Bu protokol, araştırmacıların kantitatif davranış analizini moleküler ve kimyasal tedirginliklerle birleştirerek planer davranışı ve bu davranışın altında yatan sn mekanizmalarını netleştirmelerine olanak tanır. Bu teknik, serbest hareket eden planerlerin nicel davranışsal okumalarını almak için gelişmiş araçlar veya özel yazılımgerektirmediği için tüm beceri düzeylerine kolayca erişilebilir. Scrunching planarians istisna çalışma için kullanılabilir, ve ksenobiyotikler ve hastalığın neden olduğu sinir sistemi fonksiyonu bozan, tsay hassas uç noktası olarak hizmet vermektedir.
Düz bir yüzeye kısılabilir bir LED Panel yerleştirerek başlayın, hangi tek tip beyaz arka plan sağlayacak ve uygun kontrast elde etmek için ayarlanabilir bir ışık kaynağı olarak kullanılabilir. LED Panel üzerine 100 milimetrelik Petri çanak arenayerleştirin. Arenanın üzerinde bir halka standına kamera yerleştirin ve konumu, yüksekliği ve odağı gerektiği gibi ayarlayın, böylece tüm arena görüş alanı içinde ortalanır ve odak ta.
Maksimum ses düzeyine sahip olmak için alanı yaklaşık 25 mililitre uygun pozlama ortamıyla doldurun, LED Paneli açın ve kayıt kalitesini olumsuz etkileyebilecek diğer ışık kaynaklarını kapatın. Bir transfer Pipet kullanarak arenanın merkezinde bir planarian bırakın. Kimyasal bir çözelti test ederken, planarian mümkün olduğunca az planarian su ile transfer, böylece kimyasal konsantrasyonu önemli ölçüde değişmez.
Verileri yerel Fiji biçiminde görüntü dizileri olarak kaydetmeye başlayın. Süzülme deneyleri için, bir ila iki dakikalık kayma davranışı kaydedin, scrunching veya peristalsis deneyleri için, düz bir çizgide meydana gelen en az üç ardışık salınımı yakalayacak kadar uzun bir kayıt yapın. Deneme tamamlandıktan sonra kaydı sonlandırın.
Eğer planarian sonlandırma kriterini karşılamadan arenanın sınırına ulaşırsa, planarian'ı arenanın merkezine geri getirin. Fiji'deki bir deneme için ham görüntü sırasını açın, sekiz bit'e dönüştürün ve görüntü dizisini kaydırmak için görüntü yığınının altındaki ok aracını veya kaydırıcıyı kullanın. Bir zaman dilimini ve ilgi çekici bölgeyi ayıklamak için, dikdörtgen aracını kullanarak bir planacının tam yolunu kapsayan bir ilgi alanı çizin.
Resim yığınına sağ tıklayın ve yinelenen'i seçin, yinelenen yığının bulunduğu kutuyu işaretleyin. İlgi sırasının ilk ve son karelerini girin ve tamam'ı tıklatın. Süzülme deneyleri için, planarian scrunching veya peristalsis deneyleri için vücut uzunluğunun en az iki katı hareket nerede kayma bir süre ayıklayın.
Planarian düz bir çizgi de üç ardışık ve tam vücut salınımları en az uğrar bir örnek ayıklayın. Görüntüyü binarize etmek ve planacıyı arka plandan ayıklamak için yinelenen görüntü yığınına bir eşik uygulayın, kayar çubukları tüm planacının kırmızı yla vurgulanması için ayarlayın. Tam değerler görüntüleme kalitesine bağlıdır.
Kutuları koyu arka plan için bırakın, histogram ıstifleyin ve aralığı işaretsiz sıfırlamayın. İyi bir eşik aralığı sağlamak için görüntü yığınında ilerleyin ve ardından uygula'yı tıklatın. Dönüştürme yığınında ikili pencereye, yöntemi varsayılan, arka planı ışığa ayarlayın.
Bu penceredeki tüm kutuların işaretlerini kaldırın ve tamam'ı tıklatın. Beyaz arka plan üzerinde siyah bir planarian gösteren binarized görüntü görüntülenir. Görüntü dizisinin tüm karelerinde tüm planacının görünür olduğundan emin olun.
Analiz et ve ölçümleri ayarla'yı tıklatarak ölçümleri ayarlayın. Alan, kütle merkezi, yığın konumu ve uygun elips için kutuları işaretleyin, sonra tamam tıklatın. Açık görüntü yığınını seçin ve analiz et ve parçacıkları analiz et.
