Diese Arbeit wurde teilweise vom Center for Biomedical Engineering and Technology (BioMET) unterstützt; NIH (1U01HL116321) und (1R01HL142290) und die American Heart Association 10SDG4030042 (GZ), 19POST34450156 (HCJ).

Die gesamte Tierpflege entsprach den Richtlinien der University of Maryland Baltimore und des Institutional Animal Care and Use Committee genehmigte Protokolle.
1. Vorbereitung der Lösungen
HINWEIS: Bereiten Sie Lösungen im Voraus vor. In den Experimenten werden zwei Arten von Basislösungen eingesetzt: (1) physiologische Salzlösungen (PSS) für Badsuperfusate und (2) Tyrodes Lösungen für Lumenperfusate. Kontinuierliches Blasen mit CO2 ist erforderlich, um den pH-Wert von PSS aufrechtzuerhalten. HePES-gepufferte Tyrodes Lösung wird im Lumen anstelle von PSS verwendet, um zu vermeiden, dass Blasen in die Gefäße gelangen, da Blasen die Endothelzellen7 beschädigen und den Fluss ausblenden würden.
<ol><li>PSS-Lösung: Siehe Formel und Zusammensetzung der PSS-Lösung in Tabelle 1. Machen Sie 10 L ca2+-freie und glukosefreie PSS-Lagerlösung und lagern Sie bei Raumtemperatur. 1 h vor jedem Verfahren, nehmen Sie 1 L der Lagerlösung und Blase mit 5%CO2 (74% N2 und 21%O2), um den pH-Wert der Lösung bei 7,4 zu halten. 1,8 g Glukose und 1,8 ml CaCl2 (1 M Bestand)hinzufügen 8. HINWEIS: Fügen Sie Ca2+ erst nach dem Blasen hinzu, wenn der pH-Wert 7,4 usd beträgt, andernfalls wird Ca2+ ausgefällt.</li>
	<li>Tyrodes Lösung: Siehe Die Formel und Zusammensetzung der TyrodesLösung in Tabelle 1. Filtern Sie die Lösung (0,22 m) und lagern Sie sie bei 4 °C für die zukünftige Verwendung9.</li>
	<li>Tyrodes Lösung mit BDM (2,3-Butanedion-Monoxim): Fügen Sie BDM als reversiblen Myofilament-Inhibitor hinzu, um die Kontraktion der Myozyten zu verhindern10. Wiegen Sie 600 mg BDM und fügen Sie die Tyrodes Lösung zu 200 ml hinzu. Rühren Sie die Lösung mit BDM, bis sie vollständig aufgelöst ist. Eine weitere Filtration ist nicht erforderlich.</li>
	<li>Bewahren Sie die Tyrodes-Lösung mit BDM bei 4 °C für die zukünftige Verwendung auf.</li>
</ol>2. Kammervorbereitung
<ol><li>Mantel sowohl Sezieren Kammer und Versuchskammer im Voraus mit Polydimethylsiloxan (PDMS) nach den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Füllen Sie die Sezierkammer mit der Tyrodeslösung, die BDM enthält.</li>
	<li>Schalten Sie den Kühler 1 h vor dem Eingriff ein. Stellen Sie die Temperatur auf 4 °C ein.</li>
</ol>3. Kanülenzubereitung
<ol><li>Schalten Sie den Micropipette-Puller ein. Wählen Sie die Einstellungen gemäß den Anweisungen des Herstellers aus.</li>
	<li>Nehmen Sie ein sauberes Borosilikatglasrohr (der Außen- und Innendurchmesser der verwendeten Glasrohre betrug 1,2 mm bzw. 0,69 mm).</li>
	<li>Legen Sie ein Glasrohr in die Rillenklemmen eines Sutter Pipettenziehers mit einem U-förmigen Platin-Heizfilament ein.</li>
	<li>Aktivieren Sie den Abzieher, um zwei Kanülen mit jeweils einer langen dünnen Spitze zu erzeugen.</li>
	<li>Schneiden Sie die Spitze jeder Kanüle mit einer feinen Schere unter einem Sezieren des Mikroskops, um den endgültigen Durchmesser der Spitze um 100 bis 150 m zu machen.</li>
	<li>Feuer polieren Sie die Spitze der geschnittenen Kanüle, um die scharfen Kanten leicht zu umrunden.</li>
	<li>Biegen Sie die Kanüle entlang der Welle mit einem Platindraht (mit Feinsteuerung beheizt) auf der Seite der Welle etwa 2 mm von der Spitze positioniert. Der Winkel der Biegung in der Kanüle sollte um 45° betragen.</li>
	<li>Setzen Sie das offene Ende der Kanüle in den Halter der Druckmyographenkammer ein und ziehen Sie die Armatur fest. Schließen Sie eine 5 ml Spritze, die mit der Tyrodes Lösung gefüllt ist, an die andere Seite des Fittings an. Schließen Sie die Kanüle an einen an der Kammer montierten Mikromanipulator an (siehe Abbildung 1 und Abbildung 2).</li>
	<li>Füllen Sie die Kanüle mit Deryrodes Lösung mit der Spritze (5 ml), spülen Sie sie, den Schlauch und den Anschluss von Luftblasen.</li>
	<li>Messen Sie vor dem Kanulationsverfahren den Perfusionsdruck innerhalb der Kanüle über einen bestimmten Durchflussbereich (50 bis 300 l/min, Abbildung 3). Tun Sie dies nur, wenn eine neue Kanüle verwendet wird. HINWEIS: Der Perfusionsdruck innerhalb der Kanüle ist proportional zum Durchfluss und ist linear montiert (Abbildung 3).</li>
</ol>4. Extraktion des Mausherzes
<ol><li>Legen Sie eine C57BL/6 Maus (entweder Geschlecht, 8-16 Wochen alt) in die Anästhesiebox, die mit den Tanks von Isofluran und Sauerstoff verbunden ist.</li>
	<li>Schalten Sie den Sauerstofftank ein und starten Sie den Fluss von Isofluran. Warten Sie 5 min, bis die Maus vollständig beästhetisiert ist.</li>
	<li>Nachdem die Anästhesie festgestellt wurde, nehmen Sie die Maus aus der Anästhesiebox und injizieren Heparin IP (in die Peritonealhöhle, 360 Einheiten, 0,5 ml/Maus), um die Bildung von Blutgerinnsel in der Vaskulatur zu vermeiden. Dann legen Sie die Maus wieder in die Anästhesie-Box.</li>
	<li>10 min, nachdem das Heparin injiziert wurde, bewegen Sie die Maus auf das beheizte Bett in einer Rückenposition und stabilisieren Sie ihre Pfoten mit Etikettierband. Halten Sie die Maus unter Vollanästhesie mit Isofluran e mit einem Nasenkegel.</li>
	<li>Heben Sie die Bauchhaut der Maus über das Zwerchfell mit Zange und verwenden Sie eine chirurgische Schere, um das Zwerchfell zu schneiden und auszusetzen.</li>
	<li>Das Zwerchfell und das Brustbein schneiden. Öffnen Sie die Brust.</li>
	<li>Sezieren Sie das Herz aus der Brusthöhle und schneiden Sie so nah wie möglich an der dorsalen Brustwand.</li>
	<li>Legen Sie das Herz in die eiskalte Tyrodes Lösung mit 30 mM BDM.</li>
	<li>Reinigen Sie das Herz, um das Bindegewebe wie die Lunge zu entfernen.</li>
	<li>Übertragen Sie das Herz in die vorgekühlte Sezierkammer, die mit Tyrodes Lösung gefüllt ist, die 30 mM BDM enthält.</li>
