Yazar, Doug'a sürekli cesaretlendirmesi ve sarsılmaz desteği için ve Melton laboratuvarı üyelerine de yararlı geri bildirimleri ve el yazması hakkındaki yorumları için teşekkür eder. Yazar ayrıca Harvard Hayvan Kaynakları Ofisi'ne (OAR) özverili hayvan bakımı için teşekkür eder.

Tüm hayvan deneyleri, Harvard Üniversitesi'nde IACUC (Protokol #: 11-32) ve AAALAC kılavuzlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Anestezi ve iyileşme için çözümler ve kurulum hazırlama
<ol><li>Anestezi için taze% 0.1 trikain çözeltisi ve% 0.5 sülfamerrazin sodyum tuzu çözeltisi hazırlayın. Su kullanarak çözeltileri ilgili araştırma kurumundaki onaylı IACUC protokollerine göre aksolotl yetiştiriciliği için uygun hale getirin37 (örneğin Holtfreter'in çözümünü değiştirin). Çözeltilerin iyi karıştırıldığından ve tüm aksolotu batırmak için yeterli hacmin hazırlandığından emin olun.<ol>
<li>% 0.1 trikain çözeltisi hazırlamak için, 1 g trikain ve 1 g sodyum bikarbonatı 1 L su ile karıştırın. Çözelti bu tarife göre ölçeklendirilebilir.</li>
		<li>% 0.5 sülfamerazin sodyum tuzu çözeltisi hazırlamak için, 5 g sülfamerazin sodyum tuzunu 1 L su ile karıştırın. Çözelti bu tarife göre ölçeklendirilebilir. Sülfamerrazin çözeltisi, cerrahi iyileşme sırasında bakteriyel enfeksiyonu önleyecek bir antibiyotiktir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cerrahi bölgeyi Clidox-S veya% 70 etanol ile püskürterek sterilize edin. Cerrahi aletleri (forseps, diseksiyon makasları, yaylı makas) otoklavlama ile sterilize edin. Birden fazla ameliyat yapıyorsanız, cerrahi aletleri hayvanlar arasında sıcak boncuk sterilizatörü ile sterilize ettiğinizden emin olun.</li>
	<li>Geri kazanım alanını ayarlamak için, 15 cm'lik bir Petri kabını veya aksolotu ıslak buzla dolu bir kovanın üzerine sığdıracak herhangi bir kabı yerleştirin. Petri kabını, aksolotlün tamamen suya batırılmaması için yeterli% 0.5'lik düşük bir sülfamerazin sodyum tuzu çözeltisi ile doldurun. Ameliyat sonrası buz üzerindeki iyileşme, anesteziden uyanırken hayvanın hareketini yavaşlatacak ve dikişli bölgenin nispeten bozulmadan iyileşmesini sağlayacaktır. NOT: Bu kurulum, hangi malzemelere sahip olduklarına bağlı olarak araştırmacılar tarafından özelleştirilebilir.</li>
</ol>2. Tam deri flebi cerrahi prosedürünün uygulanması
<ol><li>Aksolotl'u% 0.1'lik bir trikain çözeltisine batırarak anestezi altına alın. Bu yaklaşık 15-20 dakika sürecektir. Aksolotlün gerçekten bir kuyruk tutamağı yaparak tamamen anestezi altına alındığından emin olun. Aksolotldan yanıt yoksa, ameliyata devam edin. NOT: Bu ameliyat için daha eski, daha büyük aksolotller kullanın (en az 15 cm boyutunda). Plastik bir pipet kullanarak cildi periyodik olarak aksolotl sistem suyuyla ıslatarak aksolotlün ameliyat boyunca iyi nemlendirildiğinden emin olun. Ameliyattan önce bölgeyi steril PBS ile sulayarak cerrahi bölgeyi aseptik olarak hazırladığınızdan emin olun. Hayvan ayrıca prosedür için steril bir cerrahi örtü üzerine yerleştirilmelidir.</li>
	<li>Diseksiyon makası kullanarak zeugopodial iskelet elemanlarının distal ucunda bir uzuv amputasyonu gerçekleştirin (Şekil 1.1).</li>
	<li>Yay makasını kullanarak, cildin ventral kısmında küçük bir kesi (yaklaşık 2 mm) yapın (Şekil 1.2).</li>
	<li>Forsepsleri kullanarak, cildi zeugopodial iskelet elemanlarının yaklaşık orta çizgisine kadar dikkatlice soyun ve altta yatan uzuv dokularını (kas, kemik vb.) (Şekil 1.3). Cilde zarar vermediğinizden emin olun. 2.8. adımdan sonraki nota bakın.</li>
	<li>Zeugopodun orta hattında açıkta kalan altta yatan ekstremite dokularını cerrahi makas kullanarak amputasyon yapın (Şekil 1.4).</li>
	<li>Kas dokusunu cerrahi makasla geri itin ve açıkta kalan kemiği kesin. NOT: Bu, daha iyi iyileşmeyi sağlamak ve ayrıca çıkıntılı kemik dikişli flebe karşı pürüzlü olabileceğinden ve daha sonra sağlam bir cilt kapağının bütünlüğünü bozabileceğinden, ameliyatın başarısını artırmak için gereklidir.</li>
	<li>Forsepsleri kullanarak, ventral tam kalınlıktaki deriye bağlanarak maruz kalan altta yatan dokuları örtmek ve dikişi yerinde tutmak için ekstra tam kalınlıktaki cildi amputasyon düzlemi üzerine dikkatlice çekin (Şekil 1.5).</li>
	<li>Cildin kalan sağ ve sol taraflarını, sağlam cildin altta yatan ventral kısımlarına dikin. Bu, flebin yanlarını "çapraz çapraz" bir şekilde dikerek (önerilen) (Şekil 1.6-1.9) veya doğrudan ventral cilde dikerek yapılabilir. Dikiş için forseps ve kavisli yay makası kullanın. Açıkta kalan altta yatan dokuların görülmediğinden ve dikişlerin sıkıca bağlandığından (en az üç kez düğümlendiğinden) emin olun. NOT: Sağlam cildin adım 2.4, 2.7-2.8'de hasar görmemesi çok önemlidir. Tam kat deriye verilen hasarın başarısız ameliyatlarla ilişkili olduğunu bulduk, çünkü hasar alanları hala küçük bir yara epidermisi oluşturabilir. Mümkünse, tam kalınlıktaki deri kapağını verirken daha soluk bir çift forseps kullanmaya çalışın.</li>
	<li>Kontralateral uzuv üzerinde bir amputasyon yapın (isteğe bağlı iç hayvan kontrolü), cerrahi makasla orta zeugopod seviyesinde amputasyon yapın. Kas dokusunu cerrahi makasla geri itin ve açıkta kalan kemiği kesin. NOT: Aynı hayvanda 4. adımda ameliyatın başarısını daha iyi değerlendirmek için dahili bir kontralateral ekstremite kontrolü yapılabilir. Bununla birlikte, aynı ekstremitenin ayrı bir hayvanda amputasyonu, kontrol görevi görmek için de kullanılabilir.</li>
</ol>3. Ameliyat sonrası iyileşme ve bakım
<ol><li>Ameliyat tamamlandıktan sonra, ıslatmak için kabın veya Petri kabının altına bir Kimwipe veya steril kağıt havlu yerleştirin. Hayvanı ıslak buz üzerinde kabın içine yerleştirin ve Kimwipe veya kağıt havlunun açıkta kalan uçlarını, sülfamerrazin çözeltisi ile iyi nemlendirilmiş halde tutmak için hayvanın üst kısmına yavaşça sarın. Anesteziden iyileşme sırasında minimum hareket sağlamak için ıslak buz üzerinde 30 dakika ila 1 saat bekletin.</li>
	<li>Hayvanı% 0.5 sülfamerrazin çözeltisi içeren statik bir muhafaza kabına yerleştirin. Aksolotllar, enfeksiyonu önlemek için ilk 24 saat boyunca bu çözeltide kalmalıdır.</li>
	<li>Aksolotlü normal sistem suyuna yerleştirin ve sağlığı günlük olarak izleyin. Her gün hiçbir dikişin düşmediğinden emin olun, çünkü bu, sonuçları karıştıracak küçük bir yara epidermisi oluşumuna neden olabilir. NOT: Muhafaza kabının, aksolotlün hareket etmesi için yeterli alana sahip olduğundan emin olun ve aksolotl üzerindeki dikişli uzuvun kabın yanlarıyla temas etme olasılığını en aza indirin. Bu, özellikle ameliyat sonrası ilk hafta boyunca dikişlerin yerinde kalmasını sağlamaya yardımcı olacaktır.</li>
</ol>4. Ameliyatın başarısının stereo mikroskop altında değerlendirilmesi
NOT: Tam cilt flebinin bütünlüğünü ve ameliyatın başarısını değerlendirmek için hayvanları haftada en az bir kez stereo mikroskop altında kontrol etmenizi öneririz.
<ol><li>Aksolotu Adım 2.1'de olduğu gibi% 0.1 trikain içinde anestezi altına alın. Kapta aksolotlün hareket etmesi için geniş bir alan olduğundan emin olun.</li>
	<li>Ameliyattan sonraki ilk iki hafta boyunca muayene ediliyorsa, dikişlerin çıkmadığından ve berrak bir ince yara epidermisinin hiçbir yerde görünmediğinden emin olmak için dikişli uzuvları bir stereomikroskop kullanarak inceleyin. Ameliyat sonrası üçüncü haftada veya daha sonra muayene yapıyorsanız, bir blastema oluşmadığından emin olun ve normal kontrol ampute uzuvunun (aynı hayvandan veya farklı bir hayvandan) rejenerasyon sırasında nasıl ilerlediği ile karşılaştırın (yani, bir blastema oluşup oluşmadığı).</li>
