Biz sinek hisse senetleri için Jesper Kronhamn ve Dan Hultmark, Michael Galko ve Bloomington Menkul Kıymetler Merkezi&#39;ne teşekkür ederiz. Istatistiksel analiz ile tavsiye için Courtney Onodera özel teşekkürler. Biz yazının eleştirel okuma Katrina Altın ve Kalpana Makhijani, Katrina Altın, Derynck laboratuvar üyelerine ve el yazması üzerinde tartışma ve yorumlar için Nystul laboratuvar üyelerine teşekkür ederim. Bu çalışma Atılım Biyomedikal Araştırma (PBBR), Geniş Merkezi, Hellman Vakfı, Amerikan Kanser Derneği RSG DDC-122595, Amerikan Kalp Derneği 13BGIA13730001, Ulusal Bilim Vakfı 1.326.268, Sağlık 1R01GM112083-01 National Institutes ve için UCSF Programı hibe ile desteklenmiştir (KB) 1R56HL118726-01A1.

1. Hemosit Sızdırma / Pençe Deneyi <ol><li> Slaytların hazırlanması: <ol><li> Karo tarama fonksiyonu olmayan Mikroskop Seçenek 1: Her larva analiz edilebilmesi için, mikroskop alan görüş alanına karşılık gelen 2 mm&#39;lik kareler her yaklaşık 5 Pap-kalem kuyuları ile tek cam slayt hazırlamak; Her bir (Şekil 1A) S2 ortam 10 ul - yaklaşık 5 ekleyin. Kurumasını önlemek için kuyu nemli odasında slaytlar tutun. </li><li> Karo tarama fonksiyonu ile Mikroskop Seçenek 2: Her larva analiz edilebilmesi için, ~ 3 3 4 Pap-kalem kuyuları ile tek cam slayt hazırlamak - 4 mm kareler her; Her bir oyuğa (Şekil 1B) S2 ortam 20 ul - yaklaşık 15 ekleyin. Kurumasını önlemek için kuyu nemli odasında slaytlar tutun. NOT: kuyu yukarıda önerilen sayıda ~ 2.5, larva başına en fazla 3.000 hemocytes toplamları (geç 2. evre larvaları için yeterli - larv çoğunluğu etiketleme 3 mm uzunluk, transgenal kan hücreleri). Büyük kan hücresi sayıları değerlendirirken, daha kuyular fazla kalabalığı önlemek için gerekli olabilir. </li></ol></li><li> Larva Koleksiyonu: <ol><li> Bir Petri kabı içine larva ve floş larvaları içeren bir sinek şişenin içine su fışkırtma veya Petri kabı içine larvaları içeren bazı gıda kepçe ve bir bücür şişe kullanılarak su ile seyreltin. </li><li> Yavaşça boya fırçası yardımıyla Petri kabı dışarı larvaları almak ve bir boşluk tabak veya soğuk blokta bir slayt suya koyun. NOT: Larvalar su veya soğuk bir blokta sınırlı bir süre için muhafaza edilebilir; Larva ölümü ya hemocytes istenmeyen etkileri önlemek için, 45 dakika ya da daha az olan örnekler kullanılır. </li></ol></li><li> Diseksiyon: <ol><li> Soğuk metal blokta flöresanlı bir mikroskop altında larvaları seçin. İsterseniz boyutları ve görüntü larva ölçün. </li><li> (&quot;Bleed&quot;) hemocytes dolaşan İzolasyonu: <ol><li> Larvalar seçildikten sonra, ilk Pap-kalem de (Şekil 1C bir larva yerleştirin2A). </li><li> Larva posterior ve anterior uçları hem bir kesi yapmak için 2 temiz iğneler veya kesme makas ve forseps kullanın. Yerleşik hemocytes rahatsız etmemek için, larva ventral tarafta bu kesiler yapmak en iyisidir. Tutarlı sonuçlar için, her larva için aynı konumlarda kesiler yapmak. 1. evre larvaları için, (ventral anterior) 1 kesi yeterlidir. </li><li> Larva herhangi bir baskı ya da fiziksel ajitasyon (Şekil 2A) olmadan birkaç saniye kanamaya izin verin. NOT: Birden fazla larva üzerinde çalışan Eğer numunelerin bütünlüğünü etkileyebilecek çok uzun buz üzerinde larva tutarak önlemek için bir sonraki aşamaya geçmeden önce her biri için bu kesiler yapmak daha iyidir. </li><li> Yavaşça iğne veya forseps ile larva kaldırın ve kalan dolaşan hemocytes durulayın ikinci kuyunun içine daldırın. Bundan sonra, ikamet hemocytes sürümü ile izleyin. </li></ol></li><li&gt; yerleşik hemocytes izolasyonu (&quot;Pençe&quot;): <ol><li> Yavaşça sonraki kuyu (Şekil 2C) ile larva transferi. </li><li> Tipik larva ön ucundan yaklaşık 1/3 bulunduğu larva, lenf bezi tespit ve larva vücut duvarı ile dorsal hangi floresan olabilir. (Şekil 2C) delinmesiyle önlemek için lenf bezine mümkün olduğunca yakın bir iğne ile larva aşağı iğneleyerek ikamet hemocytes bırakırken lenf bezi kaçının. NOT: Lenf bezi hemocytes olgunlaşma larva hemocytes kıyasla gecikir ve farklılaştırılmış hemocytes floresan gazetecilere genç larvaların lenf bezinde bir sinyal göstermiyor olabilir normal gelişim sırasında. Bu durumlarda, daha az dikkat beklenen lenf bezi hemocytes tarafından ayırt floresan etiketli larva hemocytes hiçbir kirlenme olarak lenf bezi ödenmesi gerekmektedir. </li><li> Bir Boru açma yerleşik kan hücrelerini serbest bırakınkazıma ve / veya batıcı sürecine. Gerektiği gibi etkili lenf bezi yakın larva (yukarıya bakınız) ya da diğer vücut bölgeleri aşağı pin tek oya kullanın. Hemocytes ayırmak amacıyla, larva vücut duvarı (Şekil 2C, E) aracılığıyla görülebilir hemocytes kümelere de yumruk başka iğne kullanın. Hemocytes da bir sıyırma hareket salınabilir. Ancak, erken epidermisi yırtarak otomatik sayım daha zorlu yapabilir kan hücrelerinin, büyük kümeleri salabilir. NOT: larva yaşına ve genotipe bağlı olarak toplam hemocytes sayısı değişecektir. Tek hücre görüntü analizi zorlaştıracak kan hücreleri ile bir kuyu, bir aşırı kalabalık önlemek için çeşitli kuyular üzerinde, yukarıda tarif edilen salma işlemi dağıtın. </li><li> Birkaç hemocytes son karkas kalırsa, manuel taksitli sayacı (Şekil 2E) mikroskop ve kullanımı ile gözlem yoluyla bu hemocytes saymak. Sayma, s kolaylaştırmak içinAynı slayt temiz bir alanda karkas dantel ve optik uçaklarının sayısını azaltmak için ince sürede yayıldı. </li><li> Hücreler kuyuları görüntüleme önce yerleşmek (ama mutlaka bağlı değil) için 10 dk - diseksiyon tamamlandığında, 5 ila bekleyin. Kurumayı önlemek için nemli bir odaya slayt inkübe ve yerleşmiş hemocytes rahatsız olabilir slaytlar, kaba işleme kaçının. NOT: belirleyici hemocyte sayıları, serbest hücreler sabit değildir ve hücreler tercihen