Bu çalışma kısmen Biyomedikal Mühendisliği ve Teknolojisi Merkezi (BioMET) tarafından desteklendi; NIH (1U01HL116321) ve (1R01HL142290) ve Amerikan Kalp Derneği 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).

Tüm hayvan bakımı Maryland Baltimore Üniversitesi'nin yönergelerine ve Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onaylı protokollere uygundu.
1. Çözümlerin hazırlanması
NOT: Çözümleri önceden hazırlayın. Deneylerde iki tür temel çözüm kullanılmaktadır: (1) banyo superfusate için fizyolojik tuzlu su çözeltileri (PSS) ve (2) Lümen perfüzyonu için Tirot çözeltileri. PSS'nin pH'ını korumak için CO2 ile sürekli kabarcıklanma gereklidir. HEPES tamponlu Tyrode'un çözeltisi, kabarcıkların damarlara girmesini önlemek için PSS yerine lümende kullanılır, çünkü kabarcıklar endotelhücrelerine 7 zarar verir ve akışı tıkar.
<ol><li>PSS çözümü: Tablo 1'de PSS çözümünün formülüne ve bileşimine bakın. 10 L Ca2+içermeyen ve glikozsuz PSS stok çözeltisi yapın ve oda sıcaklığında saklayın. Herhangi bir işlemden önce 1 saat, çözeltinin pH'ını ~7.4'te tutmak için% 5 CO2 (% 74N 2 ve%21 O 2)ile stok çözeltisinden 1 L ve kabarcık alın. 1.8 g glikoz ve 1.8 mL CaCl2 (1 M stok)8ekleyin. NOT: Ca2+'yı yalnızca pH ~7.4 olduğunda köpürdükten sonra ekleyin, aksi takdirde Ca2+ çöker.</li>
	<li>Tyrode'un çözümü: Tablo 1'deTyrode'un çözümünün formülünü ve bileşimini görün. Çözeltiyi filtreleyin (0,22 μm) ve ileride kullanım için 4 °C'de saklanır9.</li>
	<li>Tyrode'un BDM ile çözümü (2,3-Butanedione monoksim): Miyositlerin kasılmasını önlemek için ters çevrilebilir bir miyofilament inhibitörü olarak BDM ekleyin10. 600 mg BDM ağırlığında ve 200 mL Tyrode çözeltisine ekleyin. Çözeltiyi tamamen çözünene kadar BDM ile karıştırın. Daha fazla filtrasyona gerek yoktur.</li>
	<li>Tyrode'un BDM içeren çözümünü ileride kullanmak üzere 4 °C'de saklayın.</li>
</ol>2. Oda hazırlığı
<ol><li>Üretici tarafından sağlanan talimatları izleyerek hem diseksiyon odasını hem de deneysel odayı polidimetilsiloksisan (PDMS) ile önceden kaplayın.</li>
	<li>Diseksiyon odasını Tyrode'un BDM içeren çözeltisi ile doldurun.</li>
	<li>İşlemden önce soğutucuyu 1 saat açın. Sıcaklığı 4 °C olarak ayarlayın.</li>
</ol>3.Ül hazırlığı
<ol><li>Mikropipette puller'ı açın. Üreticinin yönergelerine göre ayarları seçin.</li>
	<li>Temiz bir borosilikat cam tüp alın (kullanılan cam tüplerin dış ve iç çapı sırasıyla 1,2 mm ve 0,69 mm idi).</li>
	<li>U şeklinde platin ısıtma filamentli bir Sutter pipet çekme makinesinin yivli kelepçelerine bir cam tüp yerleştirin.</li>
	<li>Her biri uzun ince uçlu iki kanonül üretmek için çekmeciyi etkinleştirin.</li>
	<li>Ucun son çapını 100 ila 150 μm civarında yapmak için her bir canülün ucunu bir kesme mikroskobu altında ince bir makas kullanarak kesin.</li>
	<li>Ateş, keskin kenarları hafifçe yuvarlamak için kesilmiş canülun ucunu parlatır.</li>
	<li>Kanülleri, şaftın kenarına uçtan yaklaşık 2 mm uzaklıkta yerleştirilmiş platin bir tel (ince kontrolle ısıtılmış) kullanarak şaft boyunca bükün. Bükümdeki virajın açısı 45 ° civarında olmalıdır.</li>
	<li>Kanolün açık ucını basınçlı miyograf odasının tutucusuna yerleştirin ve bağlantı elemanını sıkın. Tyrode'un çözeltisi ile dolu 5 mL'lik bir şırınnayı bağlantı parçasının diğer tarafına bağlayın. Canülleri odaya monte edilmiş bir mikromanipülatöre bağlayın (bkz. Şekil 1 ve Şekil 2).</li>
	<li>Şırınd (5 mL), yıkama, boru ve hava kabarcıklarının konektörünü kullanarak kanolü Tyrode'un çözeltisiyle doldurun.</li>
	<li>Kanülasyon işleminden önce, kanül içindeki perfüzyon basıncını belirli bir akış aralığında ölçün (50 ila 300 μL/dk, Şekil 3). Bunu yalnızca yeni bir cannula kullanıldığında yapın. NOT: Kanül içindeki perfüzyon basıncı akışla orantılıdır ve doğrusal olarak monte edilmiştir (Şekil 3).</li>
</ol>4. Fare kalbinin çıkarılması
<ol><li>Izofluran ve oksijen tanklarına bağlı anestezi kutusuna bir C57BL/6 fare (seks, 8-16 haftalık) koyun.</li>
	<li>Oksijen tankını açın ve izofluran akışını başlatın. Fare tamamen uyuşturulup uyuşturuluna kadar ~5 dakika bekleyin.</li>
	<li>Anestezi kurulduktan sonra, fareyi anestezi kutusundan alın ve vaskültürde kan pıhtısı oluşumunu önlemek için heparin IP'yi (periton boşluğuna, 360 ünite, 0,5 mL / fare) enjekte edin. Sonra fareyi anestezi kutusuna geri koyun.</li>
	<li>Heparin enjekte edildikten 10 dakika sonra, fareyi supine pozisyonunda ısıtılmış yatağa hareket ettirin ve etiketleme bandı kullanarak pençelerini stabilize edin. Fareyi burun konisi kullanarak izofluran ile tam anestezi altında tutun.</li>
	<li>Farenin karın derisini önps ile diyaframın üzerine kaldırın ve diyaframı kesmek ve açığa çıkarmak için cerrahi makas kullanın.</li>
	<li>Diyaframı ve göğüs kemiğini kesin. Göğsünü aç.</li>