	<li>Tamamlandığında, aksolotlü normal sistem su ve hayvancılık koşullarına geri döndürün.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Spallanzani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Prodromo Di Un'opera Da Imprimersi Sopra Le Riproduzioni Animali. , (1768).</li><li>Gerber, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+analysis+uncovers+convergence+of+cell+identities+during+axolotl+limb+regeneration.">Single-cell analysis uncovers convergence of cell identities during axolotl limb regeneration.</a> Science. , (2018).</li><li>Leigh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+landscape+of+the+blastema+niche+in+regenerating+adult+axolotl+limbs+at+single-cell+resolution.">Transcriptomic landscape of the blastema niche in regenerating adult axolotl limbs at single-cell resolution.</a> Nature Communications. 9 (1), 5153 (2018).</li><li>Kragl, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cells+keep+a+memory+of+their+tissue+origin+during+axolotl+limb+regeneration.">Cells keep a memory of their tissue origin during axolotl limb regeneration.</a> Nature. 460 (7251), 60-65 (2009).</li><li>McCusker, C., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+limb+blastema:+cellular+and+molecular+mechanisms+driving+blastema+formation+and+limb+regeneration+in+tetrapods.">The axolotl limb blastema: cellular and molecular mechanisms driving blastema formation and limb regeneration in tetrapods.</a> Regeneration (Oxford). 2 (2), 54-71 (2015).</li><li>Endo, T., Bryant, S. V., Gardiner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+model+system+for+limb+regeneration.">A stepwise model system for limb regeneration.</a> Developmental Biology. 270 (1), 135-145 (2004).</li><li>Tsai, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+interplay+between+progenitors+and+immune+cells+in+tissue+regeneration+and+homeostasis.">The molecular interplay between progenitors and immune cells in tissue regeneration and homeostasis.</a> Journal of Immunology and Regenerative Medicine. 7, 100024 (2020).</li><li>Godwin, J. W., Pinto, A. R., Rosenthal, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+are+required+for+adult+salamander+limb+regeneration.">Macrophages are required for adult salamander limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9415-9420 (2013).</li><li>Tanaka, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+and+cellular+choreography+of+appendage+regeneration.">The molecular and cellular choreography of appendage regeneration.</a> Cell. 165 (7), 1598-1608 (2016).</li><li>Campbell, L. J., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wound+epidermis+formation+and+function+in+urodele+amphibian+limb+regeneration.">Wound epidermis formation and function in urodele amphibian limb regeneration.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 65 (1), 73-79 (2008).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+knockin+in+axolotl+and+its+use+to+test+the+role+of+satellite+cells+in+limb+regeneration.">Efficient gene knockin in axolotl and its use to test the role of satellite cells in limb regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (47), 12501-12506 (2017).</li><li>Sandoval-Guzman, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fundamental+differences+in+dedifferentiation+and+stem+cell+recruitment+during+skeletal+muscle+regeneration+in+two+salamander+species.">Fundamental differences in dedifferentiation and stem cell recruitment during skeletal muscle regeneration in two salamander species.</a> Cell Stem Cell. 14 (2), 174-187 (2014).</li><li>Tassava, R. A., Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+injury,+nerves,+and+the+wound+epidermis+during+the+initiation+of+amphibian+limb+regeneration.">The roles of injury, nerves, and the wound epidermis during the initiation of amphibian limb regeneration.</a> Differentiation. 4 (1), 23-24 (1975).</li><li>Hay, E. D., Fischman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+of+the+blastema+in+regenerating+limbs+of+the+newt+Triturus+viridescens.+An+autoradiographic+study+using+tritiated+thymidine+to+follow+cell+proliferation+and+migration.">Origin of the blastema in regenerating limbs of the newt Triturus viridescens. An autoradiographic study using tritiated thymidine to follow cell proliferation and migration.</a> Developmental Biology. 3, 26-59 (1961).</li><li>Christensen, R. N., Tassava, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical+epithelial+cap+morphology+and+fibronectin+gene+expression+in+regenerating+axolotl+limbs.">Apical epithelial cap morphology and fibronectin gene expression in regenerating axolotl limbs.</a> Developmental Dynamics. 217 (2), 216-224 (2000).</li><li>Repesh, L. A., Oberpriller, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+electron+microscopy+of+epidermal+cell+migration+in+wound+healing+during+limb+regeneration+in+the+adult+newt,+Notophthalmus+viridescens.">Scanning electron microscopy of epidermal cell migration in wound healing during limb regeneration in the adult newt, Notophthalmus viridescens.</a> American Journal of Anatomy. 151 (4), 539-555 (1978).</li><li>Neufeld, D. A., Day, F. A., Settles, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+role+of+the+basement+membrane+and+dermal+fibers+during+newt+limb+regeneration.">Stabilizing role of the basement membrane and dermal fibers during newt limb regeneration.</a> Anatomical Record. 245 (1), 122-127 (1996).</li><li>Singer, M., Saltpeter, M. M., Zarrow, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Growth in Living Systems. , (1961).</li><li>Mescher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+on+adult+newt+limb+regeneration+of+partial+and+complete+skin+flaps+over+the+amputation+surface.">Effects on adult newt limb regeneration of partial and complete skin flaps over the amputation surface.</a> Journal of Experimental Zoology. 195 (1), 117-128 (1976).</li><li>Tassava, R. A., Garling, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+responses+in+larval+axolotl+limbs+with+skin+grafts+over+the+amputation+surface.">Regenerative responses in larval axolotl limbs with skin grafts over the amputation surface.</a> Journal of Experimental Zoology. 208 (1), 97-110 (1979).</li><li>Tornier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Der+Kampf+der+Gewebe+im+Regeneratbei+Begunsiigung+der+Hautregeneralion.">Der Kampf der Gewebe im Regeneratbei Begunsiigung der Hautregeneralion.</a> Arch. Entwmech. 22, 348-352 (1906).</li><li>Goss, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerative+inhibition+following+limb+amputation+and+immediate+insertion+into+the+body+cavity.">Regenerative inhibition following limb amputation and immediate insertion into the body cavity.</a> Anatomical Record. 126 (1), 15-27 (1956).</li><li>Thornton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+apical+cap+removal+on+limb+regeneration+in+Amblystoma+larvae.">The effect of apical cap removal on limb regeneration in Amblystoma larvae.</a> Journal of Experimental Zoology. 134 (2), 357-381 (1957).</li><li>Thornton, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+inhibition+of+limb+regeneration+in+urodele+larvae+by+localized+irradiation+with+ultraviolet+light.">The inhibition of limb regeneration in urodele larvae by localized irradiation with ultraviolet light.