Protokolümüz, ECM'nin klasik adipojenik arabulucuların yokluğunda adipojenik farklılaşmayı teşvik edebileceğini ve ECM ile hücre metabolizmasının hastalığa özgü düzenlenmesini gösteren ilk protokol olduğunu göstermektedir. Tekniğimiz, ecm ve adipositlerin yağ dokusu metabolizmasındaki rollerini incelemek için bir araç sağlar ve yağ dokusu homeostazının düzenlenmesinde ECM'nin rolünün incelenmesine izin verir. Standart 2D hücre kültürü ile karşılaştırıldığında, bizim 3D modeli daha sağlam muayene ve tip 2 diyabet bağlamında adipositler ve yağ dokusu ECM arasında çapraz konuşma diseksiyon sağlar.
Hücreselhale ne kadar iyi olduğunu ölçmek için daha küçük örneklerle başlamanızı öneririz. Hücrelerin ne kadar iyi büyüdüğü ve dokunun ne kadar iyi hücreyi yitireceği konusunda hastalar arası değişkenlik olduğunu unutmayın. Dokunun hücreleşmeden emin olmak ve örnekler arasındaki potansiyel farklılıkları anlamak için her adımdan önce ve sonra dokuyu gözlemlemek önemlidir.
Ameliyattan visseral yağ dokusu veya KDV aldıktan sonra, 50 mililitrelik konik bir tüpte 15-25 mililitre dondurucu tampon çözeltisine 5-10 gram doku ekleyerek depolamaya hazırlayın. Numuneyi tamamen batırın ve hücreyi decellularization kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Preadipocyte izolasyoniçin, kollajenaz tip II çözeltisi 20 mililitre bozulmamış KDV taze bir örnek iki gram yerleştirin, sonra tüp içine steril makas eklemek ve iyice doku kıyma.
Bir kez ince bir bulamaç için kıyılmış, 60 dakika boyunca bir orbital shaker üzerinde 37 santigrat derece kollajenaz çözeltisi içinde kuluçka. Kuluçkadan sonra, 100 mikrometrelik naylon kafesten sindirilen sindirilen suyu 50 mililitrelik konik bir tüpe süzün. Sindirilmiş orta viskoziteli sarı-turuncu bir sıvı ve sindirilmemiş doku artık iplikçikleri küçük bir miktar olmalıdır.
Numuneyi 270 kez g'de 10 dakika santrifüj edin, süpernatantı çıkarın ve hücre peletini bir pipetle 1X RBC lysing çözeltisinin iki mililitresinde yeniden askıya alın. 25 santigrat derece bir dakika için çözüm kuluçka, sonra 10 mililitre ekleyin 15% FBS DMEM F12 ve 10 dakika boyunca 270 kez g santrifüj. ECM'yi hazırlamak için, önceden dondurulmuş KDV örneğini önceden ısıtılmış bir su banyosunda 20 dakika boyunca periyodik olarak hafif manuel ajitasyonla kuluçkaya yatırarak 37 santigrat dereceye kadar dondurun/eritin.
Çözüldükten sonra, 20 dakika boyunca eksi 80 santigrat dereceye geri doku aktarın ve erime ile biten üç kez dondurma/ çözülme işlemini tekrarlayın. KDV örneğini 15-25 mililitre enzimatik çözelti 1 içeren yeni bir 50 mililitrekonik tüpe aktarmak için steril forsepsler kullanın ve numunenin tamamen batırDığından emin olun. Sonra 130 RPM sallayarak 37 santigrat derece gecede kuluçka.
Ertesi gün, her yıkamadan sonra çözeltiyi dökerek 15-25 mililitre durulama tampon çözeltisi ile numuneyi üç kez yıkayın. Numuneyi 15-25 mililitre enzimatik solüsyon 2 ile yeni bir 50 mililitrelik tüpe aktarın ve bir gecede kuluçkaya yatırın. Durulama tampon çözeltisi ile yıkAyılmaz ve numuneyi 15-25 mililitre polar solvent ekstraksiyon çözeltisi içeren yeni bir tüpe aktarın.
Sallayarak bir gecede örnek kuluçka. Polar solvent çözeltisi ile kuluçkadan sonra lipid giderme numunesinin incelenmesi önemlidir. Lipid çoğu kaldırılmazsa, bu adımı tekrarlamak gerekebilir.