	<li>Kalbi torasik boşluktan parçalara ayrıştırarak sırt torasik duvarına mümkün olduğunca yakın keser.</li>
	<li>Kalbi buz gibi Tyrode'un 30 mM BDM içeren çözeltisine yerleştirin.</li>
	<li>Akciğer gibi bağ dokularını çıkarmak için kalbi temizleyin.</li>
	<li>Kalbi, 30 mM BDM içeren Tyrode çözeltisi ile dolu önceden soğutulmuş diseksiyon odasına aktarın.</li>
</ol>5. Septal arterin hazırlanması ve kanülasyonu
<ol><li>Servo pompayı aç. Servo pompayı "akış" moduna ayarlayın. Boru, vasküler lümeni boğmak için kullanılacak Tyrode çözeltisi ile doldurulana kadar yüksek hızda çalışmasına izin verin. Tüpte kabarcık olmadığından emin olun. O zaman hızı düşür.</li>
	<li>Kalbi PDMS'ye sabitleyerek kalbin orta bölgesinde herhangi bir hasar olmasını önler.</li>
	<li>Hem sağ hem de sol atriayı çıkarın. Sağ ventrikülü kesin ve bir diseksiyon mikroskobu kullanarak sağ ventrikül içermeyen duvarı çıkarın.</li>
	<li>Septal arteri açığa çıkar ve tanımla. Septal arterin altına bir naylon iplik (30 μm çapında) yerleştirin ve ileride kullanmak için gevşek bir düğüm bağlayın. NOT: Septal arter, diseksiyon mikroskobu kullanılarak kolayca tanımlanabilir. Septal arter, çoğu durumda sağ koroner arterden kaynaklanan septum üzerindeki ana arterdir.</li>
	<li>İnce makas kullanarak sol ventrikül içermeyen duvarı çıkarın.</li>
	<li>Papiller kas preparatını, canüllerin yer aldığı deneysel odaya aktarın. Oda, Tyrode'un BDM içeren çözeltisi ile doludur. Bu odanın tabanı ince (~2 mm) pdms tabakası ile kaplanmıştır.</li>
	<li>Septal arterin kanülasyonunu etkinleştirmek için kanüllerin konumunu (mikromanipülatör kullanarak) ayarlayın. Düğümü sıkın.</li>
	<li>Papiller kası oda zeminine küçük pimler kullanarak sabitleyin, böylece mikroskop hedefi vaskülatın net bir görünümüne sahiptir. Kanül açısına ve konumuna dikkat edin ve kanül ucunun arteriyel duvara paralel olduğundan emin olun.</li>
	<li>Çözeltiyi şırındiden kanülden kademeli olarak dışarı atarak kanülasyonu test edin. Tüm elementler düzgün çalışırsa, papiller kastaki artık kan bu sürecin başında dokudan çıkar ve daha sonra sadece Tirode'un çözeltisi görülür.</li>
</ol>6. Hazırlığın stabilizasyonu
<ol><li>Süperfüzyon çözeltisini sağlayacak peristaltik pompayı açın. Daha sonra banyodaki preparatı 3-4 mL / dk oranında önceden gazlanmış PSS ile sürekli olarak superfuse edin.</li>
	<li>Süperfüzyon çözeltisi için sıcaklık kontrol cihazını açın. Banyonun sıcaklığını ~35-37 °C'ye ayarlayın.</li>
	<li>Cannula'yı servo pompaya bağlayın. Basınç servo denetleyicisinde görüntülenen basıncı okuyun.</li>
	<li>Akışı ve basıncı izleyin. Akış (μL/dk) ve arteriyel perfüzyon basıncı (mm Hg) sayısallaştırıcı kullanılarak dijitalleştirilir ve ilişkili bir yazılım kullanılarak kaydedilir (Şekil 2).</li>
	<li>Basıncı ~10 mmHg ayarlamak için akışı ayarlayın ve ~10 dakika boyunca çalışmasına izin verin.</li>
	<li>Arter basıncını ~60 mmHg yapmak için ışık çözeltisinin akışını artırın. Kanül basınç damlasını çıkararak arteriyolün kendisinin son perfüzyon basıncını elde edin (Şekil 3). NOT: Basınç servo denetleyicisindeki "basınç" modu seçilirse, bu deneyler için ışık basıncı ~60 mmHg olarak ayarlanır. Ardından akışın değişimini izleyin.</li>
	<li>Akış ve/veya basınç seviyelerini izleyerek numunenin ~30-60 dakika stabilize olsun. Normalde kanülasyondan sonra perfüzyonun başlangıcında arteriyel basıncın kademeli bir artışı gözlenir. Yeni bir istikrarlı durum yaklaşık 30 dakika içinde kendiliğinden kurulacaktır (Şekil 4).</li>
	<li>Perfüzyon basıncı stabilize edildikten sonra (sabit akışta) bir deney başlatın.</li>
</ol>7. Hazırlığı floresan etiketli buğday-germ agglutinin (WGA) ile yüklemek
<ol><li>5 mL Tyrode çözümüne 100 μg eşleştirilmiş WGA ekleyerek Alexa-Fluor-488 konjuge WGA içeren Tyrode'un çözümünü hazırlayın.</li>
	<li>Perfüzyonu normal Tyrode'un çözeltisinden floresan etiketli WGA içeren bir çözeltiye dikkatlice değiştirin. Perfüzyonu dikkatlice değiştirmek önemlidir, böylece kabarcıklar kullanılmaz.</li>
	<li>~30 dakikalık WGA perfüzyondan sonra veya WGA çözeltisi bitmek üzereyken perfüzyonu normal Tyrode'un çözümüne değiştirin.</li>
</ol>8. Arteriyüllerin ve kılcal damarların konfokal görüntülemesi
<ol><li>Nipkow disk konfokal mikroskop sistemini açın.</li>
	<li>İletilen ışık modunda düşük güç hedefi (4x) kullanarak septal arteri bulmak için mikroskobu kullanın. NOT: Septal arter kanül pozisyonunu takip ederek yerlenebilir.</li>
	<li>Dönen disk konfokal ile konfokal görüntülemeye başlayın ve 488 nm ekscitasyon lazeri, 40x objektif büyütme seçin ve lazer yoğunluğunu ve örnekleme oranını (görüntü başına 10 - 500 ms) ayarlayın.</li>
	<li>Görüntüleme aralığını tanımlamak ve z yığını görüntüleme parametrelerini girmek için konfokal mikroskop için üst ve alt görüntüleme konumlarını ayarlayın.</li>
