Yazarlar, Ljubljana Üniversitesi Tıp Merkezi, İhtisas Hematoloji Laboratuvarı, Hematoloji Bölümü, İç Hastalıkları Anabilim Dalı'ndaki tüm akademik uzmanlara ve çalışanlara teşekkür eder.

Çalışma Slovenya Cumhuriyeti Tıp Etiği Komitesi tarafından onaylandı. Tüm prosedürler Helsinki bildirgesine uygundu.
1. HRM tarafından floresan bazlı nicel gerçek zamanlı PCR (qPCR) ve qPCR sonrası analiz
<ol><li>Malzeme Tablosunda listelenen astarları steril, RNaz ve DNaz içermeyen H 2 O ile 100 μM'ye yeniden sunun(bkz. Malzeme Tablosu). 10 μM çalışma konsantrasyon astarı yapın. Protokolde kullanılan primerler2'denönce yayınlanmıştır.</li>
	<li>Quantitat granülositler DNA'yı üreticinin talimatı11'i takiben floresan boyama yöntemiyle (bkz. Malzeme Tablosu). 10 mM Tris-Cl, 0,5 mM EDTA, pH 9,0 kullanarak 20 ng/μL DNA çözeltisi hazırlayın(bkz. Malzeme Tablosu).<ol>
<li>DNA örneklerine ek olarak, en az üç DNA kontrolü hazırlayın: NM_004343.3 (CALR) ile iki pozitif kontrol : c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46) (52 bp silme veya tip 1 mutasyon) ve NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47) (5 bp ekleme veya tip 2 mutasyon) genetik varyantı, ayrıca şablon olmayan (NTC) kontrol olarak vahşi tip DNA ve negatif kontrol. NOT: HRM kurulumunu gerçekleştirmeden önce, qPCR aygıtının HRM denemeleri için kalibre edilmiş olduğunu onaylayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Üretici protokolüne göre qPCR HRM Master Mix'i hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu)aşağıdaki gibi: 10 μL 2x qPCR Ana Boya ile Karışımı, 0.2 μL 10 μM İleri Astar, 0.2 μL 10 μM Ters Astar, 8.6 μL steril, RNase ve DNase içermeyen H2O. Malzeme Masasındanastarları kullanın. Her DNA örneği ve kontrolü için üç kopya çalıştırın.<ol>
<li>İşlenmekteki numune sayısına göre qPCR HRM Master Mix'i hazırlayın. Reaktif aktarımları sırasında oluşan kayıp için fazla hacim sağlamak üzere hesaplamalara en az %10'luk fazla hacim ekleyin.</li>
	</ol></li>
	<li>Tüpe hafifçe dokunup ters çevirerek reaksiyon içeriğini karıştırın ve 2-3 sn boyunca girdaplayın. Tüpün duvarından dibe kadar tüm dağınık damlacıkları kısa bir dönüşle toplayın.</li>
	<li>Cihaz ve HRM deneyi için uygun bir reaksiyon plakası hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu). qPCR HRM Master Mix'in 19 μL'lik kısmını 96 kuyulu optik reaksiyon plakasının uygun kuyularına aktarın.</li>
	<li>Negatif kontrollerin, pozitif kontrollerin ve numunelerin pipet 1 μL'si optik reaksiyon plakasının uygun kuyularına. NTC için, DNA yerine qPCR HRM Master Mix'i hazırlamak için kullanılan1 μLsteril, RNase ve DNase içermeyen H 2 O aktarın.</li>
	<li>Reaksiyon plakasını optik yapışkan filmle kapatın. Çalıştırma sırasında buharlaşmayı önlemek için sıkıca yapın. Doğru floresan algılamasını sağlamak için optik yapışkan filmin reaksiyon plakasındaki tüm kuyularda düzlem olup olmadığını kontrol edin.</li>
	<li>Reaksiyon plakasını oda sıcaklığında (RT) 780 x g'da 1 dakika döndürün. Sıvının reaksiyon plakasındaki kuyuların dibinde olup olmadığını kontrol edin. Tahlilleri çalıştırmaya devam edin. NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Plakayı 4 °C'de en fazla 24 saat saklayın. 4 °C'de depolanan plakanın RT'ye ısınmasını izin verin ve çalıştırmadan önce plakayı kısa bir süre döndürün.</li>
	<li>Üreticinin talimatına göre, DNA'yı yükseltmek ve eritmek ve qPCR cihazında HRM floresan verileri oluşturmak için koşuyu hazırlayın ve başlatın. Cihaz sistemi yazılımında, kontrolleri ve örnekleri uygun kuyulara atayın.</li>
	<li>CALR genetik varyant tespiti için, varsayılan cihaz amplifikasyon protokolünü değiştirin ve aşağıdaki termal bisiklet protokolünü kullanarak DNA'yı güçlendirin: 10 dakika boyunca 95 °C, ardından 10 s için 95 °C ve 60 s için 62,5 °C'lik 50 döngü.</li>
	<li>Üreticinin talimatlarına göre qPCR'den hemen sonra eriyik eğrisi/ayrışma (HRM) aşamasını gerçekleştirin12 aşağıdaki gibi: 10 s için 95 °C, 1 dakika için 60 °C ve ardından 95 °C'ye kadar 0,025 °C/s rampa hızı. Sıcaklığı 15 s için 95 °C'de ve 15 sn için 60 °C'de tutun.</li>
	<li>Çalıştırma otomatik olarak sona erer. İlk olarak, büyütme grafiğini gözden geçirin ve doğrulayın (Şekil 2).</li>
	<li>Cihaz sistemi yazılımının deneme menüsünde, amplifikasyon çizim seçeneğini seçin. Veri görüntülenmiyorsa, Çözümleyeşil düğmesini tıklatın.<ol>
