Questo lavoro è stato sostenuto in parte dal Centro per l'Ingegneria e la Tecnologia Biomedica (BioMET); NIH (1U01HL116321) e (1R01HL142290) e l'American Heart Association 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).

Tutta la cura degli animali era conforme alle linee guida dell'Università del Maryland baltimora e il Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali ha approvato protocolli.
1. Preparazione delle soluzioni
NOTA: Preparare le soluzioni in anticipo. Negli esperimenti vengono utilizzati due tipi di soluzioni di base: (1) soluzioni saline fisiologiche (PSS) per il superfusato da bagno e (2) soluzioni tyrode per il perfusato di lume. È necessario un continuogorgogliamento con CO 2 per mantenere il pH della PSS. La soluzione di Tyrode tamponata da HEPES viene utilizzata nel lume al posto del PSS per evitare che bolle che entrano nei vasi, poiché le bolle danneggeranno le cellule endoteliali7 e occluderebbero il flusso.
<ol><li>Soluzione PSS: Vedere la formula e la composizione della soluzione PSS nella tabella 1. Preparare 10 L dica 2+-free e glucosio-free PSS soluzione di magazzino e conservare a temperatura ambiente. 1 h prima di qualsiasi procedura, esenzi 1 L della soluzione stock e bolla con il 5% di CO 2 (74% N2 e 21% O2)per mantenere il pH dellasoluzione a ~7,4. Aggiungere 1,8 g di glucosio e 1,8 mL CaCl2 (1 M stock)8. NOTA: Aggiungere Ca2+ solo dopo il gorgogliamento quando il pH è ~7,4, altrimenti, Ca2+ verrà precipitato.</li>
	<li>Soluzione del tirolo: vedere la formula e la composizione della soluzione del tirolo nella tabella 1. Filtrare la soluzione (0,22 μm) e conservata a 4 °C per un uso futuro9.</li>
	<li>Soluzione di Tirode con BDM (2,3-Butanedione monoxime): Aggiungere BDM come inibitore reversibile del miofilamento per prevenire la contrazione dei miociti10. Pesare 600 mg di BDM e aggiungere a 200 mL della soluzione di Tyrode. Mescolare la soluzione con BDM fino a quando non è completamente sciolta. Non è richiesta ulteriore filtrazione.</li>
	<li>Conservare la soluzione tyrode contenente BDM a 4 °C per un uso futuro.</li>
</ol>2. Preparazione della camera
<ol><li>Rivestire in anticipo sia la camera di sezionatura che la camera sperimentale con polidimetilsilossano (PDMS) seguendo le istruzioni fornite dal produttore.</li>
	<li>Riempire la camera di sezionatura con la soluzione tyrode contenente BDM.</li>
	<li>Accendere il refrigeratore 1 h prima della procedura. Impostare la temperatura a 4 °C.</li>
</ol>3. Preparazione della cannula
<ol><li>Accendere l'estrattore di micropipette. Selezionare le impostazioni in base alle istruzioni del produttore.</li>
	<li>Prendere un tubo di vetro borosilicato pulito (il diametro esterno e interno dei tubi di vetro utilizzati era rispettivamente di 1,2 mm e 0,69 mm).</li>
	<li>Inserire un tubo di vetro nei morsetti scanalati di un estrattore di pipetta Sutter con un filamento riscaldante in platino a forma di U.</li>
	<li>Attivare l'estrattore per produrre due cannulae, ognuna con una punta lunga e sottile.</li>
	<li>Tagliare la punta di ogni cannula usando un bel paio di forbici sotto un microscopio sezionante per fare il diametro finale della punta intorno a 100-150 μm.</li>
	<li>Lucidare la punta della cannula tagliata per arrotondare leggermente i bordi affilati.</li>
	<li>Piegare la cannula lungo l'albero utilizzando un filo di platino (riscaldato con controllo fine) posizionato sul lato dell'albero a circa 2 mm dalla punta. L'angolo della curva nella cannula dovrebbe essere di circa 45°.</li>
	<li>Inserire l'estremità aperta della cannula nel supporto della camera del miografo a pressione e stringere il raccordo. Collegare una siringa da 5 ml riempita con la soluzione di Tyrode all'altro lato del raccordo. Collegare la cannula a un micromanipolatore montato sulla camera (vedere figura 1 e figura 2).</li>
	<li>Riempire la cannula con la soluzione di Tyrode utilizzando la siringa (5 ml), lavarla, il tubo e il connettore delle bolle d'aria.</li>
	<li>Prima della procedura di cannula, misurare la pressione di perfusione all'interno della cannula su un determinato intervallo di flusso (da 50 a 300 μL/min, Figura 3). Farlo solo quando viene utilizzata una nuova cannula. NOTA: La pressione di perfusione all'interno della cannula è proporzionale al flusso ed è lineare(Figura 3).</li>
</ol>4. Estrazione del cuore di topo
<ol><li>Mettere un mouse C57BL/6 (entrambi i sessi, 8-16 settimane) nella scatola di anestesia collegata ai serbatoi di isoflurane e ossigeno.</li>
	<li>Accendere il serbatoio dell'ossigeno e iniziare il flusso di isoflurane. Attendere ~ 5 minuti fino a quando il mouse non è completamente anestetizzato.</li>
	<li>Dopo aver stabilito l'anestesia, espellere il mouse dalla scatola dell'anestesia e iniettare IP di eparina (nella cavità peritoneale, 360 unità, 0,5 mL / topo) per evitare la formazione di coaguli di sangue nella vascucolatura. Quindi rimettere il mouse nella scatola dell'anestesia.</li>
	<li>10 minuti dopo che l'eparina è stata iniettata, spostare il mouse sul letto riscaldato in posizione supina e stabilizzare le zampe usando il nastro adesivo. Tenere il topo in anestesia completa con isoflurane usando un cono nasale.</li>
	<li>Sollevare la pelle addominale del topo sopra il diaframma con le forcep e utilizzare forbici chirurgiche per tagliare ed esporre il diaframma.</li>
