Bu deneysel yöntem, epigenomik test için yeniden kullanılabilir tek hücrelerin uzun süreli depolanmasına izin verir. Aynı zamanda aynı tek hücrede birçok epigenetik işaretin ve transkripsiyon faktörünün analizine izin verir. Tek hücreli epigenom analizi için mevcut yöntemlerde, aynı tek hücreler yeniden analiz edilemez.
Bununla birlikte, yeniden kullanılabilir tek hücrelerle, aynı tek hücreler birçok kez yeniden analiz edilebilir. Bu teknik, özellikle hasta hücrelerinin sınırlı olduğu durumlarda, epigenetik tedavinin teşhisi ve tasarımı için yararlıdır. Bu yöntem, epigenetik işaretler için spesifik antikorlar mevcut olduğu sürece epigenomun incelenmesi, gen ekspresyonunun düzenlenmesi ve diğer sistemler için en uygun yöntemdir.
Bu tekniği ilk denediğinizde, çok değerli olmayan örnekler üzerinde pratik yapmanızı ve MiSeq veya iSeq 100 gibi sığ sıralama kullanarak deneyi doğrulamanızı öneririz. Başlamak için, temiz bir laminer akış başlığında, bir mililitre hücre süspansiyonunu ve DNA için bir interkalatör boya içeren 199 mililitre bir milimolar EDTA PBS'yi karıştırın. Karıştırdıktan sonra, hücre süspansiyonunun 200 mikrolitresini düz tabanlı 96 delikli plakanın her bir kuyucuğuna aktarın.
Kapağı 96 delikli plakanın üzerine yerleştirin ve bir tarama mikroskobu kullanarak plakayı tarayın. Ardından, plakayı eğin ve tek hücre kuyunun alt kenarına batana kadar birkaç dakika bekleyin. Ardından pipet ucunu alt köşeye yerleştirin ve tek hücreyi ve tamponu bir PCR tüpüne aktarın.
Aktarımı onaylamak için bir floresan mikroskobu kullanarak kuyucuğu kontrol edin. Tek bir hücre hala kuyuda ise, DNA için bir interkalatör boya içeren bir milimolar EDTA PBS'nin kuyucuğu başına 200 mikrolitre ekleyin ve aktarımı tekrarlayın. Aktarımdan sonra, 96 delikli PCR plakasına bir kapak yerleştirin ve plakayı ara vermeden bir salıncak rotoru kullanarak santrifüj edin.
Santrifüjlemeden sonra, plakayı otomatik bir sıvı taşıma robotunun güvertesine yerleştirin. Ardından, ek kodu sıvı işleme robotunun yazılım penceresine sürükleyip bırakın ve süpernatantın 195 mikrolitresini çok yavaş bir pipetleme hızıyla çıkarmak için programı çalıştırın. 50 mikrolitre% 4 TEMED veya mineral yağ ekleyin ve plakayı gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
Ertesi gün, mineral yağı pipetleyerek çıkarın ve hücreleri 200 mikrolitre TP magnezyum negatif tampon ile beş kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, süpernatanı çıkarın, 15 mikrolitre tavlama tamponu ekleyin ve bir saat boyunca buz üzerinde inkübe edin. İnkübasyondan sonra, PCR tüplerini bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve üç dakika boyunca 94 santigrat derecede ısıtın.
Daha sonra tüpleri buz soğutmalı bir metal bloğa aktarın ve iki dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra, dört mikrolitre magnezyum sülfat-sodyum klorür, DNTP karışımı ekleyin ve maksimum hızda vorteks yaparak karıştırın. Daha sonra bir mikrolitre BST polimeraz büyük parçası ekleyin, vorteksleme ile karıştırın ve bir çalkalayıcı üzerinde dört saat boyunca inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, PCR tüpünü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve metinde açıklandığı gibi dört saatlik veya gece boyunca bir program çalıştırın. Antikor bağlanması için, tüpe 1.625 mikrolitre sodyum klorür EDTA BSA çözeltisi ekleyin. Düşük hızda vorteks yaparak karıştırın ve tüpü bir saat boyunca buz üzerinde inkübe edin.
Daha sonra mililitre antikor başına 0.1 mikrogram ekleyin ve antikor probu ile konjuge edilmiş IgG'yi kontrol edin. Antikorları ekledikten sonra, tüpleri hafifçe sallayarak buz üzerinde inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri buz üzerinde 200 mikrolitre TPM-T tamponu ile iki kez yıkayın.
Daha sonra süpernatantı çıkarın ve bir kez T4 DNA ligaz tamponu ile yıkayın. Daha sonra, 19 mikrolitre ligasyon adaptörü çözeltisi ekleyin ve 25 santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. Ardından, bir mikrolitre T4 DNA ligaz ekleyin ve tüpü orta hızda vorteks yaparak karıştırın.
