Bu protokol axolotl genetik tarama için kullanılabilecek mutajenize haploid ekstremite üretimine izin verir. Haploidlerde, düşük seviyeli mutagenez bile hücrelerde fonksiyon fenotiplerinin kaybına neden olabilir. Bu aşılama tekniği de embriyonik ölümcül fenotipleri kurtarmak için kullanılabilir.
Bu yöntem in vitro fertilizasyon ve greftleme için uygun olan herhangi bir amfibi türünde rejenerasyon çalışması için kullanılabilir. Donör olarak haploid embriyoları kullanmadan önce, GFP pozitif ve negatif diploid embriyolar arasındaki greftlerin başarısını uygulamanızı ve onaylamanızı öneririz. Kadın gamet donör hazırlık için, gamet donör olarak hizmet etmek için bir cinsel olgun beyaz veya beyaz RFP kadın aksitotik.
Ağrı simülasyonuna yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra, arka ekstremite kas dorsal içine 0.15 mililitre insan koryonik gonadotropin enjekte etmek için 30 gauge insülin şırınga kullanın. Omurilikle temas tan kaçınmak için şırıngayı orta hatta 45 derecelik bir açıyla yerleştirin. Enjekte edilen hayvanı taze %40 Holtfreter çözeltisine yerleştirin ve axolotl'ı 48 saat boyunca 8 ila 12 derece lik bir buzdolabına aktarın.
Sonra oda sıcaklığına kadın geri dönün. Dişi yumurtlarken, diseksiyon mikroskobu altında nemli kağıt havlular üzerinde supine pozisyonda tamamen anestezili bir erkek yerleştirin ve baskın el ile cloaca tabanında bir P1000 pipet ucu konum. Diğer işaret parmağı ve başparmak iki ila üç santimetre leğen kemiğine rostral yerleştirin ve yavaşça yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine her örnek toplama spermik idrar örnekleri dışarı floş için arka bacaklara doğru parmakları hareket ederken hayvan sıkmak.
Daha sonra her örnekten beş mikrolitreyi bir Petri kabına aktarın ve ters bir mikroskop kullanarak spermin kalitesini kontrol edin. Saydıktan sonra, 0.1X steril MMR mililitre başına dördüncü hücrelere sekiz kez 10 konsantrasyonsperm seyreltmek ve yeni bir Petri kabına yumurta başına sperm hücrelerinin 0.5 mikrolitre transfer. Daha sonra süspansiyonu bir milimetre kalınlığında bir katmana yaymak için pipet ucunu kullanın ve numuneyi 254 nanometrelik bir crosslinker'ın ampullerinden miliradyasyon için dört santimetre lik bir alana yerleştirmek için plastik bir asansör kullanın.
Sağlıklı bir sperm örneği topladıktan sonra, nemli kağıt havlu bir yığın üzerinde supine pozisyonda kadın yerleştirin ve dişi axolotl döllenmemiş yumurta ayıklamak için benzer bir yıkama hareketi kullanın. Sonra 10 santimetre Petri çanak içine yumurta aktarmak için ıslak forceps kullanın. Toplama dan 15 dakika içinde, 0,25 ila 0,5 mikrolitre inaktive sperm ile her yumurta kaplama döllenmemiş yumurta üzerine ışınlanmış sperm dağıtmak için bir P10 pipet kullanın.
Yumurtaların oda sıcaklığında 30 dakika oturmasına izin vererek, yumurtaları 0,1 X MMR ile doldurun. Hidrasyondan 30 dakika sonra, yumurtaları jölelemek için keskin forsepsler kullanın ve yumurtaları 7 saat içinde mikroenjeksiyon için 18 derecede yerleştirin. Bir haploid-diploid kimera oluşturmak için, bir veya iki aşamalı gfp pozitif diploid konak embriyolar ile sağlıklı bir haploid donör yerleştirin önceden soğutulmuş bir işletim çanak yalak içinde 10 derece santigrat veya daha düşük soğutma aşamasında cerrahi ortam içeren.
Tüm ekstremite tomurcuk ve çevreleyen ektoderm ve mezoderm doku katmanları kaldırmak ve konak doku kenara koymak için iki ultra ince otoklavlı düz uç forceps kullanın. Haploid donörden eşit büyüklüktebir doku kılıfı çıkarın ve haploid donör doku kılıfını konak embriyonun ilgili bölgesine yerleştirin. Ezilmiş bir mikroskop coverglass bir otoklavlı dikdörtgen cam kırık ile doku güvenli ve yavaşça konak embriyo vücuduna doku basın.
Camın kapak camı parçasını soymak için forseps kullanmadan önce kaymadığını doğrulamak için her 20 dakikada bir 60-75 dakika boyunca çapayı yerinde bırakın. Engrafted embriyolar taze cerrahi ortama transfer onları 12 veya 24-well plakaları tek tek engrafted embriyolar konut önce bir gecede sekiz ila 12 santigrat derece iyileşmek için izin. Yumurtaların %38.7'si normal olarak gelişmiş haploid embriyolara dönüşmemiştir.
Greft aşamasında, haploid embriyolar anterior-posterior ekseni boyunca azaltılmış eğrilik ve sarısı fişi eksik bir muhafaza sergilerler. Buna ek olarak, bir floresan mikroskop haploid embriyolar baba kaynaklı GFP ifade ücretsiz olduğunu doğrulamak için kullanılabilir. Başarısız ve saf olmayan greftler çeşitli fenotipler üretir.
Greftler temiz ve normal olarak geliştirildiğinde, GFP ekspresyonu öncelikle brakiyal pleksus ile sınırlandırılmalıdır, konak omurilikten elde edilen sinir ağı. Punctate GFP ekspresyonu, gelişmekte olan ekstremiteiçine göç eden kan kaynaklı konak hücrelerde duyusal nöronlar gibi görünen tek hücrelerde de mevcuttur. RFP pozitif donörler kullanıldığında, haploid greft uzuvları RFP evrensel bir ifade sergiler.
Gelişim boyunca, non-mutajenize olmayan haploid ekstremiteler şimerik hayvanlarda karşıt diploid forelimbs önemli ölçüde daha kısadır. Non-mutajenize haploid uzuvlar tamamen yenilenir, onlar diploidler ile karşılaştırıldığında dijital büyüme aşamasına ulaşmada hafif bir gecikme göstermek rağmen. Steril tekniği kullanmayı unutmayın ve tamamen kaldırmak ve temiz aşılanmış ekstremite üretmek için embriyonik konak tam mezoderm ve ektoderm doku katmanları değiştirin.
Mutant ekstremiteler kesilebilir ve rejenerasyon fenotipleri için puanlandı. Mutant aleller yeni nesil sıralama ile ölçülebilir. CRISPR-Cas9 mutagenezi ile birlikte aşılama tekniğimiz haploid ekstremitelerin yenilenmesinde hedeflenen genlerin negatif seçim taramasını yapmamızı sağlamıştır.
