Gli autori desiderano ringraziare tutti gli esperti accademici e i dipendenti del Laboratorio di Ematologia Specializzata, Dipartimento di Ematologia, Divisione di Medicina Interna, Centro Medico Universitario di Lubiana.

Lo studio è stato approvato dal Comitato di Etica Medica della Repubblica di Slovenia. Tutte le procedure erano conformi alla dichiarazione di Helsinki.
1. Pcr quantitativa in tempo reale (qPCR) basata sulla fluorescenza e analisi post-qPCR da parte di HRM
<ol><li>Sostituire i primer elencati nella Tabella dei materiali a 100 μM con H2O sterile, RNasi e DNasi free (vedi Tabella dei materiali). Fare un primer a concentrazione di lavoro da 10 μM. I primer utilizzati nel protocollo sono stati pubblicati prima di2.</li>
	<li>Quantitare il DNA dei granulociti con il metodo di colorazione a fluorescenza seguendo le istruzioni del produttore11 (vedere Tabella dei materiali). Preparare una soluzione di DNA da 20 ng/μL utilizzando 10 mM Tris-Cl, 0,5 mM EDTA, pH 9,0 (vedi Tabella dei materiali).<ol>
<li>Oltre ai campioni di DNA, preparare almeno tre controlli del DNA: due controlli positivi con il NM_004343.3 (CALR): c.1099_1150del52, p.(Leu367Thrfs*46) (52 bp delezione o mutazione di tipo 1) e NM_004343.3 (CALR): c.1154_1155insTTGTC, p.(Lys385Asnfs*47) (5 bp insertion o type 2 mutation), nonché dna wild-type e controllo negativo come controllo non-template (NTC). NOTA: prima di eseguire la configurazione HRM, verificare che lo strumento qPCR sia calibrato per gli esperimenti HRM.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare qPCR HRM Master Mix secondo il protocollo del produttore (vedi Tabella dei materiali)come segue: 10 μL di 2x qPCR Master Mix con colorante, 0,2 μL di 10 μM Forward Primer, 0,2 μL di 10 μM Reverse Primer, 8,6 μL di H2O sterile, RNasi e DNasi libera. Utilizzare i primer della Tabella dei materiali. Esegui tre repliche per ogni campione di DNA e controllo.<ol>
<li>Preparare il qPCR HRM Master Mix in base al numero di campioni in lavorazione. Includere il volume in eccesso di almeno il 10% nei calcoli per fornire un volume in eccesso per la perdita che si verifica durante i trasferimenti di reagenti.</li>
	</ol></li>
	<li>Mescolare il contenuto della reazione picchiettando delicatamente e invertendo il tubo e vorticando per 2-3 s. Raccogli tutte le goccioline sparse dalla parete del tubo verso il basso con un breve giro.</li>
	<li>Preparare una piastra di reazione appropriata per lo strumento e l'esperimento HRM (vedi Tabella dei materiali). Trasferire 19 μL del qPCR HRM Master Mix ai pozzetti appropriati della piastra di reazione ottica a 96 pozzetti.</li>
	<li>Pipettare 1 μL dei controlli negativi, dei controlli positivi e dei campioni nei pozzetti appropriati della piastra di reazione ottica. Per l'NTC, trasferire 1 μL di H2O sterile, RNasi e DNasi free utilizzato per preparare il qPCR HRM Master Mix invece del DNA.</li>
	<li>Sigillare la piastra di reazione con la pellicola adesiva ottica. Fallo con fermezza per evitare l'evaporazione durante la corsa. Verificare che la pellicola adesiva ottica sia piana su tutti i pozzetti della piastra di reazione per garantire il corretto rilevamento della fluorescenza.</li>
	<li>Ruotare la piastra di reazione a 780 x g a temperatura ambiente (RT) per 1 minuto. Controllare che il liquido si trovi sul fondo dei pozzetti nella piastra di reazione. Procedere all'esecuzione del test. NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare la piastra a 4 °C per non più di 24 ore. Lasciare che la piastra conservata a 4 °C si riscaldi a RT, quindi ruotare brevemente la piastra prima di farla funzionare.</li>
	<li>Secondo le istruzioni del produttore, preparare e avviare la corsa per amplificare e fondere il DNA e generare dati di fluorescenza HRM nello strumento qPCR. Nel software del sistema dello strumento, assegnare i controlli e i campioni ai pozzetti appropriati.</li>
	<li>Per il rilevamento della variante genetica CALR, modificare il protocollo di amplificazione predefinito dello strumento e amplificare il DNA utilizzando il seguente protocollo di ciclo termico: 95 °C per 10 minuti, seguito da 50 cicli di 95 °C per 10 s e 62,5 °C per 60 s.</li>
	<li>Eseguire lo stadio di curva di fusione/dissociazione (HRM) immediatamente dopo qPCR secondo le istruzioni del produttore12 come segue: 95 °C per 10 s, 60 °C per 1 min, e quindi una velocità di rampa di 0,025 °C/s fino a 95 °C. Mantenere la temperatura a 95 °C per 15 s e a 60 °C per 15 s.</li>
	<li>L'esecuzione termina automaticamente. Innanzitutto, rivedere e verificare il grafico di amplificazione (Figura 2).</li>
	<li>Nel menu esperimento del software del sistema dello strumento, selezionare l'opzione di trama di amplificazione. Se non vengono visualizzati dati, fare clic sul pulsante verde Analizza.<ol>