<li>Amplifikasyon çizimi sekmesinde, çizim türü açılan menüsünden, döngü numarasının (ΔRn vs Döngü) bir işlevi olarak pasif referanstan (ΔRn) floresan'a normalleştirilen ham floresan okumaları olarak amplifikasyon verilerini görüntüleyen çizimi seçin. Çizim rengi açılan menüsünde Örnek 'iseçin.</li>
	</ol></li>
	<li>Grafik türü açılır menüsünden doğrusal amplifikasyon grafik türünü seçin. Taban çizgisi başlangıç seçeneğini belirleyerek doğrusal amplifikasyon grafiğinde taban çizgisi başlangıç ve bitiş döngüsünü gösterin. Taban çizgisinin doğru ayarlı olduğunu doğrulayın. Uç döngü, önemli floresan sinyalin algılandığı döngü numarasından önce birkaç döngü ayarlanmalıdır. Taban çizgisi genellikle 3 ila 15 döngü arasında ayarlanır (Şekil 2).</li>
	<li>Grafik türü açılan menüsünden log10 amplifikasyon grafik türünü seçin. Eşik seçeneğini belirleyerek grafikteki eşik çizgisini gösterin. Doğru ayarlanmazsa eşiği buna göre ayarlayın. Doğru ayarlanmış eşik, eşik çizgisinin qPCR eğrilerinin üstel aşamasını geçtiği anlamına gelir (Şekil 2).</li>
	<li>Normal amplifikasyon eğrilerinin tüm numune ve pozitif kontrol kuyularında olduğunu doğrulayın. Döngü 40'dan önce NTC kuyularında amplifikasyon olmadığını doğrulayın. Normal bir amplifikasyon grafiği, floresanda 15 ve 35 döngüleri arasındaki eşiği aşan üstel bir artış gösterir (Şekil 2). Kuyu pozisyonunda amplifikasyon yoksa numune kuyularını analizden hariç tutun. NOT: Amplifikasyon grafiği anormal görünüyorsa veya NTC amplifikasyonu iyi gösteriyorsa, üreticinin sorun giderme kılavuzuna göre sorunu tanımlayın ve çözün.</li>
	<li>Enstrüman sistemi yazılımında 2'den fazla çoğaltmadan farklı olan nicelik döngüsü (Cq) değeri ile aykırı değeri hariç tutun12. Aykırılıklar hatalı HRM sonuçları üretebilir.</li>
	<li>Türev erime eğrilerinde, erime öncesi ve sonrası bölgeleri/sıcaklık çizgilerini gözden geçirin. Erime öncesi ve sonrası bölgeler floresan seviyelerinde büyük piklerin veya eğimlerin olmadığı düz bir alan içinde olmalıdır(Şekil 3). Gerekirse ona göre ayarlayın. Erime öncesi ve sonrası sıcaklık çizgilerinin başlangıç ve durağını birbirinden yaklaşık 0,5 °C aralıkla ayarlayın (Şekil 3). Parametreler Analiz Et düğmesine tıklayarak ayarlanırsa analizi yeniden başlatın.</li>
	<li>Fark çizimi sekmesinde, çizim ayarları sekmesinde, referans DNA'sı olarak çoğaltılan vahşi tür denetiminden (homozygote) birini seçin ve Analiz Et düğmesine tıklayarak analizi yeniden başlatın.</li>
	<li>Hizalanmış eriyik eğrileri sekmesinde, tüm pozitif denetimlerin doğru genotipe sahip olduğunu ve NTC'nin yükseltilemediğini onaylayın (Şekil 4). Kuyu tablosundan, analiz çizimlerinde karşılık gelen erime eğrisini vurgulamak için pozitif bir kontrol içeren kuyuları seçin. Çizginin renginin doğru genotipe karşılık geldiğini onaylayın. Diğer pozitif kontrolleri ve NTC'yi içeren kuyular için adımları yineleyin.</li>
	<li>Hizalanmış eriyik eğrileri sekmesinde, bilinmeyen örneklerin çizim ekranlarını dikkatlice gözden geçirin ve kontroller için çizim ekranlarıyla karşılaştırın (Şekil 4). Kuyu tablosundan, bilinmeyen örnek çoğaltmalarını içeren kuyuları seçin, eriyik eğrisinin rengini kontrol edin ve pozitif kontroller içeren kuyuları tek tek seçerek sıralı bir sırayla kontrollerle hizalayın. Bilinmeyen tüm örnekler için işlemi yineleyin. NOT: Bilinmeyen örnek, erime eğrisi ona sıkıca hizalanmışsa kontrollerden birinin varyantını içerir. Bilinmeyen örneğin kontrollere karşılık gelen bilinmeyen bir varyantdan oluştuğunu gösteren farklı varyant grupları (farklı renkler) görüntülenebilir (Şekil 8). Hastanın örneğinde düşük düzeyde somatik genetik varyant bulunabilir. Bu, özellikle tahlil tespit sınırında İkM sonucunun yorumlanmasını etkileyebilir (Şekil 9). Bu durumlarda, çizginin rengi ve hatta şekli vahşi tip genotipine çok benzeyebilir.<ol>
<li>Sonuç sonuçsuz kaldığında, HRM sonuçlarını agarose jel elektroforezi ve dizileme yöntemlerinin sonuçlarıyla birleştirin. Örneği veya isteği yeniden test edin ve gerekirse yeni bir örneği yeniden test edin.</li>