larva yayımlandıktan sonra 30 dakika içinde, kısa bir süre diseksiyonu sonrası görüntülü gereken zaman. De ortamın optik düzlemleri boyunca odaklanarak teyit edilmelidir 10 dakika - Orta ve hücre özelliklerinin hacmine bağlı olarak, hücrelerin büyük çoğunluğunun 5 içinde yerleşmiş olacaktır. Ancak, kan hücrelerinin sadece bir kısmını, bu zamana kadar slayt yüzeyine dikkate alınması gereken bir gerçeği yapıştırılır eğer hücre tespit tabanlı yaklaşımda için bu protokol değiştirereks. </li></ol></li></ol></li><li> Niceleme: <ol><li> Bir floresan mikroskobu (Şekil 2B, D, F) altında yerleşmiş hemocytes görüntü al. ImageJ yazılımı kullanarak hemocytes ölçümü ile izleyin. </li><li> ImageJ hücre sayım algoritması için görüntü hazırlayın: <ol><li> Iyi kullanan ImageJ Açık resim: → Açık → (dosyasını bulun ve seçin) Dosya. </li><li> Görüntü (ler) 8-bit veya 16-bit olduğundan emin olun. Image seçerek görüntünün eşiğini ayarlayın sonra ayarlayın ve seçin Eşik tıklayın. &quot;Eşik penceresi&quot; (Şekil 3A) gözlemleyin. </li><li> &quot;Karanlık Arka Plan&quot; seçeneğini işaretleyin. &quot;Kırmızı&quot; seçin ve görüntünün her hücre bir kırmızı nokta (gri tonlama görülecektir örtülü edilmemesi hücreler; Şekil 3B) ile işaretlenmiş kadar (siyah ok) Alt Eşik Seviye artırın. Alt Eşik gibibazı hücreler işaretlenmemiş olacak artar. Bu alt Eşik ayarlamak ne kadar için bir gösterge olabilir. NOT: Bazen hücre kümeleri çözülemeyen ve partikül sayacı biri olarak sayılacaktır. Bu gibi durumlarda, bir kümedeki hücre sayısı görüntüsünü inceleyerek (gerekirse yakınlaştırma) ve manuel sayım sayacı, bir taksitli kullanılarak tahmin edilebilir. Seçenek olarak ise, alt eşik hücre kümeleri çözmek için arttırılabilir; Bu manipülasyon kaynaklanan herhangi işaretsiz hücreler daha sonra bir taksitli sayacı kullanılarak sayılabilir. </li></ol></li><li> ImageJ kullanarak hücre sayısını analiz: <ol><li> Hücreler (Şekil 3C) saymak Parçacık Analyzer başlatın. Analiz seçip Parçacık Analiz tıklayınız. İsteğe bağlı parçacıkları algoritma sayısı (Şekil 3D) görmek için &quot;Kaplama Anahatları&quot; seçeneğini seçin. Alternatif olarak, bir birimin büyüklüğü ya da piksel alanı limitini ayarlamış (örn., Hücre, algoritma hücreler, vs.) bir yığın saymak. </li><li> Tamam&#39;a tıklayın. Sayımı (Şekil 3E) ile bir özet penceresi gözlemleyin. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Hemosit Rahatsızlık Deneyi <ol><li> Hemocytes seçeneğini larvaları rahatsız ve cam boncuklar (212-600 mikron) yaklaşık 0.5 g 2 ml mikrosantrifüj tüp yerleştirmek ve 0.5 ml su ekleyin. </li><li> 1 dakika hızda 10 at, elle, tüp Vortex. </li><li> Petri kabı içine mikrosantrifüj tüp içindekilerin dökülmesini ve bir fırça ile larva çekme cam boncuk larvaları alın. </li><li> Kurtarma fazı için, uçucu gıda küçük miktarlarda önceden hazırlanmış Petri tabaklarında larvaları yerleştirin. Larvalar 45 dakika ya da istenilen bir süre için hemocyte desen yeniden kurmak için izin verin. NOT: Onlar süreçte öldü gibi, hareketli durmuş herhangi larvaları atın. Ancak, genellikle l bakınittle hasarı vorteks 1 dakika sonra (aşağıda ve Ek Şekil 1). </li><li> Bölüm 1 &#39;de yukarıda tarif edildiği gibi bir iyileşme süresinden sonra, Boşaltma / Pençe Testi ile devam edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster.">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).</li><li>Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thicker+than+blood:+conserved+mechanisms+in+Drosophila+and+vertebrate+hematopoiesis.">Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis.</a> Dev Cell. 5, 673-690 (2003).</li><li>Wood, W., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+embryonic+haemocytes:+masters+of+multitasking.">Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).</li><li>Gold, K. S., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+for+the+two+myeloid+blood+cell+systems+in+vertebrates.">Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates.</a> Experimental hematology. 42, 717-727 (2014).</li><li>Makhijani, K., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+blood+cells+and+the+nervous+system:+Hematopoiesis+in+the+Drosophila+larva.">Of blood cells and the nervous system: Hematopoiesis in the Drosophila larva.</a> Fly. 6, 254-260 (2012).</li><li>Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peripheral+nervous+system+supports+blood+cell+homing+and+survival+in+the+Drosophila+larva.">The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva.</a> Development. 138, 5379-5391 (2011).</li><li>Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+hematopoiesis+in+Drosophila.">Postembryonic hematopoiesis in Drosophila.</a> Dev Biol. 230, 243-257 (2001).</li><li>Holz, A., Bossinger, B., Strasser, T., Janning, W., Klapper, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+origins+of+hemocytes+in+Drosophila.">The two origins of hemocytes in Drosophila.</a> Development. 130, 4955-4962 (2003).</li><li>Sieweke, M. H., Allen, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+stem+cells:+self-renewal+of+differentiated+macrophages.">Beyond stem cells: self-renewal of differentiated macrophages.</a> Science. 342, 1242974 (2013).</li><li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages.">Tissue-resident macrophages.</a> Nature immunology. 14, 986-995 (2013).</li><li>Bretscher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nimrod+transmembrane+receptor+Eater+is+required+for+hemocyte+attachment+to+the+sessile+compartment+in+Drosophila+melanogaster.">The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster.</a> Biology Open. 1-9, (2015).