	<li>Kullanılan sistem için önerilen adım boyutunu ayarlayın veya adım boyutunu istediğiniz gibi ayarlayın.</li>
	<li>z yığını ayarını ve/veya zaman serisi ayarlarını seçin.</li>
	<li>Yeni görüntüyü depolamak için yeni bir klasör seçin veya ayarlayın.</li>
	<li>İleride analiz için görüntüleme kaydetmeye başlamak için "Çalıştır" ı tıklatın (Şekil 5).</li>
</ol>9. Örnek vazodilatör deneyi: pinacidil kaynaklı vazodilasyon (Video 1).
<ol><li>Pinacidil stok çözeltisi (DMSO'da 100 mM) hazırlayın ve 4 °C'de saklanın.</li>
	<li>10 mL Tyrode çözeltisi hazırlayın. Son pinacidil konsantrasyonunu 100 μM yapmak için 10 μL pinacidil stok çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Septal arteri ve dal arterlerini içerecek şekilde papiller kası düşük büyütmede (4x amaç) görüntüleyin.</li>
	<li>Işıltılı çözeltiyi pinacidil içeren çözeltiye geçirin.</li>
</ol>10. Örnek kan akışı kontrol deneyleri: vazokonstriktör kaynaklı arteriyel perfüzyon basıncı sabit akışta artar (Şekil 6)
<ol><li>Endotelin-1 (ET-1) stok çözeltisi (10 μM) hazırlayın ve -20 °C'de saklanın.</li>
	<li>10 mL Tyrode çözeltisi hazırlayın. Son ET-1 10 nM konsantrasyonunu yapmak için 10 μL ET-1 stok çözeltisi (10 μM) ekleyin.</li>
	<li>Işık basıncını sürekli akışla kaydedin ve papiller kası görüntüleyin.</li>
	<li>Işıklı çözeltiyi ET-1 içeren çözeltiye geçirin.</li>
</ol>11. Perisitli kılcal damarların örnek görüntüleri (Şekil 7)
<ol><li>Bu protokolün bölüm 4'lerinde açıklandığı gibi bir NG2DsRedBAC transgenik fare feda edin.</li>
	<li>Kalbi çıkarın, septal arteri kanüle edin ve örneği 5-7 protokollerini izleyerek Alexa-Fluor-488 konjuge WGA ile yükleyin.</li>
	<li>Papiller kası 488 nm ve 560 nm ekscitasyonda ve konfokal kullanarak 510-525 nm, 575-625 nm emisyonda görüntüleyin. Arteriole basıncı 40 mmHg civarında olacaktır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-+and+voltage-dependent+electro-metabolic+signaling+regulates+blood+flow+in+heart.">ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).</li><li>Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+perfusion+pressure+on+force+of+contraction+in+thin+papillary+muscles+and+trabeculae+from+rat+heart.">Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart.</a> Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).</li><li>Tillmanns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+in+the+ventricle+of+the+dog+and+turtle.">Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle.</a> Circulation Research. 34, 561-569 (1974).</li><li>Martini, J., Honig, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+intercapillary+distance+in+beating+rat+heart+in+situ+under+various+conditions+of+O2+supply.">Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply.</a> Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).</li><li>Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+coronary+vessel+pressure+and+diameter+in+an+intact+beating+rabbit+heart+using+fixed-position+and+free-motion+techniques.">Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques.</a> Circulation Research. 49, 342-353 (1981).</li><li>Marcus, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+coronary+circulation+through+studies+at+the+microvascular+level.">Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level.</a> Circulation. 82, 1-7 (1990).</li><li>Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protocol+for+removal+of+the+endothelium+from+the+perfused+rat+hind-limb+preparation.">A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation.</a> Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).</li><li>Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+inositol+1,4,5-trisphosphate+receptors+mediate+UTP-induced+cation+currents,+Ca2++signals,+and+vasoconstriction+in+cerebral+arteries.">Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries.</a> Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).</li><li>Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM1+enhances+SR+Ca2++content+through+binding+phospholamban+in+rat+ventricular+myocytes.">STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).</li><li>Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contraction+uncoupling+with+butanedione+monoxime+versus+low+calcium+or+high+potassium+solutions+on+flow+and+contractile+function+of+isolated+hearts+after+prolonged+hypothermic+perfusion.">Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion.</a> Circulation. 89, 2412-2420 (1994).</li><li>Lawton, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Low-Cost+and+Open+Source+Pressure+Myograph+System+for+Vascular+Physiology.">a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology.</a> Frontiers in Physiology. 10, 99 (2019).</li><li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation.">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).</li></ol>