<li>Nella scheda Grafico amplificazione, dal menu a discesa Tipo di trama, selezionare il grafico che visualizza i dati di amplificazione come letture di fluorescenza grezze normalizzate alla fluorescenza dal riferimento passivo (ΔRn) in funzione del numero di ciclo (ΔRn vs Ciclo). Nel menu a discesa colore della stampa, selezionare Campione.</li>
	</ol></li>
	<li>Dal menu a discesa Tipo di grafico, selezionare il tipo di grafico di amplificazione lineare. Visualizzate il ciclo di inizio e fine della linea di base sul grafico di amplificazione lineare selezionando l'opzione di inizio della linea di base. Verificare che la baseline sia impostata correttamente. Il ciclo finale deve essere impostato alcuni cicli prima del numero di ciclo in cui viene rilevato un segnale fluorescente significativo. La linea di base è solitamente impostata da 3 a 15 cicli (Figura 2).</li>
	<li>Dal menu a discesa Tipo di grafico, selezionare il tipo di grafico di amplificazione log10. Mostra la linea di soglia sul grafico selezionando l'opzione di soglia. Regolare la soglia di conseguenza se non impostata correttamente. La soglia impostata correttamente significa che la linea di soglia attraversa la fase esponenziale delle curve qPCR (Figura 2).</li>
	<li>Verificare che le normali curve di amplificazione siano presenti in tutti i pozzi di controllo del campione e positivi. Verificare che non vi sia amplificazione nei pozzi NTC prima del ciclo 40. Un normale grafico di amplificazione mostra un aumento esponenziale della fluorescenza che supera la soglia tra i cicli 15 e 35 (Figura 2). Escludere i pozzetti campione dall'analisi se non vi è amplificazione nella posizione del pozzo. NOTA: se il grafico di amplificazione appare anomalo o l'NTC indica bene l'amplificazione, identificare e risolvere il problema in base alla guida alla risoluzione dei problemi del produttore.</li>
	<li>Escludere il valore anomalo con il ciclo di quantificazione (Cq) che differisce dalle repliche di più di 2 nel software del sistema dello strumento12. I valori anomali possono produrre risultati HRM errati.</li>
	<li>Nelle curve di fusione derivate, rivedere le regioni/linee di temperatura pre e post fusione. Le regioni pre e post fusione dovrebbero trovarsi all'interno di un'area pianeggiante in cui non ci sono grandi picchi o pendenze nei livelli fluorescenti (Figura 3). Se necessario, regolarlo di conseguenza. Impostare l'avvio e l'arresto delle linee di temperatura pre e post fusione a circa 0,5 °C di distanza l'una dall'altra (Figura 3). Riavviare l'analisi se i parametri vengono regolati facendo clic sul pulsante Analizza.</li>
	<li>Nella scheda grafico differenza, nella scheda Impostazioni plottaggio, scegliere uno dei controlli wild-type (omozigote) replicati come DNA di riferimento e riavviare l'analisi facendo clic sul pulsante Analizza.</li>
	<li>Nella scheda Curve di fusione allineate, verificare che tutti i controlli positivi abbiano il genotipo corretto e che NTC non sia riuscito ad amplificarsi (Figura 4). Dalla tabella dei pozzetti, selezionate i pozzetti contenenti un controllo positivo per evidenziare la curva di fusione corrispondente nei grafici di analisi. Verificare che il colore della linea corrisponda al genotipo corretto. Ripetere i passaggi per i pozzetti contenenti gli altri controlli positivi e NTC.</li>
	<li>Nella scheda Curve di fusione allineate, esaminare attentamente le visualizzazioni del plottaggio per i campioni sconosciuti e confrontarle con le visualizzazioni del plottaggio per i controlli (Figura 4). Dalla tabella dei pozzi, selezionare i pozzetti contenenti le repliche del campione sconosciuto, controllare il colore della curva di fusione e allinearli con i controlli in una sequenza ordinata selezionando i pozzetti contenenti controlli positivi uno per uno. Ripetere il processo per tutti i campioni sconosciuti. NOTA: il campione sconosciuto contiene la variante di uno dei controlli se la sua curva di fusione è strettamente allineata ad esso. È possibile visualizzare diversi gruppi di varianti (colori diversi) che indicano che il campione sconosciuto è costituito da una variante sconosciuta, non corrispondente ai controlli (Figura 8). Un basso livello della variante genetica somatica può essere presente nel campione del paziente. Ciò potrebbe influenzare l'interpretazione del risultato HRM, in particolare al limite di rilevamento del test (Figura 9). In questi casi, il colore o anche la forma della linea potrebbe assomigliare molto a quello del genotipo wild-type.<ol>
<li>Quando il risultato è inconcludente, combinare i risultati HRM con i risultati dell'elettroforesi su gel di agarosio e dei metodi di sequenziamento. Riprovare il campione o richiedere e ritestare un nuovo campione, se necessario.</li>
		<li>Esaminare attentamente il set di dati per le curve di replica e verificare che l'allineamento di ciascuna replica all'interno del gruppo sia stretto. Escludere la replica se non si allinea strettamente con gli altri campioni del gruppo (valori anomali). Ritestare il campione se sono presenti più valori anomali e i risultati sono inconcludenti. Essere consapevoli del fatto che la quantità e la qualità del campione di DNA influenzano i risultati HRM.</li>