</li><li>Leitao, A. B., Sucena, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+sessile+hemocyte+clusters+are+true+hematopoietic+tissues+that+regulate+larval+blood+cell+differentiation.">Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation.</a> eLife. , (2015).</li><li>Markus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sessile+hemocytes+as+a+hematopoietic+compartment+in+Drosophila+melanogaster.">Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4805-4809 (2009).</li><li>Babcock, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+blood+cells+function+as+a+surveillance+system+for+damaged+tissue+in+Drosophila+larvae.">Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 10017-10022 (2008).</li><li>Sinenko, S. A., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+Drosophila+tetraspanin,+Tsp68C,+suppresses+the+abnormal+proliferation+of+ytr-deficient+and+Ras/Raf-activated+hemocytes.">Increased expression of Drosophila tetraspanin, Tsp68C, suppresses the abnormal proliferation of ytr-deficient and Ras/Raf-activated hemocytes.</a> Oncogene. 23, 9120-9128 (2004).</li><li>Stramer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+wound+inflammation+in+Drosophila+embryos+reveals+key+roles+for+small+GTPases+during+in+vivo+cell+migration.">Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration.</a> J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).</li><li>Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+hemocyte-specific+enhancer-reporter+transgenes+for+the+analysis+of+hematopoiesis+in+Drosophila+Genesis.">New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila Genesis.</a> 47, 771-774 (2009).</li><li>Gajewski, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+crystal+cell-specific+enhancer+of+the+black+cells+prophenoloxidase+gene+in+Drosophila.">Identification of a crystal cell-specific enhancer of the black cells prophenoloxidase gene in Drosophila.</a> Genesis. 45, 200-207 (2007).</li><li>Lebestky, T., Chang, T., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Drosophila+hematopoietic+lineage+by+conserved+transcription+factors.">Specification of Drosophila hematopoietic lineage by conserved transcription factors.</a> Science. 288, 146-149 (2000).</li><li>Zettervall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+directed+screen+for+genes+involved+in+Drosophila+blood+cell+activation.">A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 14192-14197 (2004).</li><li>Shim, J., Mukherjee, T., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+sensing+of+systemic+and+nutritional+signals+by+haematopoietic+progenitors+in+Drosophila.">Direct sensing of systemic and nutritional signals by haematopoietic progenitors in Drosophila.</a> Nature cell biology. 14, 394-400 (2012).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+and+blood+cell+development+in+the+animal+kingdom.">Blood cells and blood cell development in the animal kingdom.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada, kantitatif tek Drosophila larva ikamet eden ve dolaşan kan hücrelerini kurtarmak ve bu iki hemocyte popülasyonlarının ölçmek için ilk yöntem açıklanmaktadır. Protokol görüntüleme ve otomatik hücre sayımı ile takip dolaşım yerleşik kan hücrelerinin ardışık salınmasını içerir. 60 dakika iyileşme süresi 6 - Larva ikamet hemocytes geçici, mekanik bozukluk dolaşıma büyük ölçüde 30 içinde ters olduğu bilinen bir süreç mobilize edilebilir. Bu duruma göre, bu protokol, iki şekilde test edildi: (1) larva ve larva gelişimi boyunca hemocytes dolaşan fraksiyonu için toplam hemocyte sayısı değerlendirerek, ve (2) deneysel olarak otomatik bir yöntem kullanılarak yerleşik hemocytes çıkartılmasından, doğruladı hemocyte lokalizasyonu ve resident hemocyte sayısı ve dolaşımdaki nüfusun sıkı ilişki. Buna ek olarak, yöntem tekrarlanabilirliği co ile gösterilmiştirbiyolojik çoğaltır iki veri setleri mparing. Geçmişte, laboratuvarlar larva hemocytes 6,13,21 ölçmek için teknikler bir dizi kullandık. Bu protokol almak ve kolayca adapte platform sağlayan, Drosophila larva ikamet eden ve dolaşan kan hücre popülasyonlarının ölçmek için ortak bir standart kurar. Açıklanan yöntem ikamet hemocytes ve mikroçevresinin rolü odaklanmak çalışmalar için önemlidir, Hematopoetik 4-6 Cepler ve floresan proteini vahşi tip transgen taşıyan Drosophila suşları ve genetiği değiştirilmiş arka incelemek için uygundur. Protokol aynı zamanda ikamet hemocytes ya da (4 gözden) toplam hemocyte sayısındaki değişim seferberliğini tetikleyen immün meydan okuma veya yaralanma ve genetik veya çevresel kaynaklı sinyalizasyon sonra hemocyte seferberlik odaklanmak çalışmalar için geçerlidir. Bu prematüre di durumlarda, belirtmek gerekir kiLenf bezi soy karşı embriyonik / larva ayırt fferentiation ve lenf bezinden hemocytes bırakma, kullanılan floresan hemocyte muhabiri ifadesi deseni ile sınırlı olabilir. Burada sunulan protokol görüntüleme canlı, floresan etiketli hemocytes dayanır. Gelecekte, bu immünsitokimya kullanarak, örneğin, tespit sonrasında serbest hücrelerin tespit edilmesini sağlamak için modifiye edilebilir. Yöntem, hemocytes alma ve işleme ex izin verdiğinden, bu durumda, iletişim kuralı yapışma inkübasyon sürelerini arttırarak ve bu konkanavalin A gibi, yapışkan kayıcı kaplaması ile, örneğin kan hücrelerinin bir yapışma sağlamak için adapte edilmesi gerekebilir in vivo, bu gelişim, hücre biyolojik ve biyokimyasal çalışmalar geniş bir fayda sağlayacaktır. Yerleşik ve dolaşımdaki kan hücreleri tüm Drosophila postembriyonik gelişim evreleri ve diğer omurgasızlar 22 suggesti sırasında bulunanng, bu yöntemin Adaptasyonun Drosophila larva hematopoietik sistem dışına çalışmalarda geniş bir fayda sağlayacaktır.