Parçacıkları çözümleme penceresinde, seçilen parametrelerle algılanan tüm nesneleri gösteren yeni bir yığın açmak için göster ve maskeleri seçin. Planarian'ın yaklaşık alanını girerek istenmeyen gürültüyü gidermek için bir boyut filtresi ayarlayın. Ardından, ekran sonuçları ve net sonuçlar için kutuları işaretleyin ve tamam'ı tıklatın.
Panelin altındaki kaydırıcıyı kullanarak maske görüntü yığınını kaydırarak, planarian olmadan gürültü veya çerçeve olmadığından emin olun. Sonuç penceresinde, dosyayı kullanarak verileri kaydedin ve verileri virgülle ayrılmış değerler olarak kaydetmek için dosya adına CSV uzantısını ekleyin. Görüntü yığınına ait veriler kaydedildikten sonra, ilgili görüntü yığını sonuçlarını kapatın ve pencereleri maskeleyin.
Zararlı sıcaklık, sıcak bir tabak üzerinde 65 santigrat derece bir cam kabında ısı planarian su ile scrunching neden olmak için. Arenanın ortasına bir planarian yerleştirin ve kendini dik yönlendirir ve kayma başlar kadar bekleyin, sonra kayıt başlar. P 200 Pipet'i kullanarak önceden ısıtılmış planer suyun 100 mikrolitrelik pipetini yavaş ve tutarlı bir şekilde kullanın, scrunching'i tetiklemek için planarianın kuyruk ucuna faringeal sonrası.
Kaydı durdurun, bir kez scrunching durdu. Planarian'ı bir kurtarma kabına yerleştirin ve daha fazla deney çalıştırıyorsa, ortamı petri kabında taze oda sıcaklığında planer suyla değiştirin. Ampütasyon yoluyla scrunching ikna etmek için, arenanın merkezine bir planarian transfer ve planarian kendini dik yönlendirir ve kayma başlar kadar bekleyin.
Sonra kayıt başlar, temiz bir jilet ile planarian amputate. Kesme yerinin denemeler arasında tutarlı olduğundan emin olun. Ön parça scrunching durdu ktan sonra kaydı durdurun.
Her iki parçayı çıkarın, ayrı bir kapta yerleştirin ve yedi gün boyunca yeniden izin verin. Amputated planarians onlar rejenere sonra ev konteyner içine yeniden dahil edilebilir. Bu protokol UV ışık maruziyeti yakın olup olmadığını test etmek için kullanılmıştır, S.mediterranea ve D.japonica planarians scrunch neden olurken, D.japonica planarians scrunch, uv ışık yakın maruz kaldığında, S.mediterranea planarians ya kuyruk inceltme ya da yanıt yok.
En az üç ardışık düz çizgi scrunches sergilenen D.japonica planarians için scrunching parametrelerinin bir nicelik, farelerde 250 mikromolar kinamaldehit bilinmeyen TRPA kontrast maruz kalma, scrunching ve S.mediterranea neden olur bu tür için scrunching parametreleri ortaya koymaktadır. D.japonica planarians kayma veya güçlü baş döner tarafından kesilen yılan gibi ve salınımhareketi karışımı görüntüler. Örneklerin ardışık en az üç salınımlı bir niceliği, dört parametreden üçü için önemli ölçüde daha düşük değerler kazandıktan sonra D.japonica'da scrunching için beklenen, gözlenen salınım hareketinin scrunching olmadığını gösteriyor.
RNAi scrunching özgüllüğünü ve S.mediterranea cinnamaldehit maruziyetine yanıt doğrular. Planarian suda maruz kalma 180 saniye içinde, tüm kontrol RNAi planarian scrunched. SMTRPA bir RNAi planarians s.mediterranea scrunching cinnamaldehit smtrpa bir gerektirdiğini gösteren hiçbiri ile karşılaştırıldığında.
Tutarlı olmak ve hayvanların gürültüyü azaltmak ve davranışsal ölçümlerde tekrarlanabilirliği sağlamak için nasıl manipüle edildiği önemlidir. Bu projeler, burada yakalanmayan diğer planer davranışların tanımlanmasına ve ölçülmesine olanak sağlayacak vücut şekli analizini içerecek şekilde genişletilebilir.