	<li>Tagliare il diaframma e lo sterno. Apri il petto.</li>
	<li>Sezionare il cuore dalla cavità toracica, tagliando il più vicino possibile alla parete toracica dorsale.</li>
	<li>Posizionare il cuore nella soluzione tyrode ghiacciata contenente 30 mM BDM.</li>
	<li>Pulire il cuore per rimuovere i tessuti connettivi come il polmone.</li>
	<li>Trasferire il cuore nella camera di sezionatura pre-refrigerata riempita con la soluzione di Tyrode contenente 30 mM di BDM.</li>
</ol>5. Preparazione e cannula dell'arteria settosa
<ol><li>Accendere la servopompa. Impostare la servopompa sulla modalità "flusso". Lasciare correre ad alta velocità fino a quando il tubo non viene riempito con la soluzione del Tirolo che verrà utilizzata per perfondere il lume vascolare. Assicurati che non ci siano bolle nei tubi. Quindi abbassare la velocità.</li>
	<li>Inchiodare il cuore al PDMS, evitando danni alla zona centrale del cuore.</li>
	<li>Rimuovere sia gli atri destro che sinistro. Aprire il ventricolo destro e rimuovere la parete libera ventricolare destra utilizzando un microscopio sezionato.</li>
	<li>Esporre e identificare l'arteria del setto. Posizionare un filo di nylon (30 μm di diametro) sotto l'arteria del setto e legare un nodo sciolto per un uso futuro. NOTA: L'arteria del setto può essere facilmente identificata utilizzando un microscopio sezionante. L'arteria settosa è un'arteria maggiore sul setto originata dall'arteria coronarica destra nella maggior parte dei casi.</li>
	<li>Rimuovere la parete libera ventricolare sinistra usando forbici fini.</li>
	<li>Trasferire la preparazione del muscolo papillare nella camera sperimentale in cui è stata posizionata la cannula. La camera è riempita con la soluzione di Tyrode contenente BDM. Il fondo di questa camera è rivestito con uno strato sottile (~ 2 mm) di PDMS.</li>
	<li>Regolare la posizione della cannula (utilizzando il micromanipolatore) per consentire la cannula dell'arteria settosa. Stringi il nodo.</li>
	<li>Fissare il muscolo papillare usando piccoli perni al pavimento della camera in modo che l'obiettivo del microscopio abbia una visione chiara della vascucolatura. Prestare attenzione all'angolo e alla posizione della cannula e assicurarsi che la punta della cannula sia parallela alla parete arteriosa.</li>
	<li>Testare la cannula espellendo gradualmente la soluzione dalla siringa attraverso la cannula. Se tutti gli elementi funzionano correttamente, il sangue residuo nel muscolo papillare uscirà dal tessuto all'inizio di questo processo e solo la soluzione di Tiroide sarà vista in seguito.</li>
</ol>6. Stabilizzazione del preparato
<ol><li>Accendere la pompa peristaltica che fornirà la soluzione di superfusione. Quindi potenziare costantemente la preparazione nella vasca da bagno con PSS pre-gassato alla velocità di 3-4 mL / min.</li>
	<li>Accendere il regolatore di temperatura per la soluzione di superfusione. Regolare la temperatura del superfusato del bagno a ~35-37 °C.</li>
	<li>Collegare la cannula alla servopompa. Leggere la pressione visualizzata sul servore controller di pressione.</li>
	<li>Monitorare il flusso e la pressione. Il flusso (μL/min) e la pressione arteriosa perfusionale (mm Hg) vengono digitalizzati utilizzando il digitalizzatore e registrati utilizzando un software associato (Figura 2).</li>
	<li>Regolare il flusso per impostare la pressione ~10 mmHg e lasciarla funzionare per ~ 10 min.</li>
	<li>Aumentare il flusso della soluzione luminare per fare la pressione dell'arteria ~ 60 mmHg. Ottenere la pressione di perfusione finale dell'arteriola stessa sottraendo la caduta di pressione della cannula (Figura 3). NOTA: Se è selezionata la modalità "pressione" sul servoretore di pressione, la pressione luminare è impostata ~60 mmHg per questi esperimenti. Quindi monitorare il cambiamento del flusso.</li>
	<li>Lasciare che il campione si stabilizzi per ~ 30-60 minuti monitorando i livelli di flusso e / o pressione. Un graduale aumento della pressione arteriosa si osserva normalmente all'inizio della perfusione dopo la cannulazione. Un nuovo stato stazionario si stabilirà da solo in circa 30 minuti(figura 4).</li>
	<li>Avviare un esperimento dopo che la pressione di perfusione è stata stabilizzata (a flusso costante).</li>
</ol>7. Caricamento del preparato con agglutinina di germe di grano con tag fluorescente (WGA)
<ol><li>Preparare la soluzione di Tyrode contenente WGA coniugata Alexa-Fluor-488 aggiungendo 100 μg di WGA coniugato in 5 mL della soluzione di Tyrode.</li>
	<li>Passare con cura il perfusato dalla normale soluzione tyrode a una contenente WGA con tag fluorescente. È importante cambiare attentamente il perfusato in modo che non siano introdotte bolle.</li>
	<li>Dopo ~ 30 minuti di perfusione WGA o quando la soluzione WGA sta per esaurirsi, modificare il perfuso di nuovo nella normale soluzione di Tyrode.</li>
</ol>8. Imaging confocale di arteriole e capillari
<ol><li>Accendere il sistema di microscopio confocale del disco di Nipkow.</li>
	<li>Utilizzare il microscopio per localizzare l'arteria del setto utilizzando un obiettivo a bassa potenza (4x) in modalità luce trasmessa. NOTA: L'arteria setta può essere posizionata seguendo la posizione della cannula.</li>
	<li>Inizia l'imaging confocale con il confocale del disco rotante e scegli il laser di eccitazione a 488 nm, l'ingrandimento obiettivo 40x e regola l'intensità del laser e la frequenza di campionamento (10 - 500 ms per immagine).</li>