	</ol></li>
	<li>Analizzare il risultato per il campione sconosciuto nella scheda Grafico differenza. Ripetere la procedura descritta nel passaggio 1.21 e verificare che i risultati ottenuti per il campione sconosciuto siano gli stessi.</li>
	<li>Quindi, eseguire i prodotti qPCR HRM sul gel di agarosio. NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui. Conservare la piastra a 4 °C per non più di 24 ore o a -20 °C per un periodo più lungo ma non superiore a 7 giorni. Lasciare che la piastra conservata a 4 °C si riscaldi a RT, quindi ruotare brevemente la piastra prima di farla funzionare. Lasciare scongelare la piastra conservata a - 20 °C e riscaldarla a RT, quindi ruotare brevemente la piastra prima di eseguirla.</li>
</ol>2. Elettroforesi su gel di agarosio
<ol><li>Eseguire i prodotti qPCR HRM su un gel prefabbricato di agarosio al 4% contenente una colorazione di acido nucleico fluorescente utilizzando l'appropriato sistema di elettroforesi su gel (vedere Tabella dei materiali, Figura 5). Eseguire solo una replica HRM qPCR positiva, negativa, NTC e campione. NOTA: I guanti devono essere sempre indossati quando si maneggiano i gel. Qualsiasi altro sistema di elettroforesi su gel può soddisfare questo scopo se si sceglie la percentuale equivalente di agarosio, la colorazione di acido nucleico fluorescente e il formato del pozzo.</li>
	<li>Eseguire il sistema di elettroforesi su gel secondo il protocollo del produttore (vedi Tabella dei materiali). Rimuovere il gel prefabbricato nella cassetta dalla confezione, rimuovere il pettine e inserirlo nell'apparecchio secondo le istruzioni del produttore (vedere Tabella dei materiali). NOTA: Caricare il gel entro 15 minuti dall'apertura della confezione.</li>
	<li>Diluire un campione da 10 μL a 20 μL con H2O sterile, privo di RNasi e DNasi. Caricare ogni pozzetto con 20 μL di campione diluito.</li>
	<li>Diluire 3 μL di soluzione standard di dimensioni del DNA a 20 μL con H2O sterile, RNasi e DNasi libera (vedere Tabella dei materiali). Caricare il pozzetto M con 20 μL di soluzione standard di dimensioni del DNA diluito (Figura 6).</li>
	<li>Riempire eventuali pozzetti vuoti con 20 μL di H2O sterili, RNasi e DNasi.</li>
	<li>Selezionare immediatamente il programma in base alla percentuale di gel in esecuzione e impostare il tempo di esecuzione sull'apparecchio su 10 minuti.</li>
	<li>Avviare l'elettroforesi entro 1 minuto dal caricamento del campione premendo il pulsante GO. Il tempo di elettroforesi può essere esteso se si ottiene una risoluzione insufficiente. NOTA: Non superare il tempo massimo raccomandato per l'elettroforesi dell'agarosio secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Quando l'elettroforesi è completata, visualizzare il DNA nel gel utilizzando una luce blu o una transilluminazione UV. La visualizzazione, l'analisi e la memorizzazione delle immagini di elettroforesi sono per lo più eseguite da un imager in gel con sistema di foto-documentazione (Figura 5).</li>
	<li>Analizzare e interpretare il modello di gel dei prodotti qPCR HRM visualizzato confrontando i risultati del campione sconosciuto con i controlli positivi (Figura 7 e Figura 8).</li>
	<li>Se i risultati sconosciuti dell'HRM e dell'elettroforesi su gel indicano la presenza di una variante genetica sconosciuta, sequenziare il prodotto qPCR HRM utilizzando primer descritti nella Tabella dei materiali secondo il protocollo descritto13. ATTENZIONE: I gel di agarosio contenenti una macchia di acido nucleico fluorescente devono essere smaltiti correttamente secondo i regolamenti dell'istituzione.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nangalia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+CALR+mutations+in+myeloproliferative+neoplasms+with+nonmutated+JAK2.">Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2.</a> New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).</li><li>Klampfl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+of+calreticulin+in+myeloproliferative+neoplasms.">Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms.</a> New England Journal of Medicine. 369, 2379-2390 (2013).</li><li>Vainchenker, W., Kralovics, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+and+molecular+pathophysiology+of+classical+myeloproliferative+neoplasms.">Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms.</a> Blood. 129, 667-679 (2017).</li><li>Pietra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+clinical+effects+of+different+mutation+subtypes+in+CALR-mutant+myeloproliferative+neoplasms.">Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms.</a> Leukemia. 30, 431-438 (2016).</li><li>Lim, K. 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Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.

