Biz sinek hisse senetleri için Jesper Kronhamn ve Dan Hultmark, Michael Galko ve Bloomington Menkul Kıymetler Merkezi&#39;ne teşekkür ederiz. Istatistiksel analiz ile tavsiye için Courtney Onodera özel teşekkürler. Biz yazının eleştirel okuma Katrina Altın ve Kalpana Makhijani, Katrina Altın, Derynck laboratuvar üyelerine ve el yazması üzerinde tartışma ve yorumlar için Nystul laboratuvar üyelerine teşekkür ederim. Bu çalışma Atılım Biyomedikal Araştırma (PBBR), Geniş Merkezi, Hellman Vakfı, Amerikan Kanser Derneği RSG DDC-122595, Amerikan Kalp Derneği 13BGIA13730001, Ulusal Bilim Vakfı 1.326.268, Sağlık 1R01GM112083-01 National Institutes ve için UCSF Programı hibe ile desteklenmiştir (KB) 1R56HL118726-01A1.

1. Hemosit Sızdırma / Pençe Deneyi <ol><li> Slaytların hazırlanması: <ol><li> Karo tarama fonksiyonu olmayan Mikroskop Seçenek 1: Her larva analiz edilebilmesi için, mikroskop alan görüş alanına karşılık gelen 2 mm&#39;lik kareler her yaklaşık 5 Pap-kalem kuyuları ile tek cam slayt hazırlamak; Her bir (Şekil 1A) S2 ortam 10 ul - yaklaşık 5 ekleyin. Kurumasını önlemek için kuyu nemli odasında slaytlar tutun. </li><li> Karo tarama fonksiyonu ile Mikroskop Seçenek 2: Her larva analiz edilebilmesi için, ~ 3 3 4 Pap-kalem kuyuları ile tek cam slayt hazırlamak - 4 mm kareler her; Her bir oyuğa (Şekil 1B) S2 ortam 20 ul - yaklaşık 15 ekleyin. Kurumasını önlemek için kuyu nemli odasında slaytlar tutun. NOT: kuyu yukarıda önerilen sayıda ~ 2.5, larva başına en fazla 3.000 hemocytes toplamları (geç 2. evre larvaları için yeterli - larv çoğunluğu etiketleme 3 mm uzunluk, transgenal kan hücreleri). Büyük kan hücresi sayıları değerlendirirken, daha kuyular fazla kalabalığı önlemek için gerekli olabilir. </li></ol></li><li> Larva Koleksiyonu: <ol><li> Bir Petri kabı içine larva ve floş larvaları içeren bir sinek şişenin içine su fışkırtma veya Petri kabı içine larvaları içeren bazı gıda kepçe ve bir bücür şişe kullanılarak su ile seyreltin. </li><li> Yavaşça boya fırçası yardımıyla Petri kabı dışarı larvaları almak ve bir boşluk tabak veya soğuk blokta bir slayt suya koyun. NOT: Larvalar su veya soğuk bir blokta sınırlı bir süre için muhafaza edilebilir; Larva ölümü ya hemocytes istenmeyen etkileri önlemek için, 45 dakika ya da daha az olan örnekler kullanılır. </li></ol></li><li> Diseksiyon: <ol><li> Soğuk metal blokta flöresanlı bir mikroskop altında larvaları seçin. İsterseniz boyutları ve görüntü larva ölçün. </li><li> (&quot;Bleed&quot;) hemocytes dolaşan İzolasyonu: <ol><li> Larvalar seçildikten sonra, ilk Pap-kalem de (Şekil 1C bir larva yerleştirin2A). </li><li> Larva posterior ve anterior uçları hem bir kesi yapmak için 2 temiz iğneler veya kesme makas ve forseps kullanın. Yerleşik hemocytes rahatsız etmemek için, larva ventral tarafta bu kesiler yapmak en iyisidir. Tutarlı sonuçlar için, her larva için aynı konumlarda kesiler yapmak. 1. evre larvaları için, (ventral anterior) 1 kesi yeterlidir. </li><li> Larva herhangi bir baskı ya da fiziksel ajitasyon (Şekil 2A) olmadan birkaç saniye kanamaya izin verin. NOT: Birden fazla larva üzerinde çalışan Eğer numunelerin bütünlüğünü etkileyebilecek çok uzun buz üzerinde larva tutarak önlemek için bir sonraki aşamaya geçmeden önce her biri için bu kesiler yapmak daha iyidir. </li><li> Yavaşça iğne veya forseps ile larva kaldırın ve kalan dolaşan hemocytes durulayın ikinci kuyunun içine daldırın. Bundan sonra, ikamet hemocytes sürümü ile izleyin. </li></ol></li><li&gt; yerleşik hemocytes izolasyonu (&quot;Pençe&quot;): <ol><li> Yavaşça sonraki kuyu (Şekil 2C) ile larva transferi. </li><li> Tipik larva ön ucundan yaklaşık 1/3 bulunduğu larva, lenf bezi tespit ve larva vücut duvarı ile dorsal hangi floresan olabilir. (Şekil 2C) delinmesiyle önlemek için lenf bezine mümkün olduğunca yakın bir iğne ile larva aşağı iğneleyerek ikamet hemocytes bırakırken lenf bezi kaçının. NOT: Lenf bezi hemocytes olgunlaşma larva hemocytes kıyasla gecikir ve farklılaştırılmış hemocytes floresan gazetecilere genç larvaların lenf bezinde bir sinyal göstermiyor olabilir normal gelişim sırasında. Bu durumlarda, daha az dikkat beklenen lenf bezi hemocytes tarafından ayırt floresan etiketli larva hemocytes hiçbir kirlenme olarak lenf bezi ödenmesi gerekmektedir. </li><li> Bir Boru açma yerleşik kan hücrelerini serbest bırakınkazıma ve / veya batıcı sürecine. Gerektiği gibi etkili lenf bezi yakın larva (yukarıya bakınız) ya da diğer vücut bölgeleri aşağı pin tek oya kullanın. Hemocytes ayırmak amacıyla, larva vücut duvarı (Şekil 2C, E) aracılığıyla görülebilir hemocytes kümelere de yumruk başka iğne kullanın. Hemocytes da bir sıyırma hareket salınabilir. Ancak, erken epidermisi yırtarak otomatik sayım daha zorlu yapabilir kan hücrelerinin, büyük kümeleri salabilir. NOT: larva yaşına ve genotipe bağlı olarak toplam hemocytes sayısı değişecektir. Tek hücre görüntü analizi zorlaştıracak kan hücreleri ile bir kuyu, bir aşırı kalabalık önlemek için çeşitli kuyular üzerinde, yukarıda tarif edilen salma işlemi dağıtın. </li><li> Birkaç hemocytes son karkas kalırsa, manuel taksitli sayacı (Şekil 2E) mikroskop ve kullanımı ile gözlem yoluyla bu hemocytes saymak. Sayma, s kolaylaştırmak içinAynı slayt temiz bir alanda karkas dantel ve optik uçaklarının sayısını azaltmak için ince sürede yayıldı. </li><li> Hücreler kuyuları görüntüleme önce yerleşmek (ama mutlaka bağlı değil) için 10 dk - diseksiyon tamamlandığında, 5 ila bekleyin. Kurumayı önlemek için nemli bir odaya slayt inkübe ve yerleşmiş hemocytes rahatsız olabilir slaytlar, kaba işleme kaçının. NOT: belirleyici hemocyte sayıları, serbest hücreler sabit değildir ve hücreler tercihen larva yayımlandıktan sonra 30 dakika içinde, kısa bir süre diseksiyonu sonrası görüntülü gereken zaman. De ortamın optik düzlemleri boyunca odaklanarak teyit edilmelidir 10 dakika - Orta ve hücre özelliklerinin hacmine bağlı olarak, hücrelerin büyük çoğunluğunun 5 içinde yerleşmiş olacaktır. Ancak, kan hücrelerinin sadece bir kısmını, bu zamana kadar slayt yüzeyine dikkate alınması gereken bir gerçeği yapıştırılır eğer hücre tespit tabanlı yaklaşımda için bu protokol değiştirereks. </li></ol></li></ol></li><li> Niceleme: <ol><li> Bir floresan mikroskobu (Şekil 2B, D, F) altında yerleşmiş hemocytes görüntü al. ImageJ yazılımı kullanarak hemocytes ölçümü ile izleyin. </li><li> ImageJ hücre sayım algoritması için görüntü hazırlayın: <ol><li> Iyi kullanan ImageJ Açık resim: → Açık → (dosyasını bulun ve seçin) Dosya. </li><li> Görüntü (ler) 8-bit veya 16-bit olduğundan emin olun. Image seçerek görüntünün eşiğini ayarlayın sonra ayarlayın ve seçin Eşik tıklayın. &quot;Eşik penceresi&quot; (Şekil 3A) gözlemleyin. </li><li> &quot;Karanlık Arka Plan&quot; seçeneğini işaretleyin. &quot;Kırmızı&quot; seçin ve görüntünün her hücre bir kırmızı nokta (gri tonlama görülecektir örtülü edilmemesi hücreler; Şekil 3B) ile işaretlenmiş kadar (siyah ok) Alt Eşik Seviye artırın. Alt Eşik gibibazı hücreler işaretlenmemiş olacak artar. Bu alt Eşik ayarlamak ne kadar için bir gösterge olabilir. NOT: Bazen hücre kümeleri çözülemeyen ve partikül sayacı biri olarak sayılacaktır. Bu gibi durumlarda, bir kümedeki hücre sayısı görüntüsünü inceleyerek (gerekirse yakınlaştırma) ve manuel sayım sayacı, bir taksitli kullanılarak tahmin edilebilir. Seçenek olarak ise, alt eşik hücre kümeleri çözmek için arttırılabilir; Bu manipülasyon kaynaklanan herhangi işaretsiz hücreler daha sonra bir taksitli sayacı kullanılarak sayılabilir. </li></ol></li><li> ImageJ kullanarak hücre sayısını analiz: <ol><li> Hücreler (Şekil 3C) saymak Parçacık Analyzer başlatın. Analiz seçip Parçacık Analiz tıklayınız. İsteğe bağlı parçacıkları algoritma sayısı (Şekil 3D) görmek için &quot;Kaplama Anahatları&quot; seçeneğini seçin. Alternatif olarak, bir birimin büyüklüğü ya da piksel alanı limitini ayarlamış (örn., Hücre, algoritma hücreler, vs.) bir yığın saymak. </li><li> Tamam&#39;a tıklayın. Sayımı (Şekil 3E) ile bir özet penceresi gözlemleyin. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Hemosit Rahatsızlık Deneyi <ol><li> Hemocytes seçeneğini larvaları rahatsız ve cam boncuklar (212-600 mikron) yaklaşık 0.5 g 2 ml mikrosantrifüj tüp yerleştirmek ve 0.5 ml su ekleyin. </li><li> 1 dakika hızda 10 at, elle, tüp Vortex. </li><li> Petri kabı içine mikrosantrifüj tüp içindekilerin dökülmesini ve bir fırça ile larva çekme cam boncuk larvaları alın. </li><li> Kurtarma fazı için, uçucu gıda küçük miktarlarda önceden hazırlanmış Petri tabaklarında larvaları yerleştirin. Larvalar 45 dakika ya da istenilen bir süre için hemocyte desen yeniden kurmak için izin verin. NOT: Onlar süreçte öldü gibi, hareketli durmuş herhangi larvaları atın. Ancak, genellikle l bakınittle hasarı vorteks 1 dakika sonra (aşağıda ve Ek Şekil 1). </li><li> Bölüm 1 &#39;de yukarıda tarif edildiği gibi bir iyileşme süresinden sonra, Boşaltma / Pençe Testi ile devam edin. </li></ol>