</a> Journal of Experimental Zoology. 137 (1), 153-179 (1958).</li><li>Tsai, S. L., Baselga-Garriga, C., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Midkine+is+a+dual+regulator+of+wound+epidermis+development+and+inflammation+during+the+initiation+of+limb+regeneration.">Midkine is a dual regulator of wound epidermis development and inflammation during the initiation of limb regeneration.</a> Elife. 9, (2020).</li><li>Nowoshilow, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+axolotl+genome+and+the+evolution+of+key+tissue+formation+regulators.">The axolotl genome and the evolution of key tissue formation regulators.</a> Nature. 554 (7690), 50-55 (2018).</li><li>Elewa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reading+and+editing+the+Pleurodeles+waltl+genome+reveals+novel+features+of+tetrapod+regeneration.">Reading and editing the Pleurodeles waltl genome reveals novel features of tetrapod regeneration.</a> Nature Communications. 8 (1), 2286 (2017).</li><li>Bryant, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Tissue-Mapped+Axolotl+De+Novo+Transcriptome+Enables+Identification+of+Limb+Regeneration+Factors.">A Tissue-Mapped Axolotl De Novo Transcriptome Enables Identification of Limb Regeneration Factors.</a> Cell Reports. 18 (3), 762-776 (2017).</li><li>Looso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+de+novo+assembly+of+the+newt+transcriptome+combined+with+proteomic+validation+identifies+new+protein+families+expressed+during+tissue+regeneration.">A de novo assembly of the newt transcriptome combined with proteomic validation identifies new protein families expressed during tissue regeneration.</a> Genome Biology. 14 (2), 16 (2013).</li><li>Abdullayev, I., Kirkham, M., Bjorklund, A. K., Simon, A., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reference+transcriptome+and+inferred+proteome+for+the+salamander+Notophthalmus+viridescens.">A reference transcriptome and inferred proteome for the salamander Notophthalmus viridescens.</a> Experimental Cell Research. 319 (8), 1187-1197 (2013).</li><li>Burns, J. A., Zhang, H., Hill, E., Kim, E., Kerney, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+analysis+illuminates+the+nature+of+the+intracellular+interaction+in+a+vertebrate-algal+symbiosis.">Transcriptome analysis illuminates the nature of the intracellular interaction in a vertebrate-algal symbiosis.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Nakamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transcriptome+for+the+study+of+early+processes+of+retinal+regeneration+in+the+adult+newt,+Cynops+pyrrhogaster.">A transcriptome for the study of early processes of retinal regeneration in the adult newt, Cynops pyrrhogaster.</a> PLoS One. 9 (10), 109831 (2014).</li><li>Smith, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chromosome-scale+assembly+of+the+axolotl+genome.">A chromosome-scale assembly of the axolotl genome.</a> Genome Research. 29 (2), 317-324 (2019).</li><li>Arenas Gomez, C. M., Woodcock, R. M., Smith, J. J., Voss, S. R., Delgado, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+transcriptomics+to+enable+a+plethodontid+salamander+(Bolitoglossa+ramosi)+for+limb+regeneration+research.">Using transcriptomics to enable a plethodontid salamander (Bolitoglossa ramosi) for limb regeneration research.</a> BMC Genomics. 19 (704), (2018).</li><li>Fei, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+and+optimization+of+CRISPR-Cas9-mediated+genome+engineering+in+axolotl+(Ambystoma+mexicanum).">Application and optimization of CRISPR-Cas9-mediated genome engineering in axolotl (Ambystoma mexicanum).</a> Nature Protocols. 13 (12), 2908-2943 (2018).</li><li>Flowers, G. P., Timberlake, A. T., McLean, K. C., Monaghan, J. R., Crews, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+targeted+mutagenesis+in+axolotl+using+Cas9+RNA-guided+nuclease.">Highly efficient targeted mutagenesis in axolotl using Cas9 RNA-guided nuclease.</a> Development. 141 (10), 2165-2171 (2014).</li><li>Khattak, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+axolotl+(Ambystoma+mexicanum)+husbandry,+breeding,+metamorphosis,+transgenesis+and+tamoxifen-mediated+recombination.">Optimized axolotl (Ambystoma mexicanum) husbandry, breeding, metamorphosis, transgenesis and tamoxifen-mediated recombination.</a> Nature Protocols. 9 (3), 529-540 (2014).</li><li>Joven, A., Elewa, A., Simon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+systems+for+regeneration:+salamanders.">Model systems for regeneration: salamanders.</a> Development. 146 (14), (2019).</li><li>Johnson, K., Bateman, J., DiTommaso, T., Wong, A. Y., Whited, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+cell+cycle+activation+is+induced+following+complex+tissue+injury+in+axolotl.">Systemic cell cycle activation is induced following complex tissue injury in axolotl.</a> Developmental Biology. 433 (2), 461-472 (2018).</li></ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Bu makalede, yara epidermisi oluşumunu inhibe etmek için aksolotl ekstremitelerde tam deri flebi ameliyatlarının yapılması için bir protokol anlatılmaktadır. Bu ameliyat, yara epidermisi oluşumunu inhibe eden diğer yöntemlere kıyasla nispeten basit ve teknik olarak tekrarlanabilir olsa da, ameliyatın başarısını etkileyebilecek birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, sağlam tam cilt kapağını maruz kalan altta yatan dokuların üzerine çekerken, tam kalınlıktaki cildin hiçbir şekilde zarar görmemesi çok önemlidir. Cilt kapağındaki hasar hala küçük bir yara epidermisi oluşumuna yol açabilir, bu da küçük bir blastema benzeri büyümeye neden olabilir. İkincisi, ameliyat sonrası bakım sırasında dikişlerin düşmediğinden emin olun, çünkü bu aynı zamanda küçük bir yara epidermisi oluşumuna da yol açabilir. Bu noktada, dikişli uzuv ile herhangi bir yüzey arasındaki potansiyel teması en aza indirmek, özellikle ameliyat sonrası ilk hafta boyunca önemlidir. Bunu önlemenin birkaç yolu, aksolotlün ameliyat sonrası hareket etmek için bol miktarda alana sahip olması için yeterince büyük bir kapta aksolotlün yuvalanmasını ve anestezi yapılmasını gerektirir.
Bu ameliyatın da bazı sınırlamaları vardır. Belki de en önemlisi, ameliyatların başarısının sadece iki şekilde değerlendirilebilmesidir: ameliyatın ilk iki haftasında diseksiyon kapsamını kullanarak bir yara epidermisinin yokluğunu araştırmak ve / veya 3 hafta içinde bir blastema oluşup oluşmadığını kontrol etmek. Bu yöntemler etkili olsa da, nispeten düşük aktarım hızıdır. Yara epidermise özgü belirteçler için gelecekteki transgenik muhabir aksolotlların geliştirilmesi, başarılı ve başarısız ameliyatlar için daha hızlı taramaya yardımcı olabilir. Ayrıca, sağlam cilt daha kırılgan olduğu için bu ameliyatın genç hayvanlarda yapılması daha zordur. Bu nedenle sub-adult veya adult aksolotlların kullanılması önerilir.
Bu ameliyat başlangıçta N. viridiscens19'da geliştirilmiş olsa da, aksolotllar25,39 için kolayca uyarlanmıştır ve muhtemelen diğer semender türlerine de uygulanabilir. Özetle, bu tekniğin gelecekteki uzuv rejeneratif çalışmalarına uygulanması, araştırmacıların hem yara epidermisi biyolojisini ele almak için daha fazla araç geliştirmelerini hem de blastema oluşumunu başlatmadaki işlevini yürüten altta yatan mekanizmaları tanımlamalarını sağlayacaktır.