Daha kısa kuluçka süresi kullanılabilir. Kuluçkadan sonra, numuneyi 15-25 mililitre durulama tampon çözeltisi içeren yeni bir tüpe aktarın ve numuneyi üç kez çalkalayıcı üzerinde yıkayın. Daha sonra her yıkamadan sonra etanol dökülen, % 70 etanol çözeltisi ile örnek üç kez yıkayın.
Numuneyi depolama solüsyonuyla bir kez yıkayın, ardından 15-25 mililitre depolama çözeltisi içeren taze bir tüpe aktarmak için steril forsepsler kullanın ve tam olarak batırın. Örnek daha sonra bir aya kadar dört santigrat derecede saklanabilir. Isopropanol ve etanol yanıcıdır ve oda sıcaklığında olmalı ve yanıcı atıklarda bertaraf edilmelidir.
Herhangi bir insan atıkları her zamanki biyolojik tehlike atıklarından ayrı olarak bertaraf edilmelidir. Depolanan ECM parçalarını steril forsepsli 24 kuyuluk bir plakanın tek tek kuyularına aktarın ve planlanan aşağı tahliller için gerektiği kadar parça ekleyerek. Orbital shaker üzerinde% 70 etanol 500 mikrolitre ile üç kez yıkayın, sonra PBS ile üç kez yıkayarak onları rehydrate.
ECM'yi 100 miligramlık parçalara dönüştürmek için steril makas kullanın. Her parçayı 24 kuyuluk bir kuyuya yerleştirin ve fazla PBS'nin parçalardan dışarı çıkması için plakayı 15 dakika boyunca 25 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra bir pipet ile kuyulardan kalan PBS'yi dikkatlice çıkarın.
Hücreleri doğrudan ECM'ye boruhaline getirerek her parçayı 20 mikrolitre preadipocyit hücre süspansiyonu ile tohumlayın. Pipet ucunu ECM'ye yerleştirin ve yavaşça matrisin ortasına atarak hücre süspansiyonunun taşmayıp kuyunun dibine inmediğinden emin olun. Hücre süspansiyonu ECM'den taşarsa, pipet ucunu o konumdan çıkarın ve ECM'nin başka bir yerine takın.
Hücre tohumlama sonra, 37 santigrat derece 40 dakika boyunca ECM kuluçka. Tohumlu ECM parçalarını kapsayacak şekilde her kuyuyu 500 mikrolitre büyüme ortamıyla doldurun. Kültür hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit 72 saat.
72 saat sonra, ECM parçasını rahatsız etmeden büyüme ortamını dikkatlice aspire edin. Her iki veya üç günde bir medya değişen 14 gün boyunca farklılaşma medya ve kültür hücreleri 500 mikrolitre ekleyin. Işık mikroskobu kullanarak farklılaşma olup olup yok.
Hücreler lipidler birikir, renk kahverengi-sarı açmak ve onlar ayırt olarak daha küresel hale gelir. Yağ dokusu ECM'nin hazırlanması, preadipocytes ile tohumlama ve olgun adiposiitlere in vitro farklılaşma, ECM'nin hücredışılaştırılması ve reseeding ve farklılaşma üzerine adiposit içeren lipidin daha sonra recapitülasyonu nu ortaya çıkaran taramalı elektron mikroskobu ile izlendi. Kollajen 1 hücreli ECM spesifik immünohistokimyakolajen mikro mimarisinin bakım gösterdi canlı ve sabit 3D ECM-adiposit yapılar Yağ Red-O boyama adipositler içeren lipid gösterdi.
ECM'de farklılaşan adipositler, ecm'de kültürlenen farklılaşmamış preadipocyte'lere göre farklılaşmış hücrelerde bu genlerin upregulated olduğunu gösteren kantitatif gerçek zamanlı PCR kullanılarak adipojenik genler için tarandı. Transkript düzeylerindeki tam fark gösterilir. Diyabetik ve nondiyabetik deneklerin dört ecm ve adiposit kombinasyonu metabolik fenotitiplemeye tabi tutuldu.
Diyabetik dokularda lipolitik fonksiyonda bozulmuş glikoz alımı keşfedildi. Daha da önemlisi, diyabetik adipositlerde insülin uyarılmış glikoz alımı ve lipolitik kapasiteyi diyabetik olmayan ECM'nin kurtardığı bulunmuştur. İzole preadipocytes kontaminasyonu, hücreli doku, ve reseeded ECM nadir değildir.
Kısırlık protokol boyunca özenle muhafaza edilmelidir.