<ol>
	<li>Lemaitre, B., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+defense+of+Drosophila+melanogaster.">The host defense of Drosophila melanogaster.</a> Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).</li><li>Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thicker+than+blood:+conserved+mechanisms+in+Drosophila+and+vertebrate+hematopoiesis.">Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis.</a> Dev Cell. 5, 673-690 (2003).</li><li>Wood, W., Jacinto, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+melanogaster+embryonic+haemocytes:+masters+of+multitasking.">Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).</li><li>Gold, K. S., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+as+a+model+for+the+two+myeloid+blood+cell+systems+in+vertebrates.">Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates.</a> Experimental hematology. 42, 717-727 (2014).</li><li>Makhijani, K., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Of+blood+cells+and+the+nervous+system:+Hematopoiesis+in+the+Drosophila+larva.">Of blood cells and the nervous system: Hematopoiesis in the Drosophila larva.</a> Fly. 6, 254-260 (2012).</li><li>Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Br&#252;ckner, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+peripheral+nervous+system+supports+blood+cell+homing+and+survival+in+the+Drosophila+larva.">The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva.</a> Development. 138, 5379-5391 (2011).</li><li>Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postembryonic+hematopoiesis+in+Drosophila.">Postembryonic hematopoiesis in Drosophila.</a> Dev Biol. 230, 243-257 (2001).</li><li>Holz, A., Bossinger, B., Strasser, T., Janning, W., Klapper, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+two+origins+of+hemocytes+in+Drosophila.">The two origins of hemocytes in Drosophila.</a> Development. 130, 4955-4962 (2003).</li><li>Sieweke, M. H., Allen, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+stem+cells:+self-renewal+of+differentiated+macrophages.">Beyond stem cells: self-renewal of differentiated macrophages.</a> Science. 342, 1242974 (2013).</li><li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-resident+macrophages.">Tissue-resident macrophages.</a> Nature immunology. 14, 986-995 (2013).</li><li>Bretscher, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nimrod+transmembrane+receptor+Eater+is+required+for+hemocyte+attachment+to+the+sessile+compartment+in+Drosophila+melanogaster.">The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster.</a> Biology Open. 1-9, (2015).</li><li>Leitao, A. B., Sucena, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+sessile+hemocyte+clusters+are+true+hematopoietic+tissues+that+regulate+larval+blood+cell+differentiation.">Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation.</a> eLife. , (2015).</li><li>Markus, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sessile+hemocytes+as+a+hematopoietic+compartment+in+Drosophila+melanogaster.">Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4805-4809 (2009).</li><li>Babcock, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+blood+cells+function+as+a+surveillance+system+for+damaged+tissue+in+Drosophila+larvae.">Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 105, 10017-10022 (2008).</li><li>Sinenko, S. A., Mathey-Prevot, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+expression+of+Drosophila+tetraspanin,+Tsp68C,+suppresses+the+abnormal+proliferation+of+ytr-deficient+and+Ras/Raf-activated+hemocytes.">Increased expression of Drosophila tetraspanin, Tsp68C, suppresses the abnormal proliferation of ytr-deficient and Ras/Raf-activated hemocytes.</a> Oncogene. 23, 9120-9128 (2004).</li><li>Stramer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+wound+inflammation+in+Drosophila+embryos+reveals+key+roles+for+small+GTPases+during+in+vivo+cell+migration.">Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration.</a> J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).</li><li>Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+hemocyte-specific+enhancer-reporter+transgenes+for+the+analysis+of+hematopoiesis+in+Drosophila+Genesis.">New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila Genesis.</a> 47, 771-774 (2009).</li><li>Gajewski, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+crystal+cell-specific+enhancer+of+the+black+cells+prophenoloxidase+gene+in+Drosophila.">Identification of a crystal cell-specific enhancer of the black cells prophenoloxidase gene in Drosophila.</a> Genesis. 45, 200-207 (2007).</li><li>Lebestky, T., Chang, T., Hartenstein, V., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specification+of+Drosophila+hematopoietic+lineage+by+conserved+transcription+factors.">Specification of Drosophila hematopoietic lineage by conserved transcription factors.</a> Science. 288, 146-149 (2000).</li><li>Zettervall, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+directed+screen+for+genes+involved+in+Drosophila+blood+cell+activation.">A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101, 14192-14197 (2004).</li><li>Shim, J., Mukherjee, T., Banerjee, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+sensing+of+systemic+and+nutritional+signals+by+haematopoietic+progenitors+in+Drosophila.">Direct sensing of systemic and nutritional signals by haematopoietic progenitors in Drosophila.</a> Nature cell biology. 14, 394-400 (2012).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+cells+and+blood+cell+development+in+the+animal+kingdom.">Blood cells and blood cell development in the animal kingdom.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Burada, kantitatif tek Drosophila larva ikamet eden ve dolaşan kan hücrelerini kurtarmak ve bu iki hemocyte popülasyonlarının ölçmek için ilk yöntem açıklanmaktadır. Protokol görüntüleme ve otomatik hücre sayımı ile takip dolaşım yerleşik kan hücrelerinin ardışık salınmasını içerir. 60 dakika iyileşme süresi 6 - Larva ikamet hemocytes geçici, mekanik bozukluk dolaşıma büyük ölçüde 30 içinde ters olduğu bilinen bir süreç mobilize edilebilir. Bu duruma göre, bu protokol, iki şekilde test edildi: (1) larva ve larva gelişimi boyunca hemocytes dolaşan fraksiyonu için toplam hemocyte sayısı değerlendirerek, ve (2) deneysel olarak otomatik bir yöntem kullanılarak yerleşik hemocytes çıkartılmasından, doğruladı hemocyte lokalizasyonu ve resident hemocyte sayısı ve dolaşımdaki nüfusun sıkı ilişki. Buna ek olarak, yöntem tekrarlanabilirliği co ile gösterilmiştirbiyolojik çoğaltır iki veri setleri mparing. Geçmişte, laboratuvarlar larva hemocytes 6,13,21 ölçmek için teknikler bir dizi kullandık. Bu protokol almak ve kolayca adapte platform sağlayan, Drosophila larva ikamet eden ve dolaşan kan hücre popülasyonlarının ölçmek için ortak bir standart kurar. Açıklanan yöntem ikamet hemocytes ve mikroçevresinin rolü odaklanmak çalışmalar için önemlidir, Hematopoetik 4-6 Cepler ve floresan proteini vahşi tip transgen taşıyan Drosophila suşları ve genetiği değiştirilmiş arka incelemek için uygundur. Protokol aynı zamanda ikamet hemocytes ya da (4 gözden) toplam hemocyte sayısındaki değişim seferberliğini tetikleyen immün meydan okuma veya yaralanma ve genetik veya çevresel kaynaklı sinyalizasyon sonra hemocyte seferberlik odaklanmak çalışmalar için geçerlidir. Bu prematüre di durumlarda, belirtmek gerekir kiLenf bezi soy karşı embriyonik / larva ayırt fferentiation ve lenf bezinden hemocytes bırakma, kullanılan floresan hemocyte muhabiri ifadesi deseni ile sınırlı olabilir. Burada sunulan protokol görüntüleme canlı, floresan etiketli hemocytes dayanır. Gelecekte, bu immünsitokimya kullanarak, örneğin, tespit sonrasında serbest hücrelerin tespit edilmesini sağlamak için modifiye edilebilir. Yöntem, hemocytes alma ve işleme ex izin verdiğinden, bu durumda, iletişim kuralı yapışma inkübasyon sürelerini arttırarak ve bu konkanavalin A gibi, yapışkan kayıcı kaplaması ile, örneğin kan hücrelerinin bir yapışma sağlamak için adapte edilmesi gerekebilir in vivo, bu gelişim, hücre biyolojik ve biyokimyasal çalışmalar geniş bir fayda sağlayacaktır. Yerleşik ve dolaşımdaki kan hücreleri tüm Drosophila postembriyonik gelişim evreleri ve diğer omurgasızlar 22 suggesti sırasında bulunanng, bu yöntemin Adaptasyonun Drosophila larva hematopoietik sistem dışına çalışmalarda geniş bir fayda sağlayacaktır.