Lazzaro Spallanzani'nin 17681'de bildirdiğinden beri, semender uzuv rejenerasyonu, yüzyıllardır biyologları büyüleyen en iyi çalışılmış doğal rejeneratif fenomenlerden biri olmuştur. Başarılı uzuv rejenerasyonu, blastema olarak bilinen farklılaşmamış bir hücresel yapının oluşumuna, büyümesine ve ardından modellenmesine bağlıdır. Araştırmacılar, blastemanın hücresel bileşimini ve oluşumu için hangi destekleyici dokuların ve hücre tiplerinin gerekli olduğunu anlamada önemli adımlar atmışlardır2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Bununla birlikte, blastema oluşumunun başlamasına yol açan farklı dokular ve hücre tipleri arasındaki koordineli sinyal mekanizmaları tam olarak anlaşılamamıştır.
Başarılı blastema oluşumu ve rejenerasyonu için anahtar gereksinim, amputasyondan sonraki 12 saat içinde amputasyon düzlemini kaplayan geçici ve uzmanlaşmış bir epitel olan yara epidermidir10. Amputasyonu takiben, sağlam deri proksimal yaralanmasına kadar epitel hücreleri, ince bir yara epiteli oluşturmak için amputasyon düzlemi üzerinden hızla göç eder14. Blastema sonraki haftalarda oluştukça, erken yara epidermisi apikal epitel kapağı (AEC)15 adı verilen daha kalın bir epitel sinyal yapısına dönüşür. Normal tam kat deri, bazal lamina ile ayrılmış hem epitel hem de dermal tabaka içerirken, yara epidermis/AEC sadece epitel tabakasından oluşur ve bazal laminadan yoksundur16,17. Bazal lamina ve dermisin yokluğu, yara epitel hücreleri ile altta yatan dokular arasında doğrudan temasa izin verir ve bu da hem blastema oluşumu hem de bakım için kritik olan iki bölme arasında çift yönlü sinyalleşmeyi kolaylaştırır17,18.
Klasik deneysel çalışmalarda yara epidermis/AEK fonksiyonunu ve gerekliliğini inhibe ederek oluşumunu inhibe etmek için çeşitli yenilikçi cerrahi yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemler arasında dikiş19 veya amputasyon düzlemi üzerinde tam kalınlıkta deri20,21 greftleme, ampute edilen ekstremitenin derhal vücut boşluğuna dikilmesi22 ve erken yara epidermisinin ve AEC23,24'ün sürekli günlük olarak çıkarılması veya ışınlanması yer alıyordu. Toplamda, bu deneyler sadece yara epidermisi / AEC'nin önemini ortaya koymakla kalmadı, aynı zamanda erken doku histolizindeki rollerini daha da belirledi ve rejenerasyon boyunca progenitör hücre proliferasyonunu ve blastemal büyümeyi13 sürdürdü.
Bununla birlikte, bu önceki çalışmalar büyük ölçüde histolojik boyama ve hücre proliferasyonunu izlemek için tritiated timidin pulses ile sınırlıydı. Aslında, bu klasik deneylerin semenderlerde modern dizileme teknolojileri ve fonksiyonel tekniklerle tekrar gözden geçirilmesi ancak yakın zamanda yapılmış ve rejenerasyonun erken aşamalarında inflamasyon ve ECM bozunması / birikiminin modüle edilmesinde yara epidermisi için ek rollerin keşfedilmesine yol açmıştır25. Çeşitli semender genomu ve transkriptom dizilerinin serbest bırakılmasıyla26,27,28,29,30,31,32,33,34 ve semender türlerinde mevcut fonksiyonel yöntemlerin sayısının artmasıyla11,35,36,37,38 Araştırmacılar şimdi yara epidermisi oluşumunu, fonksiyonunu ve AEC gelişimini yönlendiren moleküler mekanizmaları çözmeye başlamak için iyi konumlandırılmıştır.
Ne yazık ki, yara epidermisi oluşumunu inhibe etmek için kullanılan bu klasik yöntemlerin birçoğu teknik olarak zordur ve aynı deneydeki biyolojik replikalar arasında tekrarlanabilirlik için zorluklar ortaya koymaktadır. Örneğin, cilt greftlerinin bakımı zor olabilir, çünkü greftler sonunda konakçı uzuvdan düşebilir ve yara epidermisi / AEC'nin günlük olarak çıkarılması, altta yatan dokulara zarar vermeden zordur. Ayrıca, ampute edilmiş uzuvun vücut boşluğuna dikilmesi zordur ve ayrıca yerleştirme bölgesinde ek yaralanma gerektirir. Öte yandan, tam kalınlıktaki cildin amputasyon düzlemi üzerine dikilmesi nispeten basittir, teknik olarak tekrarlanabilir ve minimum doku hasarı sağlar. Bu tam deri flebi (FSF) cerrahi yöntemi daha önce Anthony Mescher tarafından 1976 yılında yetişkin yenilerde (Notophthalmus viridiscens) geliştirilmiştir. FSF cerrahisinin hem amputasyon düzlemi üzerinde epitel hücre göçünü hem de epitel hücreleri ile altta yatan dokular arasındaki doğrudan teması yasaklayarak yara epidermisi oluşumunu ve fonksiyonunu inhibe ettiğini gösterdi.
Burada, bu cerrahi prosedür aksolotl uzuv kullanılarak adım adım gösterilmektedir. Günümüz moleküler ve dizileme teknolojileri ile birleştiğinde, bu teknik, araştırmacıların uzuv rejenerasyonu sırasında yara epidermisi / AEC oluşumu ve fonksiyonu hakkındaki anlayışımızı derinleştirmeleri için çok yararlı olabilir.

