Drosophila melanogaster in vivo kimyasalların potansiyel toksik ve endokrin etkilerini değerlendirmek için güçlü bir modeldir, endokrin bozucular gibi, bu insan sağlığı ve doğal ortamlar için ciddi bir sorun temsil. FECundity, doğurganlık, gelişim süresi ve yaşam süresi gibi sinek hormonal yaşam özellikleri, EDCs etkisi ele. Bu vivo endokrin bozulma araştırmak için kolay, ucuz ve hızlı bir yoldur.
Drosophila doğurganlık, gelişme ve yaşam süresi dikkatle bu protokolün başarılı bir sonucu sağlamak için kontrol edilmesi gereken çeşitli faktör etkilenebilir. Bu nedenle sinek yetiştirme ve taşımada azami dikkat gereklidir. Seçilen EDC'nin tadını tisem için, anesteziden sonra, 15 genç sinek yiyişiyle, mısır unu ortasını içeren dört paralel şişeye bir gıda boyası ile karıştırın.
Kontrol şişesi tek başına çözücü içerir, ve diğer üç şişe seçilen EDCs farklı dozlarda ile desteklenmektedir. Şişeleri 12 saatlik doğal bir ışıkla bir gün boyunca nemlendirilmiş bir kuluçka makinesinde tutun. Sinekleri tekrar anestezi ettikten sonra, hareketsiz sinekleri beyaz bir kağıda aktarın ve gözlemlemek için stereo mikroskobun altına yerleştirin.
Her tedavi grubunun karın boyasını kontrol grubu ile karşılaştırın. Sineklerin üreme performansını tsaymak için, her EDC için ebeveyn şişeleri olarak sinek üç şişe hazırlamak, sekiz kadın ve dört erkek mısır unu orta 10 mililitre EE2 ile desteklenmektedir. Kontrol için, her biri sekiz dişi ve dört erkek tene2 çözücü ile desteklenen 10 mililitre mısır unu orta gıda olmak üzere altı şişe sinek hazırlayın.
Arka, 25 santigrat derecede bir kuvözde uçuyor. Gelişimleri sırasında larvaların aşırı kalabalıklaşmasını önleyin. Dört gün sonra, ebeveynleri çıkarmak ve beş gün daha kuvöze şişeleri geri getirmek için bir etherizer üzerinde her şişe ters.
Dokuzuncu günün geç saatlerinde, şişelerden yeni çıkan tüm sinekleri çıkarmak ve şişeleri bir gecede 18 santigrat derecede başka bir kuvöze koymak için her şişeyi bir etherizer'ın üzerine ters çevirin. 10. günün sabahında, Drosophila karbondioksit iş istasyonunda, anestezili sineklerin ortama düşmesini önlemek için kültür şişesini dikkatlice tersine çevirin ve pamuk durdurucu ile şişe duvarı arasındaki şişeye iğneyle kauçuk bir tüp yerleştirin. Karbondioksit sağlamak için vanayı açın.
Birkaç saniye içinde, sinekleri mikroskop altında bir sinek yatağına aktarın. Bakire dişileri ve genç erkekleri ayrı ayrı sinek yatağında iki gruba ayırın. Her sinek grubunu küçük alt gruplarhalinde rastgele bölün, şişe başına 10 dişi veya 20 erkek taze mısır unu ile doldurulmuştur.
Kuluçkaya devam edin ve her EDC için 30 bakire kadın ve 30 erkek, kontrol için 90 bakire kadın ve 90 erkek toplayın. Bu sinek gruplarını, eclosion sonrası dört gün yaşlanınncaya kadar 25 derecede barındırın. Daha sonra her iki günde bir taze karşılık gelen orta içeren yeni şişeler içine aktarın.
Dişi şişelerde larva yok. Daha sonra aşağıdaki tedavi için sıralı numaraları farklı bir dizi ile şişeleri etiket. Anesteziden sonra, ee2 solventle işlenmiş bir dişi, EE2'siz taze mısır unu domates lifi içeren küçük bir şişeye aktarın ve kontrol için bir EE2 solvent le tedavi edilen erkek ekleyin.
Her tedavi için EE2 ile tedavi edilen bir erkeği EE2 solvent le tedavi edilen kadın veya EE2 ile tedavi edilen dişi ile EE2 solvent ile tedavi edilen erkek ile eşleştirin. Ev 20 tek haç 25 santigrat derecede. Sonraki 10 gün boyunca her gün EDC olmadan taze mısır unu domates orta şişeler için her çiftleme çifti aktarın.