Omurgasız modelinde Drosophila melanogaster Araştırma doğal bağışıklık 1 keşif sürdü ve 2-4. Drosophila hematopoiezis menşei embriyonik / larva hemocytes soyu, ayrılabilir kan hücresi gelişiminin çeşitli yönlerini anlaşılmasını kolaylaştırdı Embriyo ve larva genişletmek ve lenf bezinin soy 4,5 Hemocytes. Burada, Drosophila larva çoğunlukla plazmatositler (makrofajlar) ve birkaç kristal hücreler 4 içermektedir larva / embriyonik hemocytes soyu, odaklanan bir protokol mevcut. Epidermis ve larva vücut duvarının 5,6 kas tabakaları arasında yer alan larva olarak, embriyo hemocytes devam ve kolonize segmental tekrarlanan ve terminal Hematopoetik cepler (HPS). Kendini yenileyen makrofajlar 6, lokal doku mikroçevrelerde 6 onların baskın ikametgah olarak doğaları dayanarakGelişme 6,8 edilirken ortaya çıkan erken kan hücreleri 7 ve bunların soyu, bu kan hücre popülasyonu omurgalı kendini yenileyen doku makrofajları, son türlerin 4,9,10 çeşitli tespit bağımsız myeloid benzer kabul edilir. Bununla birlikte, Drosophila, bir kısmı veya yerleşik hücrelerin tümü, aynı zamanda plastisite gibi kristal hücreleri 11,12 gibi diğer kan hücre tiplerinin sebep göstermek. Larva hemocytes ağırlıklı ikamet (sapsız) vardır, ancak çeşitli HPs arasında dinamik kararlı durumdadır. 3. instar larva pupariation 5-7 yaklaşırken Onlar kademeli özellikle dolaşıma salınır. Hemolimf 4,6,13 içine Bağışıklık geri dönüşümlü ikinci durumda zorluklar, erken yaralanma veya mekanik bozukluk kurşun, yerleşik hemocytes seferberlik. Önceki çalışmalar ikamet önerdi ve dolaşımdakiLarva hemocytes aynı soydan gelen, ancak bunların yapışkan veya hedef arama özellikleri 6,7,13,14 farklıdır. Yerleşik hemocytes karşı dolaşan seçici izolasyonu Periferik Sinir Sistemi duyusal nöron kümeleri epidermis ve kas tabakaları ile kaplı ve ayrıca liman olan HP&#39;nin 6. Drosophila larva HPS gelen endüktif ipuçlarına maruz kaldıkları öne ikamet hemocyte nüfusun çoğalması düzeyi yüksek saptandı (PNS) ve karaciğer fonksiyon oenocytes 6 benzeyen. İşlevsel, mutant ve genetik hücre ablasyon deneyler HPS&#39;de bulunan duyusal nöronlar larva hemocytes 6 trofik hayatta kalma ve lokalizasyonu destekleyen olduğunu göstermiştir. Burada belirli bir izolasyon ve ikamet ölçümü ve tek Drosophila larva dolaşan hemocytes ve mekanik hemocyte seferberlik için bir protokol için bir yöntem açıklanmaktadır. Yöntem, ex vivo kullanılabilirhemocytes çalışması ve ayrıca, pupa ve erişkin ve diğer omurgasız sistemleri gibi diğer Drosophila gelişim aşamalarına uyarlanabilir. Önceki çalışmalar yerleşik ve dolaşımdaki hemocytes ayırt etmedi beri, bu protokol ikamet kan hücrelerinin çalışma için ortak bir standart sağlar ve omurgasız kan hücre araştırmalarının tutarlılığını artırmak için yardımcı olacak. İlk olarak, Hemosit Taşma Payı / Pençe Deneyi diferansiyel izolasyonu ve floresan protein-işaretlenmiş ikamet ve tek Drosophila larva hemocyte popülasyonlarının dolaşan otomatik ölçümü açıklar; protokol, düzenli ve kiremit tarama donanımlı mikroskopları için iki seçenek (Şekil 1) sağlar. Bunun bir sonucu olarak, dolaşımdaki hemocytes yüzdesi ve larva için hemocytes sayısı elde edilir. Yöntem kan hücresinin içinde floresan protein ifade transgenik Drosophila larva dayanırNüfus. Hemocyte sürücüsü veya muhabir seçimi kan hücrelerinin nüfusu görüntülenmiştir ve sayısal olan, yani sonucunu belirler. Ağırlıklı olarak etiketlemek için makrofajlar ikamet ve Drosophila larva 6 dolaşımdaki hemocyte nüfusunun büyük çoğunluğunu oluşturan (plazmatositler), uygun transgenler ile (HML Δ-DsRed 6, HmlΔ -GAL4 15, PXN -GAL4 16, CRQ-GAL4 dahil H. Agaisse 16) ya da yiyici-GAL4 17; Kristal hücrelerinin nispeten küçük nüfusu etiketlemek için uygun hatlar BcF6-OBP ve GFP 18 veya (J. Pollock 19) tarafından lz-GAL4 vardır; etiketleme lamellocytes için, özel bir hücre tipi ağırlıklı olarak bağışıklık zorluklar ve yaralanma 13 tarafından uyarılan, örneğin, MSNF9mo mCherry 17 kullanılabilir. Bazı transgenik sürücüler farklı kan bir dizi olarak ifade edilmiştirTüm larva kan hücreleri 20 yaklaşık% 80 etiketler GAL4 20, - örneğin O gibi hücreler ve progenitorlar,. GAL4 sürücüler kullanıldığı yerlerde UAS-GFP veya başka bir floresan protein UAS-transgen ile kombinasyon gereklidir tüm durumlarda lütfen unutmayınız. Sonuçlar bölümünde, bu yöntem, larva gelişimi boyunca, kan hücre sayısı ve dolaşım davranışını izlemek için kullanılır. (- 60 dak 30) 6 İkincisi, Hemosit Rahatsızlık Deneyi sonradan yeniden yapışması ve ev HPS sınırlı bir zaman çerçevesinde hemocytes yeteneği değerlendirilmesine olanak dış manipülasyon tarafından ikamet hemocytes ayırmak için tasarlanmış bir önceki adımı açıklanır. Tipik olarak, bu deney, her bir larva için hemocytes dolaşımdaki yüzdesini belirlemek için Boşaltma / Pençe Tahlili tarafından takip edilir. Biz vorteksleme wit göre rahatsızlık kullanan bu deneyi (Şekil 1D) için basitleştirilmiş bir protokol mevcuth cam boncuk, yerine boya fırçası ile tek larva manipülasyon önce 6 açıklandığı gibi. Sonuçlar bölümünde, bu deney hemolimf bu geçici müstakil hemocytes şamandıra göstermek için kullanılır ve hemocytes dolaşan fraksiyonunda elde edilebilir. Tahlil örn, çeşitli genetik geçmişleri veya stimülasyon koşullarının karşılaştırılması ikamet sitelere kendi hedef arama / yapışma hemocytes farklılıkları ölçmek için de yararlıdır. Bu mekanik manipülasyon geri çevrilebilir bir süreç yansıtır ve genellikle kısa bir süre 4,13 geri dönüşümlü olmayan enfeksiyon-veya hasar kaynaklı ikamet hemocyte seferberlik farklı olduğunu unutmayın.