	<li>Impostare le posizioni di imaging superiore e inferiore per il microscopio confocale per definire l'intervallo di imaging e immettere i parametri per l'imaging z-stack.</li>
	<li>Impostare la dimensione del passaggio come consigliato per il sistema utilizzato o impostare le dimensioni del passaggio come desiderato.</li>
	<li>Scegliere l'impostazione z-stack e/o le impostazioni delle serie temporali.</li>
	<li>Selezionare o impostare una nuova cartella per archiviare la nuova immagine.</li>
	<li>Fare clic su "Esegui" per avviare la registrazione dell'imaging per l'analisifutura ( Figura 5).</li>
</ol>9. Esempio di esperimento vasodilatatore: vasodilatazione indotta da pinacidil (Video 1).
<ol><li>Preparare la soluzione di materiale pinacidile (100 mM in DMSO) e conservarla a 4 °C.</li>
	<li>Preparare 10 mL della soluzione di Tyrode. Aggiungere 10 μL di soluzione di titolo pinacidile per effettuare la concentrazione finale di pinacidil 100 μM.</li>
	<li>Immagine del muscolo papillare a basso ingrandimento (obiettivo 4x) per includere l'arteria settica e le arteriole del ramo.</li>
	<li>Passare la soluzione luminale alla soluzione contenente pinacidil.</li>
</ol>10. Esempi di esperimenti di controllo del flusso sanguigno: aumento della pressione arteriosa indotta da vasocostrittore a flusso costante (Figura 6)
<ol><li>Preparare la soluzione stock di endotelina-1 (ET-1) (10 μM) e conservarla a -20 °C.</li>
	<li>Preparare 10 mL della soluzione di Tyrode. Aggiungere 10 μL di soluzione stock ET-1 (10 μM) per effettuare la concentrazione finale di ET-1 10 nM.</li>
	<li>Registrare la pressione luminare con flusso costante e l'immagine del muscolo papillare.</li>
	<li>Passare la soluzione luminale alla soluzione contenente ET-1.</li>
</ol>11. Immagini di esempio di capillare con periciti (Figura 7)
<ol><li>Sacrificare un mouse transgenico NG2DsRedBAC come descritto nella sezione 4 di questo protocollo.</li>
	<li>Estrarre il cuore, cannulate l'arteria settosa e caricare il campione con Alexa-Fluor-488 coniugato WGA seguendo i protocolli 5-7.</li>
	<li>Immagina il muscolo papillare a 488 nm e 560 nm di eccitazione e 510-525 nm, emissione di 575-625 nm usando confocale. La pressione dell'arteriola sarà di circa 40 mmHg.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-+and+voltage-dependent+electro-metabolic+signaling+regulates+blood+flow+in+heart.">ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).</li><li>Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+perfusion+pressure+on+force+of+contraction+in+thin+papillary+muscles+and+trabeculae+from+rat+heart.">Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart.</a> Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).</li><li>Tillmanns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+in+the+ventricle+of+the+dog+and+turtle.">Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle.</a> Circulation Research. 34, 561-569 (1974).</li><li>Martini, J., Honig, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+intercapillary+distance+in+beating+rat+heart+in+situ+under+various+conditions+of+O2+supply.">Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply.</a> Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).</li><li>Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+coronary+vessel+pressure+and+diameter+in+an+intact+beating+rabbit+heart+using+fixed-position+and+free-motion+techniques.">Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques.</a> Circulation Research. 49, 342-353 (1981).</li><li>Marcus, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+coronary+circulation+through+studies+at+the+microvascular+level.">Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level.</a> Circulation. 82, 1-7 (1990).</li><li>Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protocol+for+removal+of+the+endothelium+from+the+perfused+rat+hind-limb+preparation.">A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation.</a> Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).</li><li>Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+inositol+1,4,5-trisphosphate+receptors+mediate+UTP-induced+cation+currents,+Ca2++signals,+and+vasoconstriction+in+cerebral+arteries.">Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries.</a> Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).</li><li>Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM1+enhances+SR+Ca2++content+through+binding+phospholamban+in+rat+ventricular+myocytes.">STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).</li><li>Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contraction+uncoupling+with+butanedione+monoxime+versus+low+calcium+or+high+potassium+solutions+on+flow+and+contractile+function+of+isolated+hearts+after+prolonged+hypothermic+perfusion.">Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion.</a> Circulation. 89, 2412-2420 (1994).</li><li>Lawton, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Low-Cost+and+Open+Source+Pressure+Myograph+System+for+Vascular+Physiology.">a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology.</a> Frontiers in Physiology. 10, 99 (2019).</li><li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation.">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).</li></ol>