La fusione ad alta risoluzione del DNA è una soluzione semplice per la genotipizzazione e la scansione delle varianti genetiche14. Dipende dalle differenze di sequenza che si traducono in eteroduplex che cambiano la forma della curva di fusione. Diversi tipi di varianti genetiche con frequenze diverse possono essere osservati nel gene specifico per un certo gruppo di pazienti con cancro1,2,15,...

Varianti genetiche somatiche nel gene della calreticulina (CALR) sono state riconosciute nel 2013 in pazienti con neoplasie mieloproliferative (MPN) come trombocitemia essenziale e mielofibrosi primaria1,2. Da allora, sono state scoperte più di 50 varianti genetiche nel gene CALR, inducendo un +1 (−1+2) frameshift3. Le due varianti genetiche CALR più frequenti sono una delezione di 52 bp (NM_004343.3 (CALR):c.1099_1150del52,p.(Leu367Thrfs*46)), chiamata anche mutazione di tipo 1, e un'inserzione di 5 bp (NM_004343.3 (CALR):c.1154_1155insTTGTC,p.(Lys385Asnfs*47)), chiamata anche mutazione di tipo 2. Queste due varianti genetiche rappresentano l'80% di tutte le varianti genetiche CALR. Gli altri sono stati classificati come tipo 1 o tipo 2 utilizzando algoritmi basati sulla conservazione di un'elica α vicino al tipo selvaggio CALR4. Qui, presentiamo uno dei metodi altamente sensibili e rapidi per il rilevamento delle varianti genetiche CALR, il metodo di analisi della fusione ad alta risoluzione (HRM). Questo metodo consente la rapida individuazione di varianti genetiche di tipo 1 e di tipo 2, che rappresentano la maggior parte delle mutazioni CALR 5. HRM è stato introdotto in combinazione con la "reazione a catena della polimerasi" in tempo reale (qPCR) nel 1997 come strumento per rilevare la mutazione nel fattore V Leiden6. Rispetto al sequenziamento Sanger che rappresenta la tecnica golden standard, HRM è un metodo più sensibile e meno specifico5. Il metodo HRM è un buon metodo di screening che consente un'analisi rapida di un gran numero di campioni con un grande rapporto costi-benefici5. Si tratta di un semplice metodo di PCR eseguito in presenza di un colorante fluorescente e non richiede competenze specifiche. Un altro vantaggio è che la procedura stessa non danneggia o distrugge il campione analizzato che ci consente di riutilizzare il campione per l'elettroforesi o il sequenziamento Sanger dopo la procedura HRM7. L'unico svantaggio è che a volte è difficile interpretare i risultati. Inoltre, HRM non rileva la mutazione esatta nei pazienti con mutazioni non di tipo 1 o di tipo2 8. In questi pazienti deve essere eseguito il sequenziamento Con Sanger (Figura 1).
L'HRM si basa sull'amplificazione della specifica regione del DNA in presenza di colorante fluorescente saturante di DNA, che è incorporato nel DNA a doppio filamento (dsDNA). Il colorante fluorescente emette luce quando incorporato nel dsDNA. Dopo un progressivo aumento della temperatura, il dsDNA si scompone in DNA a singolo filamento, che può essere rilevato sulla curva di fusione come un'improvvisa diminuzione dell'intensità di fluorescenza. La forma della curva di fusione dipende dalla sequenza di DNA utilizzata per rilevare la mutazione. Le curve di fusione dei campioni vengono confrontate con le curve di fusione di mutazioni note o CALR di tipo selvatico. Curve di fusione distinte rappresentano una mutazione diversa che non è di tipo 1 o di tipo 29.
L'algoritmo per la rilevazione di varianti genetiche somatiche nel gene CALR mediante HRM, elettroforesi su gel di agarosio e metodo di sequenziamento (Figura 1) è stato utilizzato e convalidato nello studio retrospettivo pubblicato prima del10.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>E-Gel EX 4% Agarose</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>G401004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuorometer 3.0 QUBIT</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>G6465EU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeltDoctor HRM MasterMix 2X</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4415440</td>
			<td>Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL)</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4346907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical adhesive film</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuGenius</td>
			<td>Syngene</td>
			<td>NG-1045</td>
			<td>Gel documentation systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CALRex9 Forward</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>Sequence: 5&#39;GGCAAGGCCCTGAGGTGT&#39;3 (High-Purity, Salt-Free)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CALRex9 Reverse</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>Sequence: 5&#39;GGCCTCAGTCCAGCCCTG&#39;3 (High-Purity, Salt-Free)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>51306</td>
			<td>DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUBIT dsDNA HS assay</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trackit 100bp DNA Ladder</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>10488058</td>
			<td>Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4453534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water nuclease free</td>
			<td>VWR, Life Science</td>
			<td>436912C</td>
			<td>RNase, DNase and Protease free water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic variant detection in the calr gene using high resolution melting analysis

