Son çalışmalar, obezitenin gelişimi sırasında Yağ dokusu remodeling anjiyogenez ve sempatik yenilik kritik rolü vurgulanmıştır. Burada, Adipose dokusunda kan damarlarını ve sinir liflerini etkin bir şekilde duran değiştirilmiş bir immünoresans yöntemini gösteriyoruz. Yaklaşımımız, ayakta verimlilik ve kaliteden ödün vermeden doğrudan ve verimlidir.
Görüntüleri konfokal mikroskopi ile elde ediyoruz. Görüntülerin yüksek çözünürlüğü, kan damarı ağlarını yeniden yapılandırmamızı ve özelliklerini doğru bir şekilde analiz etmemizi sağlar. Bu prosedüre metin protokolünde ayrıntılı olarak belirtildiği gibi altı haftalık C57 Black-6J erkek farelerin anestezi ve perfüzyonile başlayın.
Farelerden beyaz ve kahverengi yağ ları inceleyin. Parça küçük parçalar halinde doku örnekleri kırmak için makas kullanın. Sterilize cımbızlı küçük parçaları kasetlerde doku örneklerinin doğru etiketle etiketlenmiş kasetleri yerleştiren dokuya aktarın.
Doku örnekleri içeren gömülü kasetleri 24 ila 48 saat boyunca dört santigrat derecede fiksasyon çözeltisine batırın. Küçük parçalar bir Petri Çanak içine cımbız sterilize edildi aktarın. Numuneleri yıkama başına 0,5 mililitre fırça 1x PBS tamponuyla 3 kez yıkayın.
Şimdi sterilize makas ile yaklaşık iki milimetreküp küpler halinde sabit doku örnekleri kesti. Permeabalizasyon için, numuneleri %1 Triton PBS tamponunun mililitresini içeren 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın ve tüpleri 18 RPM'de 1 saat oda sıcaklığında hafifçe döndürün. Bir saat sonra % 1'lik Triton PBS tamponu aspirasyon ile dikkatlice çıkarın ve 1x PBS'yi doğrudan aynı tüplere ekleyerek numuneleri üç kez yıkayın.
Her yıkama sırasında tüpleri birkaç kez ters çevirin. Engelleme için, numunelere 0,5 mililitre bloke tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca hafif bir dönüşle kuluçkaya yatırın. 0.4 mililitre primer antikor çözeltisi hazırlamak için, iki mikrolitre anti Endomusin ve iki mikrolitre anti-tirozin hidroksi lase antikorlarını 396 mikrolitre bloke edici tampona kadar seyreltin.
Vortex ve ses seviyesini kurtarmak için aşağı spin. Şimdi, doku parçalarından bloke tamponu dikkatlice çıkarın. Tüpler içine hazırlanan birincil antikor solüsyonu 100 mikrolitre ekleyin ve dört derece celcius gecede kuluçka.
Ertesi gün, dikkatlice istenirse yeniden kullanmak için birincil antikor solüsyonu toplamak. Numuneleri 18 RPM'de yumuşak bir dönüşle 30 dakika boyunca yıkama başına 500 mikro litrede 1x PBST ile üç kez yıkayın. İkincil antikor solüsyonunun hazırlanması için, iki mikrolitre flouro-flouro konjuge anti-tanrı IGG'yi iki mikrolitre flouro-flouro konjuge anti-kuduz IGG'yi 396 mikrolitre bloke tamponuna seyreltin.
Girdap ve tüm sıvı toplamak için kısa bir süre spin. Şimdi, örneklerden son yıkama tamponu çıkarın. Tüpleriçine ikincil antikor çözeltisi 100 mikrolitre ekleyin.
Örnekleri 18 RPM'de hafif bir dönüşle iki saat oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. İkincil antikor solüsyonu dikkatlice çıkardıktan sonra numuneleri her biri 18 RPM'de yumuşak bir dönüşle 30 dakika boyunca yıkama başına 500 mikrolitrede 1x PBST ile üç kez yıkayın. Optik açıklık için, % 90 Gliserol bir mililitre örnekleri batırın ve şeffaf hale gelene kadar karanlıkta dört derece celcius örnekleri tutun.
Burada ses görüntüleme için bir kuyu oluşturmak için slayt bir silikon izolatör ekleyin. Silikonun yüksekliğini numunenin yüksekliğine veya biraz daha azına tutun. Dikkatle kuyuya örnekleri aktarın ve montaj ortamı ile doldurun.
Yüzeye bir kapak fişi yerleştirin ve kapak kaymasının dörtte birini yüksek viskoziteli ortamla kapatın. Oda sıcaklığında ve karanlıkta 24 saat montaj orta tedavi sağlar. Kürleme tamamlandıktan sonra, optimum numune uzun ömürlülüğü için kapak kapağının kenarlarını tamamen kapatın.
Bir konfokal mikroskop ve ilgili yazılım 20 kez hedefi ile Z yığını görüntüleri edinin. Sistemi çalıştırın. Yapılandırma sekmesine tıklayın ve hem Argon lazer hem de He-Ne 633 lazeretkinleştirin.
Edinme sekmesine tıklayın. Görünür lazer çizgileri panelinde, 488 nanometre ve 633 nanometreye kadar lazer çizgilerini seçmek için ilgili yoğunluk kaydırıcılarını yukarı doğru hareket ettirin. Başlangıçta yoğunlukları 20-30% Şimdi 488, 561, 633 üçlü dikroik ayna seçin ayarlanabilir.