Nel presente lavoro, abbiamo introdotto un metodo ex vivo straordinariamente semplice ma altamente pratico per studiare il microcircolo coronarica nel cuore in condizioni fisiologiche. Questo metodo è stato modificato da indagini meccaniche utilizzando ratti2. L'aggiunta impegnativa è stata la tecnologia di imaging ad alta velocità e alta risoluzione ottica. Abbiamo quindi potuto usufruire dei sistemi avanzati di imaging ottico ora disponibili in commercio. Con un'attenta dissezione e posiziona...

Un'adeguata regolazione coronarica del flusso di pressione assicura un apporto di sangue sufficiente al cuore per soddisfare le sue esigenzemetaboliche 1. Tuttavia, solo di recente è diventato chiaro come il flusso di pressione coronarica sia regolato dinamicamente nel cuore, nonostante studi approfonditi che sono stati eseguiti in vivo e in vitro negli ultimi decenni. Uno dei motivi è la difficoltà di stabilire un modello di lavoro fisiologico per tali studi a causa del costante battito del cuore. Indipendentemente da ciò, è stata stabilita una varietà di metodi per l'osservazione dei micro-vasi coronari nei tessuti viventi o negli animali, ma nessuno di questi metodi è stato in grado di ottenere una messa a fuoco costante / stabile e le misurazioni della pressione, del flusso e del diametro microvascolareallo stesso tempo 2,3. La visualizzazione diretta dei micro-vasi arteriosi coronari nel cuore pulsante è stata introdottadecenni fa 4,3, ma le misurazioni del diametro in piccoli vasi erano impegnative e le funzioni specifiche dei molti tipi di cellule specializzate associate al microcircolo erano ugualmente vessatorie. Anche il metodo stroboscopico e il sistema obiettivo flottante non sono stati in grado di fornire le informazioni di cui sopracontemporaneamente 5. Tuttavia, è stata ottenuta una quantità significativa di informazioni preziose utilizzando le suddette tecnologie, che ci hanno aiutato a capire di più sulla regolazione del flusso sanguigno coronarica6. Il metodo che stiamo descrivendo in questo documento aiuterà a indagare e comprendere in dettaglio come i componenti delle arterie coronarie, delle arteriole e della microvascolarizzazione rispondono in modo diverso alle stimolazioni e alle richieste metaboliche.
Il modello di lavoro che abbiamo stabilito per proseguire questi studi è stato costruito sul precedente lavoro di Westerhof etal. A seguito della cannulazione dell'arteria settale del cuore del topo, è stata utilizzata una fisiologica soluzione salina per perfondere quell'arteria per mantenere nutriti i miociti e altri componenti del tessuto cardiaco. La pressione arteriosa perfusione, il flusso e il diametro vascolare sono stati monitorati tra le altre funzioni fisiologiche utilizzando opportuni indicatori fluorescenti. Questo metodo ci consente di visualizzare il letto microvascolare coronarico sotto pressione fisiologica nel tessuto vivente e studiare per la prima volta i meccanismi cellulari alla base della regolazione del microcircolo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2 solution</td>
			<td>MilliporeSigma, USA</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2 solution</td>
			<td>MilliporeSigma, USA</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxoScope software</td>
			<td>Molecular Devices, San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chiller/water incubator</td>
			<td>FisherScientific, USA</td>
			<td>Isotemp 3016S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Nikon Instruments, USA</td>
			<td>A1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom glass tubing</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>9-000-3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1322A</td>
			<td>Molecular Devices, San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin-1</td>
			<td>MilliporeSigma, USA</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline solution Heater</td>
			<td>Warner Istruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VETone, Idaho, USA</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette/cannula holder</td>
			<td>Warner Istruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>64-0981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2DsRedBAC transgenic mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>#008241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon thread for tying blood vessels</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA</td>
			<td>THR-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (polydimethylsiloxane)</td>
			<td>SYLGARD, Germantown, WI, USA</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson, Middleton, WI, USA</td>
			<td>minipuls 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Servo Controller</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA</td>
			<td>PS-200-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>15000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo Pump</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA</td>
			<td>PS-200-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>W11261</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic measurement and imaging of capillaries, arterioles, and pericytes in mouse heart