Her şişeyi her gün yumurtalar için görsel olarak inceleyin ve doğurganlık tablosunda sayılarını bildirin. Her şişede, yeni ortaya çıkan sinekler için yakından kontrol edin ve 10 günlük süre içinde yetişkin soyundan günlük sayısını kaydedin. İlk miteden 10 gün sonra, anne ve babaları son şişe serisinden çıkarın.
Klozyon test protokollerinde, ilk olarak, her bir tedavi grubu için, iki günden daha eski 10 şişe genç, sağlıklı sinekler, her biri EDC'siz 10 mililitre mısır unu yiyeceğinde altı kadın ve üç erkek vardır. Sinekleri 24 saat boyunca yiyeceklerin üzerine koyve çiftleşmelerine izin ver. Daha sonra tedavi grubu başına 10 adet paralel şişe daha hazırlayın ve her biri farklı EDC konsantrasyonları veya kontrol için tek başına EE2 çözücüsü ile desteklenen taze mısır unu gıdasının her biri.
Çiftleştirilmiş sinekleri bu yeni şişelere aktarın. Farklı serileri kaydetmek için bir gelişim tablosu yapın. Sinekler 16 saat boyunca yumurtlamak için izin verin.
Sonra, şişelerden ebeveynleri çıkarın. Şişeleri 25 derecede 3-4 gün veya dolaşan larvalar görünene kadar kuluçkaya yatırın. Her gün, aynı pupaiki kez sayma önlemek için şişe dışında her pupa tarafından sırayla bir sayı yazarak her şişede yeni pupa sayısını saymak.
Yeni ortaya çıkan pupa sayısını üç ila dört gün veya daha fazla pupa formu oluşmayana bildirin. Dokuzuncu günden itibaren, daha fazla yetişkin ortaya çıkana kadar, her gün ortaya çıkan yetişkinlerin sayısını sayın. Gelişim tablosunda rapor layın ve makaleye göre klozyon tayinigeri gerçekleştirmek.
Yaşam süresi protokolünde, ilk olarak sekiz dişi ve dört erkekten oluşan 20 şişe kurulur, her biri 10 mililitre mısır unu yiyeceği yle doldurulmuş ve 25 santigrat derecede barındırışlar. Dört gün sonra sinekleri atın ve şişeleri kuvöze geri yerleştirin. Dokuzuncu günün öğleden sonra, şişelerden yeni çıkan tüm sinekleri çıkarın ve şişeleri kuvöze geri getirin.
16 ila 24 saat sonra, her iki cinsten 250 adet bir günlük yetişkin sinekleri hafif karbondioksit anestezisi altında dört gruba ayırın ve bunları yetişkin orta gıda içeren 250 mililitrelik şişelere aktarın, üçü farklı EDC konsantrasyonları ve biri de sadece EE2 çözücüsüyle tamamlanır. Sinekleri çiftleşmek için 2-3 gün boyunca 25 derecede koruyun. Daha sonra, sineklerin her bir kohortunu sekse göre iki gruba ayırın.
Her tedavi koşulu içinde, her iki cins için, rastgele şişe başına 20 bireylerin yoğunluğunda beş paralel şişeler her grup bölmek. Ölü sinek sayısının bir önceki transferden hayatta kalan sinek sayısından çıkarıldığı bir yaşam süresi tablosu hazırlayın, böylece her transferde kurtulanların sayısı otomatik olarak elde edilir. Üç gün sonra, aynı anda ilgili gıda içeren yeni şişeler anestezi olmadan sinek transfer ve ölüm kontrol edin.
Sineklerin yaşını ve ölü sinek sayısını kaydedin. Tüm sinekler ölene kadar transferi üç günde bir tekrarlayın. Bu deneyde, yaşam süresi eğrileri her EDC konsantrasyonu ve kontrol için geçen gün karşı kümülatif kurtulan lık olarak çizilmiştir.
Kontrol için, hayatta kalma eğrisi nispeten yüksek kaldı uzun bir başlangıç döneminden sonra, yaklaşık 60 gün sonra katlanarak azaldı. EDC maruziyetinin ardından, tedavi edilen sineklerin hayatta kalma eğrisi önemli ölçüde etkilendi ve 36 gün sonra dramatik bir düşüş gösterdi. Bu analiz altında paralel şişeler çok benzer olması gerektiği hakkında tavsiye edilir, aksi takdirde hangi atmak için anlamak zor olacaktır.
Bu nedenle, büyük bir örnek boyutu kullanarak, iyi bir deneysel uygulama benimseyerek, büyük bir özen öneririz. Bu protokolleri takiben, seçilen endokrin bozucunun kuşaklar arası etkisini değerlendirmek ve farklı endokrin bozucuların bir kombinasyonunun potansiyel katkı etkilerini test etmek de mümkündür.