</ol>5. Vorbereitung und Cannulation der Septalarterie
<ol><li>Schalten Sie die Servopumpe ein. Stellen Sie die Servopumpe auf den "Flow"-Modus ein. Lassen Sie es mit hoher Geschwindigkeit laufen, bis der Schlauch mit der Tyrodes-Lösung gefüllt ist, die verwendet wird, um das Gefäßlumen zu durchdringen. Stellen Sie sicher, dass sich keine Blasen in den Schläuchen befinden. Dann senken Sie die Geschwindigkeit.</li>
	<li>Heften Sie das Herz an das PDMS an, um Schäden am mittleren Bereich des Herzens zu vermeiden.</li>
	<li>Entfernen Sie sowohl die rechte als auch die linke Vorhöfin. Schneiden Sie den rechten Ventrikel auf und entfernen Sie die rechte ventrikuläre freie Wand mit einem Sezierendes Mikroskop.</li>
	<li>Belichten und identifizieren Sie die Septalarterie. Legen Sie ein Nylonfaden (30 m Durchmesser) unter die Septalarterie und binden Sie einen losen Knoten für die zukünftige Verwendung. HINWEIS: Die Septalarterie kann leicht mit einem Sezierendes Mikroskop identifiziert werden. Die Septalarterie ist in den meisten Fällen eine Hauptschlagader auf dem Septum, die von der rechten Herzkranzgefäße stammt.</li>
	<li>Entfernen Sie die linksventrikuläre freie Wand mit einer feinen Schere.</li>
	<li>Übertragen Sie das Papillarmuskelpräparat in die Versuchskammer, in der die Kanüle positioniert war. Die Kammer ist mit Tyrodes Lösung gefüllt, die BDM enthält. Der Boden dieser Kammer ist mit einer dünnen (ca. 2 mm) Schicht aus PDMS beschichtet.</li>
	<li>Passen Sie die Position der Kanüle (mit Hilfe des Mikromanipulators) an, um die Kanüle der Septalarterie zu ermöglichen. Ziehen Sie den Knoten fest.</li>
	<li>Sichern Sie den Papillenmuskel mit kleinen Stiften am Kammerboden, so dass das Mikroskopobjektiv einen klaren Blick auf die Gefäße hat. Achten Sie auf den Winkel und die Position der Kanüle und stellen Sie sicher, dass die Spitze der Kanüle parallel zur Arterienwand verläuft.</li>
	<li>Testen Sie die Cannulation, indem Sie die Lösung schrittweise aus der Spritze durch die Kanüle ausweisen. Wenn alle Elemente richtig funktionieren, wird Restblut im Papillenmuskel das Gewebe zu Beginn dieses Prozesses verlassen und nur Tyrodes Lösung wird später gesehen.</li>
</ol>6. Stabilisierung der Zubereitung
<ol><li>Schalten Sie die peristaltische Pumpe ein, die die Superfusionslösung liefert. Dann die Zubereitung im Bad mit vorvergastem PSS mit einer Geschwindigkeit von 3-4 ml/min ständig überlagern.</li>
	<li>Schalten Sie den Temperaturregler für die Superfusionslösung ein. Stellen Sie die Temperatur des Bades superfusate auf 35-37 °C.</li>
	<li>Schließen Sie die Kanüle an die Servopumpe an. Lesen Sie den Druck auf dem Druckservoregler.</li>
	<li>Überwachen Sie den Durchfluss und den Druck. Der Durchfluss (L/min) und der arterielle Perfusionsdruck (mm Hg) werden mit Digitalisierer digitalisiert und mit einer zugehörigen Software aufgezeichnet (Abbildung 2).</li>
	<li>Stellen Sie den Durchfluss ein, um den Druck von 10 mmHg einzustellen, und lassen Sie ihn für 10 min laufen.</li>
	<li>Erhöhen Sie den Durchfluss der Luminallösung, um den Druck der Arterie n 60 mmHg zu machen. Erhalten Sie den endgültigen Perfusionsdruck der Artemole selbst, indem Sie den Druckabfall der Kanüle subtrahieren (Abbildung 3). HINWEIS: Wenn der Druckmodus auf dem Druckservoregler ausgewählt ist, wird für diese Experimente der Luminaldruck mit 60 mmHg eingestellt. Überwachen Sie dann die Änderung des Durchflusses.</li>
	<li>Lassen Sie die Probe für 30-60 min stabilisieren, indem Sie den Durchfluss und/oder den Druckpegel überwachen. Eine allmähliche Erhöhung des arteriellen Drucks wird normalerweise zu Beginn der Perfusion nach der Cannulation beobachtet. In etwa 30 min wird sich ein neuer stabiler Zustand etablieren (Abbildung 4).</li>
	<li>Initiieren Sie ein Experiment, nachdem der Perfusionsdruck stabilisiert wurde (bei konstantem Durchfluss).</li>
</ol>7. Beladen der Zubereitung mit fluoreszierend getaggtem Weizenkeim Agglutinin (WGA)
<ol><li>Bereiten Sie Die Tyrodes Lösung mit Alexa-Fluor-488 konjugierter WGA vor, indem Sie 100 g konjugierte WGA in 5 ml Der Tyrodes Lösung hinzufügen.</li>
	<li>Schalten Sie die Perfusate vorsichtig von der normalen Tyrodes-Lösung auf eine Lösung um, die fluoreszierend WGA enthält. Es ist wichtig, die Perfusate sorgfältig zu schalten, damit keine Blasen eingeführt werden.</li>
	<li>Nach 30 min WGA-Perfusion oder wenn die WGA-Lösung ausläuft, ändern Sie die Perfusate wieder in normale Tyrodes Lösung.</li>
</ol>8. Konfokale Bildgebung von Arteriolen und Kapillaren
<ol><li>Schalten Sie das konfokale Mikroskopsystem der Nipkow-Scheibe ein.</li>
	<li>Verwenden Sie das Mikroskop, um die Septalarterie mit einem Low-Power-Objektiv (4x) im Durchlichtmodus zu lokalisieren. HINWEIS: Die Septalarterie kann durch Befolgen der Position der Kanüle lokalisiert werden.</li>
	<li>Starten Sie die konfokale Bildgebung mit der drehbaren Scheibe konfokale und wählen Sie 488 nm Anregungslaser, 40x Objektivvergrößerung und passen Sie die Laserintensität und die Abtastrate (10 - 500 ms pro Bild) an.</li>
	<li>Richten Sie obere und untere Bildgebungspositionen für das konfokale Mikroskop ein, um den Bildbereich zu definieren und die Parameter für die Z-Stack-Bildgebung einzugeben.</li>
	<li>Legen Sie die Schrittgröße wie für das verwendete System empfohlen fest, oder legen Sie die Schrittgröße wie gewünscht fest.</li>
	<li>Wählen Sie die Einstellung z-Stack und/oder Zeitreiheneinstellungen aus.</li>
	<li>Wählen Sie einen neuen Ordner aus, oder legen Sie ihn fest, um das neue Bild zu speichern.</li>
	<li>Klicken Sie auf "Ausführen", um die Aufzeichnung der Bildgebung für zukünftige Analysen zu starten (Abbildung 5).</li>
</ol>9. Beispiel Vasodilatator-Experiment: Pinacidil-induzierte Vasodilatation (Video 1).