Omurgasız modelinde Drosophila melanogaster Araştırma doğal bağışıklık 1 keşif sürdü ve 2-4. Drosophila hematopoiezis menşei embriyonik / larva hemocytes soyu, ayrılabilir kan hücresi gelişiminin çeşitli yönlerini anlaşılmasını kolaylaştırdı Embriyo ve larva genişletmek ve lenf bezinin soy 4,5 Hemocytes. Burada, Drosophila larva çoğunlukla plazmatositler (makrofajlar) ve birkaç kristal hücreler 4 içermektedir larva / embriyonik hemocytes soyu, odaklanan bir protokol mevcut. Epidermis ve larva vücut duvarının 5,6 kas tabakaları arasında yer alan larva olarak, embriyo hemocytes devam ve kolonize segmental tekrarlanan ve terminal Hematopoetik cepler (HPS). Kendini yenileyen makrofajlar 6, lokal doku mikroçevrelerde 6 onların baskın ikametgah olarak doğaları dayanarakGelişme 6,8 edilirken ortaya çıkan erken kan hücreleri 7 ve bunların soyu, bu kan hücre popülasyonu omurgalı kendini yenileyen doku makrofajları, son türlerin 4,9,10 çeşitli tespit bağımsız myeloid benzer kabul edilir. Bununla birlikte, Drosophila, bir kısmı veya yerleşik hücrelerin tümü, aynı zamanda plastisite gibi kristal hücreleri 11,12 gibi diğer kan hücre tiplerinin sebep göstermek. Larva hemocytes ağırlıklı ikamet (sapsız) vardır, ancak çeşitli HPs arasında dinamik kararlı durumdadır. 3. instar larva pupariation 5-7 yaklaşırken Onlar kademeli özellikle dolaşıma salınır. Hemolimf 4,6,13 içine Bağışıklık geri dönüşümlü ikinci durumda zorluklar, erken yaralanma veya mekanik bozukluk kurşun, yerleşik hemocytes seferberlik. Önceki çalışmalar ikamet önerdi ve dolaşımdakiLarva hemocytes aynı soydan gelen, ancak bunların yapışkan veya hedef arama özellikleri 6,7,13,14 farklıdır. Yerleşik hemocytes karşı dolaşan seçici izolasyonu Periferik Sinir Sistemi duyusal nöron kümeleri epidermis ve kas tabakaları ile kaplı ve ayrıca liman olan HP&#39;nin 6. Drosophila larva HPS gelen endüktif ipuçlarına maruz kaldıkları öne ikamet hemocyte nüfusun çoğalması düzeyi yüksek saptandı (PNS) ve karaciğer fonksiyon oenocytes 6 benzeyen. İşlevsel, mutant ve genetik hücre ablasyon deneyler HPS&#39;de bulunan duyusal nöronlar larva hemocytes 6 trofik hayatta kalma ve lokalizasyonu destekleyen olduğunu göstermiştir. Burada belirli bir izolasyon ve ikamet ölçümü ve tek Drosophila larva dolaşan hemocytes ve mekanik hemocyte seferberlik için bir protokol için bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem, ex vivo kullanılabilirhemocytes çalışması ve ayrıca, pupa ve erişkin ve diğer omurgasız sistemleri gibi diğer Drosophila gelişim aşamalarına uyarlanabilir. Önceki çalışmalar yerleşik ve dolaşımdaki hemocytes ayırt etmedi beri, bu protokol ikamet kan hücrelerinin çalışma için ortak bir standart sağlar ve omurgasız kan hücre araştırmalarının tutarlılığını artırmak için yardımcı olacak. İlk olarak, Hemosit Taşma Payı / Pençe Deneyi diferansiyel izolasyonu ve floresan protein-işaretlenmiş ikamet ve tek Drosophila larva hemocyte popülasyonlarının dolaşan otomatik ölçümü açıklar; protokol, düzenli ve kiremit tarama donanımlı mikroskopları için iki seçenek (Şekil 1) sağlar. Bunun bir sonucu olarak, dolaşımdaki hemocytes yüzdesi ve larva için hemocytes sayısı elde edilir. Yöntem kan hücresinin içinde floresan protein ifade transgenik Drosophila larva dayanırNüfus. Hemocyte sürücüsü veya muhabir seçimi kan hücrelerinin nüfusu görüntülenmiştir ve sayısal olan, yani sonucunu belirler. Ağırlıklı olarak etiketlemek için makrofajlar ikamet ve Drosophila larva 6 dolaşımdaki hemocyte nüfusunun büyük çoğunluğunu oluşturan (plazmatositler), uygun transgenler ile (HML Δ-DsRed 6, HmlΔ -GAL4 15, PXN -GAL4 16, CRQ-GAL4 dahil H. Agaisse 16) ya da yiyici-GAL4 17; Kristal hücrelerinin nispeten küçük nüfusu etiketlemek için uygun hatlar BcF6-OBP ve GFP 18 veya (J. Pollock 19) tarafından lz-GAL4 vardır; etiketleme lamellocytes için, özel bir hücre tipi ağırlıklı olarak bağışıklık zorluklar ve yaralanma 13 tarafından uyarılan, örneğin, MSNF9mo mCherry 17 kullanılabilir. Bazı transgenik sürücüler farklı kan bir dizi olarak ifade edilmiştirTüm larva kan hücreleri 20 yaklaşık% 80 etiketler GAL4 20, - örneğin O gibi hücreler ve progenitorlar,. GAL4 sürücüler kullanıldığı yerlerde UAS-GFP veya başka bir floresan protein UAS-transgen ile kombinasyon gereklidir tüm durumlarda lütfen unutmayınız. Sonuçlar bölümünde, bu yöntem, larva gelişimi boyunca, kan hücre sayısı ve dolaşım davranışını izlemek için kullanılır. (- 60 dak 30) 6 İkincisi, Hemosit Rahatsızlık Deneyi sonradan yeniden yapışması ve ev HPS sınırlı bir zaman çerçevesinde hemocytes yeteneği değerlendirilmesine olanak dış manipülasyon tarafından ikamet hemocytes ayırmak için tasarlanmış bir önceki adımı açıklanır. Tipik olarak, bu deney, her bir larva için hemocytes dolaşımdaki yüzdesini belirlemek için Boşaltma / Pençe Tahlili tarafından takip edilir. Biz vorteksleme wit göre rahatsızlık kullanan bu deneyi (Şekil 1D) için basitleştirilmiş bir protokol mevcuth cam boncuk, yerine boya fırçası ile tek larva manipülasyon önce 6 açıklandığı gibi. Sonuçlar bölümünde, bu deney hemolimf bu geçici müstakil hemocytes şamandıra göstermek için kullanılır ve hemocytes dolaşan fraksiyonunda elde edilebilir. Tahlil örn, çeşitli genetik geçmişleri veya stimülasyon koşullarının karşılaştırılması ikamet sitelere kendi hedef arama / yapışma hemocytes farklılıkları ölçmek için de yararlıdır. Bu mekanik manipülasyon geri çevrilebilir bir süreç yansıtır ve genellikle kısa bir süre 4,13 geri dönüşümlü olmayan enfeksiyon-veya hasar kaynaklı ikamet hemocyte seferberlik farklı olduğunu unutmayın.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>6cm/9cm Petri dishes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>One for each genotype to be evaluated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water squirt bottle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal spoon/spatula</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thin paintbrush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>e.g. a &#34;liner&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cavity dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PAP pen: Super PAP PEN IM3580</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g. 2mm squares.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Moist chamber</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#8217;s Drosophila cell culture media</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold block</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Two 1ml syringes with needles (27G &#189;)</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>For dissections.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2mm)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass beads, 212-600 micron</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Eppendorf tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>One per genotype evaluating</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Mixer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. Suitable transgenes include: Hml&#916;-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or Hml&#916;-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence dissecting microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted fluorescence microscope with camera attachment</td>
			<td>Leica or Keyence</td>
			<td></td>
			<td>With or without tile scanning function (eg. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assaying blood cell populations of the drosophila melanogaster larva