Mevcut çalışmada, fizyolojik koşullar altında kalpteki koroner mikroskrkülasyonu incelemek için son derece basit ama son derece pratik bir ex vivo yöntemi sunduk. Bu yöntem, sıçanlar kullanılarak mekanik araştırmalardan değiştirilmiştir2. Zorlu ek, yüksek hızlı ve yüksek optik çözünürlüğe sahip görüntüleme teknolojisiydi. Bu nedenle, şu anda piyasada bulunan gelişmiş optik görüntüleme sistemlerinden yararlanabildik. Çalışan papiller kas preparatının uygun b...

Uygun koroner basınç akışı düzenlemesi, kalbin metabolik taleplerini karşılamak için yeterli kan akışını sağlar1. Bununla birlikte, son on yıldır in vivo ve in vitro olarak yapılan kapsamlı çalışmalara rağmen, koroner basınç akışının kalpte nasıl dinamik olarak düzenlendiği daha yeni ortaya çıktı. Bunun nedenlerinden biri, kalbin sürekli atması nedeniyle bu tür çalışmalar için fizyolojik bir çalışma modeli oluşturmanın zorluğudur. Ne olursa olsun, koroner mikro damarların canlı dokularda veya hayvanlarda gözlemlenmesi için çeşitli yöntemler oluşturulmuştur, ancak bu yöntemlerin hiçbiri sabit / kararlı odak ve basınç, akış ve mikrovasküler çap ölçümlerini aynı anda elde edemedi2,3. Atan kalpte koroner arteriyel mikro damarların doğrudan görselleştirilmesi on yıllar önce tanıtıldı4,3, ancak küçük damarlardaki çap ölçümleri zorluydu ve mikrosirkülasyonla ilişkili birçok özel hücre tipinin spesifik işlevleri eşit derecede can sıkıcıydı. Stroboscopic yöntem ve yüzen nesnel sistem bile yukarıdaki bilgileri aynı anda sağlayamadı5. Bununla birlikte, koroner kan akışının düzenlenmesi hakkında daha fazla bilgi edinmemize yardımcı olan yukarıda belirtilen teknolojiler kullanılarak önemli miktarda değerli bilgi elde edilmiştir6. Bu makalede anlattığımız yöntem, koroner arterlerin, arterioles ve mikrovasküler arter bileşenlerinin stimülasyonlara ve metabolik taleplere nasıl farklı yanıt verdiğini ayrıntılı olarak araştırmamıza ve anlamamıza yardımcı olacaktır.
Bu çalışmaları sürdürmek için kurduğumuz çalışma modeli Westerhof ve ark.2'ninönceki çalışmaları üzerine inşa edildi. Fare kalbinin septal arterinin kanülasyonunu takiben, kalp dokusunun miyositlerini ve diğer bileşenlerini besleyen arteri boğmak için fizyolojik salin çözeltisi kullanıldı. Arteriyel perfüzyon basıncı, akış ve damar çapı diğer fizyolojik fonksiyonlar arasında uygun floresan göstergeler kullanılarak izlendi. Bu yöntem, canlı dokuda fizyolojik basınç altında koroner mikrovasküler yatağı görselleştirmemizi ve mikro sirkülasyon regülasyonunun altında yatan hücresel mekanizmaları ilk kez incelememizi sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2 solution</td>
			<td>MilliporeSigma, USA</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2 solution</td>
			<td>MilliporeSigma, USA</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxoScope software</td>
			<td>Molecular Devices, San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chiller/water incubator</td>
			<td>FisherScientific, USA</td>
			<td>Isotemp 3016S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Nikon Instruments, USA</td>
			<td>A1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom glass tubing</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>9-000-3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1322A</td>
			<td>Molecular Devices, San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin-1</td>
			<td>MilliporeSigma, USA</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline solution Heater</td>
			<td>Warner Istruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VETone, Idaho, USA</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette/cannula holder</td>
			<td>Warner Istruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>64-0981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2DsRedBAC transgenic mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>#008241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon thread for tying blood vessels</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA</td>
			<td>THR-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (polydimethylsiloxane)</td>
			<td>SYLGARD, Germantown, WI, USA</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson, Middleton, WI, USA</td>
			<td>minipuls 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Servo Controller</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA</td>
			<td>PS-200-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>15000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo Pump</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA</td>
			<td>PS-200-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>W11261</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic measurement and imaging of capillaries, arterioles, and pericytes in mouse heart