<ol><li>Pinacidil-Stammlösung (100 mM in DMSO) vorbereiten und bei 4 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie 10 ml der Tyrodes Lösung vor. Fügen Sie 10 l Pinacidil-Stammlösung hinzu, um die endgültige Konzentration von Pinacidil 100 m zu erreichen.</li>
	<li>Stellen Sie sich den Papillenmuskel bei geringer Vergrößerung (4x Objektiv) vor, um die Septalarterie und die Astarteriolen einzubeziehen.</li>
	<li>Schalten Sie die Luminallösung auf die pinacidil enthaltende Lösung.</li>
</ol>10. Beispiel Blutflusskontrollexperimente: Vasokonstriktor-induzierte arterielle Perfusionsdruckerhöhung bei konstantem Durchfluss (Abbildung 6)
<ol><li>Endothelin-1 (ET-1) Stofflösung (10 m) vorbereiten und bei -20 °C lagern.</li>
	<li>Bereiten Sie 10 ml der Tyrodes Lösung vor. Fügen Sie 10 L ET-1-Lagerlösung (10 m) hinzu, um die Endkonzentration von ET-1 10 nM zu erreichen.</li>
	<li>Nehmen Sie den Luminaldruck mit konstantem Durchfluss auf und bilden Sie den Papillenmuskel ab.</li>
	<li>Schalten Sie die Luminallösung auf die ET-1-haltige Lösung.</li>
</ol>11. Beispielbilder von Kapillaren mit Pericyten (Abbildung 7)
<ol><li>Opfern Sie eine transgene NG2DSRedBAC-Maus, wie in Abschnitt 4 dieses Protokolls beschrieben.</li>
	<li>Extrahieren Sie das Herz, können Sie die Septalarterie anheben und die Probe mit Alexa-Fluor-488 konjugiertem WGA nach den Protokollen 5-7 laden.</li>
	<li>Stellen Sie den Papillenmuskel bei 488 nm und 560 nm Anregung und 510-525 nm, 575-625 nm Emission mit konfokaler Emission dar. Der Arteriendruck wird etwa 40 mmHg betragen.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Zhao, G., Joca, H. C., Nelson, M. T., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATP-+and+voltage-dependent+electro-metabolic+signaling+regulates+blood+flow+in+heart.">ATP- and voltage-dependent electro-metabolic signaling regulates blood flow in heart.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117, 7461-7470 (2020).</li><li>Schouten, V. J., Allaart, C. P., Westerhof, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+perfusion+pressure+on+force+of+contraction+in+thin+papillary+muscles+and+trabeculae+from+rat+heart.">Effect of perfusion pressure on force of contraction in thin papillary muscles and trabeculae from rat heart.</a> Journal of Physiology. 451, 585-604 (1992).</li><li>Tillmanns, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcirculation+in+the+ventricle+of+the+dog+and+turtle.">Microcirculation in the ventricle of the dog and turtle.</a> Circulation Research. 34, 561-569 (1974).</li><li>Martini, J., Honig, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+intercapillary+distance+in+beating+rat+heart+in+situ+under+various+conditions+of+O2+supply.">Direct measurement of intercapillary distance in beating rat heart in situ under various conditions of O2 supply.</a> Microvascular Research. 1, 244-256 (1969).</li><li>Nellis, S. H., Liedtke, A. J., Whitesell, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+coronary+vessel+pressure+and+diameter+in+an+intact+beating+rabbit+heart+using+fixed-position+and+free-motion+techniques.">Small coronary vessel pressure and diameter in an intact beating rabbit heart using fixed-position and free-motion techniques.</a> Circulation Research. 49, 342-353 (1981).</li><li>Marcus, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Understanding+the+coronary+circulation+through+studies+at+the+microvascular+level.">Understanding the coronary circulation through studies at the microvascular level.</a> Circulation. 82, 1-7 (1990).</li><li>Ralevic, V., Kristek, F., Hudlicka, O., Burnstock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+protocol+for+removal+of+the+endothelium+from+the+perfused+rat+hind-limb+preparation.">A new protocol for removal of the endothelium from the perfused rat hind-limb preparation.</a> Circulation Research. 64, 1190-1196 (1989).</li><li>Zhao, G., Adebiyi, A., Blaskova, E., Xi, Q., Jaggar, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+1+inositol+1,4,5-trisphosphate+receptors+mediate+UTP-induced+cation+currents,+Ca2++signals,+and+vasoconstriction+in+cerebral+arteries.">Type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptors mediate UTP-induced cation currents, Ca2+ signals, and vasoconstriction in cerebral arteries.</a> Amercian Journal of Physiology-Cell Physiology. 295, 1376-1384 (2008).</li><li>Zhao, G., Li, T., Brochet, D. X., Rosenberg, P. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM1+enhances+SR+Ca2++content+through+binding+phospholamban+in+rat+ventricular+myocytes.">STIM1 enhances SR Ca2+ content through binding phospholamban in rat ventricular myocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112, 4792-4801 (2015).</li><li>Stowe, D. F., Boban, M., Graf, B. M., Kampine, J. P., Bosnjak, Z. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contraction+uncoupling+with+butanedione+monoxime+versus+low+calcium+or+high+potassium+solutions+on+flow+and+contractile+function+of+isolated+hearts+after+prolonged+hypothermic+perfusion.">Contraction uncoupling with butanedione monoxime versus low calcium or high potassium solutions on flow and contractile function of isolated hearts after prolonged hypothermic perfusion.</a> Circulation. 89, 2412-2420 (1994).</li><li>Lawton, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+Low-Cost+and+Open+Source+Pressure+Myograph+System+for+Vascular+Physiology.">a Low-Cost and Open Source Pressure Myograph System for Vascular Physiology.</a> Frontiers in Physiology. 10, 99 (2019).</li><li>Kim, K. J., Filosa, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+in+vitro+approach+to+study+neurovascular+coupling+mechanisms+in+the+brain+microcirculation.">Advanced in vitro approach to study neurovascular coupling mechanisms in the brain microcirculation.</a> Journal of Physiology. 590, 1757-1770 (2012).</li></ol>