<table><tbody><tr><td>6 cm/9 cm Petri dishes</td><td></td><td></td><td>One for each genotype to be evaluated</td></tr><tr><td>Water squirt bottle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal spoon/spatula</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thin paintbrush</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.,&lt;/em&gt; a &quot;liner&quot;</td></tr><tr><td>Glass cavity dish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP pen: Super PAP PEN IM3580</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass slides</td><td></td><td></td><td>Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; &lt;em&gt;e.g.,&lt;/em&gt; 2 mm squares.</td></tr><tr><td>Moist chamber</td><td></td><td></td><td>This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom</td></tr><tr><td>Schneider&amp;rsquo;s &lt;em&gt;Drosophila&lt;/em&gt; cell culture media</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cold block</td><td></td><td></td><td>This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color</td></tr><tr><td>2 x 1 ml syringes with needles (27 G &amp;frac12;&quot;)</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td>For dissections.</td></tr><tr><td>Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2 mm)</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass beads, 212 - 600 &amp;mu;m</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml Eppendorf tubes</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>One per genotype evaluating</td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes.</td><td></td><td></td><td>Suitable transgenes include: Hml&amp;Delta;-DsRed (Makhijani &lt;em&gt;et al.,&lt;/em&gt; 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi &lt;em&gt;et al.,&lt;/em&gt; 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski &lt;em&gt;et al.,&lt;/em&gt; 2007), or Hml&amp;Delta;-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer &lt;em&gt;et al.,&lt;/em&gt; 2005), He-GAL4 (Zettervall &lt;em&gt;et al.,&lt;/em&gt; 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer &lt;em&gt;et al.,&lt;/em&gt; 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi &lt;em&gt;et al.,&lt;/em&gt; 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes.</td></tr><tr><td>Fluorescence dissecting microscope</td><td>Leica</td><td></td><td>Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module</td></tr><tr><td>Inverted fluorescence microscope with camera attachment</td><td>Leica or Keyence</td><td></td><td>With or without tile scanning function (&lt;em&gt;e.g.,&lt;/em&gt; Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series)</td></tr></tbody></table>