L'analisi di fusione ad alta risoluzione (HRM) è un metodo potente per la genotipizzazione e la scansione delle variazioni genetiche. La maggior parte delle applicazioni HRM dipende da coloranti a DNA saturo che rilevano differenze di sequenza ed eteroduplex che cambiano la forma della curva di fusione. Sono necessari un'eccellente risoluzione dello strumento e uno speciale software di analisi dei dati per identificare le piccole differenze della curva di fusione che identificano una variante o un genotipo. Diversi tipi di varianti genetiche con frequenze diverse possono essere osservati nel gene specifico per i pazienti con una malattia specifica, in particolare il cancro e nel gene CALR nei pazienti con neoplasie mieloproliferative negative al cromosoma Philadelphia. Singoli cambiamenti nucleotidici, inserzioni e/o delezioni (indels) nel gene di interesse possono essere rilevati dall'analisi HRM. L'identificazione di diversi tipi di varianti genetiche si basa principalmente sui controlli utilizzati nel test qPCR HRM. Tuttavia, con l'aumentare della lunghezza del prodotto, la differenza tra curve wild-type ed eterozigoti diventa più piccola e il tipo di variante genetica è più difficile da determinare. Pertanto, laddove gli indels sono la variante genetica prevalente attesa nel gene di interesse, un metodo aggiuntivo come l'elettroforesi su gel di agarosio può essere utilizzato per la chiarificazione del risultato HRM. In alcuni casi, un risultato inconcludente deve essere ricontrollato/ri-diagnosticato mediante sequenziamento Sanger standard. In questo studio retrospettivo, abbiamo applicato il metodo a pazienti JAK2 V617F-negativi con MPN.