Omurgalılarda, hematopoez endüktif mikroçevrelerde (nişler) tarafından düzenlenir. Benzer şekilde, omurgasız bir model organizma Drosophila melanogaster, larva Hematopoietik cepler (HPS) olarak bilinen indüktif mikroçevrelerde kendini yenileyen makrofaj özellikle gelişimi ve kan hücreleri (hemocytes) düzenlenmesi için anatomik bölgelerden olarak tespit edilmiştir. HPS olan segmental da periferal sinir sisteminin duyusal nöronlar ihtiva larva epidermis ve kas tabakaları arasındaki cepler tekrarladı. Larva olarak, ikamet (sesil) hemocytes, anti-apoptotik, yapıştırıcı ve bu duyusal nöronlar gelen çoğalma kuyruklar ve astar kas ve epitel katman olarak HPS potansiyel olarak diğer bileşenleri maruz kalmaktadır. HPs yakıtlardan normal gelişim, yerleşik hemocytes kademeli olarak gevşetmek sırasında mo sürümünde doruğa dolaşan hemocytes nüfusu,metamorfoz başında ikamet hemocytes st. Bağışıklık saldırılar, fiziksel yaralanma ya da mekanik rahatsızlık dolaşıma ikamet hemocytes prematüre salınımını tetikler. Ikamet yerleri ve dolaşım arasındaki larva hemocytes anahtarı seçici ayırmak ve tek Drosophila larva kan hücrelerinin bu iki popülasyonlarının ölçmek için ortak bir standart / prosedür gereksinimini artırmaktadır. Buna göre, bu protokol bırakın ve tek larva yerleşik ve dolaşımdaki hemocytes ölçmek için otomatik bir yöntem açıklanır. Yöntem, ex vivo yaklaşımlar kolaylaştırır ve Drosophila aşamalar ve diğer omurgasız organizma, çeşitli hizmet etmek için adapte edilmiş olabilir.