Kılcal damarların açılması veya kapanması ile birlikte koroner arteriyel ton, sabit perfüzyon basıncında kardiyomiyositlere kan akışını büyük ölçüde belirler. Bununla birlikte, koroner arteriyüllerin ve tüm kalpteki kılcal damarların dinamik değişikliklerini, öncelikle hareketi ve durmadan atması nedeniyle izlemek zordur. Burada, fare sağ ventrikül papiller kaslarındaki arteriyel perfüzyon oranının, basıncının ve arteriyüllerin ve kılcal damarların çap değişikliklerinin izlenmesini sağlayan bir yöntemi açıklıyoruz. Fare septal arteri, dinamik olarak ölçülen diğer ile sabit bir akışta veya basınçta kanüle edilir ve perfüzyona edilir. Floresan etiketli bir lektin (örneğin, Alexa Fluor-488 veya -633 wheat-germ Agglutinin, WGA) etiketli perfüzyondan sonra, sağ ventrikül papiller kas ve septumdaki arteriüller ve kılcal damarlar (ve diğer damarlar) kolayca görüntülenebilir. Damar çapı değişiklikleri daha sonra kalp kasılmalarının varlığında veya yokluğunda ölçülebilir. Genetik olarak kodlanmış floresan proteinler ifade edildiğinde, belirli özellikler izlenebilirdi. Örneğin, perisitler NG2-DsRed'i ifade eden fare kalplerinde görselleştirildi. Bu yöntem, kalpteki kılcal perisitlerin fizyolojik işlevlerini incelemek için yararlı bir platform sağlamıştır. Damar/kılcal çapı ve arteriyel ışık basıncını aynı anda ölçerek reaktiflerin kalpteki kan akışı üzerindeki etkisini incelemek için de uygundur. Bu preparat, son teknoloji optik görüntüleme sistemi ile birlikte, kişinin kan akışını ve kontrolünü fizyolojik koşullar altında kalpteki hücresel ve moleküler düzeyde incelemesini sağlar.

Bir floresan vasküler belirteç vasküler lümende perfüzyona girdiğinde (burada WGA, Alexa Fluor-488 ile eşleştirilmiş), yüksek hızlı konfokal mikroskop kullanarak Şekil 5'te (Sol panel) gösterildiği gibi tüm vasküler ağaçları görselleştirmek mümkündür. Daha fazla büyütme, kılcal damarların ayrıntılı olarak görüntülenmesini sağlar (Şekil 5, Sağ Panel). Basınçlı sistem ışık basıncının sürekli izlenmesini desteklediği...