		<li>Eğrileri çoğaltmak için veri kümesini dikkatlice gözden geçirin ve grup içindeki her çoğaltmanın hizalamasının sıkı olup olmadığını kontrol edin. Gruptaki diğer örneklerle (aykırı) sıkıca hizalanmamışsa, yinelemeyi hariç tutun. Daha fazla aykırılık varsa ve sonuçlar sonuçsuzsa örneği yeniden test edin. DNA örneğinin miktarının ve kalitesinin İkM sonuçlarını etkilediğini unutmayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Fark çizimi sekmesinde bilinmeyen örnek için sonucu çözümle. 1.21 adımında açıklanan yordamı yineleyin ve bilinmeyen örnek için elde edilen sonuçların aynı olduğunu doğrulayın.</li>
	<li>Ardından, qPCR HRM ürünlerini agarose jel üzerinde çalıştırın. NOT: Protokol burada duraklatılabilir. Plakayı 4 °C'de en fazla 24 saat veya -20 °C'de daha uzun bir süre, ancak 7 günden fazla saklamayın. 4 °C'de depolanan plakanın RT'ye ısınmasını izin verin ve çalıştırmadan önce plakayı kısa bir süre döndürün. - 20 °C'de depolanan plakanın çözülmesine ve RT'ye ısınmasına izin verin ve çalıştırmadan önce plakayı kısa bir süre döndürün.</li>
</ol>2. Agarose jel elektroforezi
<ol><li>QPCR HRM ürünlerini uygun jel elektroforez sistemini kullanarak floresan nükleik asit lekesi içeren% 4 agarose ön döküm jel üzerinde çalıştırın(bkz. Malzeme Tablosu , Şekil 5). Yalnızca bir pozitif, negatif, NTC ve örnek qPCR HRM çoğaltması çalıştırın. NOT: Jelleri kullanırken eldivenler her zaman giyilmelidir. Eşdeğer agarose yüzdesi, floresan nükleik asit lekesi ve kuyu formatı seçilirse, başka herhangi bir jel elektroforezi sistemi bu amacı yerine getirebilir.</li>
	<li>Jel elektroforezi sistemini üreticinin protokolüne göre çalıştırın(bkz. Malzeme Tablosu). Kasetteki ön döküm jeli paketten çıkarın, tarağı çıkarın ve üreticinin talimatlarına göre cihaza yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). NOT: Paketi açtıktan sonraki 15 dakika içinde jeli yükleyin.</li>
	<li>10 μL'lik bir numuneyi steril, RNaz ve DNaz içermeyen H 2 O ile20μL'ye seyreltin.</li>
	<li>Steril, RNase ve DNase içermeyen H 2 O ile 3 μL DNA boyutu standart çözeltisini20μL'ye seyreltin (bkz. Malzeme Tablosu). M'yi 20 μL seyreltilmiş DNA boyutu standart çözeltisi ile iyi yükleyin (Şekil 6).</li>
	<li>Boş kuyuları 20 μL steril, RNase ve DNase içermeyen H2O ile doldurun.</li>
	<li>Çalıştırılan jelin yüzdesine göre programı hemen seçin ve cihazdaki çalışma süresini 10 dakika olarak ayarlayın.</li>
	<li>GO düğmesine basarak elektroforezi yükleme örneğinden 1 dakika sonra başlatın. Yetersiz çözünürlük elde edilirse elektroforezi süresi uzatılabilir. NOT: Üreticinin talimatlarına göre önerilen maksimum agarose elektroforez çalışma süresini aşmayın.</li>
	<li>Elektroforez tamamlandığında, mavi ışık veya UV transillumination kullanarak jeldeki DNA'yı görselleştirin. Elektroforez görüntülerinin görselleştirilmesi, analizlenmesi ve saklanması çoğunlukla foto-dokümantasyon sistemine sahip bir jel görüntüleyiç tarafından yapılır (Şekil 5).</li>
	<li>Bilinmeyen numunenin sonuçlarını pozitif kontrollerle karşılaştırarak görselleştirilmiş qPCR HRM ürünleri jel desenini analiz edin ve yorumlayın (Şekil 7 ve Şekil 8).</li>
	<li>Bilinmeyen örnek HRM ve jel elektroforez sonuçları bilinmeyen bir genetik varyantın mevcut olduğunu gösteriyorsa, açıklanan protokole göre Malzeme Tablosunda açıklanan astarları kullanarak qPCR HRM ürününü sıralayın13. DİkKAT: Floresan nükleik asit lekesi içeren agarose jelleri kurum yönetmeliklerine uygun şekilde atılmalıdır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nangalia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+CALR+mutations+in+myeloproliferative+neoplasms+with+nonmutated+JAK2.">Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2.</a> New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).</li><li>Klampfl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+of+calreticulin+in+myeloproliferative+neoplasms.">Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms.</a> New England Journal of Medicine. 369, 2379-2390 (2013).</li><li>Vainchenker, W., Kralovics, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+and+molecular+pathophysiology+of+classical+myeloproliferative+neoplasms.">Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms.</a> Blood. 129, 667-679 (2017).</li><li>Pietra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+clinical+effects+of+different+mutation+subtypes+in+CALR-mutant+myeloproliferative+neoplasms.">Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms.</a> Leukemia. 30, 431-438 (2016).