Tarif edilen yöntemlerin tipik sonuçlarını göstermek için, öncelikle larva hemocyte numaralarının ilerlemesini ve larva gelişim boyunca kendi ikamet (Şekil 4) anahat Hemosit Sızdırma / Pençe Testi kullanılmıştır. Yerleşik ve larva hemocyte popülasyonları dolaşan tek larva izole edilmiştir (HML Δ-GAL4, UAS-GFP, O-GAL4 etiket engin larva hemocytes çoğunluğu) ve ImageJ kullanılarak ölçülebilir. Larva tabur (~ 48 saat AEL ya da 1 instar), 2,5 mm (~ 80 saat AEL ya da geç 2. evre) ve 3,5 mm (~ 96 saat AEL veya 3. instar) incelendi (Şekil 4) 1.2 mm boyutlu . Hemocyte numaraları ilişkilendirilmesi ve boya lekeli larva 7 ve larva manikür 6 ile floresan protein etiketli hemocytes canlı sayım, ışık mikroskobu dayalı önceki tahminler aşan, larva gelişimi boyunca genişletti. 1. insDolaşımdaki hemocytes kesir giderek daha önceki yayınlarda 6,7 ile tutarlı larva gelişim kursu (Şekil 4B, C), üzerinde artarken tar larvaları hemen hemen tüm hemocytes, ikamet idi. Sonraki biz yöntemi sadakatle yerleşik ve dolaşımdaki nüfus arasındaki hemocytes geçişi izler olup olmadığını incelemiştir. Yerleşik hemocytes geçici mekanik bozukluk ile ayrılabilir ve onların yerleşik sitelerine kendiliğinden 6-uymak yeniden bu olayın yararlanan biz Hemosit Rahatsızlık Testi anlatıldığı gibi cam boncuk ile karıştırın ikamet hemocytes dağıldılar. Nitekim, larvaların mekanik bozukluk ikamet hemocytes gideri (Şekil 5) hemocytes dolaşımdaki nüfus dramatik bir artışa yol açmıştır. 45 dakikalık bir geri kazanım süresinden sonra, hemocytes büyük ölçüde görsel inceleme ile ve aynı hem kendi yapışan durumuna dönendolaşan hücrelerin değerlendirmeden geçirilmiş yüzdesi (Şekil 5D, E). Beklendiği gibi, toplam hemocyte numaraları dolaşan ve yerleşik nüfus arasındaki hemocytes vardiya rağmen, zamanla sabit kalmıştır. Birkaç ek hususlar dikkate alınmıştır. Cam boncuklar, çeşitli zaman aralıklarında (1, 5, 20 dk), tripan mavisi (Sigma) varlığında yapıldı ile vorteks, ana doku hasarına neden olmadığını doğrulamak için, vorteks. 20 dakika süre ile girdap pozitif kontrol (Ek Şekil 1) olarak kullanılan iğne ilmek kaynaklanan hasar benzeyen, hasar küçük alanlarda neden Her iki 1 ve 5 dakika süre ile girdap, belirgin bir doku bozulmasına neden olmamıştır. Epidermis ya da manikür zarar vermeden diğer dokuların iç hasar göz ardı edilemez, ancak bu senaryo larva bütünlük ödün değildi düşündüren, 1 dakika ve 5 dakika tedavi edilen larva yeniden yapıştırılmış beklenen desen ve zaman çerçevesi içinde hemocytes olarak değil zor görünüyord (Ek Şekil 1). Bunun aksine, larva yeniden yapışma eksikliği muzdarip 20 dakika süre ile girdaplandı, ve daha önce 14 tarif edildiği gibi daha da epidermal yara sitelere hemocytes dolaşımdaki eki göstermemiştir. Son olarak, yöntemin tekrarlanabilirliği göstermek için, biz ayrı denemecileri tarafından yapılmıştır Yukarıdaki iki deneylerin, 2.5 mm larvalarının biyolojik çoğaltır karşılaştırıldı. Ek, Şekil 2 &#39;de gösterildiği üzere, her iki kohort karşılaştırılabilir toplam larva için hemocytes sayıları ve dolaşımdaki hemocytes yüzdesi gösterdi. Student t test yöntemi tekrarlanabilir ve geniş çapta uygulanabilir olduğunu düşündüren, istatistiksel olarak anlamlı farklılık gösterdi. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1. Hemosit Bleed / kazıyın ve Bozulma Testi s<html> etup ve şema. (A) Tek Resim Slayt Ayarı: 5X amacı ile görüntüleme için beş 2mm kareler (B) Çini Tarama Slayt Kurulum:. Görüntüleme kanın dört 3mm kareler / çini tarama mikroskobu ile ≤2.5 mm larvalarının sıyrıklar. Görüntüleme için önerilen hedefler 5X veya 10X. (C) / ImageJ kullanarak kazıyın Deneyi şematik ve elde edilen sayımsal havasını alın. (D) Bozucu Tahlili olan hemocyte desen mekanik cam boncuklar ile larvaların vorteks bozulur. Larvalar hemocytes Hematopoietik cepler yeniden bağlı sırasında 45 dakikalık bir süre boyunca iyileşmesine izin verilir. Hemocytes yapışkan özellikleri rahatsızlık sonrası dolaşımdaki hemocytes yüzdesini miktarının, bu yöntemle tespit edilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> yolları &quot;&gt; <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52733/52733fig2highres.jpg" width="700" /> Şekil 2. Sızdırma / Pençe Deneyi dolaşan ve yerleşik hemocytes serbest bırakmak için. (A) larva kanamaya için, larva posterior ve anterior ucunda ventral kesi (makas sembol) yapılır. (B) Hemocytes kesiler dışarı akacak ve slayt yüzeyinde çözecek dolaşımda. (C) Lenf bezi (LG) bulunan ve onu delinmesiyle olmadan sıkıştırdılar edilir. Resident hemocytes batıcı ve / veya bir iğne ile larva kazınarak serbest bırakılır. Slaytta (D) Yerleşik hemocytes. (E, F) ikamet eden bütün hemocytes bırakılıncaya kadar kazıyın işlem tekrarlanır. Sağlam lenf bezi içeren larva karkas geride. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 3. ImageJ kullanarak hemocytes miktarının otomatik. (A, B) ImageJ bir hemocyte görüntü dosyası açtıktan sonra, alt eşik seviyesi görüntüdeki tüm hücreler için hesap ayarlanır. (C, D) Parçacıklar hücre piksel boyutu, dairesellik ve sonuç okuma ayar gerektirir Analiz biçimi (örneğin, Yerleşimi Anahatlar). (E) hemocytes sayısını gösteren Özeti penceresi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52733/52733fig4highres.jpg" width="700" /> Şekil 4. Temsilcisi Sonuçlar (1). Hemocyte numarası ve üzerinde ikamet devlet<html> Larva gelişme elbette. (A) kullanılan larva evrelerinin Bakış; 1. evre (48 sa AEL; ~ 1,2 mm uzunluk); 2. evre (80 saat AEL, 2.5 mm uzunluğunda); 3. instar (96 saat AEL; ~ 3.5 mm uzunluğunda). Genotip HML Δ-GAL4, UAS-GFP olduğu; O-GAL4. Aşamaları larva mouthhooks değerlendirerek teyit edildi. İlgili larva aşamasında dolaşan ve yerleşik hemocyte numaraları (B) Bar diyagramı. Hemocytes dolaşımdaki (C) yüzdesi. Dolaşımdaki hemocytes kesir larva gelişimi boyunca orantısız artar unutmayın. (D) Toplam hemocytes, larva başına dolaşan ve yerleşik hemocytes toplamından kaynaklanan. Hemocytes Silme / Pençe yöntemi kullanılarak ölçüldü; n ≥ 6 larva / durumu, hata çubukları, standart sapma, 3 bağımsız kopya deneylerle doğrulanmıştır bulgular.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52733/52733fig5highres.jpg" width="700" /> Şekil 5. Temsilcisi Sonuçlar (2). Hemocyte ikamet mekanik rahatsızlık etkileri. (AC) öncesi ve 45 dakika geri izledi cam boncuklar ile vorteks sonra larva Örnek (A) Hayır rahatsızlık kontrolü.; hemocytes Hematopoietik Cepler lokalizedir (B) kesintiye hemocyte desen 0 dak cam boncuklar ve su ihtiva eden bir süspansiyona larvaları vorteks sonrası iyileşme sonrası rahatsızlık 45 dakika (C) Hemosit şablonu..; Birçok hemocytes Hematopoetik Cepler taşındı var; genişletilmiş dorsal-damar ilişkili kümeleri ve erken post-rahatsızlık birikimi (oklar) baskın siteler dorsal çizgili not edin. Genotip HML Δ-GAL4, UAS-GFP olduğunu; O-GAL4 x yw. Boşaltma / Pençe yöntem ile nicelleştirilmiştir hemocytes dolaşımdaki (D) oranı. (E) toplam hemocytes, larva için sirkülasyon ve yerleşik hemocytes toplamından elde edilir. n ≥ 4 larva / durumu, hata çubukları, standart sapma, 3 bağımsız kopya deneylerle doğrulanmıştır bulgular. Student t-testi önemini teyit etmek için, NS (önemli değil), ** (p ≤ 0.05), ** (0.01 ≤ p). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig5highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva at JoVE.com