<table><tbody><tr><td>Curved spring scissors</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>15009-08</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>11252-40</td><td>Need two pairs</td></tr><tr><td>Nylon monofilament sutures (9-0)</td><td>Roboz</td><td>SUT-1000-21</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Leica</td><td>MZ6</td><td></td></tr><tr><td>Sulfamerazine sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>127-58-2</td><td></td></tr><tr><td>Surgical scissors</td><td>Fine Scientific Tools</td><td>14002-14</td><td></td></tr></tbody></table>

inhibition of wound epidermis formation via full skin flap surgery during axolotl limb regeneration

Son yüzyılda semender rejeneratif biyolojisindeki klasik deneyler, yara epidermisinin amputasyon sonrası hızla oluşan ve uzuv rejenerasyonu için gerekli olan çok önemli bir sinyal yapısı olduğunu uzun zamandır ortaya koymuştur. Bununla birlikte, son on yıllarda moleküler düzeyde kesin işlevini inceleme yöntemleri, semender model sistemlerinde bulunan kesin fonksiyonel tekniklerin ve genomik bilgilerin yetersizliği nedeniyle sınırlandırılmıştır. Heyecan verici bir şekilde, çeşitli semender genomlarının serbest bırakılması ve CRISPR de dahil olmak üzere fonksiyonel genetik test yöntemlerinin ortaya çıkmasıyla birleşen dizileme teknolojilerinin son zamanlardaki bolluğu, bu temel deneyleri benzeri görülmemiş moleküler çözünürlükte tekrar ziyaret etmeyi mümkün kılmaktadır. Burada, amputasyondan hemen sonra yara epidermisi oluşumunu inhibe etmek için yetişkin aksolotllarda klasik olarak geliştirilmiş tam deri flebi (FSF) cerrahisinin nasıl yapılacağını anlatıyorum. Yara epidermisi normalde yarayı dış ortamdan kapatmak için amputasyon düzlemine proksimal derideki epitel hücrelerinin distal göçü yoluyla oluşur. Ameliyat, epitel hücre göçünü ve altta yatan hasarlı mezenkimal dokularla teması engellemek için amputasyon düzlemi üzerinde tam kalınlıkta cildin (hem epidermal hem de dermal tabakaları içeren) derhal dikilmesini gerektirir. Başarılı ameliyatlar blastema oluşumunun ve ekstremite rejenerasyonunun inhibisyonu ile sonuçlanır. Bu cerrahi yöntemi çağdaş aşağı akış moleküler ve fonksiyonel analizlerle birleştirerek, araştırmacılar uzuv rejenerasyonu sırasında yara epidermisi fonksiyonunun ve biyolojisinin moleküler temellerini ortaya çıkarmaya başlayabilirler.