Il tono arterioso coronario insieme all'apertura o alla chiusura dei capillari determinano in gran parte il flusso sanguigno ai cardiomiociti a pressione perfusionale costante. Tuttavia, è difficile monitorare i cambiamenti dinamici delle arteriole coronarie e dei capillari in tutto il cuore, principalmente a causa del suo movimento e del battito non-stop. Qui descriviamo un metodo che consente il monitoraggio della velocità di perfusione arteriosa, della pressione e dei cambiamenti di diametro delle arteriole e dei capillari nei muscoli papillari ventricolari destro del topo. L'arteria del setto di topo viene cannulata e perfusa a un flusso o pressione costante con l'altra misurata dinamicamente. Dopo la perfusione con una lectina etichettata fluorescentmente (ad esempio, Alexa Fluor-488 o -633 etichettata Wheat-Germ Agglutinin, WGA), le arteriole e i capillari (e altri vasi) nel muscolo papillare ventricolo destro e nel setto potrebbero essere facilmente immagini. I cambiamenti del diametro del vaso potrebbero quindi essere misurati in presenza o assenza di contrazioni cardiache. Quando sono state espresse proteine fluorescenti geneticamente codificate, è stato possibile monitorare caratteristiche specifiche. Ad esempio, i periciti sono stati visualizzati nei cuori dei topi che esprimevano NG2-DsRed. Questo metodo ha fornito una piattaforma utile per studiare le funzioni fisiologiche dei periciti capillari nel cuore. È adatto anche per studiare l'effetto dei reagenti sul flusso sanguigno nel cuore misurando contemporaneamente il diametro vascolare/capillare e la pressione luminare arteriosa. Questa preparazione, combinata con un sistema di imaging ottico all'avanguardia, consente di studiare il flusso sanguigno e il suo controllo a livello cellulare e molecolare nel cuore in condizioni quasi fisiologiche.

Quando un marcatore vascolare a fluorescenza viene perfuso in lume vascolare (qui WGA coniugato con Alexa Fluor-488), è possibile visualizzare interi alberi vascolari come mostrato nella figura 5 (pannello sinistro) utilizzando il microscopio confocale ad alta velocità. Un ulteriore ingrandimento consente l'imaging capillare in dettaglio(Figura 5, Pannello destro). Poiché il sistema pressurizzato supporta un monitoraggio costante della pressione luminare, que...

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Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Presentato qui è un protocollo per studiare il microcircolo coronarico nel tessuto cardiaco murino vivente monitorando ex vivo la pressione e il flusso di perfusione arteriosa che mantiene la pressione, così come i componenti dell'albero vascolare tra cui i letti capillari e i periciti, poiché l'arteria settale è cannulata e pressurizzata.