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

assaying-blood-cell-populations-of-the-drosophila-melanogaster-larva

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

12.2K Görüntüleme.  University of California San Francisco. Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Video: Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is a model for understanding microbial interactions with animal hosts, facilitated by approaches to rear large sample sizes of Drosophila under microorganism-free (axenic) conditions, or with defined microbial communities (gnotobiotic). This work outlines a method for collection of Drosophila embryos, hypochlorite dechorionation and sterilization, and transfer to sterile diet. Sterilized embryos are transferred to sterile diet in 50 ml centrifuge tubes, and developing larvae and adults remain free of any exogenous microbes until the vials are opened. Alternatively, flies with a defined microbiota can be reared by inoculating sterile diet and embryos with microbial species of interest. We describe the introduction of 4 bacterial species to establish a representative gnotobiotic microbiota in Drosophila. Finally, we describe approaches for confirming bacterial community composition, including testing if axenic Drosophila remain bacteria-free into adulthood.

Rearing the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions

A method for rearing Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions is presented. Fly embryos are dechorionated in sodium hypochlorite, transferred aseptically to sterile diet, and reared in closed containers. Inoculating diet and embryos with bacteria leads to gnotobiotic associations, and bacterial presence is confirmed by plating whole-body Drosophila homogenates.

Meyve Fly Yetiştirme<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Aksenik ve gnotobiyotik Koşullarında

The influence of microbes on myriad animal traits and behaviors has been increasingly recognized in recent years. The fruit fly Drosophila melanogaster is ...

Gelişim Biyolojisi

Isolation of Perivascular Multipotent Precursor Cell Populations from Human Cardiac Tissue

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their anatomical tissue location remained unclear. The recent discovery of defined perivascular and MSC cell marker expression by perivascular cells in multiple tissues by our group and other researchers has provided an opportunity to prospectively isolate and purify specific homogenous subpopulations of multipotent perivascular precursor cells. We have previously demonstrated the use of fluorescent activated cell sorting (FACS) to purify microvascular CD146+CD34- pericytes and vascular CD34+CD146- adventitial cells from human skeletal muscle. Herein we describe a method to simultaneously isolate these two perivascular cell subsets from human myocardium by FACS, based on the expression of a defined set of cell surface markers for positive and negative selections. This method thus makes available two specific subpopulations of multipotent cardiac MSC-like precursor cells for use in basic research and/or therapeutic investigations.

Human cardiac tissue harbours multipotent perivascular precursor cell populations that may be suitable for myocardial regeneration. The technique described here allows for the simultaneous isolation and purification of two multipotent stromal cell populations associated with native blood vessels, i.e. CD146+CD34- pericytes and CD34+CD146- adventitial cells, from the human myocardium.

İnsan Kardiyak Doku perivasküler Multipotent Öncü hücre popülasyonlarının izolasyonu

Multipotent mesenchymal stem/stromal cells (MSC) were conventionally isolated, through their plastic adherence, from primary tissue digests whilst their ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

Diseksiyon ve mantar vücut immünfloresan boyama ve yetişkin Drosophila melanogaster beynindeki nöronlar Photoreceptor

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the number of novel cell lines is expected to increase. The DGRC aims to familiarize researchers with using Drosophila cell lines as an experimental tool to complement and drive their research agenda. Procedures for working with a variety of Drosophila cell lines with distinct characteristics are provided, including protocols for thawing, culturing, and cryopreserving cell lines. Importantly, this publication demonstrates the best practices required to work with Drosophila cell lines to minimize the risk of contaminations from adventitious microorganisms or from other cell lines. Researchers who become familiar with these procedures will be able to delve into the many applications that use Drosophila cultured cells including biochemistry, cell biology and functional genomics.

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Drosophila cell lines are important reagents for both fundamental and biomedical research. This article provides protocols for thawing, subculturing, and the cryopreservation of commonly used Drosophila cell lines to assist researchers in incorporating the use of these reagents in their research.

Çözdürme, kültür ve Drosophila hücre hatları Cryopreserving

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor chemicals (EDCs). These chemicals may alter the normal balance of endocrine systems and lead to adverse effects, as well as an increasing number of hormonal disorders in the human population or disturbed growth and reduced reproduction in the wildlife species. For some EDCs, there are documented health effects and restrictions on their use. However, for most of them, there is still no scientific evidence in this sense. In order to verify potential endocrine effects of a chemical in the full organism, we need to test it in appropriate model systems, as well as in the fruit fly, Drosophila melanogaster. Here we report detailed in vivo protocols to study endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on the fecundity/fertility, developmental timing, and lifespan of the fly. In the last few years, we used these Drosophila life traits to investigate the effects of exposure to 17-&#945;-ethinylestradiol (EE2), bisphenol A (BPA), and bisphenol AF (BPA F). Altogether, these assays covered all Drosophila life stages and made it possible to evaluate endocrine disruption in all hormone-mediated processes. Fecundity/fertility and developmental timing assays were useful to measure the EDC impact on the fly reproductive performance and on developmental stages, respectively. Finally, the lifespan assay involved chronic EDC exposures to adults and measured their survivorship. However, these life traits can also be influenced by several experimental factors that had to be carefully controlled. So, in this work, we suggest a series of procedures we have optimized for the right outcome of these assays. These methods allow scientists to establish endocrine disruption for any EDC or for a mixture of different EDCs in Drosophila, although to identify the endocrine mechanism responsible for the effect, further essays could be needed.

Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster

Endocrine disruptor chemicals (EDCs) represent a serious problem for organisms and for natural environments. Drosophila melanogaster represents an ideal model to study EDC effects in vivo. Here, we present methods to investigate endocrine disruption in Drosophila, addressing EDC effects on fecundity, fertility, developmental timing, and lifespan of the fly.

Drosophila melanogaster endokrin bozulma test yöntemleri

In recent years there has been growing evidence that all organisms and the environment are exposed to hormone-like chemicals, known as endocrine disruptor ...