Watch this Scientific Journal Video about Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart at JoVE.com

Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Burada, septal arter kanüle edildiği ve basınçlandırıldığı için kılcal yataklar ve perisitler de dahil olmak üzere damar ağacı bileşenlerinin yanı sıra basıncı koruyan arteriyel perfüzyon basıncının ve akışının eks vivo izlenmesi ile canlı murine kalp dokusundaki koroner mikrositülasyonu incelemek için bir protokol sunulmaktadır.

Fare Kalbinde Kılcal Damarlar, Arterioles ve Perisitlerin Dinamik Ölçümü ve Görüntülenmesi

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

dynamic-measurement-imaging-capillaries-arterioles-pericytes-mouse

Research

JoVE Journal

Medicine

5.3K Görüntüleme.  University of Maryland School of Medicine. Burada, septal arter kanüle edildiği ve basınçlandırıldığı için kılcal yataklar ve perisitler de dahil olmak üzere damar ağacı bileşenlerinin yanı sıra basıncı koruyan arteriyel perfüzyon basıncının ve akışının eks vivo izlenmesi ile canlı murine kalp dokusundaki koroner mikrositülasyonu incelemek için bir protokol sunulmaktadır.

Video: Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment for melanoma remains surgical excision, therefore, the key to extended survival is early detection 2,3. Considering the large numbers of patients diagnosed every year and the limitations in accessing specialized care quickly, the development of objective in vivo diagnostic instruments to aid the diagnosis is essential. New techniques to detect skin cancer, especially non-invasive diagnostic tools, are being explored in numerous laboratories. Along with the surgical methods, techniques such as digital photography, dermoscopy, multispectral imaging systems (MelaFind), laser-based systems (confocal scanning laser microscopy, laser doppler perfusion imaging, optical coherence tomography), ultrasound, magnetic resonance imaging, are being tested. Each technique offers unique advantages and disadvantages, many of which pose a compromise between effectiveness and accuracy versus ease of use and cost considerations. Details about these techniques and comparisons are available in the literature 4.
Infrared (IR) imaging was shown to be a useful method to diagnose the signs of certain diseases by measuring the local skin temperature. There is a large body of evidence showing that disease or deviation from normal functioning are accompanied by changes of the temperature of the body, which again affect the temperature of the skin 5,6. Accurate data about the temperature of the human body and skin can provide a wealth of information on the processes responsible for heat generation and thermoregulation, in particular the deviation from normal conditions, often caused by disease. However, IR imaging has not been widely recognized in medicine due to the premature use of the technology 7,8 several decades ago, when temperature measurement accuracy and the spatial resolution were inadequate and sophisticated image processing tools were unavailable. This situation changed dramatically in the late 1990s-2000s. Advances in IR instrumentation, implementation of digital image processing algorithms and dynamic IR imaging, which enables scientists to analyze not only the spatial, but also the temporal thermal behavior of the skin 9, allowed breakthroughs in the field.
In our research, we explore the feasibility of IR imaging, combined with theoretical and experimental studies, as a cost effective, non-invasive, in vivo optical measurement technique for tumor detection, with emphasis on the screening and early detection of melanoma 10-13. In this study, we show data obtained in a patient study in which patients that possess a pigmented lesion with a clinical indication for biopsy are selected for imaging. We compared the difference in thermal responses between healthy and malignant tissue and compared our data with biopsy results. We concluded that the increased metabolic activity of the melanoma lesion can be detected by dynamic infrared imaging.

We demonstrated that malignant pigmented lesions with increased metabolic activity generate quantifiable amounts of heat and the measurement of the transient thermal response of the skin to a cooling excitation allows quantitative identification of melanoma and other skin cancers (vs. non-proliferative nevi) at an early stage of the disease.

Kantitatif Görselleştirme ve Dinamik Termal Görüntüleme Deri Kanseri Tespiti

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Tıp

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are associated with obesity, though the precise underlying mechanisms that contribute to the disease are currently being delineated.2,3 Several small animal models of obesity have been developed and are employed in a variety of studies.4 A critical component to these experiments involves the collection of regional and/or total animal fat content data under varied conditions.
Traditional experimental methods available for measuring fat content in small animal models of obesity include invasive (e.g. ex vivo measurement of fat deposits) and non-invasive (e.g. Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA), or Magnetic Resonance (MR)) protocols, each of which presents relative trade-offs. Current invasive methods for measuring fat content may provide details for organ and region specific fat distribution, but sacrificing the subjects will preclude longitudinal assessments. Conversely, current non-invasive strategies provide limited details for organ and region specific fat distribution, but enable valuable longitudinal assessment. With the advent of dedicated small animal X-ray computed tomography (CT) systems and customized analytical procedures, both organ and region specific analysis of fat distribution and longitudinal profiling may be possible. Recent reports have validated the use of CT for in vivo longitudinal imaging of adiposity in living mice.5,6 Here we provide a modified method that allows for fat/total volume measurement, analysis and visualization utilizing the Carestream Molecular Imaging Albira CT system in conjunction with PMOD and Volview software packages.