assaying blood cell populations of the drosophila melanogaster larva

Omurgalılarda, hematopoez endüktif mikroçevrelerde (nişler) tarafından düzenlenir. Benzer şekilde, omurgasız bir model organizma Drosophila melanogaster, larva Hematopoietik cepler (HPS) olarak bilinen indüktif mikroçevrelerde kendini yenileyen makrofaj özellikle gelişimi ve kan hücreleri (hemocytes) düzenlenmesi için anatomik bölgelerden olarak tespit edilmiştir. HPS olan segmental da periferal sinir sisteminin duyusal nöronlar ihtiva larva epidermis ve kas tabakaları arasındaki cepler tekrarladı. Larva olarak, ikamet (sesil) hemocytes, anti-apoptotik, yapıştırıcı ve bu duyusal nöronlar gelen çoğalma kuyruklar ve astar kas ve epitel katman olarak HPS potansiyel olarak diğer bileşenleri maruz kalmaktadır. HPs yakıtlardan normal gelişim, yerleşik hemocytes kademeli olarak gevşetmek sırasında mo sürümünde doruğa dolaşan hemocytes nüfusu,metamorfoz başında ikamet hemocytes st. Bağışıklık saldırılar, fiziksel yaralanma ya da mekanik rahatsızlık dolaşıma ikamet hemocytes prematüre salınımını tetikler. Ikamet yerleri ve dolaşım arasındaki larva hemocytes anahtarı seçici ayırmak ve tek Drosophila larva kan hücrelerinin bu iki popülasyonlarının ölçmek için ortak bir standart / prosedür gereksinimini artırmaktadır. Buna göre, bu protokol bırakın ve tek larva yerleşik ve dolaşımdaki hemocytes ölçmek için otomatik bir yöntem açıklanır. Yöntem, ex vivo yaklaşımlar kolaylaştırır ve Drosophila aşamalar ve diğer omurgasız organizma, çeşitli hizmet etmek için adapte edilmiş olabilir.