La regione di interesse del DNA amplificata con successo con un aumento esponenziale della fluorescenza che supera la soglia tra i cicli 15 e 35 e valori molto ristretti del ciclo di quantificazione (Cq) in tutti i campioni e controlli replicati(Figura 2)è un prerequisito per l'identificazione affidabile delle varianti genetiche mediante analisi HRM. Ciò si ottiene utilizzando una determinazione precisa del DNA con colorazione a fluorescenza e una quantità uguale di DNA nell'esperimento q...

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Genetic Variant Detection in the CALR gene using High Resolution Melting Analysis

L'analisi di fusione ad alta risoluzione (HRM) è una soluzione sensibile e rapida per il rilevamento di varianti genetiche. Dipende dalle differenze di sequenza che si traducono in eteroduplex che cambiano la forma della curva di fusione. Combinando l'elettroforesi hrM e gel di agarosio, è possibile identificare diversi tipi di varianti genetiche come gli indel.

Rilevamento di varianti genetiche nel gene CALR utilizzando l'analisi di fusione ad alta risoluzione

High resolution melting analysis (HRM) is a powerful method for genotyping and genetic variation scanning. Most HRM applications depend on saturating DNA ...

Tadej Paji&#269; 1,2, Tanja Bel&#269;i&#269; Miki&#269;1, Helena Podgornik1,3, Jurka Klun1, Sandra &#352;u&#263;urovi&#263;1,&#160;

genetic-variant-detection-calr-gene-using-high-resolution-melting

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Variant Detection in the CALR gene using High Resolution Melting Analysis

4.7K Views.  University Medical Centre Ljubljana. Tadej Pajič 1,2, Tanja Belčič Mikič1, Helena Podgornik1,3, Jurka Klun1, Sandra Šućurović1, 

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Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

Perturbazioni di circolazione miRNA nella sindrome dell&#39;intestino irritabile rilevato utilizzando una piattaforma di espressione genica multiplex high-throughput