Fat content analysis is routinely conducted in studies utilizing murine obesity models. Emerging methods in small animal CT imaging and analysis are providing for longitudinal detail rich fat content analysis. Here we detail step by step procedures for performing small animal CT imaging, analysis, and visualization.

Segmentasyon ve Mürin Obezite Modelleri Yağ Hacimleri ölçümü X-ray Bilgisayarlı Tomografi Kullanımı

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can accurately screen for brain injury, monitor injury evolution, or assess response to therapy. The energy used by neurons is derived largely from tissue oxidative metabolism, and neural hyperactivity and cell death are reflected by corresponding changes in cerebral oxygen metabolism (CMRO2). Thus, measures of CMRO2 are reflective of neuronal viability and provide critical diagnostic information, making CMRO2 an ideal target for bedside measurement of brain health.
Brain-imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) yield measures of cerebral glucose and oxygen metabolism, but these techniques require the administration of radionucleotides, so they are used in only the most acute cases.
Continuous-wave near-infrared spectroscopy (CWNIRS) provides non-invasive and non-ionizing radiation measures of hemoglobin oxygen saturation (SO2) as a surrogate for cerebral oxygen consumption. However, SO2 is less than ideal as a surrogate for cerebral oxygen metabolism as it is influenced by both oxygen delivery and consumption. Furthermore, measurements of SO2 are not sensitive enough to detect brain injury hours after the insult 1,2, because oxygen consumption and delivery reach equilibrium after acute transients 3. We investigated the possibility of using more sophisticated NIRS optical methods to quantify cerebral oxygen metabolism at the bedside in healthy and brain-injured newborns. More specifically, we combined the frequency-domain NIRS (FDNIRS) measure of SO2 with the diffuse correlation spectroscopy (DCS) measure of blood flow index (CBFi) to yield an index of CMRO2 (CMRO2i) 4,5.
With the combined FDNIRS/DCS system we are able to quantify cerebral metabolism and hemodynamics. This represents an improvement over CWNIRS for detecting brain health, brain development, and response to therapy in neonates. Moreover, this method adheres to all neonatal intensive care unit (NICU) policies on infection control and institutional policies on laser safety. Future work will seek to integrate the two instruments to reduce acquisition time at the bedside and to implement real-time feedback on data quality to reduce the rate of data rejection.

We combined frequency-domain near-infrared spectroscopy measures of cerebral hemoglobin oxygenation with diffuse correlation spectroscopy measures of cerebral blood flow index to estimate an index of oxygen metabolism. We tested the utility of this measure as a bedside screening tool to evaluate the health and development of the newborn brain.

Bebeklerde Serebral Metabolizma ve Hemodinamiğin Noninvaziv Optik Ölçüm

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

MRI and PET in Mouse Models of Myocardial Infarction

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ideal model for testing novel therapeutic strategies.
In vivo magnetic resonance imaging (MRI) gives excellent views of the heart noninvasively with clear anatomical detail, which can be used for accurate functional assessment. Contrast agents can provide basic measures of tissue viability but these are nonspecific. Positron emission tomography (PET) is a complementary technique that is highly specific for molecular imaging, but lacks the anatomical detail of MRI. Used together, these techniques offer a sensitive, specific and quantitative tool for the assessment of the heart in disease and recovery following treatment.
In this paper we explain how these methods are carried out in mouse models of acute myocardial infarction. The procedures described here were designed for the assessment of putative protective drug treatments. We used MRI to measure systolic function and infarct size with late gadolinium enhancement, and PET with fluorodeoxyglucose (FDG) to assess metabolic function in the infarcted region. The paper focuses on practical aspects such as slice planning, accurate gating, drug delivery, segmentation of images, and multimodal coregistration. The methods presented here achieve good repeatability and accuracy maintaining a high throughput.

We describe how to perform MRI and PET imaging of the mouse heart. The protocol is tailored to assess treatment efficacy in models of myocardial infarction and heart failure.

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease and injury regional estimates, World Health Organization, 2004). Surgeries that often compromise the quality of life are required to correct heart defects, reminding us of the importance of finding the causes of CHD. Mutant mouse models and live imaging technology have become essential tools to study the etiology of this disease. Although advanced methods allow live imaging of abnormal hearts in embryos, the physiological and hemodynamic states of the latter are often compromised due to surgical and/or lengthy procedures. Noninvasive ultrasound imaging, however, can be used without surgically exposing the embryos, thereby maintaining their physiology. Herein, we use simple M-mode ultrasound to assess heart rates of embryos at E18.5 in utero. The detection of abnormal heart rates is indeed a good indicator of dysfunction of the heart and thus constitutes a first step in the identification of developmental defects that may lead to heart failure.

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Ultra-high frequency ultrasound is a powerful live imaging tool to examine cardiac abnormalities in small animals. Its noninvasiveness allows maintaining the physiologic state of embryos. Herein, we show the use of M-mode ultrasound to measure the heart rates of embryos at E18.5 in utero.