</li><li>Lim, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+detection+of+CALR+exon+9+mutations+using+high-resolution+melting+analysis.">Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis.</a> Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).</li><li>Lay, M. J., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+fluorescence+genotyping+of+factor+V+leiden+during+rapid-cycle+PCR.">Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR.</a> Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).</li><li>Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+melting+analysis+(HRMA)+-+More+than+just+sequence+variant+screening.">High-resolution melting analysis (HRMA) - More than just sequence variant screening.</a> Human Mutation. 30, 860-866 (2009).</li><li>Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+for+revision+and+proposed+changes+of+the+WHO+diagnostic+criteria+for+polycythemia+vera,+essential+thrombocythemia+and+primary+myelofibrosis.">Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis.</a> Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).</li><li>Reed, G. H., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+and+specificity+of+single-nucleotide+polymorphism+scanning+by+high-resolution+melting+analysis.">Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis.</a> Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).</li><li>Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CALR+mutations+in+a+cohort+of+JAK2+V617F+negative+patients+with+suspected+myeloproliferative+neoplasms.">CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms.</a> Scientific Reports. 9, 19838 (2019).</li><li>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (2015).</li><li>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (2011).</li><li>Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , (2010).</li><li>Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+DNA+melting+analysis+for+simple+and+efficient+molecular+diagnostics.">High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics.</a> Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).</li><li>Gonzalez-Bosquet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+somatic+mutations+by+high-resolution+DNA+melting+(HRM)+analysis+in+multiple+cancers.">Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers.</a> PLoS One. 6, 14522 (2011).</li><li>Van Der Stoep, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+guidelines+for+high-resolution+melting+curve+(HRM)+analysis:+An+interlaboratory+validation+of+BRCA1+mutation+scanning+using+the+96-well+LightScanner.">Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner.</a> Human Mutation. 30, 899-909 (2009).</li><li>Singdong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+Prognosis+Significance+of+JAK2+(V617F),+MPL,+and+CALR+Mutations+in+Philadelphia-Negative+Myeloproliferative+Neoplasms.">Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms.</a> Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).</li><li>Erali, M., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+melting+analysis+for+gene+scanning.">High resolution melting analysis for gene scanning.</a> Methods. 50, 250-261 (2010).</li><li>Bilbao-Sieyro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Resolution+Melting+Analysis:+A+Rapid+and+Accurate+Method+to+Detect+CALR+Mutations.">High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations.</a> PLoS One. 9, 103511 (2014).</li><li>S&#322;omka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+melting+(HRM)+for+high-throughput+genotyping-limitations+and+caveats+in+practical+case+studies.">High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+common+DNA+concentration+measurement+methods.">Comparison of three common DNA concentration measurement methods.</a> Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).</li><li>Voytas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis.">Agarose Gel Electrophoresis.</a> Current Protocols in Immunology. 2, (1992).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments.">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Endonuclease+R&#183;EcoRI+Fragments+of+DNA+from+Lambdoid+Bacteriophages+and+Other+Viruses+by+Agarose-Gel+Electrophoresis.">Analysis of Endonuclease R&#183;EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis.</a> Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).</li></ol>