Bu cerrahi protokol, yara epidermisi oluşumunun (Şekil 1) ve nihayetinde ekstremite rejenerasyonunun tamamen inhibisyonuna izin verecektir. Başarılı bir ameliyat, hayvanın büyüklüğüne bağlı olarak yaklaşık 2-3 hafta içinde blastema oluşumu ile sonuçlanmazken, kontrol yenileyici uzuvlar normal olarak bir blastema oluşturmalıdır.
Araştırmacılar, dikişlerin dışarı çıkmadığından ve bir blastema oluşmadığından emin olmak için dikişli uzuvları her 2-3 günde bir çıplak gözle incelemelidir. Dikişlerden bir veya daha fazlası çıkarsa, küçük veya büyük bir blastema ve başarısız bir cerrahi ile sonuçlanan bir yara epidermisi oluşabilir (Şekil 2). Ek olarak, araştırmacılar, ince bir yara epidermisinin amputasyon yüzeyinin herhangi bir yerinde belirgin olmadığından emin olmak için dikişli uzuvları haftada en az bir kez stereomikroskop altında incelemelidir. Karşılaştırma için, araştırmacılar amputasyon düzlemi üzerinde bir yara epidermisine sahip olması gereken kontrol yenileyici uzuvları da incelemeli ve 2-3 hafta boyunca bir blastema oluşturmalıdır. Yara epidermisi ince ve berrak görünürken, normal cilt sırasıyla lösistik, albino veya wildtype aksolotllarda daha opak ve soluk pembe (neredeyse beyaz), açık sarı veya koyu yeşil görünecektir.
Araştırmacılar 2-3 haftada blastema oluşum aşamalarından önce doku toplamak isterlerse, dikişlerin yerinde kaldığından ve küçük bir yara epidermisinin oluşmadığından emin olmak için numune toplamadan önce dikişli uzuvları incelemelidirler. Ek olarak, dikişli ekstremite dokusundan sagital olarak kesitleme ve herhangi bir zaman noktasında histolojik analizler yapmak, tüm amputasyon düzlemini çevreleyen tam deri flebinden dermisin varlığını ve bir yara epidermisinin yokluğunu da doğrulayabilir (Şekil 3).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig01.jpg"> Şekil 1: Tam deri flebi ameliyatının basamaklarının şeması. Protokolün adımları burada numaralandırılır ve diyagramı çizilir. Noktalı çizgiler, protokolün 1. ve 3. adımlarındaki amputasyon düzlemlerini gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig02.jpg"> Şekil 2: Başarılı ve başarısız tam deri flebi ameliyatlarına örnekler. Amputasyondan 25 gün sonra başarılı bir ameliyat (solda), başarısız bir ameliyat (sağda) ve kontrol yenileyici bir uzuv (ameliyat olmadan) geçirmiş bir uzuvun temsili parlak alan görüntüsü. Başarılı cerrahi, tam cilt flebinin dikildiği düz bir amputasyon düzlemine sahipken, başarısız ameliyatta küçük bir blastema gelişir. Ok uçları amputasyon düzlemini gösterir ve beyaz noktalı çizgiler, başarılı cerrahide blastema yokluğunun ve başarısız ameliyatta blastema varlığının görselleştirilmesine yardımcı olmak ve yenileyici uzuvları kontrol etmek için vardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61522/61522fig03.jpg"> Şekil 3: Normal rejenere ve FSF dikişli uzuvların histolojik boyanması. (A-B') 7 dpa'da rejenerasyondan (A-A') ve dikişli aksolotl uzuvlardan (B-B') pikro-mallori boyalı kesitlerin temsili parlak alan görüntüleri. A ve B'deki girintiler sırasıyla A' ve B' olarak gösterilir. Kollajen ağırlıklı dermal tabaka çizgilerini çizer ve dikişli uzuvlarda tüm amputasyon düzlemini kaplar. Amputasyon düzlemi A-B'de ok uçları ile gösterilir. Ölçek çubukları 500 μm'yi temsil eder. Bu rakam Tsai ve ark.25'ten uyarlanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61522/61522fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration at JoVE.com

Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

Bu makalede, aksolotl ekstremite rejenerasyonu sırasında yara epidermisi oluşumunu inhibe etmek için amputasyon düzlemi üzerinde tam kalınlıkta deri dikişleyerek cerrahi bir yöntemin nasıl uygulanacağı anlatılmaktadır. Bu yöntem, araştırmacıların ekstremite rejenerasyonunun erken aşamalarında yara epidermisinin fonksiyonel rollerini araştırmalarını sağlar.

Aksolotl Ekstremite Rejenerasyonu Sırasında Tam Cilt Flep Cerrahisi ile Yara Epidermisi Oluşumunun İnhibisyonu

Classical experiments in salamander regenerative biology over the last century have long established that the wound epidermis is a crucial signaling ...

inhibition-wound-epidermis-formation-via-full-skin-flap-surgery

Research

JoVE Journal

Biology

3.0K Görüntüleme.  Harvard University. Bu makalede, aksolotl ekstremite rejenerasyonu sırasında yara epidermisi oluşumunu inhibe etmek için amputasyon düzlemi üzerinde tam kalınlıkta deri dikişleyerek cerrahi bir yöntemin nasıl uygulanacağı anlatılmaktadır. Bu yöntem, araştırmacıların ekstremite rejenerasyonunun erken aşamalarında yara epidermisinin fonksiyonel rollerini araştırmalarını sağlar.