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

Ricerca

Genetica

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

Rilevamento di Copy Number Alterazioni Utilizzando Sequencing Single Cell

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but especially on red blood cells (RBCs). As a receptor for the complement components C3b and C4b, CR1 regulates the activation of the complement cascade and promotes the phagocytosis of immune complexes and cellular debris, as well as the amyloid-beta (A&#946;) peptide in Alzheimer's disease (AD). Several studies have confirmed AD-associated single nucleotide polymorphisms (SNPs), as well as a copy-number variation (CNV) in the CR1 gene. Here, we describe an innovative method for determining the length polymorphism of the CR1 receptor. The receptor includes three domains, called long homologous repeats (LHR)-LHR-A, LHR-C, and LHR-D-and an n domain, LHR-B, where n is an integer between 0 and 3. Using a single pair of specific primers, the genetic material is used to amplify a first fragment of the LHR-B domain (the variant amplicon B) and a second fragment of the LHR-C domain (the invariant amplicon). The variant amplicon B and the invariant amplicon display differences at five nucleotides outside of the hybridization areas of said primers. The numbers of variant amplicons B and of invariant amplicons is deduced using a quantitative tool (high-resolution melting (HRM) curves), and the ratio of the variant amplicon B to the invariant amplicon differs according to the CR1 length polymorphism. This method provides several advantages over the canonical phenotype method, as it does not require fresh material and is cheaper, faster, and therefore applicable to larger populations. Thus, the use of this method should be helpful to better understand the role of CR1 isoforms in the pathogenesis of diseases such as AD.

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer&#039;s Disease Gene Susceptibility Assessment

Here, we describe an innovative method to determine complement receptor 1 (CR1) length polymorphisms for use in several applications, particularly the assessment of susceptibility to diseases such as Alzheimer&#39;s disease (AD). This method could be useful to better understand the role of CR1 isoforms in the pathogenesis of AD.

PCR di fusione ad alta risoluzione per il recettore del complemento 1 lunghezza di polimorfismo Genotipizzazione: uno strumento innovativo per la malattia di Alzheimer Valutazione sulla suscettibilità dei geni

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

Ibridazione fluorescente In Situ ad alta risoluzione in embrioni della drosofila e tessuti mediante amplificazione del segnale Tyramide

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

Promotore cattura Ciao-c: Ad alta risoluzione, Genome-wide profilatura delle interazioni del promotore

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons of conjugation frequency under different conditions are required to understand how the conjugative element spreads in nature. However, conventional methods for comparing conjugation frequency are not appropriate for in-depth comparisons because of the high background caused by the occurrence of additional conjugation events on the selective plate. We successfully reduced the background by introducing a most probable number (MPN) method and a higher concentration of antibiotics to prevent further conjugation in selective liquid medium. In addition, we developed a protocol for estimating the probability of how often donor cells initiate conjugation by sorting single donor cells into recipient pools by fluorescence-activated cell sorting (FACS). Using two plasmids, pBP136 and pCAR1, the differences in conjugation frequency in Pseudomonas putida cells could be detected in liquid medium at different stirring rates. The frequencies of conjugation initiation were higher for pBP136 than for pCAR1. Using these results, we can better understand the conjugation features in these two plasmids.

With an aim to understand the behaviors of various bacterial conjugative DNA elements under different conditions, we describe a protocol for detecting differences in conjugation frequency, with high resolution, to estimate how efficiently the donor bacterium initiates conjugation.

Confronto ad alta risoluzione delle frequenze di Coniugazione batterica

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

Identificazione di High-throughput di sequenze regolatorie del Gene mediante sequenziamento di nuova generazione di cromosoma circolare conformazione catturare (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Determining the Likelihood of Variant Pathogenicity Using Amino Acid-level Signal-to-Noise Analysis of Genetic Variation

Advancements in the cost and speed of next generation genetic sequencing have generated an explosion of clinical whole exome and whole genome testing. While this has led to increased identification of likely pathogenic mutations associated with genetic syndromes, it has also dramatically increased the number of incidentally found genetic variants of unknown significance (VUS). Determining the clinical significance of these variants is a major challenge for both scientists and clinicians. An approach to assist in determining the likelihood of pathogenicity is signal-to-noise analysis at the protein sequence level. This protocol describes a method for amino acid-level signal-to-noise analysis that leverages variant frequency at each amino acid position of the protein with known protein topology to identify areas of the primary sequence with elevated likelihood of pathologic variation (relative to population &#34;background&#34; variation). This method can identify amino acid residue location &#34;hotspots&#34; of high pathologic signal, which can be used to refine the diagnostic weight of VUSs such as those identified by next generation genetic testing.