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

DNA'nın yüksek çözünürlüklü erimesi genotipleme ve genetik varyant taraması için basit bir çözümdür14. Erime eğrisinin şeklini değiştiren heteroduplexes ile sonuçlanan sıra farklılıklarına bağlıdır. Kanserli belirli bir grup hastaya özgü gende çeşitli frekanslara sahip farklı genetik varyantlar gözlenebilir 1,2,15,16,<sup class=...

Kalretikülin geninde(CALR)somatik genetik varyantlar 2013 yılında esansiyel trombositemi ve primer miyelofibrozis1,2gibi miyeloproliferatif neoplazmları (MPN) olan hastalarda tanınmıştır. O zamandan beri, CALR geninde 50'den fazla genetik varyant keşfedildi ve bu da +1 (−1+2) çerçeve3'üindükledi. En sık görülen iki CALR genetik varyantı 52 bp silmedir (NM_004343.3 (CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46)), tip 1 mutasyonu ve 5 bp ekleme (NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47)), tip 2 mutasyonu olarak da adlandırılır. Bu iki genetik varyant tüm CALR genetik varyantlarının %80'ini temsil eder. Diğerleri, vahşi tip CALR4'eyakın bir α sarmalının korunmasına dayanan algoritmalar kullanılarak tip 1 gibi veya tip 2 gibi sınıflandırılmıştır. Burada, CALR genetik varyant tespiti için son derece hassas ve hızlı yöntemlerden biri olan yüksek çözünürlüklü erime analiz yöntemini (HRM) sunuyoruz. Bu yöntem, CALR mutasyonlarının çoğunluğunu temsil eden tip 1 ve tip 2 genetik varyantların hızlı bir şekilde algılanmasını sağlar5. HRM, 1997 yılında V Leiden6faktöründeki mutasyonu tespit etmek için bir araç olarak gerçek zamanlı »polimeraz zincir reaksiyonu« (qPCR) ile birlikte tanıtıldı. Altın standart tekniği temsil eden Sanger dizilimine kıyasla, HRM daha hassas ve daha az spesifik bir yöntemdir5. HRM yöntemi, çok sayıda numunenin hızlı bir şekilde analizini sağlayan iyi birtarama yöntemidir. Floresan boya varlığında gerçekleştirilen basit bir PCR yöntemidir ve belirli beceriler gerektirmez. Başka bir fayda, prosedürün kendisinin, numuneyi HRM prosedüründen sonra elektroforezi veya Sanger dizilemesi için yeniden kullanmamızı sağlayan analiz edilen örneğe zarar vermemesi veya yoketmemesidir 7. Tek dezavantajı, bazen sonuçları yorumlamanın zor olmasıdır. Ek olarak, HRM tip 1 veya tip 2 mutasyonu olmayan hastalarda tam mutasyonu tespit etmez8. Bu hastalarda Sanger dizilimi yapılmalıdır(Şekil 1).
HRM, çift iplikli DNA'ya (dsDNA) dahil edilen doygun DNA floresan boyası varlığında spesifik DNA bölgesinin amplifikasyonuna dayanmaktadır. Floresan boya, dsDNA'ya dahil edildiğinde ışık yayar. Sıcaklıkta ilerleyici bir artış sonrasında dsDNA, erime eğrisinde floresan yoğunluğunda ani bir azalma olarak tespit edilebilen tek iplikli DNA'ya ayrılır. Erime eğrisinin şekli mutasyonu tespit etmek için kullanılan DNA dizisine bağlıdır. Örneklerin erime eğrileri, bilinen mutasyonların veya vahşi tip CALR'nin erime eğrileriyle karşılaştırılır. Farklı erime eğrileri tip 1 veya tip 2 9 olmayan farklı bir mutasyonu temsileder.
10'danönce yayınlanan retrospektif çalışmada HRM, agarose jel elektroforezi vedizileme yöntemi ile CALR geninde somatik genetik varyant tespiti algoritması kullanılmıştır ve doğrulanmıştır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>E-Gel EX 4% Agarose</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>G401004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuorometer 3.0 QUBIT</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>G6465EU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeltDoctor HRM MasterMix 2X</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4415440</td>
			<td>Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL)</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4346907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical adhesive film</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuGenius</td>
			<td>Syngene</td>
			<td>NG-1045</td>
			<td>Gel documentation systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CALRex9 Forward</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>Sequence: 5&#39;GGCAAGGCCCTGAGGTGT&#39;3 (High-Purity, Salt-Free)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CALRex9 Reverse</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>Sequence: 5&#39;GGCCTCAGTCCAGCCCTG&#39;3 (High-Purity, Salt-Free)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>51306</td>
			<td>DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUBIT dsDNA HS assay</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trackit 100bp DNA Ladder</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>10488058</td>
			<td>Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4453534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water nuclease free</td>
			<td>VWR, Life Science</td>
			<td>436912C</td>
			<td>RNase, DNase and Protease free water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic variant detection in the calr gene using high resolution melting analysis

Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRM), genotipleme ve genetik varyasyon taraması için güçlü bir yöntemdir. Çoğu HRM uygulaması, dizi farklılıklarını algılayan DNA boyalarını ve erime eğrisinin şeklini değiştiren heteroduplexleri doyurma işlemine bağlıdır. Bir varyantı veya genotipi tanımlayan küçük erime eğrisi farklılıklarını tanımlamak için mükemmel cihaz çözünürlüğü ve özel veri analizi yazılımı gereklidir. Philadelphia kromozomu-negatif miyeloproliferatif neoplazmları olan hastalarda, kanser başta olmak üzere belirli bir hastalığı olan hastalara özgü gende ve CALR geninde farklı frekanslara sahip farklı genetik varyantlar gözlenebilir. İlgi geninde tek nükleotid değişiklikleri, eklemeler ve/veya silmeler (indels) HRM analizi ile tespit edilebilir. Farklı genetik varyant türlerinin tanımlanması çoğunlukla qPCR HRM testinde kullanılan kontrollere dayanmaktadır. Bununla birlikte, ürün uzunluğu arttıkça, vahşi tip ve heterozygot eğrileri arasındaki fark küçülür ve genetik varyant türünü belirlemek daha zordur. Bu nedenle, indellerin ilgi geninde beklenen yaygın genetik varyant olduğu durumlarda, HRM sonucunun netleşmesi için agarose jel elektroforezi gibi ek bir yöntem kullanılabilir. Bazı durumlarda, sonuçsuz bir sonuç standart Sanger dizilimi tarafından yeniden denetlenmeli/yeniden teşhis edilmelidir. Bu retrospektif çalışmada yöntemi MPN'li JAK2 V617F negatif hastalara uyguladık.

Tüm çoğaltılmış örnek ve kontrollerde 15 ve 35 döngüleri arasındaki eşiği ve nicelik döngüsünün çok dar değerlerini aşan üstel bir floresan artışı ile ilgi çekici DNA bölgesi başarıyla güçlendirilmişTIR (Şekil 2), genetik varyantların HRM analizi ile güvenilir bir şekilde tanımlanması için bir ön koşuldur. Bu, qPCR HRM deneyinde floresan boyama ile DNA'nın kesin bir şekilde belirlenmesi ve eşit miktarda DNA kullanılarak elde edilir (bkz. adım 1.2)....

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Variant Detection in the CALR gene using High Resolution Melting Analysis at JoVE.com

Genetic Variant Detection in the CALR gene using High Resolution Melting Analysis

Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRM), genetik varyant tespiti için hassas ve hızlı bir çözümdür. Erime eğrisinin şeklini değiştiren heteroduplexes ile sonuçlanan sıra farklılıklarına bağlıdır. HRM ve agarose jel elektroforezi taranarak, indels gibi farklı genetik varyantlar tanımlanabilir.