Etkin onay kutularına tıklayarak fotoğraf çarpanlarını etkinleştirin. 633 nanometre lazer için 488 nanometre lazer ve fotoçarpan 34 tarafından uygulanan emisyon için photomultiplier birini seçin. Dalga boyu aralığını fotoğraf çarpanı bir için 500 ile 550 nanometre arasında ayarlayın.
650-750 nanometre, fotoğraf çarpanı üç için. Her fotoğraf çarpanına renkli dikdörtgeni çift tıklayarak ve açılır menüden bir renk seçerek görüntü görüntüleme için kullanılacak sözde rengi seçin. Şimdi örneklerde görüntü kontrol etmek için canlı tıklayın.
XY ilgi alanı içinde bir odak düzlemi seçmek için Z konumu nob'unu kullanın. Lazer yoğunluğunu, akıllı kazancı ve mahsupı çevirerek görüntülerin parlaklığını ayarlayın. Her floresan kanalı için bu ayarlamayı hızlı arama tablosu görüntüleme modu altında gerçekleştirin.
Doymuş piksellerin mavi renkte görüntülendiği hızlı arama tablosu moduna girmek için hızlı bak masa düğmesine tıklayın ve uygun parlaklık düzeyinin ayarlanmasına yardımcı olur. Sözde renkli ekran moduna geri dönmek için hızlı yukarı bak düğmesine iki kez tıklayın. Tarama yaparken, odak düzlemini ilgi hacminin bir ucuna taşımak için Z konumunun nob yönünü nisbeten döndürün.
Sonra tarama ve konumunu ayarlamak için son ok ucunu tıklatın. Odak düzlemini numuneden, ilgi hacminin diğer ucuna taşımak için Z pozisyon nob'unu saat yönünde çevirin. Ardından, tarama başlangıç konumunu ayarlamak için başlat ok başlığına tıklayın.
Z adım boyutunu üç mikrona ayarlayın. 1024'e 1024, 100 Hz'lik bir hız ve iki satır ortalaması seçerek görüntü kalitesini değiştirin. Z yığını nın görüntü edinimi başlatmak için başlat'ı seçin Elde edilen görüntü yığınının maksimum projeksiyonu için, işlem sekmesine ve ardından aracı tıklatın;3B projeksiyonu seçin ve X, Y ve Z.Set eşiği sıfıra değişiklik yapmadan yöntem listesine maksimum girin, uygula'ya tıklayın.
Z hacminin maksimum yoğunluğu görüntülenen bir 2B görüntüiçine yığılmış olacaktır. 2B görüntüleri açık kaynak kodlu yazılım la analiz etmek için, yığınla gösterilen görüntüleri yazılımda açın. Tüm damar yapıları düzgün seçilene kadar damar çapını ve yoğunluğunu ayarlayın.
Çalıştır çözümlemesi seçin ve yazılımın rehberliğini izleyerek verileri dışa aktarın. Lisans yazılımı aracılığıyla 3D görüntüleri analiz etmek için, yazılımla birlikte görüntülerin ham verilerini açın. Z hacminin her katmanındaki damar yapıları düzgün bir şekilde parçalanana kadar yoğunluk eşiğini ve diğer parametreleri ayarlayın.
Özel bir grafik elde etmek için ortaya çıkan binarised görüntü yığınını iskeletleştirin. Seçilen segment özelliklerini analiz edin ve yazılımın rehberliğini takiben verileri dışa aktarın. Distal bölge epididimal beyaz yağ dokusu, dorsal lomber subkutan beyaz yağ dokusunun medial bölgesi ve intra-skapular kahverengi yağ dokusunun medial bölgesi toplandı.
Bütün bir montaj boyama sonra, doku gövdeleri monte edildi ve konfokal mikroskop ile görüntülendi. Daha fazla kan damarı pozitif olarak lekelendi. Gliserol anti-Endomusin antikor ile subkutan beyaz yağ dokusu inkübe, temizleme adımı kan damarlarının tam boyama için kritik olduğunu düşündürmektedir.
Bu yöntemle kan damarları nın ve sinir liflerinin depolar arasında farklı desenler gösterip göstermediğini belirlemek için, kan damarlarını göstermek için antikorlu antikorlu ororeskans dokusunda ve sinir liflerini gösteren anti-tirozin hidroksi kız ile ortak floresan boyama yapıldı. İlginçtir, sonuçlar beyaz yağ dokusu ile karşılaştırıldığında kahverengi yağ dokusunda sinir lifleri daha önemli ölçüde daha fazla kan damarları olduğunu göstermektedir. Beyaz yağ dokusu arasında, deri altı beyaz yağ dokusu epididimal beyaz yağ dokusu daha yüksek kan damarı yoğunluğu sergiledi.
Dikkat, sinir lifleri kan damarlarına paralel olarak genişletilmiş iken, onlar önemli eş lokalizasyon göstermedi. Damar alanı, kavşak sayısı ve tüp uzunluğu daha sonra bu üç tür yağ dokusunda 2B yöntemi ile niteliksel olarak ölçüldü ve benzer sonuçlar bulundu. Bu yöntem verimli cos-dens kan damarları ve sinir lifleri ve yağ dokusu.
Obezite gelişimi sırasında yağ dokusundaki dinamik değişimi incelemek için yararlı bir araç olarak geliyor. Güçlü ağız hy-de toksiktir. Lazer ışınları odak mikroskobu haline gelmiştir çünkü lütfen P-ifa daha geniş bir cilt temas ve teneffüs adımları ve düzgün bir şekilde ele yürütmek ama göz zarar.
Amaçtan gelen ışınlara göz maruziyetini önlemek,
