Bu yöntem drosophila gelişiminin birden fazla aşamasında kan-beyin bariyerinin oluşumu ve bakımı genetik düzenleme ile ilgili anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir. Bu yöntem aynı zamanda çeşitli organizmalarda bağırsak epiteli gibi diğer bariyerlerin geçirgenliğini incelemek için uyarlanabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı canlı dokularda kan-beyin bariyer fonksiyonunun değerlendirilmesi sağlar olmasıdır.
Örnek manipülasyonlar zor olabilir ve birçok adım ayrıntılara yakın dikkat gerektirdiğinden, bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. Embriyo toplama için Mısır Unu Agar gıda ile şişe başına 20-25 erkek ile en az 50 bakire kadın yer ve koleksiyonları başlamadan önce bir ila iki gün boyunca bu sinekler kuluçka. Toplama bir gün önce, 25 santigrat derece gece sıcak elma suyu agar plakaları.
Ertesi sabah transfer karbondioksit anestezi sinekler bir toplama kafesi ve kafesin açık ucunda maya ezmesi küçük bir yayma ile önceden ısıtılmış elma suyu agar plaka yerleştirin. Sonra kırmızı kollu kafese plaka güvenli. Eski embriyoları temizlemek için, sinekler 25 santigrat derece bir saat boyunca bir elma suyu agar plaka üzerinde yumurta bırakmak için izin verin.
Kuluçka sonunda, kafes örgü tarafı aşağı ters ve kafesin altına sinek dokunun. Maya hamuru küçük bir yayma ile yeni bir önceden ısıtılmış elma suyu agar plaka ile elma suyu agar değiştirin. Sinekler 25 santigrat derece başka bir saat için yeni plaka üzerinde yumurtlamak için izin verin.
Enjeksiyon için geç evre 17 embriyoları toplamak için, maya ezmesi bir yayma ile yeni bir önceden ısıtılmış plaka ile elma suyu agar plaka değiştirin. Ve sineklerin 25 santigrat derecede yumurtalarını tabağa bırakmalarına izin verin. Bir saat sonra, plakayı değiştirin ve plakayı 25 santigrat derecede 19 saat boyunca toplanan embriyolarla değiştirin, böylece embriyolar görüntüleme sırasında 20 ila 21 saat yaşlansın.
19 saatlik kuluçka sonunda, embriyo toplama plakasını kuvözden çıkarın ve plakanın yüzeyini PbTx ile kapatın. Ve embriyolar ile süzgeç yerleştirin 50%çamaşır suyu çözeltisi içinde 100 milimetre Petri çanak beş dakika oda sıcaklığında zaman zaman ajitasyon ile onları dekorionate.
Kuluçka sonunda, her yıkama için yeni bir Petri kabı kullanarak, taze PbTx süzgeç girdap tarafından üç kez embriyolar durulayın. PbTx ile süzgeç bir tarafında yıkama embriyolar ve% 2 agarose jel levha üzerine embriyolar aktarmak için bir cam pipet kullanın. Fazla sıvıyı filtre kağıdı yla çıkarın.
Altı ila sekiz embriyoyu levhaüzerinde, sağdaki arka larla hizalayın ve sırt kenarları yukarı bakacak şekilde ve embriyoların üzerine yapıştırılmış çift taraflı bant parçasına sıkıca basın. Daha sonra örnekleri Halokarbon yağı ile kaplamadan önce embriyoları oda sıcaklığında yaklaşık 25 dakika kurutun. Larva koleksiyonu için, istenilen genotip 5-10 bakire dişi sinekler ve Cornmeal Agar gıda ile bir şişe istenilen genotip yarısı kadar erkek ile bir haç kurmak.
25 santigrat derece de beş ila yedi gün sonra, genotip bağlı olarak, yavaşça şişe den dolaşan üçüncü yıldız larvaları toplamak ve herhangi bir sıkışmış gıda kaldırmak için PBS ile larvaları durulayın için forceps kullanın. Larvaları bir doku üzerinde kurutmak için bir boya fırçası kullanmadan önce gerektiği gibi genotipleme için bir elma suyu agar plakasına aktarın. Daha sonra altı ila sekiz larvayı çift taraflı bantla hazırlanmış bir slayta aktarmak için forcep kullanın.
Enjeksiyondan önce, d.Melanogaster enjeksiyonları için standart bir iğne şekli içine kılcal tüpler çekmek ve bir Petri kabında kil iğneleri çapa bir mikropipet puller kullanın. Embriyo enjeksiyonu için, 20 mikrolitrejel yükleme pipet ucu sülforhodamine 101 asit klorür konjuge 10 kilodalton dekstran 5 mikrolitre ile hazırlanmış bir iğne yüklemek ve bir iğne tutucu içine iğne yüklemek kullanın. İğneyi çelik bir tabana sabitlenmiş bir mikromanipülatöre yerleştirin ve enjekte cihazını inç kare başına 50 pound'a ve 10'luk bir aralıkla 5 ila 10 milisaniyeye ayarlayın.