Yüksek Çözünürlüklü Erime Analizi Kullanarak CALR Geninde Genetik Varyant Tespiti

High resolution melting analysis (HRM) is a powerful method for genotyping and genetic variation scanning. Most HRM applications depend on saturating DNA ...

Tadej Paji&#269; 1,2, Tanja Bel&#269;i&#269; Miki&#269;1, Helena Podgornik1,3, Jurka Klun1, Sandra &#352;u&#263;urovi&#263;1,&#160;

genetic-variant-detection-calr-gene-using-high-resolution-melting

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Variant Detection in the CALR gene using High Resolution Melting Analysis

4.7K Görüntüleme.  University Medical Centre Ljubljana. Tadej Pajič 1,2, Tanja Belčič Mikič1, Helena Podgornik1,3, Jurka Klun1, Sandra Šućurović1, 

Video: Genetic Variant Detection in the CALR gene using High Resolution Melting Analysis

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

İrritabl Bağırsak Sendromu içinde miRNA&#39;lar Sirkülasyon tedirginlikler bir Çoklanmış Yüksek verim Gen İfadesi Platformu Kullanma Algılanan

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Genetik

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but especially on red blood cells (RBCs). As a receptor for the complement components C3b and C4b, CR1 regulates the activation of the complement cascade and promotes the phagocytosis of immune complexes and cellular debris, as well as the amyloid-beta (A&#946;) peptide in Alzheimer's disease (AD). Several studies have confirmed AD-associated single nucleotide polymorphisms (SNPs), as well as a copy-number variation (CNV) in the CR1 gene. Here, we describe an innovative method for determining the length polymorphism of the CR1 receptor. The receptor includes three domains, called long homologous repeats (LHR)-LHR-A, LHR-C, and LHR-D-and an n domain, LHR-B, where n is an integer between 0 and 3. Using a single pair of specific primers, the genetic material is used to amplify a first fragment of the LHR-B domain (the variant amplicon B) and a second fragment of the LHR-C domain (the invariant amplicon). The variant amplicon B and the invariant amplicon display differences at five nucleotides outside of the hybridization areas of said primers. The numbers of variant amplicons B and of invariant amplicons is deduced using a quantitative tool (high-resolution melting (HRM) curves), and the ratio of the variant amplicon B to the invariant amplicon differs according to the CR1 length polymorphism. This method provides several advantages over the canonical phenotype method, as it does not require fresh material and is cheaper, faster, and therefore applicable to larger populations. Thus, the use of this method should be helpful to better understand the role of CR1 isoforms in the pathogenesis of diseases such as AD.

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer&#039;s Disease Gene Susceptibility Assessment

Here, we describe an innovative method to determine complement receptor 1 (CR1) length polymorphisms for use in several applications, particularly the assessment of susceptibility to diseases such as Alzheimer&#39;s disease (AD). This method could be useful to better understand the role of CR1 isoforms in the pathogenesis of AD.

Complement Reseptör 1 Boyunca Polimorfizm Genotiplendirme için Yüksek Çözünürlükte Melting PCR: Alzheimer Hastalığı Gen Duyarlılık Değerlendirmesi için Yenilikçi Bir Araç

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

Organizatörü yakalama Merhaba-C: Yüksek çözünürlüklü, genom çapında organizatörü etkileşimlerin profil oluşturma

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons of conjugation frequency under different conditions are required to understand how the conjugative element spreads in nature. However, conventional methods for comparing conjugation frequency are not appropriate for in-depth comparisons because of the high background caused by the occurrence of additional conjugation events on the selective plate. We successfully reduced the background by introducing a most probable number (MPN) method and a higher concentration of antibiotics to prevent further conjugation in selective liquid medium. In addition, we developed a protocol for estimating the probability of how often donor cells initiate conjugation by sorting single donor cells into recipient pools by fluorescence-activated cell sorting (FACS). Using two plasmids, pBP136 and pCAR1, the differences in conjugation frequency in Pseudomonas putida cells could be detected in liquid medium at different stirring rates. The frequencies of conjugation initiation were higher for pBP136 than for pCAR1. Using these results, we can better understand the conjugation features in these two plasmids.

With an aim to understand the behaviors of various bacterial conjugative DNA elements under different conditions, we describe a protocol for detecting differences in conjugation frequency, with high resolution, to estimate how efficiently the donor bacterium initiates conjugation.