In der vorliegenden Arbeit haben wir eine bemerkenswert einfache, aber sehr praktische Ex-vivo-Methode eingeführt, um die koronare Mikrozirkulation im Herzen unter physiologischen Bedingungen zu untersuchen. Diese Methode wurde aus mechanischen Untersuchungen mit Ratten2modifiziert. Die herausforderungsgemäße Ergänzung war die Bildgebungstechnologie mit hoher Geschwindigkeit und hoher optischer Auflösung. So konnten wir die fortschrittlichen optischen Bildgebungssysteme nutzen, die jetzt im H...

Eine angemessene koronare Druck-Durchfluss-Regulierung gewährleistet eine ausreichende Blutversorgung des Herzens, um seine metabolischen Anforderungen zu erfüllen1. Allerdings ist erst vor kurzem deutlich geworden, wie der koronare Druckfluss im Herzen dynamisch reguliert wird, trotz umfangreicher Studien, die in den letzten Jahrzehnten in vivo und in vitro durchgeführt wurden. Einer der Gründe ist die Schwierigkeit, ein physiologisches Arbeitsmodell für solche Studien aufgrund des ständigen Schlagens des Herzens zu etablieren. Unabhängig davon wurden eine Vielzahl von Methoden zur Beobachtung der koronaren Mikrogefäße in lebenden Geweben oder Tieren etabliert, aber keine dieser Methoden war in der Lage, einen konstanten/stabilen Fokus und die Messungen von Druck, Durchfluss und mikrovaskulärem Durchmesser gleichzeitig zu erreichen2,3. Die direkte Visualisierung von koronaren arteriellen Mikrogefäßen im schlagenden Herzen wurde vor Jahrzehnten eingeführt4,3, aber die Durchmessermessungen in kleinen Gefäßen waren anspruchsvoll und die spezifischen Funktionen der vielen spezialisierten Zelltypen, die mit der Mikrozirkulation verbunden sind, waren ebenso ärgerlich. Selbst die Stroboskopmethode und das schwimmende Objektivsystem konnten die oben genannten Informationen nicht gleichzeitig liefern5. Nichtsdestotrotz wurde eine beträchtliche Menge wertvoller Informationen mit den oben genannten Technologien gewonnen, die uns geholfen haben, mehr über die Regulierung des koronaren Blutflusses zu verstehen6. Die Methode, die wir in diesem Papier beschreiben, wird einem helfen, zu untersuchen und im Detail zu verstehen, wie Komponenten der Herzkranzgefäße, der Arteriolen und der Mikrovaskulatur unterschiedlich auf Stimulationen und metabolische Anforderungen reagieren.
Das Arbeitsmodell, das wir für diese Studien etabliert haben, baute auf den früheren Arbeiten von Westerhof et al.2auf. Nach der Kanulation der Septalarterie des Mausherzes wurde eine physiologische Salzlösung verwendet, um diese Arterie zu durchdringen, um die Myozyten und andere Bestandteile des Herzgewebes zu nähren. Der arterielle Perfusionsdruck, der Durchfluss und der Gefäßdurchmesser wurden unter anderem mit hilfe geeigneter Fluoreszenzindikatoren überwacht. Diese Methode ermöglicht es uns, das koronare mikrovaskuläre Bett unter physiologischem Druck im lebenden Gewebe zu visualisieren und zum ersten Mal die zellulären Mechanismen zu untersuchen, die der Mikrozirkulationsregulation zugrunde liegen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1 M CaCl2 solution</td>
			<td>MilliporeSigma, USA</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 M MgCl2 solution</td>
			<td>MilliporeSigma, USA</td>
			<td>M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxoScope software</td>
			<td>Molecular Devices, San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chiller/water incubator</td>
			<td>FisherScientific, USA</td>
			<td>Isotemp 3016S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal</td>
			<td>Nikon Instruments, USA</td>
			<td>A1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom glass tubing</td>
			<td>Drummond Scientific Company</td>
			<td>9-000-3301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digidata 1322A</td>
			<td>Molecular Devices, San Jose, CA, USA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting microscope</td>
			<td>Olympus, Japan</td>
			<td>SZX12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Endothelin-1</td>
			<td>MilliporeSigma, USA</td>
			<td>E7764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Fine Scientific Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Sodium Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inline solution Heater</td>
			<td>Warner Istruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>SH-27B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>VETone, Idaho, USA</td>
			<td>502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments, Novato, CA, USA</td>
			<td>P-97</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette/cannula holder</td>
			<td>Warner Istruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>64-0981</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NG2DsRedBAC transgenic mouse</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td>#008241</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon thread for tying blood vessels</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA</td>
			<td>THR-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PDMS (polydimethylsiloxane)</td>
			<td>SYLGARD, Germantown, WI, USA</td>
			<td>184 SIL ELAST KIT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump</td>
			<td>Gilson, Middleton, WI, USA</td>
			<td>minipuls 3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pressure Servo Controller</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA</td>
			<td>PS-200-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Scientific Tools, Foster City, CA, USA</td>
			<td>15000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Servo Pump</td>
			<td>Living Systems Instrumentation, Burlington, Vt, USA</td>
			<td>PS-200-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments, Hamden, CT, USA</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ Agglutinin, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific, Waltham, MA USA</td>
			<td>W11261</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