Mikromanipülatör aşamasında slayt yerleştirin ve 45 derecelik bir açıyla çift taraflı bant kenarına iğne kenarına fırça sadece açılış yoluyla 10 kilodalton dextran akışını sağlamak için yeterli kırık hafif açılı bir ucu oluşturmak için. Boya iğnenin ucunda olana kadar ayak pedalını pompalayın. İğneyi embriyoya paralel olacak şekilde hizala ve numunenin arka ucunu delin.
Numunenin içine iki nanolitre boya enjekte etmek için ayak pedalını pompalayın. Kuluçka amacıyla enjeksiyon süresine dikkat edin ve ek numuneler enjekte etmek için slaytaşağı devam edin. Larva enjeksiyonu için, embriyo enjekte etmek için kullanılandan biraz daha büyük açılı bir açıklık yapın ve larvalara embriyonik örneklerde gösterildiği gibi 220 nanolitre enjekte etmeden önce iğneyi numuneye doğru hafifçe aşağıya doğru açıya çevirin.
10 dakikalık enjeksiyon kuluçka sonunda, bir spacer olarak slayt örneklerinin sağ ve sol taraflarında petrol jöle uygulamak için bir pamuk uçlu aplikatör kullanın. Kapak fişini üste yerleştirin ve kaydırağı konfokal mikroskop aşamasına yerleştirin. 20X hedefini seçin ve her embriyonun derinliği boyunca örnekleri görüntüleyin.
Daha sonra formüle göre kan-beyin bariyeri tehlikeye ile örneklerin yüzdesini hesaplayın. Diseksiyon işlemine başlamadan önce, bir slaytüzerine yaklaşık 0,5 santimetre aralıklı iki kapak fişi takmak için oje kullanın ve 30 dakikalık kuluçka sonunda slaytta PBS içine enjekte edilen larva yerleştirin. Bir çift forceps kullanarak, larvayı yarım kavrayışla kavrayın ve larvanın ön ve arka yarısını ayırmak için ikinci bir çift forceps kullanın.
Daha sonra, ağız kancalarında ön bölgeyi kavramak için bir çift forceps kullanın ve ilk çift forceps ucu üzerinde vücut duvarını tersine çevirmek için ikinci çift forceps kullanın. Beyin ve ventral sinir kordonu açığa çıkacak. Gerekirse sinirleri keserek beyin ve ventral sinir kordonu vücut duvarından ayırın ve slayt vücut duvarı kaldırın.
% 80 gliserol 10 mikrolitre ile örnek kapağı. Daha sonra görüntüleme ve görüntü örnekleri için örnek üstüne bir kapak kayma yerleştirin kanıtgösterildiği gibi bir tehlikeye kan-beyin bariyeri ile örneklerin yüzdesini belirlemek için. Yabani tip geç evre 17 embriyolar 10 kilodalton dekstran ile sülforhodamine 101 asit klorür floresan boya konjuge enjekte edildiğinde, büyük dekstran molekülü ventral sinir kordonu dışında tutulur, beklendiği gibi.
Heterozigot ham 1 mutant embriyolar sağlam bir kan-beyin bariyeri sergilerler, vahşi tip kontrol embriyolarında gözlenene benzer. Buna karşılık, homozigot ham 1 mutant embriyolar kan-beyin bariyerinin bütünlüğü kusurları sergilemek, ile 10 kilodalton dextran ventral sinir kordonu içine sel, oluşturmak için kan-beyin bariyerinin bir başarısızlık gösteren. Yabani tip kontrol larva örneklerinde, 10 kilodalton dextran kan-beyin bariyerini geçemez ve beyin ve ventral sinir kordonu dışında tutulur.
Bu prosedür denerken, embriyoların düzgün yaşlanması, örneklerin kan-beyin bariyerinin tam laşmasının beklendiği bir yaşta incelenmesini sağlamak için önemlidir. Bu prosedürütaki kan-beyin bariyerini koruyan mutantlar, hücresel düzeydeki gen fonksiyonunu daha iyi anlamak için genetik, immünohistokimya ve mikroskopi kullanılarak daha da ileri ye doğru çalışılabilirler. Bu teknik, araştırmacıların kan-beyin bariyerinin kurulması ve bakımı için kritik olan ek genleri belirlemelerine olanak sağlayacaktır.