Misurazione dinamica e imaging di capillari, arterioli e periciti nel cuore del topo

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

5.2K Views.  University of Maryland School of Medicine. Presentato qui è un protocollo per studiare il microcircolo coronarico nel tessuto cardiaco murino vivente monitorando ex vivo la pressione e il flusso di perfusione arteriosa che mantiene la pressione, così come i componenti dell'albero vascolare tra cui i letti capillari e i periciti, poiché l'arteria settale è cannulata e pressurizzata.

Video: Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment for melanoma remains surgical excision, therefore, the key to extended survival is early detection 2,3. Considering the large numbers of patients diagnosed every year and the limitations in accessing specialized care quickly, the development of objective in vivo diagnostic instruments to aid the diagnosis is essential. New techniques to detect skin cancer, especially non-invasive diagnostic tools, are being explored in numerous laboratories. Along with the surgical methods, techniques such as digital photography, dermoscopy, multispectral imaging systems (MelaFind), laser-based systems (confocal scanning laser microscopy, laser doppler perfusion imaging, optical coherence tomography), ultrasound, magnetic resonance imaging, are being tested. Each technique offers unique advantages and disadvantages, many of which pose a compromise between effectiveness and accuracy versus ease of use and cost considerations. Details about these techniques and comparisons are available in the literature 4.
Infrared (IR) imaging was shown to be a useful method to diagnose the signs of certain diseases by measuring the local skin temperature. There is a large body of evidence showing that disease or deviation from normal functioning are accompanied by changes of the temperature of the body, which again affect the temperature of the skin 5,6. Accurate data about the temperature of the human body and skin can provide a wealth of information on the processes responsible for heat generation and thermoregulation, in particular the deviation from normal conditions, often caused by disease. However, IR imaging has not been widely recognized in medicine due to the premature use of the technology 7,8 several decades ago, when temperature measurement accuracy and the spatial resolution were inadequate and sophisticated image processing tools were unavailable. This situation changed dramatically in the late 1990s-2000s. Advances in IR instrumentation, implementation of digital image processing algorithms and dynamic IR imaging, which enables scientists to analyze not only the spatial, but also the temporal thermal behavior of the skin 9, allowed breakthroughs in the field.
In our research, we explore the feasibility of IR imaging, combined with theoretical and experimental studies, as a cost effective, non-invasive, in vivo optical measurement technique for tumor detection, with emphasis on the screening and early detection of melanoma 10-13. In this study, we show data obtained in a patient study in which patients that possess a pigmented lesion with a clinical indication for biopsy are selected for imaging. We compared the difference in thermal responses between healthy and malignant tissue and compared our data with biopsy results. We concluded that the increased metabolic activity of the melanoma lesion can be detected by dynamic infrared imaging.

We demonstrated that malignant pigmented lesions with increased metabolic activity generate quantifiable amounts of heat and the measurement of the transient thermal response of the skin to a cooling excitation allows quantitative identification of melanoma and other skin cancers (vs. non-proliferative nevi) at an early stage of the disease.

Visualizzazione quantitativa e diagnosi del tumore della pelle utilizzando Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Ricerca

Medicina

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are associated with obesity, though the precise underlying mechanisms that contribute to the disease are currently being delineated.2,3 Several small animal models of obesity have been developed and are employed in a variety of studies.4 A critical component to these experiments involves the collection of regional and/or total animal fat content data under varied conditions.
Traditional experimental methods available for measuring fat content in small animal models of obesity include invasive (e.g. ex vivo measurement of fat deposits) and non-invasive (e.g. Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA), or Magnetic Resonance (MR)) protocols, each of which presents relative trade-offs. Current invasive methods for measuring fat content may provide details for organ and region specific fat distribution, but sacrificing the subjects will preclude longitudinal assessments. Conversely, current non-invasive strategies provide limited details for organ and region specific fat distribution, but enable valuable longitudinal assessment. With the advent of dedicated small animal X-ray computed tomography (CT) systems and customized analytical procedures, both organ and region specific analysis of fat distribution and longitudinal profiling may be possible. Recent reports have validated the use of CT for in vivo longitudinal imaging of adiposity in living mice.5,6 Here we provide a modified method that allows for fat/total volume measurement, analysis and visualization utilizing the Carestream Molecular Imaging Albira CT system in conjunction with PMOD and Volview software packages.

Fat content analysis is routinely conducted in studies utilizing murine obesity models. Emerging methods in small animal CT imaging and analysis are providing for longitudinal detail rich fat content analysis. Here we detail step by step procedures for performing small animal CT imaging, analysis, and visualization.