dynamic measurement and imaging of capillaries, arterioles, and pericytes in mouse heart

Der koronare arterielle Ton sowie das Öffnen oder Schließen der Kapillaren bestimmen weitgehend den Blutfluss zu Kardiomyozyten bei konstantem Perfusionsdruck. Es ist jedoch schwierig, die dynamischen Veränderungen der koronaren Arteriolen und der Kapillaren im ganzen Herzen zu überwachen, vor allem aufgrund seiner Bewegung und non-stop schlagen. Hier beschreiben wir eine Methode, die die Überwachung der arteriellen Perfusionsrate, des Drucks und der Durchmesseränderungen der Arteriolen und Kapillaren in den rechten ventrikulären Papillarmuskeln der Maus ermöglicht. Die Mausseptalarterie wird kanüliert und bei einem konstanten Durchfluss oder Druck mit der anderen dynamisch gemessenen durchtränz. Nach Perfusion mit einem fluoreszierend gekennzeichneten Lektin (z.B. Alexa Fluor-488 oder -633 mit Weizen-Germ Agglutinin, WGA) konnten die Arteriolen und Kapillaren (und andere Gefäße) in rechten Ventrikelpapillarmuskel und Septum leicht abgebildet werden. Die Gefäßdurchmesseränderungen könnten dann in Gegenwart oder Abwesenheit von Herzkontraktionen gemessen werden. Wenn genetisch kodierte fluoreszierende Proteine exprimiert wurden, konnten bestimmte Merkmale überwacht werden. Zum Beispiel wurden Pericyte in Mausherzen visualisiert, die NG2-DsRed ausdrückten. Diese Methode hat eine nützliche Plattform zur Untersuchung der physiologischen Funktionen von kapillaren Pericyten im Herzen zur Verfügung gestellt. Es eignet sich auch zur Untersuchung der Wirkung von Reagenzien auf den Blutfluss im Herzen durch gleichzeitige Messung des Vaskulären/Kapillardurchmessers und des arteriellen Luminaldrucks. Dieses Präparat, kombiniert mit einem hochmodernen optischen Bildgebungssystem, ermöglicht es, den Blutfluss und seine Kontrolle auf zellulärer und molekularer Ebene im Herzen unter nahezu physiologischen Bedingungen zu untersuchen.

Wenn ein Fluoreszenzgefäßmarker in Gefäßlumen durchdrungen ist (hier WGA konjugiert mit Alexa Fluor-488), ist es möglich, ganze Gefäßbäume zu visualisieren, wie in Abbildung 5 (linkes Panel) mit dem Konfokalmikroskop mit hoher Geschwindigkeit dargestellt. Eine weitere Vergrößerung ermöglicht die Abbildung der Kapillare im Detail(Abbildung 5, Rechtes Panel). Da das Drucksystem eine konstante Überwachung des Luminaldrucks unterstützt, kann dieses Prä...

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Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Präsentiert wird hier ein Protokoll zur Untersuchung der koronaren Mikrozirkulation im lebenden murinen Herzgewebe durch ex vivo-Überwachung des arteriellen Perfusionsdrucks und -flusses, der den Druck aufrechterhält, sowie gefäßvaskulärer Baumbestandteile, einschließlich der Kapillarbetten und Pericyten, da die Septalarterie kanüliert und unter Druck steht.

Dynamische Messung und Bildgebung von Kapillaren, Arteriolen und Pericyten im Mausherz

Coronary arterial tone along with the opening or closing of the capillaries largely determine the blood flow to cardiomyocytes at constant perfusion ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

5.2K Aufrufe.  University of Maryland School of Medicine. Präsentiert wird hier ein Protokoll zur Untersuchung der koronaren Mikrozirkulation im lebenden murinen Herzgewebe durch ex vivo-Überwachung des arteriellen Perfusionsdrucks und -flusses, der den Druck aufrechterhält, sowie gefäßvaskulärer Baumbestandteile, einschließlich der Kapillarbetten und Pericyten, da die Septalarterie kanüliert und unter Druck steht.