Bakteriyel konjugasyon frekans yüksek çözünürlüklü karşılaştırma

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Gen düzenleyici dizileri dairesel kromozom Conformation yeni nesil sıralama kullanarak yüksek üretilen iş tanımlaması yakalama (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Determining the Likelihood of Variant Pathogenicity Using Amino Acid-level Signal-to-Noise Analysis of Genetic Variation

Advancements in the cost and speed of next generation genetic sequencing have generated an explosion of clinical whole exome and whole genome testing. While this has led to increased identification of likely pathogenic mutations associated with genetic syndromes, it has also dramatically increased the number of incidentally found genetic variants of unknown significance (VUS). Determining the clinical significance of these variants is a major challenge for both scientists and clinicians. An approach to assist in determining the likelihood of pathogenicity is signal-to-noise analysis at the protein sequence level. This protocol describes a method for amino acid-level signal-to-noise analysis that leverages variant frequency at each amino acid position of the protein with known protein topology to identify areas of the primary sequence with elevated likelihood of pathologic variation (relative to population &#34;background&#34; variation). This method can identify amino acid residue location &#34;hotspots&#34; of high pathologic signal, which can be used to refine the diagnostic weight of VUSs such as those identified by next generation genetic testing.

Amino acid-level signal-to-noise analysis determines the prevalence of genetic variation at a given amino acid position normalized to background genetic variation of a given population. This allows for identification of variant &#34;hotspots&#34; within a protein sequence (signal) that rises above the frequency of rare variants found in a population (noise).

Varyant patojenitesi Amino asit düzeyi parazit sinyal analizi genetik varyasyon kullanarak olasılığını belirleme

Advancements in the cost and speed of next generation genetic sequencing have generated an explosion of clinical whole exome and whole genome testing. ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in regulating gene expression at the post-transcriptional level. Sequencing sRNA libraries by Next Generation Sequencing (NGS) methods has been widely employed to identify and analyze miRNA transcriptomes in the last decade, resulting in a rapid increase of miRNA discovery. However, two major challenges arise in plant miRNA annotation due to increasing depth of sequenced sRNA libraries as well as the size and complexity of plant genomes. First, many other types of sRNAs, in particular, short interfering RNAs (siRNAs) from sRNA libraries, are erroneously annotated as miRNAs by many computational tools. Second, it becomes an extremely time-consuming process for analyzing miRNA transcriptomes in plant species with large and complex genomes. To overcome these challenges, we recently upgraded miRDeep-P (a popular tool for miRNA transcriptome analyses) to miRDeep-P2 (miRDP2 for short) by employing a new filtering strategy, overhauling the scoring algorithm and incorporating newly updated plant miRNA annotation criteria. We tested miRDP2 against sequenced sRNA populations in five representative plants with increasing genomic complexity, including Arabidopsis, rice, tomato, maize and wheat. The results indicate that miRDP2 processed these tasks with very high efficiency. In addition, miRDP2 outperformed other prediction tools regarding sensitivity and accuracy. Taken together, our results demonstrate miRDP2 as a fast and accurate tool for analyzing plant miRNA transcriptomes, therefore a useful tool in helping the community better annotate miRNAs in plants.

A bioinformatics pipeline, namely miRDeep-P2 (miRDP2 for short), with updated plant miRNA criteria and an overhauled algorithm, could accurately and efficiently analyze microRNA transcriptomes in plants, especially for species with complex and large genomes.

Bitkilerdeki MikroRNA Transkripsiyonlarını Doğru ve Verimli Bir Şekilde Analiz Eden Bir Biyoinformatik Boru Hattı

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the TILLING system has less applicability for insertion/deletion (Indel) detection and traditional TILLING needs more complex steps, like CEL I nuclease digestion and gel electrophoresis. To improve the throughput and selection efficiency, and to make the screening of both Indels and single base substitions (SBSs) possible, a new high-resolution melting (HRM)-based TILLING system is developed. Here, we present a detailed HRM-TILLING protocol and show its application in mutation screening. This method can analyze the mutations of PCR amplicons by measuring the denaturation of double-stranded DNA at high temperatures. HRM analysis is directly performed post-PCR without additional processing. Moreover, a simple, safe and fast (SSF) DNA extraction method is integrated with HRM-TILLING to identify both Indels and SBSs. Its simplicity, robustness and high throughput make it potentially useful for mutation scanning in rice and other crops.

In this article, we present the protocol that is described as high-resolution melting analysis (HRM)-based Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING). This method utilizes fluorescence changes during the melting of the DNA duplex and is suitable for high-throughput screening of both insertion/deletion (Indel) and single base substition (SBS).

Pirinç Bir TILLING Popülasyonyüksek Çözünürlükte Erime mutasyonları belirlenmesi

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...