Tüpü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve yakınlık ligasyon programını çalıştırın. Çalışmadan sonra, hücreleri 200 mikrolitre BST magnezyum negatif EDTA pozitif tampon ile iki kez yıkayın ve hücreleri gece boyunca dört santigrat derecede saklayın. Ertesi gün, hücreleri iki kez 200 mikrolitre BST magnezyum negatif EDTA negatif tamponla yıkayın ve 20 mikrolitre BST, DNTP'ler ve magnezyum sülfat içeren bir karışım ekleyin.
Daha sonra bir vorteks karıştırıcı ile karıştırın ve tüpü yörüngesel bir çalkalayıcıda dört saat boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, tüpü bir termal döngüleyiciye yerleştirin ve metin makalesinde açıklandığı gibi tam uzatma programını çalıştırın. Daha sonra, çoklu yer değiştirme amplifikasyonu için, 0.4 mikrolitre 100 mikromolar saniye rastgele astar ekleyin ve vorteks ile karıştırın.
Daha sonra, tüpü 94 santigrat derecede ısıtmak için bir termal döngüleyiciye yerleştirmeden önce tüpü iki saat boyunca bir yörüngesel çalkalayıcıda inkübe edin. Üç dakika sonra, tüpleri buz soğutmalı bir metal bloğa yerleştirin ve bir mikrolitre BST DNA polimeraz ekleyin. Tüpleri yavaş hızda vorteks.
Ardından, çoklu deplasmanlı amplifikasyon programını çalıştırmak için tüpleri bir termal döngüleyiciye yerleştirin. Programdan sonra, yaklaşık 20 mikrolitre süpernatantı bir PCR tüpüne aktarın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, yeniden kullanılabilir tek hücreyi içeren bir PCR tüpüne 20 mikrolitre% 0.05 ARA 20 ve 0.1X TE tamponu ekleyin ve tüpü gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, süpernatantı toplayın ve daha önce toplanan süpernatant ile birleştirin. Ardından,% 50 gliserol, beş milimolar EDTA,% 0.5 BSA ve% 0.05 TWEEN 20 içeren yeniden kullanılabilir tek hücreli ve TBS tamponunu ıslatın, ardından bir orbital çalkalayıcıda 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra, yeniden kullanılabilir tek hücreyi bir sonraki kullanıma kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın.
Son olarak, 40 mikrolitre Exo negatif ana karışım ekleyin ve programı metin makalesinde açıklandığı gibi çalıştırmak için tüpü bir termal döngüleyiciye yerleştirin. K562 yeniden kullanılabilir tek hücreler bu protokol kullanılarak üretildi. Tek hücreler poliakrilamid boncuğun dış tabakasına gömüldü ve DNA boyaması için bir interkalatör boya kullanılarak görselleştirildi.
BciVI sindiriminden önceki ve sonraki DNA ürünleri burada gösterilmiştir. Restriksiyon enzimi sindirimi, beklenen 19 ila 20, 31 ila 32, 49 ve 49'dan fazla baz çifti fragmanı üretti. Ayrıca, inşa edilen DNA kütüphanesi, istenen ürünler için kılcal elektroforez ile analiz edildi.
Sıralama sonuçları, anti-histon H3 asetillenmiş lizin 27 ve anti-histon H3 trimetillenmiş lizin 27'den elde edilen benzersiz haritalanmış okumaların, kontrol IgG'den anlamlı derecede daha fazla sayıda olduğunu göstermiştir. REpi sıralama sinyalleri, REpi dizileme verileri ile toplu ChIP dizileme verileri karşılaştırılarak değerlendirildi. Ortalama olarak, REpi diziliminden histon H3 asetillenmiş lizin 27 sinyallerinin yaklaşık% 91'i, toplu ChIP dizilemesinde histon H-3 asetillenmiş lizin 27 pikleri ile örtüşmüştür.
Aktif olmayan histon işareti, histon H3 trimetillenmiş lizin 27 için REpi dizilemesinin hassasiyeti% 52 idiREpi dizilemesinin duyarlılığı, REpi dizilemesinin kaç pik pikinin REpi dizilimi ile tespit edildiğini ölçmek için analiz edildi. REpi sekanslamasının duyarlılığı histon H3 asetillenmiş lizin 27'de %55.30 ve histon H3 trimetillenmiş lizin 27'de %50.94 idi. Lütfen DNS içermeyen reaktifler kullandığınızdan emin olun.
Ayrıca, açma borusu uçlarını veya reaktif uçlarını içeren tüm işlemler temiz bir başlıkta yapılmalıdır. Bu prosedürün DNA ürünleri sıralanır ve daha sonra genomun hangi bölgelerinde tek hücrelerde hangi histon modifikasyonlarının mevcut olduğunu ortaya çıkarmak için genomla eşleştirilir. Bu teknoloji, aynı tek hücrede birden fazla epigenetik işaretin analiz edilmesini mümkün kıldı ve herhangi bir tek hücrede multiomik analizin yolunu açtı.
