dynamic range, and can measure only one protein at a time.	
Here we show a multiplex immunoassay in which three cardiac proteins can be measured simultaneously with high sensitivity. Measuring cMyBP-C in uniplex or together with creatine kinase MB and cardiac troponin I showed comparable sensitivity. This technique uses the Meso Scale Discovery (MSD) method of multiplexing in a 96-well plate combined with electrochemiluminescence for detection. While only small sample volumes are required, high sensitivity and a large dynamic range are achieved. Using this technique, we measured cMyBP-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I levels in serum samples from 16 subjects with MI and compared the results with 16 control subjects. We were able to detect all three markers in these samples and found all three biomarkers to be increased after MI. This technique is, therefore, suitable for the sensitive detection of cardiac biomarkers in serum samples.

Measuring biomarkers in complex biological samples is increasingly guiding clinical decision-making. We describe a highly sensitive method to simultaneously measure cardiac myosin binding protein-C, creatine kinase MB, and cardiac troponin I in serum samples from subjects with myocardial infarction and healthy control subjects.

Elektrokemiluminesan immunoassay Serum Kardiyak Miyozin Bağlayıcı Protein-C belirlenmesi için hassas ve özel miktar tayini yöntemi

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using this protocol, angiogenesis may be measured in vitro in a fast, quantifiable manner. Primary or immortalized endothelial cells are mixed with conditioned media and plated on basement membrane matrix. The endothelial cells form capillary like structures in response to angiogenic signals found in conditioned media. The tube formation occurs quickly with endothelial cells beginning to align themselves within 1&#160;hr and lumen-containing tubules beginning to appear within 2 hr. Tubes can be visualized using a phase contrast inverted microscope, or the cells can be treated with calcein AM prior to the assay and tubes visualized through fluorescence or confocal microscopy. The number of branch sites/nodes, loops/meshes, or number or length of tubes formed can be easily quantified as a measure of in vitro angiogenesis. In summary, this assay can be used to identify genes and pathways that are involved in the promotion or inhibition of angiogenesis in a rapid, reproducible, and quantitative manner.

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

The tube formation assay is a fast, quantifiable method for measuring in vitro angiogenesis. Endothelial cells are combined with conditioned media and plated on basement membrane extract. Tube formation occurs within hours and newly formed tubules easily quantified.

Endotel Hücre için Tüp Deneyi birleşimi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Anjiyogenezin Çalışması

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes oxidation of molecules (lipid, DNA, protein) and leads to cell death. Oxidative stress also impacts the progression of several pathological conditions such as diabetes, retinopathies, neurodegeneration, and cancer. Thus, it is important to define tools to investigate oxidative stress conditions not only at the level of single cells but also in the context of whole organisms. Here, we consider the zebrafish embryo as a useful in vivo system to perform such studies and present a protocol to measure in vivo oxidative stress. Taking advantage of fluorescent ROS probes and zebrafish transgenic fluorescent lines, we develop two different methods to measure oxidative stress in vivo: i) a &#8220;whole embryo ROS-detection method&#8221; for qualitative measurement of oxidative stress and ii) a &#8220;single-cell&#160;ROS detection method&#8221; for quantitative measurements of oxidative stress. Herein, we demonstrate the efficacy of these procedures by increasing oxidative stress in tissues by oxidant agents and physiological or genetic methods. This protocol is amenable for forward genetic screens and it will help address cause-effect relationships of ROS in animal models of oxidative stress-related pathologies such as neurological disorders and cancer.

Here we report a protocol to measure oxidative stress in living zebrafish embryos. This procedure allows reactive oxygen species (ROS) detection in both whole embryo tissues and single-cell populations. This protocol will accomplish both qualitative and quantitative analyses.

Zebra balığı Embriyolar Oksidatif Stres Analizi

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

Çoklanmış Immuno-histokimyasal boyanması ve Multispektral Görüntüleme kullanma Protein Ekspresyonu ve Co-lokalizasyon Kantifikasyonu

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and exhibit a pro-inflammatory phenotype. Although the development of microfluidic devices has been embraced by engineers over two decades, their biological applications remain limited. A more physiologically relevant in vitro microvessel model validated by biological applications is important to advance the field and bridge the gaps between in vivo and in vitro studies. Here, we present detailed procedures for the development of cultured microvessel network using a microfluidic device with a long-term perfusion capability. We also demonstrate its applications for quantitative measurements of agonist-induced changes in EC [Ca2+]i and nitric oxide (NO) production in real time using confocal and conventional fluorescence microscopy. The formed microvessel network with continuous perfusion showed well-developed junctions between ECs. VE-cadherin distribution was closer to that observed in intact microvessels than statically cultured EC monolayers. ATP-induced transient increases in EC [Ca2+]i and NO production were quantitatively measured at individual cell levels, which validated the functionality of the cultured microvessels. This microfluidic device allows ECs to grow under a well-controlled, physiologically relevant flow, which makes the cell culture environment closer to in vivo than that in the conventional, static 2D cultures. The microchannel network design is highly versatile, and the fabrication process is simple and repeatable. The device can be easily integrated to the confocal or conventional microscopic system enabling high resolution imaging. Most importantly, because the cultured microvessel network can be formed by primary human ECs, this approach will serve as a useful tool to investigate how pathologically altered blood components from patient samples affect human ECs and provide insight into clinical issues. It also can be developed as a platform for drug screening.

Development and Characterization of In Vitro Microvessel Network and Quantitative Measurements of Endothelial [Ca2+]i and Nitric Oxide Production

Primary human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) were grown to confluence within a microfluidic network device. The endothelial cell junction and F-actin distributions were illustrated and the changes in intracellular calcium concentration and nitric oxide production in response to adenosine triphosphate (ATP) were quantified in real-time at individual cell levels.

Gelişim ve karakterizasyonu<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikrodamar Ağ ve Endotel kantitatif ölçümleri [Ca<sup&gt; 2+</sup&gt;]<sub&gt; I</sub&gt; Ve Nitrik Oksit Üretimi

Endothelial cells (ECs) lining the blood vessel walls in vivo are constantly exposed to flow, but cultured ECs are often grown under static conditions and ...