Serie: Dynamic Measurement and Imaging of Capillaries, Arterioles, and Pericytes in Mouse Heart

Quantitative Visualization and Detection of Skin Cancer Using Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment for melanoma remains surgical excision, therefore, the key to extended survival is early detection 2,3. Considering the large numbers of patients diagnosed every year and the limitations in accessing specialized care quickly, the development of objective in vivo diagnostic instruments to aid the diagnosis is essential. New techniques to detect skin cancer, especially non-invasive diagnostic tools, are being explored in numerous laboratories. Along with the surgical methods, techniques such as digital photography, dermoscopy, multispectral imaging systems (MelaFind), laser-based systems (confocal scanning laser microscopy, laser doppler perfusion imaging, optical coherence tomography), ultrasound, magnetic resonance imaging, are being tested. Each technique offers unique advantages and disadvantages, many of which pose a compromise between effectiveness and accuracy versus ease of use and cost considerations. Details about these techniques and comparisons are available in the literature 4.
Infrared (IR) imaging was shown to be a useful method to diagnose the signs of certain diseases by measuring the local skin temperature. There is a large body of evidence showing that disease or deviation from normal functioning are accompanied by changes of the temperature of the body, which again affect the temperature of the skin 5,6. Accurate data about the temperature of the human body and skin can provide a wealth of information on the processes responsible for heat generation and thermoregulation, in particular the deviation from normal conditions, often caused by disease. However, IR imaging has not been widely recognized in medicine due to the premature use of the technology 7,8 several decades ago, when temperature measurement accuracy and the spatial resolution were inadequate and sophisticated image processing tools were unavailable. This situation changed dramatically in the late 1990s-2000s. Advances in IR instrumentation, implementation of digital image processing algorithms and dynamic IR imaging, which enables scientists to analyze not only the spatial, but also the temporal thermal behavior of the skin 9, allowed breakthroughs in the field.
In our research, we explore the feasibility of IR imaging, combined with theoretical and experimental studies, as a cost effective, non-invasive, in vivo optical measurement technique for tumor detection, with emphasis on the screening and early detection of melanoma 10-13. In this study, we show data obtained in a patient study in which patients that possess a pigmented lesion with a clinical indication for biopsy are selected for imaging. We compared the difference in thermal responses between healthy and malignant tissue and compared our data with biopsy results. We concluded that the increased metabolic activity of the melanoma lesion can be detected by dynamic infrared imaging.

We demonstrated that malignant pigmented lesions with increased metabolic activity generate quantifiable amounts of heat and the measurement of the transient thermal response of the skin to a cooling excitation allows quantitative identification of melanoma and other skin cancers (vs. non-proliferative nevi) at an early stage of the disease.

Quantitative Visualisierung und Erkennung von Hautkrebs mit Dynamic Thermal Imaging

In 2010 approximately 68,720 melanomas will be diagnosed in the US alone, with around 8,650 resulting in death 1. To date, the only effective treatment ...

Forschung

Medizin

Segmentation and Measurement of Fat Volumes in Murine Obesity Models Using X-ray Computed Tomography

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are associated with obesity, though the precise underlying mechanisms that contribute to the disease are currently being delineated.2,3 Several small animal models of obesity have been developed and are employed in a variety of studies.4 A critical component to these experiments involves the collection of regional and/or total animal fat content data under varied conditions.
Traditional experimental methods available for measuring fat content in small animal models of obesity include invasive (e.g. ex vivo measurement of fat deposits) and non-invasive (e.g. Dual Energy X-ray Absorptiometry (DEXA), or Magnetic Resonance (MR)) protocols, each of which presents relative trade-offs. Current invasive methods for measuring fat content may provide details for organ and region specific fat distribution, but sacrificing the subjects will preclude longitudinal assessments. Conversely, current non-invasive strategies provide limited details for organ and region specific fat distribution, but enable valuable longitudinal assessment. With the advent of dedicated small animal X-ray computed tomography (CT) systems and customized analytical procedures, both organ and region specific analysis of fat distribution and longitudinal profiling may be possible. Recent reports have validated the use of CT for in vivo longitudinal imaging of adiposity in living mice.5,6 Here we provide a modified method that allows for fat/total volume measurement, analysis and visualization utilizing the Carestream Molecular Imaging Albira CT system in conjunction with PMOD and Volview software packages.

Fat content analysis is routinely conducted in studies utilizing murine obesity models. Emerging methods in small animal CT imaging and analysis are providing for longitudinal detail rich fat content analysis. Here we detail step by step procedures for performing small animal CT imaging, analysis, and visualization.

Segmentierung und Messung von FAT-Volumes in Murine Obesity Modellen mithilfe von Röntgen-Computertomographie

Obesity is associated with increased morbidity and mortality as well as reduced metrics in quality of life.1 Both environmental and genetic factors are ...

Non-invasive Optical Measurement of Cerebral Metabolism and Hemodynamics in Infants