Tarif edilen yöntemlerin tipik sonuçlarını göstermek için, öncelikle larva hemocyte numaralarının ilerlemesini ve larva gelişim boyunca kendi ikamet (Şekil 4) anahat Hemosit Sızdırma / Pençe Testi kullanılmıştır. Yerleşik ve larva hemocyte popülasyonları dolaşan tek larva izole edilmiştir (HML Δ-GAL4, UAS-GFP, O-GAL4 etiket engin larva hemocytes çoğunluğu) ve ImageJ kullanılarak ölçülebilir. Larva tabur (~ 48 saat AEL ya da 1 instar), 2,5 mm (~ 80 saat AEL ya da geç 2. evre) ve 3,5 mm (~ 96 saat AEL veya 3. instar) incelendi (Şekil 4) 1.2 mm boyutlu . Hemocyte numaraları ilişkilendirilmesi ve boya lekeli larva 7 ve larva manikür 6 ile floresan protein etiketli hemocytes canlı sayım, ışık mikroskobu dayalı önceki tahminler aşan, larva gelişimi boyunca genişletti. 1. insDolaşımdaki hemocytes kesir giderek daha önceki yayınlarda 6,7 ile tutarlı larva gelişim kursu (Şekil 4B, C), üzerinde artarken tar larvaları hemen hemen tüm hemocytes, ikamet idi. Sonraki biz yöntemi sadakatle yerleşik ve dolaşımdaki nüfus arasındaki hemocytes geçişi izler olup olmadığını incelemiştir. Yerleşik hemocytes geçici mekanik bozukluk ile ayrılabilir ve onların yerleşik sitelerine kendiliğinden 6-uymak yeniden bu olayın yararlanan biz Hemosit Rahatsızlık Testi anlatıldığı gibi cam boncuk ile karıştırın ikamet hemocytes dağıldılar. Nitekim, larvaların mekanik bozukluk ikamet hemocytes gideri (Şekil 5) hemocytes dolaşımdaki nüfus dramatik bir artışa yol açmıştır. 45 dakikalık bir geri kazanım süresinden sonra, hemocytes büyük ölçüde görsel inceleme ile ve aynı hem kendi yapışan durumuna dönendolaşan hücrelerin değerlendirmeden geçirilmiş yüzdesi (Şekil 5D, E). Beklendiği gibi, toplam hemocyte numaraları dolaşan ve yerleşik nüfus arasındaki hemocytes vardiya rağmen, zamanla sabit kalmıştır. Birkaç ek hususlar dikkate alınmıştır. Cam boncuklar, çeşitli zaman aralıklarında (1, 5, 20 dk), tripan mavisi (Sigma) varlığında yapıldı ile vorteks, ana doku hasarına neden olmadığını doğrulamak için, vorteks. 20 dakika süre ile girdap pozitif kontrol (Ek Şekil 1) olarak kullanılan iğne ilmek kaynaklanan hasar benzeyen, hasar küçük alanlarda neden Her iki 1 ve 5 dakika süre ile girdap, belirgin bir doku bozulmasına neden olmamıştır. Epidermis ya da manikür zarar vermeden diğer dokuların iç hasar göz ardı edilemez, ancak bu senaryo larva bütünlük ödün değildi düşündüren, 1 dakika ve 5 dakika tedavi edilen larva yeniden yapıştırılmış beklenen desen ve zaman çerçevesi içinde hemocytes olarak değil zor görünüyord (Ek Şekil 1). Bunun aksine, larva yeniden yapışma eksikliği muzdarip 20 dakika süre ile girdaplandı, ve daha önce 14 tarif edildiği gibi daha da epidermal yara sitelere hemocytes dolaşımdaki eki göstermemiştir. Son olarak, yöntemin tekrarlanabilirliği göstermek için, biz ayrı denemecileri tarafından yapılmıştır Yukarıdaki iki deneylerin, 2.5 mm larvalarının biyolojik çoğaltır karşılaştırıldı. Ek, Şekil 2 &#39;de gösterildiği üzere, her iki kohort karşılaştırılabilir toplam larva için hemocytes sayıları ve dolaşımdaki hemocytes yüzdesi gösterdi. Student t test yöntemi tekrarlanabilir ve geniş çapta uygulanabilir olduğunu düşündüren, istatistiksel olarak anlamlı farklılık gösterdi. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/52733/52733fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1. Hemosit Bleed / kazıyın ve Bozulma Testi s<html> etup ve şema. (A) Tek Resim Slayt Ayarı: 5X amacı ile görüntüleme için beş 2mm kareler (B) Çini Tarama Slayt Kurulum:. Görüntüleme kanın dört 3mm kareler / çini tarama mikroskobu ile ≤2.5 mm larvalarının sıyrıklar. Görüntüleme için önerilen hedefler 5X veya 10X. (C) / ImageJ kullanarak kazıyın Deneyi şematik ve elde edilen sayımsal havasını alın. (D) Bozucu Tahlili olan hemocyte desen mekanik cam boncuklar ile larvaların vorteks bozulur. Larvalar hemocytes Hematopoietik cepler yeniden bağlı sırasında 45 dakikalık bir süre boyunca iyileşmesine izin verilir. Hemocytes yapışkan özellikleri rahatsızlık sonrası dolaşımdaki hemocytes yüzdesini miktarının, bu yöntemle tespit edilebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig1highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> yolları &quot;&gt; <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/52733/52733fig2highres.jpg" width="700" /> Şekil 2. Sızdırma / Pençe Deneyi dolaşan ve yerleşik hemocytes serbest bırakmak için. (A) larva kanamaya için, larva posterior ve anterior ucunda ventral kesi (makas sembol) yapılır. (B) Hemocytes kesiler dışarı akacak ve slayt yüzeyinde çözecek dolaşımda. (C) Lenf bezi (LG) bulunan ve onu delinmesiyle olmadan sıkıştırdılar edilir. Resident hemocytes batıcı ve / veya bir iğne ile larva kazınarak serbest bırakılır. Slaytta (D) Yerleşik hemocytes. (E, F) ikamet eden bütün hemocytes bırakılıncaya kadar kazıyın işlem tekrarlanır. Sağlam lenf bezi içeren larva karkas geride. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig2highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Şekil 3. ImageJ kullanarak hemocytes miktarının otomatik. (A, B) ImageJ bir hemocyte görüntü dosyası açtıktan sonra, alt eşik seviyesi görüntüdeki tüm hücreler için hesap ayarlanır. (C, D) Parçacıklar hücre piksel boyutu, dairesellik ve sonuç okuma ayar gerektirir Analiz biçimi (örneğin, Yerleşimi Anahatlar). (E) hemocytes sayısını gösteren Özeti penceresi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig3highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4," src="/files/ftp_upload/52733/52733fig4highres.jpg" width="700" /> Şekil 4. Temsilcisi Sonuçlar (1). Hemocyte numarası ve üzerinde ikamet devlet<html> Larva gelişme elbette. (A) kullanılan larva evrelerinin Bakış; 1. evre (48 sa AEL; ~ 1,2 mm uzunluk); 2. evre (80 saat AEL, 2.5 mm uzunluğunda); 3. instar (96 saat AEL; ~ 3.5 mm uzunluğunda). Genotip HML Δ-GAL4, UAS-GFP olduğu; O-GAL4. Aşamaları larva mouthhooks değerlendirerek teyit edildi. İlgili larva aşamasında dolaşan ve yerleşik hemocyte numaraları (B) Bar diyagramı. Hemocytes dolaşımdaki (C) yüzdesi. Dolaşımdaki hemocytes kesir larva gelişimi boyunca orantısız artar unutmayın. (D) Toplam hemocytes, larva başına dolaşan ve yerleşik hemocytes toplamından kaynaklanan. Hemocytes Silme / Pençe yöntemi kullanılarak ölçüldü; n ≥ 6 larva / durumu, hata çubukları, standart sapma, 3 bağımsız kopya deneylerle doğrulanmıştır bulgular.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 5," src="/files/ftp_upload/52733/52733fig5highres.jpg" width="700" /> Şekil 5. Temsilcisi Sonuçlar (2). Hemocyte ikamet mekanik rahatsızlık etkileri. (AC) öncesi ve 45 dakika geri izledi cam boncuklar ile vorteks sonra larva Örnek (A) Hayır rahatsızlık kontrolü.; hemocytes Hematopoietik Cepler lokalizedir (B) kesintiye hemocyte desen 0 dak cam boncuklar ve su ihtiva eden bir süspansiyona larvaları vorteks sonrası iyileşme sonrası rahatsızlık 45 dakika (C) Hemosit şablonu..; Birçok hemocytes Hematopoetik Cepler taşındı var; genişletilmiş dorsal-damar ilişkili kümeleri ve erken post-rahatsızlık birikimi (oklar) baskın siteler dorsal çizgili not edin. Genotip HML Δ-GAL4, UAS-GFP olduğunu; O-GAL4 x yw. Boşaltma / Pençe yöntem ile nicelleştirilmiştir hemocytes dolaşımdaki (D) oranı. (E) toplam hemocytes, larva için sirkülasyon ve yerleşik hemocytes toplamından elde edilir. n ≥ 4 larva / durumu, hata çubukları, standart sapma, 3 bağımsız kopya deneylerle doğrulanmıştır bulgular. Student t-testi önemini teyit etmek için, NS (önemli değil), ** (p ≤ 0.05), ** (0.01 ≤ p). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52733/52733fig5highres.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva at JoVE.com

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

In vertebrates, hematopoiesis is regulated by inductive microenvironments (niches). Likewise, in the invertebrate model organism&#160;Drosophila ...

assaying-blood-cell-populations-of-the-drosophila-melanogaster-larva

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

12.3K Görüntüleme.  University of California San Francisco. Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.