Segmentazione e misurazione dei volumi FAT nei modelli murini di obesità Utilizzo di X-ray Tomografia Computerizzata

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can accurately screen for brain injury, monitor injury evolution, or assess response to therapy. The energy used by neurons is derived largely from tissue oxidative metabolism, and neural hyperactivity and cell death are reflected by corresponding changes in cerebral oxygen metabolism (CMRO2). Thus, measures of CMRO2 are reflective of neuronal viability and provide critical diagnostic information, making CMRO2 an ideal target for bedside measurement of brain health.
Brain-imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) yield measures of cerebral glucose and oxygen metabolism, but these techniques require the administration of radionucleotides, so they are used in only the most acute cases.
Continuous-wave near-infrared spectroscopy (CWNIRS) provides non-invasive and non-ionizing radiation measures of hemoglobin oxygen saturation (SO2) as a surrogate for cerebral oxygen consumption. However, SO2 is less than ideal as a surrogate for cerebral oxygen metabolism as it is influenced by both oxygen delivery and consumption. Furthermore, measurements of SO2 are not sensitive enough to detect brain injury hours after the insult 1,2, because oxygen consumption and delivery reach equilibrium after acute transients 3. We investigated the possibility of using more sophisticated NIRS optical methods to quantify cerebral oxygen metabolism at the bedside in healthy and brain-injured newborns. More specifically, we combined the frequency-domain NIRS (FDNIRS) measure of SO2 with the diffuse correlation spectroscopy (DCS) measure of blood flow index (CBFi) to yield an index of CMRO2 (CMRO2i) 4,5.
With the combined FDNIRS/DCS system we are able to quantify cerebral metabolism and hemodynamics. This represents an improvement over CWNIRS for detecting brain health, brain development, and response to therapy in neonates. Moreover, this method adheres to all neonatal intensive care unit (NICU) policies on infection control and institutional policies on laser safety. Future work will seek to integrate the two instruments to reduce acquisition time at the bedside and to implement real-time feedback on data quality to reduce the rate of data rejection.

We combined frequency-domain near-infrared spectroscopy measures of cerebral hemoglobin oxygenation with diffuse correlation spectroscopy measures of cerebral blood flow index to estimate an index of oxygen metabolism. We tested the utility of this measure as a bedside screening tool to evaluate the health and development of the newborn brain.

Non invasiva di misurazione ottica del metabolismo cerebrale ed emodinamica nei neonati

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease and injury regional estimates, World Health Organization, 2004). Surgeries that often compromise the quality of life are required to correct heart defects, reminding us of the importance of finding the causes of CHD. Mutant mouse models and live imaging technology have become essential tools to study the etiology of this disease. Although advanced methods allow live imaging of abnormal hearts in embryos, the physiological and hemodynamic states of the latter are often compromised due to surgical and/or lengthy procedures. Noninvasive ultrasound imaging, however, can be used without surgically exposing the embryos, thereby maintaining their physiology. Herein, we use simple M-mode ultrasound to assess heart rates of embryos at E18.5 in utero. The detection of abnormal heart rates is indeed a good indicator of dysfunction of the heart and thus constitutes a first step in the identification of developmental defects that may lead to heart failure.

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Ultra-high frequency ultrasound is a powerful live imaging tool to examine cardiac abnormalities in small animals. Its noninvasiveness allows maintaining the physiologic state of embryos. Herein, we show the use of M-mode ultrasound to measure the heart rates of embryos at E18.5 in utero.

In utero Misurazione della frequenza cardiaca in mouse da non invasiva ecocardiografia M-mode

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

Diagnostic Ultrasound Imaging of Mouse Diaphragm Function

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive surgical procedures. Although this is an effective method of assessing in vitro diaphragm activity, it involves non-survival surgery. The application of non-invasive ultrasound imaging as an in vivo procedure is beneficial since it not only reduces the number of animals sacrificed, but is also suitable for monitoring disease progression in live mice. Thus, our ultrasound imaging method may likely assist in the development of novel therapies that alleviate muscle injury induced by various respiratory diseases. Particularly, in clinical diagnoses of obstructive lung diseases, ultrasound imaging has the potential to be used in conjunction with other standard tests to detect the early onset of diaphragm muscle fatigue. In the current protocol, we describe how to accurately evaluate diaphragm contractility in a mouse model using a diagnostic ultrasound imaging technique.

Diagnostic ultrasound imaging has proven to be effective in diagnosing various respiratory diseases in human and animal subjects. We demonstrate a comprehensive ultrasound protocol utilized by Dr. Zuo's lab to analyze diaphragm kinetics specifically in mouse models. This is also a non-invasive research technique which can provide quantitative information on mouse respiratory muscle function.