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can accurately screen for brain injury, monitor injury evolution, or assess response to therapy. The energy used by neurons is derived largely from tissue oxidative metabolism, and neural hyperactivity and cell death are reflected by corresponding changes in cerebral oxygen metabolism (CMRO2). Thus, measures of CMRO2 are reflective of neuronal viability and provide critical diagnostic information, making CMRO2 an ideal target for bedside measurement of brain health.
Brain-imaging techniques such as positron emission tomography (PET) and single-photon emission computed tomography (SPECT) yield measures of cerebral glucose and oxygen metabolism, but these techniques require the administration of radionucleotides, so they are used in only the most acute cases.
Continuous-wave near-infrared spectroscopy (CWNIRS) provides non-invasive and non-ionizing radiation measures of hemoglobin oxygen saturation (SO2) as a surrogate for cerebral oxygen consumption. However, SO2 is less than ideal as a surrogate for cerebral oxygen metabolism as it is influenced by both oxygen delivery and consumption. Furthermore, measurements of SO2 are not sensitive enough to detect brain injury hours after the insult 1,2, because oxygen consumption and delivery reach equilibrium after acute transients 3. We investigated the possibility of using more sophisticated NIRS optical methods to quantify cerebral oxygen metabolism at the bedside in healthy and brain-injured newborns. More specifically, we combined the frequency-domain NIRS (FDNIRS) measure of SO2 with the diffuse correlation spectroscopy (DCS) measure of blood flow index (CBFi) to yield an index of CMRO2 (CMRO2i) 4,5.
With the combined FDNIRS/DCS system we are able to quantify cerebral metabolism and hemodynamics. This represents an improvement over CWNIRS for detecting brain health, brain development, and response to therapy in neonates. Moreover, this method adheres to all neonatal intensive care unit (NICU) policies on infection control and institutional policies on laser safety. Future work will seek to integrate the two instruments to reduce acquisition time at the bedside and to implement real-time feedback on data quality to reduce the rate of data rejection.

We combined frequency-domain near-infrared spectroscopy measures of cerebral hemoglobin oxygenation with diffuse correlation spectroscopy measures of cerebral blood flow index to estimate an index of oxygen metabolism. We tested the utility of this measure as a bedside screening tool to evaluate the health and development of the newborn brain.

Non-invasive optische Messung des zerebralen Metabolismus und Hämodynamik bei Säuglingen

Perinatal brain injury remains a significant cause of infant mortality  and morbidity, but there is not yet an effective bedside tool that can  accurately ...

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease and injury regional estimates, World Health Organization, 2004). Surgeries that often compromise the quality of life are required to correct heart defects, reminding us of the importance of finding the causes of CHD. Mutant mouse models and live imaging technology have become essential tools to study the etiology of this disease. Although advanced methods allow live imaging of abnormal hearts in embryos, the physiological and hemodynamic states of the latter are often compromised due to surgical and/or lengthy procedures. Noninvasive ultrasound imaging, however, can be used without surgically exposing the embryos, thereby maintaining their physiology. Herein, we use simple M-mode ultrasound to assess heart rates of embryos at E18.5 in utero. The detection of abnormal heart rates is indeed a good indicator of dysfunction of the heart and thus constitutes a first step in the identification of developmental defects that may lead to heart failure.

In utero Measurement of Heart Rate in Mouse by Noninvasive M-mode Echocardiography

Ultra-high frequency ultrasound is a powerful live imaging tool to examine cardiac abnormalities in small animals. Its noninvasiveness allows maintaining the physiologic state of embryos. Herein, we show the use of M-mode ultrasound to measure the heart rates of embryos at E18.5 in utero.

In utero Messung der Herzfrequenz in Mouse von Nichtinvasive M-Mode-Echokardiographie

Congenital heart disease (CHD) is the most frequent noninfectious cause of death at birth. The incidence of CHD ranges from 4 to 50/1,000 births (Disease ...

Diagnostic Ultrasound Imaging of Mouse Diaphragm Function

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive surgical procedures. Although this is an effective method of assessing in vitro diaphragm activity, it involves non-survival surgery. The application of non-invasive ultrasound imaging as an in vivo procedure is beneficial since it not only reduces the number of animals sacrificed, but is also suitable for monitoring disease progression in live mice. Thus, our ultrasound imaging method may likely assist in the development of novel therapies that alleviate muscle injury induced by various respiratory diseases. Particularly, in clinical diagnoses of obstructive lung diseases, ultrasound imaging has the potential to be used in conjunction with other standard tests to detect the early onset of diaphragm muscle fatigue. In the current protocol, we describe how to accurately evaluate diaphragm contractility in a mouse model using a diagnostic ultrasound imaging technique.

Diagnostic ultrasound imaging has proven to be effective in diagnosing various respiratory diseases in human and animal subjects. We demonstrate a comprehensive ultrasound protocol utilized by Dr. Zuo's lab to analyze diaphragm kinetics specifically in mouse models. This is also a non-invasive research technique which can provide quantitative information on mouse respiratory muscle function.

Diagnostische Ultraschall-Bildgebung der Maus Membranfunktion

Function analysis of rodent respiratory skeletal muscles, particularly the diaphragm, is commonly performed by isolating muscle strips using invasive ...

Dynamic Contrast Enhanced Magnetic Resonance Imaging of an Orthotopic Pancreatic Cancer Mouse Model

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe respiratory motion artifact in the abdominal area. Orthotopic tumor models offer advantages over subcutaneous ones, because those can reflect the primary tumor microenvironment affecting blood supply, neovascularization, and tumor cell invasion. We have recently established a protocol of DCE-MRI of orthotopic pancreatic tumor xenografts in mouse models by securing tumors with an orthogonally bent plastic board to prevent motion transfer from the chest region during imaging. The pressure by this board was localized on the abdominal area, and has not resulted in respiratory difficulty of the animals. This article demonstrates the detailed procedure of orthotopic pancreatic tumor modeling using small animals and DCE-MRI of the tumor xenografts. Quantification method of pharmacokinetic parameters in DCE-MRI is also introduced. The procedure described in this article will assist investigators to apply DCE-MRI for orthotopic gastrointestinal cancer mouse models.

The goal of this protocol is to apply dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) for orthotopic pancreatic tumor xenografts in mice. DCE-MRI is a non-invasive method to analyze microvasculature in a target tissue, and useful to assess vascular response in a tumor following a novel therapy.

Dynamic Contrast Verbesserte Spintomographie von einem orthotopen Mausmodell Bauchspeicheldrüsenkrebs

Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging (DCE-MRI) has been limitedly used for orthotopic pancreatic tumor xenografts due to severe ...