Video: Assaying Blood Cell Populations of the Drosophila melanogaster Larva

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize mammalian adaptive immunity. Drosophila and mammalian hematopoiesis occur in spatially and temporally distinct phases to produce several blood cell lineages. Both systems maintain reservoirs of blood cell progenitors with which to expand or replace mature lineages. The hematopoietic system allows Drosophila and mammals to respond to and to adapt to immune challenges. Importantly, the transcriptional regulators and signaling pathways that control the generation, maintenance, and function of the hematopoietic system are conserved from flies to mammals. These similarities allow Drosophila to be used to genetically model hematopoietic development and disease.
Here we detail assays to examine the hematopoietic system of Drosophila larvae. In particular, we outline methods to measure blood cell numbers and concentration, visualize a specific mature lineage in vivo, and perform immunohistochemistry on blood cells in circulation and in the hematopoietic organ. These assays can reveal changes in gene expression and cellular processes including signaling, survival, proliferation, and differentiation and can be used to investigate a variety of questions concerning hematopoiesis. Combined with the genetic tools available in Drosophila, these assays can be used to evaluate the hematopoietic system upon defined genetic alterations. While not specifically outlined here, these assays can also be used to examine the effect of environmental alterations, such as infection or diet, on the hematopoietic system.

Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae

Drosophila and mammalian hematopoietic systems share many common features, making Drosophila an attractive genetic model to study hematopoiesis. Here we demonstrate dissection and mounting of the major larval hematopoietic organ for immunohistochemistry. We also describe methods to assay various larval hematopoietic compartments including circulating hemocytes and sessile crystal cells.

Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Many parallels exist between the Drosophila and mammalian hematopoietic systems, even though Drosophila lack the lymphoid lineage that characterize ...

Gelişim Biyolojisi

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The serotonergic feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of critical importance during the development of the circuit. Using the functional output of the circuit, feeding, changes in the neuronal architecture of the stomatogastric system can be visualized. Feeding behavior can be recorded by observing the rate of retraction of the mouth hooks, which receive innervation from the brain. Locomotor behavior is used as a physiological control for feeding, since larvae use their mouth hooks to traverse across an agar substrate. Changes in feeding behavior can be correlated with the axonal architecture of the neurites innervating the gut. Using immunohistochemistry it is possible to visualize and quantitate these changes. Improper handling of the larvae during behavior paradigms can alter data as they are very sensitive to manipulations. Proper imaging of the neurite architecture innervating the gut is critical for precise quantitation of number and size of varicosities as well as the extent of branch nodes. Analysis of most circuits allow only for visualization of neurite architecture or behavioral effects; however, this model allows one to correlate the functional output of the circuit with the impairments in neuronal architecture.

Functional Analysis of the Larval Feeding Circuit in Drosophila

The feeding circuit in Drosophila melanogaster larvae serves a simple yet powerful model that allows changes in feeding rate to be correlated with alterations in the stomatogastric neural circuitry. This circuit is composed of central serotonergic neurons that send projections to the mouth hooks as well as the foregut.

Içinde larvaların Devre Fonksiyonel Analiz Drosophila</i

The serotonergic  feeding circuit in Drosophila  melanogaster larvae can be used to investigate neuronal substrates of  critical importance during the ...

Nörobilim

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or complete loss of viability at different stages of development. Our lab has developed a method to assess viability in Drosophila from embryo to fully mature adult. The method relies on quantifying the number of progeny present at different stages during development, starting with hatched embryos. After embryos have been quantified, additional stages are counted, including L1/L2, pupae, and mature adults. After all stages have been examined, a statistical analysis such as the chi-square test is used to determine if there is a significant difference between the starting number of progeny (hatched embryos) and later stages culminating in the observed number of adults, thus rejecting or accepting the null hypothesis (that the number of hatched embryos will be equal to the number of larvae, pupae, and adults recorded throughout the stages of development). The primary advantage of this assay is its simplicity and accuracy, as it does not require an embryo rinse to transfer them to the food vial, avoiding losses from technical errors. Although the protocol described here does not directly examine L2/L3 larvae, additional steps can be added to account for these. Comparing the number of hatched embryos, L1, pupae, and adults can help determine if viability was compromised during the L2/L3 stages for further studies (the use of colored food helps with visual identification of larvae). Overall, this method can help Drosophila researchers and educators determine when viability is compromised during the fly life cycle. Routine assessment of stocks using this assay can prevent accumulation of secondary mutations that may affect the phenotype of the originally isolated mutant, especially if the original mutations affect fitness. For this reason, our lab maintains multiple copies of each of our Dm ime4 alleles and routinely checks the purity of each stock with this method in addition to other molecular analyses.&#160;

A Direct and Simple Method to Assess Drosophila melanogaster's Viability from Embryo to Adult

This protocol is designed to assess the viability of Drosophila at every developmental stage, from embryo to adult. The method can be used to determine and compare the viability of different genotypes or growth conditions.

Drosophila Melanogaster'In Embriyodan Yetişkine Canlılığını Değerlendirmek Için Doğrudan ve Basit Bir Yöntem

In Drosophila melanogaster, viability assays are used to determine the fitness of certain genetic backgrounds. Allelic variations can result in partial or ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Biyoloji

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous system and protects neural tissue from toxins and pathogens. Defects in the formation of this barrier have been correlated with neuropathies, and the breakdown of this barrier has been observed in many neurodegenerative diseases. Therefore, it is critical to identify the genes that regulate the formation and maintenance of the blood-brain barrier to identify potential therapeutic targets. In order to understand the exact roles these genes play in neural development, it is necessary to assay the effects of altered gene expression on the integrity of the blood-brain barrier. Many of the molecules that function in the establishment of the blood-brain barrier have been found to be conserved across eukaryotic species, including the fruit fly, Drosophila melanogaster. Fruit flies have proven to be an excellent model system for examining the molecular mechanisms regulating nervous system development and function. This protocol describes a step-by-step procedure to assay for blood-brain barrier integrity during the embryonic and larval stages of D. melanogaster development.

Assay for Blood-brain Barrier Integrity in Drosophila melanogaster

Blood-brain barrier integrity is critical for nervous system function. In Drosophila melanogaster, the blood-brain barrier is formed by glial cells during late embryogenesis. This protocol describes methods to assay for blood-brain barrier formation and maintenance in D. melanogaster embryos and third instar larvae.