Amino acid-level signal-to-noise analysis determines the prevalence of genetic variation at a given amino acid position normalized to background genetic variation of a given population. This allows for identification of variant &#34;hotspots&#34; within a protein sequence (signal) that rises above the frequency of rare variants found in a population (noise).

Determinazione del rischio di patogenicità variante usando l'analisi di segnale-rumore dell'amminoacido-livello di variazione genetica

Advancements in the cost and speed of next generation genetic sequencing have generated an explosion of clinical whole exome and whole genome testing. ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in regulating gene expression at the post-transcriptional level. Sequencing sRNA libraries by Next Generation Sequencing (NGS) methods has been widely employed to identify and analyze miRNA transcriptomes in the last decade, resulting in a rapid increase of miRNA discovery. However, two major challenges arise in plant miRNA annotation due to increasing depth of sequenced sRNA libraries as well as the size and complexity of plant genomes. First, many other types of sRNAs, in particular, short interfering RNAs (siRNAs) from sRNA libraries, are erroneously annotated as miRNAs by many computational tools. Second, it becomes an extremely time-consuming process for analyzing miRNA transcriptomes in plant species with large and complex genomes. To overcome these challenges, we recently upgraded miRDeep-P (a popular tool for miRNA transcriptome analyses) to miRDeep-P2 (miRDP2 for short) by employing a new filtering strategy, overhauling the scoring algorithm and incorporating newly updated plant miRNA annotation criteria. We tested miRDP2 against sequenced sRNA populations in five representative plants with increasing genomic complexity, including Arabidopsis, rice, tomato, maize and wheat. The results indicate that miRDP2 processed these tasks with very high efficiency. In addition, miRDP2 outperformed other prediction tools regarding sensitivity and accuracy. Taken together, our results demonstrate miRDP2 as a fast and accurate tool for analyzing plant miRNA transcriptomes, therefore a useful tool in helping the community better annotate miRNAs in plants.

A bioinformatics pipeline, namely miRDeep-P2 (miRDP2 for short), with updated plant miRNA criteria and an overhauled algorithm, could accurately and efficiently analyze microRNA transcriptomes in plants, especially for species with complex and large genomes.

Una pipeline di bioinformatica per analizzare in modo accurato ed efficiente i trascrittomi di microRNA nelle piante

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the TILLING system has less applicability for insertion/deletion (Indel) detection and traditional TILLING needs more complex steps, like CEL I nuclease digestion and gel electrophoresis. To improve the throughput and selection efficiency, and to make the screening of both Indels and single base substitions (SBSs) possible, a new high-resolution melting (HRM)-based TILLING system is developed. Here, we present a detailed HRM-TILLING protocol and show its application in mutation screening. This method can analyze the mutations of PCR amplicons by measuring the denaturation of double-stranded DNA at high temperatures. HRM analysis is directly performed post-PCR without additional processing. Moreover, a simple, safe and fast (SSF) DNA extraction method is integrated with HRM-TILLING to identify both Indels and SBSs. Its simplicity, robustness and high throughput make it potentially useful for mutation scanning in rice and other crops.

In this article, we present the protocol that is described as high-resolution melting analysis (HRM)-based Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING). This method utilizes fluorescence changes during the melting of the DNA duplex and is suitable for high-throughput screening of both insertion/deletion (Indel) and single base substition (SBS).

Identificare le mutazioni con lo scioglimento ad alta risoluzione in una popolazione di riso TILLING

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...