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular diseases, such as diabetic retinopathy, hypertensive retinopathy, and possibly glaucoma. Therefore, retinal microvascular preparations are pivotal tools for physiological and pharmacological studies to delineate the underlying pathophysiological mechanisms and to design therapies for the diseases. Despite the wide use of mouse models in ophthalmic research, studies on retinal vascular reactivity are scarce in this species. A major reason for this discrepancy is the challenging isolation procedures owing to the small size of these retinal blood vessels, which is ~ &#8804; 30 &#181;m in luminal diameter. To circumvent the problem of direct isolation of these retinal microvessels for functional studies, we established an isolation and preparation technique that enables ex vivo studies of mouse retinal vasoactivity under near-physiological conditions. Although the present experimental preparations will specifically refer to the mouse retinal arterioles, this methodology can readily be employed to microvessels from rats.

Preparation Steps for Measurement of Reactivity in Mouse Retinal Arterioles Ex Vivo

Many vision-threatening ocular diseases are associated with dysfunctional retinal microvessels. Therefore, the measurement of retinal arteriole responses is important to investigate the underlying pathophysiological mechanisms. This article describes a detailed protocol for mouse retinal arteriole isolation and preparation to assess the effects of vasoactive substances on vascular diameter.

Vorbereitende Schritte für die Messung der Reaktivität in Maus retinalen Arteriolen Ex Vivo

Vascular insufficiency and alterations in normal retinal perfusion are among the major factors for the pathogenesis of various sight-threatening ocular ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing continuous remodeling with the competing activity of osteoblasts, which produce the new bone matrix, and osteoclasts, whose function is to eliminate mineralized bone. [18F]-NaF is a positron emission tomography (PET) radiotracer that enables visualization of bone metabolism. [18F]-NaF is chemically absorbed into hydroxyapatite in the bone matrix by osteoblasts and can thus noninvasively detect osteoblastic activity, which is occult to conventional imaging techniques. Kinetic modeling of dynamic [18F]-NaF-PET data provides detailed quantitative measures of bone metabolism. Conventional semi-quantitative PET data, which utilizes standardized uptake values (SUVs) as a measure of radiotracer activity, is referred to as a static technique due to its snapshot of tracer uptake in time.&#160; Kinetic modeling, however, utilizes dynamic image data where tracer levels are continuously acquired providing tracer uptake temporal resolution. From the kinetic modeling of dynamic data, quantitative values like blood flow and metabolic rate (i.e., potentially informative metrics of tracer dynamics) can be extracted, all with respect to the measured activity in the image data. When combined with dual modality PET-MRI, region-specific kinetic data can be correlated with anatomically registered high-resolution structural and pathologic information afforded by MRI. The goal of this methodological manuscript is to outline detailed techniques for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data. The lumbar facet joint is a common site of degenerative arthritis disease and a common cause for axial low back pain.&#160; Recent studies suggest [18F]-NaF-PET may serve as a useful biomarker of painful facetogenic disease.&#160; The human lumbar facet joint will, therefore, be used as a prototypical region of interest for dynamic [18F]-NaF-PET-MRI analysis in this manuscript.

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. We present detailed methodologies for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data in a patient with facetogenic low back pain using the lumbar facet joints as a prototypical region of interest.

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI-Analyse zur Bewertung des dynamischen Knochenumsatzes bei Patienten mit facetogenen Rückenschmerzen

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...

Isolation and Purification of Murine Cardiac Pericytes

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier integrity. However, their tissue-specific functions in the heart are not well understood. Moreover, there is currently no protocol utilizing readily accessible materials to isolate and purify pericytes of cardiac origin. Our protocol focuses on using the widely used mammalian model, the mouse, as our source of cells. Using the enzymatic digestion and mechanical dissociation of heart tissue, we obtained a crude cell mixture that was further purified by fluorescence activating cell sorting (FACS) by a plethora of markers. Because there is no single unequivocal marker for pericytes, we gated for cells that were CD31-CD34-CD45-CD140b+NG2+CD146+. Following purification, these primary cells were cultured and passaged multiple times without any changes in morphology and marker expression. With the ability to regularly obtain primary murine cardiac pericytes using our protocol, we hope to further understand the role of pericytes in cardiovascular physiology and their therapeutic potential.

We have optimized a protocol to isolate and purify murine cardiac pericytes for basic research and investigation of their biology and therapeutic potential.

Isolierung und Reinigung von murinen Herzperizyten

Pericytes, perivascular cells of microvessels and capillaries, are known to play a part in angiogenesis, vessel stabilization, and endothelial barrier ...

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes the atrioventricular node (AVN), to allow excitation and contraction of the whole heart. Any dysfunction of either SAN or AVN results in arrhythmias, indicating their fundamental role in electrophysiology and arrhythmogenesis. Mouse models are widely used in arrhythmia research, but the specific investigation of SAN and AVN remains challenging.
The SAN is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava and AVN is located at the apex of the triangle of Koch, formed by the orifice of the coronary sinus, the tricuspid annulus, and the tendon of Todaro. However, due to the small size, visualization by conventional histology remains challenging and it does not allow the study of SAN and AVN within their 3D environment.
Here we describe a whole-mount immunofluorescence approach that allows the local visualization of labelled mouse SAN and AVN. Whole-mount immunofluorescence staining is intended for smaller sections of tissue without the need for manual sectioning. To this purpose, the mouse heart is dissected, with unwanted tissue removed, followed by fixation, permeabilization and blocking. Cells of the conduction system within SAN and AVN are then stained with an anti-HCN4 antibody. Confocal laser scanning microscopy and image processing allow differentiation between nodal cells and working cardiomyocytes, and to clearly localize SAN and AVN. Furthermore, additional antibodies can be combined to label other cell types as well, such as nerve fibers.
Compared to conventional immunohistology, whole-mount immunofluorescence staining preserves the anatomical integrity of the cardiac conduction system, thus allowing the investigation of AVN; especially so into their anatomy and interactions with the surrounding working myocardium and non-myocyte cells.

We provide a step-by-step protocol for whole-mount immunofluorescence staining of the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) in murine hearts.

Whole-Mount Immunfluoreszenz-Färbung, konfokale Bildgebung und 3D-Rekonstruktion des sinus- und atrioventrikulären Knotens in der Maus

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...