Noninvaziv M-mod ekokardiyografi ile Fare Kalp Puan utero Ölçümünde

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

Diagnostic Ultrasound Imaging of Mouse Diaphragm Function

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive surgical procedures. Although this is an effective method of assessing in vitro diaphragm activity, it involves non-survival surgery. The application of non-invasive ultrasound imaging as an in vivo procedure is beneficial since it not only reduces the number of animals sacrificed, but is also suitable for monitoring disease progression in live mice. Thus, our ultrasound imaging method may likely assist in the development of novel therapies that alleviate muscle injury induced by various respiratory diseases. Particularly, in clinical diagnoses of obstructive lung diseases, ultrasound imaging has the potential to be used in conjunction with other standard tests to detect the early onset of diaphragm muscle fatigue. In the current protocol, we describe how to accurately evaluate diaphragm contractility in a mouse model using a diagnostic ultrasound imaging technique.

Diagnostic ultrasound imaging has proven to be effective in diagnosing various respiratory diseases in human and animal subjects. We demonstrate a comprehensive ultrasound protocol utilized by Dr. Zuo's lab to analyze diaphragm kinetics specifically in mouse models. This is also a non-invasive research technique which can provide quantitative information on mouse respiratory muscle function.

Fare Diyafram Fonksiyonu Diagnostik Ultrason Görüntüleme

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular diseases, such as diabetic retinopathy, hypertensive retinopathy, and possibly glaucoma. Therefore, retinal microvascular preparations are pivotal tools for physiological and pharmacological studies to delineate the underlying pathophysiological mechanisms and to design therapies for the diseases. Despite the wide use of mouse models in ophthalmic research, studies on retinal vascular reactivity are scarce in this species. A major reason for this discrepancy is the challenging isolation procedures owing to the small size of these retinal blood vessels, which is ~ &#8804; 30 &#181;m in luminal diameter. To circumvent the problem of direct isolation of these retinal microvessels for functional studies, we established an isolation and preparation technique that enables ex vivo studies of mouse retinal vasoactivity under near-physiological conditions. Although the present experimental preparations will specifically refer to the mouse retinal arterioles, this methodology can readily be employed to microvessels from rats.

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Many vision-threatening ocular diseases are associated with dysfunctional retinal microvessels. Therefore, the measurement of retinal arteriole responses is important to investigate the underlying pathophysiological mechanisms. This article describes a detailed protocol for mouse retinal arteriole isolation and preparation to assess the effects of vasoactive substances on vascular diameter.

Fare retina arteriyoller Ex Vivo reaktivite ölçümü için hazırlık adımları

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing continuous remodeling with the competing activity of osteoblasts, which produce the new bone matrix, and osteoclasts, whose function is to eliminate mineralized bone. [18F]-NaF is a positron emission tomography (PET) radiotracer that enables visualization of bone metabolism. [18F]-NaF is chemically absorbed into hydroxyapatite in the bone matrix by osteoblasts and can thus noninvasively detect osteoblastic activity, which is occult to conventional imaging techniques. Kinetic modeling of dynamic [18F]-NaF-PET data provides detailed quantitative measures of bone metabolism. Conventional semi-quantitative PET data, which utilizes standardized uptake values (SUVs) as a measure of radiotracer activity, is referred to as a static technique due to its snapshot of tracer uptake in time.&#160; Kinetic modeling, however, utilizes dynamic image data where tracer levels are continuously acquired providing tracer uptake temporal resolution. From the kinetic modeling of dynamic data, quantitative values like blood flow and metabolic rate (i.e., potentially informative metrics of tracer dynamics) can be extracted, all with respect to the measured activity in the image data. When combined with dual modality PET-MRI, region-specific kinetic data can be correlated with anatomically registered high-resolution structural and pathologic information afforded by MRI. The goal of this methodological manuscript is to outline detailed techniques for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data. The lumbar facet joint is a common site of degenerative arthritis disease and a common cause for axial low back pain.&#160; Recent studies suggest [18F]-NaF-PET may serve as a useful biomarker of painful facetogenic disease.&#160; The human lumbar facet joint will, therefore, be used as a prototypical region of interest for dynamic [18F]-NaF-PET-MRI analysis in this manuscript.

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. We present detailed methodologies for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data in a patient with facetogenic low back pain using the lumbar facet joints as a prototypical region of interest.

Nicel [18F]-Facetogenic alçak sırt ağrısı olan bir hastada dinamik kemik cirosunun değerlendirilmesi Için NAF-Pet-MRI Analizi

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

Murine Kardiyak Perisitlerin İzolasyon ve Safifikasyonu

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

Faredeki Sinoatriyal ve Atriyoventriküler Düğümün Tam Montajlı İmmünofloresan Boyama, Konfokal Görüntüleme ve 3D Rekonstrüksiyonu

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...