Video: Inhibition of Wound Epidermis Formation via Full Skin Flap Surgery During Axolotl Limb Regeneration

Capturing Tissue Repair in Zebrafish Larvae with Time-lapse Brightfield Stereomicroscopy

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two layers of skin that enclose undifferentiated mesenchyme, and because the larval tail fin regenerates rapidly within 2-3 days. Using this system, we demonstrate a method for capturing the repair dynamics of the amputated tail fin with time-lapse video brightfield stereomicroscopy. We demonstrate that fin amputation triggers a contraction of the amputation wound and extrusion of cells around the wound margin, leading to their subsequent clearance. Fin regeneration proceeds from proximal to distal direction after a short delay. In addition, developmental growth of the larva can be observed during all stages. The presented method provides an opportunity for observing and analyzing whole tissue-scale behaviors such as fin development and growth in a simple microscope setting, which is easily adaptable to any stereomicroscope with time-lapse capabilities.

We present a protocol for capturing the dynamics of zebrafish larval tail fin regeneration on a whole-tissue scale using brightfield-based stereomicroscopy. This technique enables capturing the regeneration dynamics with single cell resolution. This methodology can be adapted to any stereomicroscope equipped with a CCD camera and time-lapse software.

Time-lapse aydınlık stereomikroskobi ile Zebra balığı Larva Doku Onarım yakalama

The zebrafish larval tail fin is ideal for studying tissue regeneration due to the simple architecture of the larval fin-fold, which comprises of two ...

Gelişim Biyolojisi

Generation of Chimeric Axolotls with Mutant Haploid Limbs Through Embryonic Grafting

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as axolotls, to regenerate entire limbs as adults. Here, we outline techniques used to generate chimeric axolotls with Cas9-mutagenized haploid forelimbs that can be used for exploring gene function and the fidelity of limb regeneration. We combine several embryological and genetic techniques, including haploid generation via in vitro activation, CRISPR/Cas9 mutagenesis, and tissue grafting into one protocol to produce a unique system for haploid genetic screening in a model organism of regeneration. This strategy reduces the number of animals, space, and time required for the functional analysis of genes in limb regeneration. This also permits the investigation of regeneration-specific functions of genes that may be required for other essential processes, such as organogenesis, tissue morphogenesis, and other essential embryonic processes. The method described here is a unique platform for conducting haploid genetic screening in a vertebrate model system.

This goal of this protocol is to produce chimeric axolotls with haploid forelimbs derived from Cas9-mutagenized donor tissue using embryonic tissue grafting techniques.

Embriyonik Greftleme Yoluyla Mutant Haploid Ekstremiteler ile Şemerik Axolotls Üretimi

A growing set of genetic techniques and resources enable researchers to probe the molecular origins of the ability of some species of salamanders, such as ...

Genetik

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Biyomühendislik

Engineered Vascularized Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen supply to the cell microenvironment, as passive diffusion is limited to a very thin layer. Although various materials have been described to restore the integrity of full-thickness defects of the abdominal wall, no material has yet proved to be optimal, due to low graft vascularization, tissue rejection, infection, or inadequate mechanical properties. This protocol describes a means of engineering a fully vascularized flap, with a thickness relevant for muscle tissue reconstruction. Cell-embedded poly L-lactic acid/poly lactic-co-glycolic acid constructs are implanted around the mouse femoral artery and vein and maintained in vivo for a period of one or two weeks. The vascularized graft is then transferred as a flap towards a full thickness defect made in the abdomen. This technique replaces the need for autologous tissue sacrifications and may enable the use of in vitro engineered vascularized flaps in many surgical applications.

To date, thick tissue defects are typically reconstructed by applying autologous tissue flaps or engineered tissues. In this protocol, we present a new method for engineering vascularized tissue flap bearing an autologous pedicle, to serve as a substitute to autologous flaps.

Engineered Vaskülarize Muscle Flap

One of the main factors limiting the thickness of a tissue construct and its consequential viability and applicability in vivo, is the control of oxygen ...

Murine Excisional Wound Healing Model and Histological Morphometric Wound Analysis

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, proliferation and remodeling. Murine wounds have a histologically well-defined and easily recognizable wound bed over which these different phases of the healing process are measurable. Within the field, it is common to use an arbitrarily defined &#8220;middle&#8221; of the wound for histological analyses. However, wounds are a three-dimensional entity and often not histologically symmetrical, supporting the need for a well-defined and robust method of quantification to detect morphometric defects with a small effect size. In this protocol, we describe the procedure for creating bilateral, full-thickness excisional wounds in mice as well as a detailed instruction on how to measure morphometric parameters using an image processing program on select serial sections. The two-dimension measurements of wound length, epidermal length, epidermal area, and wound area are used in combination with the known distance between sections to extrapolate the three-dimension epidermal area covering the wound, overall wound area, epidermal volume and wound volume. Although this detailed histological analysis is more time and resource consuming than conventional analyses, its rigor increases the likelihood of detecting novel phenotypes in an inherently complex wound healing process.

This protocol describes how to generate bilateral, full-thickness excisional wounds in mice and how to subsequently monitor, harvest, and prepare the wounds for morphometric analysis. Included is an in-depth description of how to use serial histological sections to define, precisely quantify and detect morphometric defects.

Murine Eksizyonel Yara İyileştirme Modeli ve Histolojik Morfometrik Yara Analizi

The murine excisional wound model has been used extensively to study each of the sequentially overlapping phases of wound healing: inflammation, ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

Yenileyici Yetişkin Zebra balığı Tail Fin içine Morpholinos in vivo olarak Elektroporasyon

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...

Biyoloji

Assessment of Acute Wound Healing using the Dorsal Subcutaneous Polyvinyl Alcohol Sponge Implantation and Excisional Tail Skin Wound Models.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine models provide valuable mechanistic insight into these processes; however, no single model fully addresses all aspects of the wound healing response. Instead, it is ideal to use multiple models to address the different aspects of wound healing. Here, two different methods that address diverse aspects of the wound healing response are described. In the first model, polyvinyl alcohol sponges are subcutaneously implanted along the mouse dorsum. Following sponge retrieval, cells can be isolated by mechanical disruption, and fluids can be extracted by centrifugation, thus allowing for a detailed characterization of cellular and cytokine responses in the acute wound environment. A limitation of this model is the inability to assess the rate of wound closure. For this, a tail skin excision model is utilized. In this model, a 10 mm x 3 mm rectangular piece of tail skin is excised along the dorsal surface, near the base of the tail. This model can be easily photographed for planimetric analysis to determine healing rates and can be excised for histological analysis. Both described methods can be utilized in genetically altered mouse strains, or in conjunction with models of comorbid conditions, such as diabetes, aging, or secondary infection, in order to elucidate wound healing mechanisms.