Diagnostic Ultrasound Imaging di funzione mouse Diaframma

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive ...

Dynamic Contrast Enhanced Magnetic Resonance Imaging of an Orthotopic Pancreatic Cancer Mouse Model

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe respiratory motion artifact in the abdominal area. Orthotopic tumor models offer advantages over subcutaneous ones, because those can reflect the primary tumor microenvironment affecting blood supply, neovascularization, and tumor cell invasion. We have recently established a protocol of DCE-MRI of orthotopic pancreatic tumor xenografts in mouse models by securing tumors with an orthogonally bent plastic board to prevent motion transfer from the chest region during imaging. The pressure by this board was localized on the abdominal area, and has not resulted in respiratory difficulty of the animals. This article demonstrates the detailed procedure of orthotopic pancreatic tumor modeling using small animals and DCE-MRI of the tumor xenografts. Quantification method of pharmacokinetic parameters in DCE-MRI is also introduced. The procedure described in this article will assist investigators to apply DCE-MRI for orthotopic gastrointestinal cancer mouse models.

The goal of this protocol is to apply dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) for orthotopic pancreatic tumor xenografts in mice. DCE-MRI is a non-invasive method to analyze microvasculature in a target tissue, and useful to assess vascular response in a tumor following a novel therapy.

Contrasto dinamico migliorato risonanza magnetica di un modello ortotopico cancro del pancreas mouse

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular diseases, such as diabetic retinopathy, hypertensive retinopathy, and possibly glaucoma. Therefore, retinal microvascular preparations are pivotal tools for physiological and pharmacological studies to delineate the underlying pathophysiological mechanisms and to design therapies for the diseases. Despite the wide use of mouse models in ophthalmic research, studies on retinal vascular reactivity are scarce in this species. A major reason for this discrepancy is the challenging isolation procedures owing to the small size of these retinal blood vessels, which is ~ &#8804; 30 &#181;m in luminal diameter. To circumvent the problem of direct isolation of these retinal microvessels for functional studies, we established an isolation and preparation technique that enables ex vivo studies of mouse retinal vasoactivity under near-physiological conditions. Although the present experimental preparations will specifically refer to the mouse retinal arterioles, this methodology can readily be employed to microvessels from rats.

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Many vision-threatening ocular diseases are associated with dysfunctional retinal microvessels. Therefore, the measurement of retinal arteriole responses is important to investigate the underlying pathophysiological mechanisms. This article describes a detailed protocol for mouse retinal arteriole isolation and preparation to assess the effects of vasoactive substances on vascular diameter.

Procedura di preparazione per la misura della reattività in Mouse arteriole retiniche Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing continuous remodeling with the competing activity of osteoblasts, which produce the new bone matrix, and osteoclasts, whose function is to eliminate mineralized bone. [18F]-NaF is a positron emission tomography (PET) radiotracer that enables visualization of bone metabolism. [18F]-NaF is chemically absorbed into hydroxyapatite in the bone matrix by osteoblasts and can thus noninvasively detect osteoblastic activity, which is occult to conventional imaging techniques. Kinetic modeling of dynamic [18F]-NaF-PET data provides detailed quantitative measures of bone metabolism. Conventional semi-quantitative PET data, which utilizes standardized uptake values (SUVs) as a measure of radiotracer activity, is referred to as a static technique due to its snapshot of tracer uptake in time.&#160; Kinetic modeling, however, utilizes dynamic image data where tracer levels are continuously acquired providing tracer uptake temporal resolution. From the kinetic modeling of dynamic data, quantitative values like blood flow and metabolic rate (i.e., potentially informative metrics of tracer dynamics) can be extracted, all with respect to the measured activity in the image data. When combined with dual modality PET-MRI, region-specific kinetic data can be correlated with anatomically registered high-resolution structural and pathologic information afforded by MRI. The goal of this methodological manuscript is to outline detailed techniques for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data. The lumbar facet joint is a common site of degenerative arthritis disease and a common cause for axial low back pain.&#160; Recent studies suggest [18F]-NaF-PET may serve as a useful biomarker of painful facetogenic disease.&#160; The human lumbar facet joint will, therefore, be used as a prototypical region of interest for dynamic [18F]-NaF-PET-MRI analysis in this manuscript.

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. We present detailed methodologies for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data in a patient with facetogenic low back pain using the lumbar facet joints as a prototypical region of interest.

Quantitativo [18F]-Naf-PET-MRI Analisi per la valutazione del fatturato osseo dinamico in un paziente con mal di schiena facetogenico

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

Isolamento e purificazione dei Periciti Cardiaci Murine

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

Colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero, imaging confocale e ricostruzione 3D del nodo senoatriale e atrioventricolare nel topo

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...