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Drosophila melanogaster Kan-beyin Bariyer Bütünlüğü için Tahse

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Capturing the Cardiac Injury Response of Targeted Cell Populations via Cleared Heart Three-Dimensional Imaging

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in cardiac injury, primarily in the form of an acute myocardial infarction. With little resilience following injury, the once healthy cardiac tissue will be replaced by fibrous, non-contractile scar tissue and often be a prelude to heart failure. To identify novel treatment options in regenerative medicine, research has focused on vertebrates with innate regenerative capabilities. One such model organism is the neonatal mouse, which responds to cardiac injury with robust myocardial regeneration. In order to induce an injury in the neonatal mouse that is clinically relevant, we have developed a surgery to occlude the left anterior descending artery (LAD), mirroring a myocardial infarction triggered by atherosclerosis in the human heart. When matched with the technology to track changes both within cardiomyocytes and non-myocyte populations, this model provides us with a platform to identify the mechanisms that guide heart regeneration. Gaining insight into changes in cardiac cell populations following injury once relied heavily on methods such as tissue sectioning and histological examination, which are limited to two-dimensional analysis and often damage the tissue in the process. Moreover, these methods lack the ability to trace changes in cell lineages, instead providing merely a snapshot of the injury response. Here, we describe how technologically advanced methods in lineage tracing models, whole organ clearing, and three-dimensional (3D) whole-mount microscopy can be used to elucidate mechanisms of cardiac repair. With our protocol for neonatal mouse myocardial infarction surgery, tissue clearing, and 3D whole organ imaging, the complex pathways that induce cardiomyocyte proliferation can be unraveled, revealing novel therapeutic targets for cardiac regeneration.

Cardiomyocyte proliferation following injury is a dynamic process that requires a symphony of extracellular cues from non-myocyte cell populations. Utilizing lineage tracing, passive CLARITY, and three-dimensional whole-mount confocal microscopy techniques, we can analyze the influence of a variety of cell types on cardiac repair and regeneration.

Temizlenmiş Kalp Üç Boyutlu Görüntüleme ile Hedefhücre Popülasyonlarının Kardiyak Yaralanma Yanıtının Yakalanması

Cardiovascular disease outranks all other causes of death and is responsible for a staggering 31% of mortalities worldwide. This disease manifests in ...

Generation of a Human iPSC-Based Blood-Brain Barrier Chip

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the blood that can disrupt delicate brain function. As such, the BBB is a major obstacle to the delivery of therapeutics to the CNS. Accumulating evidence suggests that the BBB plays a key role in the onset and progression of neurological diseases. Thus, there is a tremendous need for a BBB model that can predict penetration of CNS-targeted drugs as well as elucidate the BBB&#39;s role in health and disease.
We have recently combined organ-on-chip and induced pluripotent stem cell (iPSC) technologies to generate a BBB chip fully personalized to humans. This novel platform displays cellular, molecular, and physiological properties that are suitable for the prediction of drug and molecule transport across the human BBB. Furthermore, using patient-specific BBB chips, we have generated models of neurological disease and demonstrated the potential for personalized predictive medicine applications. Provided here is a detailed protocol demonstrating how to generate iPSC-derived BBB chips, beginning with differentiation of iPSC-derived brain microvascular endothelial cells (iBMECs) and resulting in mixed neural cultures containing neural progenitors, differentiated neurons, and astrocytes. Also described is a procedure for seeding cells into the organ chip and culturing of the BBB chips under controlled laminar flow. Lastly, detailed descriptions of BBB chip analyses are provided, including paracellular permeability assays for assessing drug and molecule permeability as well as immunocytochemical methods for determining the composition of cell types within the chip.

The blood-brain barrier (BBB) is a multicellular neurovascular unit tightly regulating brain homeostasis. By combining human iPSCs and organ-on-chip technologies, we have generated a personalized BBB chip, suitable for disease modeling and CNS drug penetrability predictions. A detailed protocol is described for the generation and operation of the BBB chip.

İnsan iPSC Tabanlı Kan-Beyin Bariyer Chip Üretimi

The blood brain barrier (BBB) is formed by neurovascular units (NVUs) that shield the central nervous system (CNS) from a range of factors found in the ...

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a well-characterized model organism, has benefited from the use of light and electron microscopy to understand gene function at the level of cells and tissues. The application of imaging platforms that allow for an understanding of gene function at the level of the entire intact organism would further enhance our knowledge of genetic mechanisms. Here a whole animal imaging method is presented that outlines the steps needed to visualize Drosophila at any developmental stage using microcomputed tomography (&#181;-CT). The advantages of &#181;-CT include commercially available instrumentation and minimal hands-on time to produce accurate 3D information at micron-level resolution without the need for tissue dissection or clearing methods. Paired with software that accelerate image analysis and 3D rendering, detailed morphometric analysis of any tissue or organ system can be performed to better understand mechanisms of development, physiology, and anatomy for both descriptive and hypothesis testing studies. By utilizing an imaging workflow that incorporates the use of electron microscopy, light microscopy, and &#181;-CT, a thorough evaluation of gene function can be performed, thus furthering the usefulness of this powerful model organism.

Whole Animal Imaging of Drosophila melanogaster using Microcomputed Tomography

A protocol is presented that allows for the visualization of intact Drosophila melanogaster at any stage of development using microcomputed tomography.

Mikro bilgisayarlı Tomografi kullanılarak Drosophila melanogaster'ın Tüm Hayvan Görüntülemesi

Biomedical imaging tools permit investigation of molecular mechanisms across spatial scales, from genes to organisms. Drosophila melanogaster, a ...

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larvalarından Canlı Beyin Eksplantlarının Görüntülenmesi

Live-Cell Imaging of Drosophila melanogaster Third Instar Larval Brains

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a differentiating ganglion mother cell (GMC), which will undergo one additional division to give rise to two neurons or glia. Studies in NBs have uncovered the molecular mechanisms underlying cell polarity, spindle orientation, neural stem cell self-renewal, and differentiation. These asymmetric cell divisions are readily observable via live-cell imaging, making larval NBs ideally suited for investigating the spatiotemporal dynamics of asymmetric cell division in living tissue. When properly dissected and imaged in nutrient-supplemented medium, NBs in explant brains robustly divide for 12-20 h. Previously described methods are technically difficult and may be challenging to those new to the field. Here, a protocol is described for the preparation, dissection, mounting, and imaging of live third-instar larval brain explants using fat body supplements. Potential problems are also discussed, and examples are provided for how this technique can be used.

Yazar Gündemi: Asimetrik Hücre Bölünmesi Dinamiğinin Araştırılması: Drosophila Larva Beyin Eksplantlarının Canlı Görüntülenmesi İçin Bir Protokol 

Here, we discuss a workflow to prepare, dissect, mount, and image live explant brains from Drosophila melanogaster third instar larvae to observe the cellular and subcellular dynamics under physiological conditions.

Drosophila melanogaster Üçüncü Instar Larva Beyinlerinin Canlı Hücre Görüntülemesi

Drosophila neural stem cells (neuroblasts, NBs hereafter) undergo asymmetric divisions, regenerating the self-renewing neuroblast, while also forming a ...