Drosophila melanogaster Kan-beyin Bariyer Bütünlüğü için Tahse

Proper nervous system development includes the formation of the blood-brain barrier, the diffusion barrier that tightly regulates access to the nervous ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the goal of this protocol is to develop a method to visualize the pathogen invasion in a specific immune compartment of flies, namely hemocytes. Using the method presented here, up to 3 &#215; 106 live hemocytes can be obtained from 200 Drosophila 3rd instar larvae in 30 min for ex vivo infection. Alternatively, hemocytes can be infected in vivo through injection of 3rd instar larvae followed by hemocyte extraction up to 24 h post-infection. These infected primary cells were fixed, stained, and imaged using confocal microscopy. Then, 3D representations were generated from the images to definitively show pathogen invasion. Additionally, high-quality RNA for qRT-PCR can be obtained for the detection of pathogen mRNA following infection, and sufficient protein can be extracted from these cells for Western blot analysis. Taken together, we present a method for definite reconciliation of pathogen invasion and confirmation of infection using bacterial and viral pathogen types and an efficient method for hemocyte extraction to obtain enough live hemocytes from Drosophila larvae for ex vivo and in vivo infection experiments.

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

This method demonstrates how to visualize pathogen invasion into insect cells with three-dimensional (3D) models. Hemocytes from Drosophila larvae were infected with viral or bacterial pathogens, either ex vivo or in vivo. Infected hemocytes were then fixed and stained for imaging with a confocal microscope and subsequent 3D cellular reconstruction.

Hemocytes mikrobiyal enfeksiyon ve çözümleme çekme--dan Drosophila melanogaster larva

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are the main branches of innate immunity, and many of the factors regulating these responses are evolutionarily conserved between invertebrates and mammals. Phagocytosis, the central component of cellular innate immunity, is carried out by specialized blood cells of the immune system. The fruit fly, Drosophila melanogaster, has emerged as a powerful genetic model to investigate the molecular mechanisms and physiological impacts of phagocytosis in whole animals. Here we demonstrate an injection-based in vivo phagocytosis assay to quantify the particle uptake and destruction by Drosophila blood cells, hemocytes. The procedure allows researchers to precisely control the particle concentration and dose, making it possible to obtain highly reproducible results in a short amount of time. The experiment is quantitative, easy to perform, and can be applied to screen for host factors that influence pathogen recognition, uptake, and clearance.

Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo phagocytosis assay in adult Drosophila melanogaster to quantify phagocyte recognition and clearance of microbial infections.

Bir In Vivo fagositoz tahlil kullanarak Drosophila melanogaster, meyve sineği hücresel bağışıklık yanıtı değerlendirirken

In all animals, innate immunity provides an immediate and robust defense against a broad spectrum of pathogens. Humoral and cellular immune responses are ...

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

Flow cytometry has been widely used to obtain information about DNA content in a population of cells, to infer relative percentages in different cell cycle phases. This technique has been successfully extended to the mitotic tissues of the model organism Drosophila melanogaster for genetic studies of cell cycle regulation in vivo. When coupled with cell-type specific fluorescent protein expression and genetic manipulations, one can obtain detailed information about effects on cell number, cell size and cell cycle phasing in vivo. However this live-cell method has relied on the use of the cell permeable Hoechst 33342 DNA-intercalating dye, limiting users to flow cytometers equipped with a UV laser. We have modified this protocol to use a newer live-cell DNA dye, Vybrant DyeCycle Violet, compatible with the more common violet 405nm laser. The protocol presented here allows for efficient cell cycle analysis coupled with cell type, relative cell size and cell number information, in a variety of Drosophila tissues. This protocol extends the useful cell cycle analysis technique for live Drosophila tissues to a small benchtop analyzer, the Attune Acoustic Focusing Cytometer, which can be run and maintained on a single-lab scale.

Live Cell Cycle Analysis of Drosophila Tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer and Vybrant DyeCycle Violet DNA Stain

A protocol for cell cycle analysis of live Drosophila tissues using the Attune Acoustic Focusing Cytometer is described. This protocol simultaneously provides information about relative cell size, cell number, DNA content and cell type via lineage tracing or tissue specific expression of fluorescent proteins in vivo.

Canlı Hücre Döngüsü Analizi<em&gt; Drosophila</emAkort Akustik Odaklama Sitometreyi ve Vybrant DyeCycle Violet DNA Leke kullanarak&gt; Dokular

Flow cytometry has  been widely used to obtain information about DNA content in a population of  cells, to infer relative percentages in different cell ...

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to recognize a wide range of particles and destroy microbial pathogens. As organisms age, this process begins to decline, yet little is known about the underlying mechanisms or the genetic basis of immunosenescence. Here, an injection based in vivo phagocytosis assay is used to assess age related changes in different aspects of phagocytosis, such as binding, engulfment, and degradation of internalized particles, by quantifying phagocytic events in hemocytes in adult Drosophila. Drosophila melanogaster has become an ideal model to investigate age related changes in innate immune function for many reasons. For one, many genetic components and functions of the innate immune response, including phagocytosis, are evolutionarily conserved between Drosophila and mammals. Because of that, results obtained from using this protocol are likely to be widely relevant to understanding the age related changes in immune function in a variety of organisms. Additionally, we note that this method provides quantitative estimates of hemocyte phagocytic ability, which could be useful for a variety of research topics, and need not be limited to studies of aging.

Assessing the Age-Specific Phagocytic Ability of Adult Drosophila melanogaster Hemocytes using an In Vivo Phagocytosis Assay

This protocol describes an in vivo assay of phagocytosis used to assess and quantify the ability of young and aged Drosophila melanogaster hemocytes to phagocytose bacteria.

Erişkin Drosophila melanogaster Hemositlerin Yaşa Özgü Fagositik Yeteneğinin In Vivo Fagositoz Islımı Ile Değerlendirilmesi

Phagocytosis is an essential function of the innate immune response. This process is carried out by phagocytic hemocytes whose primary function is to ...

Cuticle Disruption: A Method to Collect Hemolymph from Drosophila Larvae

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. <a href="https://www.jove.com/video/54544/" target="_blank">Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae</a>. J. Vis. Exp. (2016).
The Drosophila hemolymph serves as both blood and interstitial fluid, circulating throughout the body during the larva and adult stages. This video describes a protocol to collect larval hemolymph in order to quantify the circulating cells.

Kütikül Bozulması: Drosophila Larvalarından Hemolenf Toplamak İçin Bir Yöntem

Source: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae. J. Vis. Exp. (2016).
The Drosophila ...

Ve tahlil Kan Hücresi popülasyonlar

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Yöntemler Lenf Bezi ve Hemocytes içinde incelemek için

Içinde larvaların Devre Fonksiyonel Analiz Drosophila