Here, two murine wound healing models are described, one designed to assess cellular and cytokine wound healing responses and the other to quantify the rate of wound closure. These methods can be used with complex disease models such as diabetes to determine mechanisms of various aspects of poor wound healing.

Dorsal Subkutan Polivinil Alkol Sünger İmplantasyonu ve Eksizyonal Kuyruk Deri Yara Modelleri kullanılarak Akut Yara İyileşmesinin Değerlendirilmesi.

Wound healing is a complex process that requires the orderly progression of inflammation, granulation tissue formation, fibrosis, and resolution. Murine ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Contusion Spinal Cord Injury via a Microsurgical Laminectomy in the Regenerative Axolotl

The purpose of this study is to establish a standardized and reproducible regenerative blunt spinal cord injury model in the axolotl (Ambystoma mexicanum). Most clinical spinal cord injuries occur as high energy blunt traumas, inducing contusion injuries. However, most studies in the axolotl spinal cord have been conducted with sharp traumas. Hence, this study aims to produce a more clinically relevant regenerative model. Due to their impressive ability to regenerate almost any tissue, axolotls are widely used as models in regenerative studies and have been used extensively in spinal cord injury (SCI) studies. In this protocol, the axolotls are anesthetized by submersion in a benzocaine solution. Under the microscope, an angular incision is made bilaterally at a level just caudal to the hind limbs. From this incision, it is possible to dissect and expose the spinous processes. Using forceps and scissors, a two-level laminectomy is performed, exposing the spinal cord. A custom trauma device consisting of a falling rod in a cylinder is constructed, and this device is used to induce a contusion injury to the spinal cord. The incisions are then sutured, and the animal recovers from anesthesia. The surgical approach is successful in exposing the spinal cord. The trauma mechanism can produce contusion injuries to the spinal cord, as confirmed by histology, MRI, and neurological examination. Finally, the spinal cord regenerates from the injury. The critical step of the protocol is removing the spinous processes without inflicting damage to the spinal cord. This step requires training to ensure a safe procedure. Furthermore, wound closure is highly dependent on not inflicting unnecessary damage to the skin during incision. The protocol was performed in a randomized study of 12 animals.

This manuscript presents protocols for surgically inflicting controlled blunt and sharp spinal cord injuries to a regenerative axolotl (Ambystoma mexicanum).

Rejeneratif Axolotl'da Mikrocerrahi Laminektomi Ile Kontüzyon Omurilik Yaralanması

The purpose of this study is to establish a standardized and reproducible regenerative blunt spinal cord injury model in the axolotl (Ambystoma ...

Tıp

A Murine Model of a Burn Wound Reconstructed with an Allogeneic Skin Graft

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and require surgical debridement and skin grafting. Successful integration of the donor graft into a recipient wound bed depends on timely recruitment of immune cells, robust angiogenic response and new extracellular matrix formation. The development of novel therapeutic agents, which target some key processes involved in wound healing, are hindered by the lack of reliable preclinical models with optimized objective assessment of wound closure. Here, we describe an inexpensive and reproducible model of experimental full thickness burn wound reconstructed with an allogeneic skin graft. The wound is induced on the dorsum surface of anaesthetized inbred wild type mice from the BALB/C and SKH1-Hrhr backgrounds. The burn is produced using a brass template measuring 10 mm in diameter, which is preheated to 80 &#176;C and delivered at a constant pressure for 20 s. Burn eschar is excised 24 hours after the injury and replaced with a full thickness graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse. No specialized equipment is required for the procedure and surgical techniques are straightforward to follow. The method may be effortlessly implemented and reproduced in most research settings. Certain limitations are associated with the model. Due to technical difficulties, the harvest of thinner split thickness skin grafts is not possible. The surgical method we describe here allows for the reconstruction of burn wounds using full thickness skin grafts. It may be used to carry out preclinical therapeutic testing.

The aim of this study was to develop a murine model of burn wound healing. A thermal burn was induced on the dorsal skin of mice using a preheated brass template. Burned tissue was debrided and overlaid with a skin graft harvested from the tail of a genetically similar donor mouse.

Allojenik Deri Grefti ile Yeniden Yapılandırılan Yanık Yarasının Murine Modeli

Trivial superficial wounds heal without complications by primary intention. Deep wounds, such as full thickness burns, heal by secondary intention and ...

<meta charset="utf8"></head><body>Aksolotllarda kemik iyileşmesini ve uzuv rejenerasyonunu incelemek için plaka fiksasyonunun kullanılması

Stabilizing a Femur Osteotomy with a Plate Fixation in Ambystoma mexicanum

The axolotl (Ambystoma mexicanum) is a promising model organism for regenerative medicine due to its remarkable ability to regenerate lost or damaged organs, including limbs, brain, heart, tail, and others. Studies on axolotl shed light on cellular and molecular pathways ruling progenitor activation and tissue restoration after injury. This knowledge can be applied to facilitate the healing of regeneration-incompetent injuries, such as bone non-union. In the current protocol, the femur osteotomy stabilization using an internal plate fixation system is described. The procedure was adapted for use in aquatic animals (axolotl, Ambystoma mexicanum). &#8805;20 cm snout-to-tail tip axolotls with fully ossified, mouse-size comparable femurs were used, and special attention was paid to the plate positioning and fixation, as well as to the postoperative care. This surgical technique allows for standardized and stabilized bone fixation and could be useful for direct comparison to axolotl limb regeneration and analogous studies of bone healing across amphibians and mammals.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Hücresel ve Moleküler Mekanizmalar, Kemik İyileşmesi ve İnsan Terapileri için Çıkarımlar Yoluyla Aksolotllarda Rejenerasyonu Keşfetmek

A protocol for femoral osteotomy surgery with the use of internal plate fixation in mature axolotls is presented. The procedure can be used to perform comparative studies on limb regeneration and fracture healing in aquatic amphibians.

Ambystoma mexicanum'da Plak Fiksasyonu ile Femur Osteotomisinin Stabilize Edilmesi

The axolotl (Ambystoma mexicanum) is a promising model organism for regenerative medicine due to its remarkable ability to regenerate lost or damaged ...