著者らは、大学医療センターリュブリャナの内科、血液学部門、専門血液学研究所の学術専門家と従業員全員に感謝したいと考えています。

この研究は、スロベニア共和国の医療倫理委員会によって承認されました。すべての手順はヘルシンキ宣言に従っていました。
1. 蛍光ベースの定量リアルタイム PCR (qPCR) および HRM による qPCR 後分析
<ol><li>材料表に記載されているプライマーを無菌、RNaseおよびDNaseフリーH2Oで100 μMに再懸濁します(材料表を参照)。10 μMの作業濃度プライマーを作ります。プロトコルで使用されるプライマーは2の前に公開されました。</li>
	<li>製造者の指示11 に従って蛍光染色法により顆粒球DNAを定量する( 材料表を参照)。10 mM トリスCl、0.5 mM EDTA、pH 9.0を使用して20 ng/μL DNA溶液を調製します( 材料表を参照)。<ol>
<li>DNAサンプルに加えて、 少なくとも3つのDNA制御を用意する:NM_004343.3(CALR):c.1099_1150del52、p.(Leu367Thrfs*46)(52bp欠失またはタイプ1突然変異)、およびNM_004343.3(CALR)、c.1154_1155insTTGTC、p.(5bp挿入または2型突然変異)遺伝子変異体、ならびに野生型DNAおよび陰性対照(非NTC)対照として( 注: HRM のセットアップを実行する前に、qPCR 装置が HRM 実験用に調整されていることを確認してください。</li>
	</ol></li>
	<li>メーカーのプロトコルに従ってqPCR HRMマスターミックスを準備する(材料表を参照)は、色素との2x qPCRマスターミックスの10 μL、10 μMフォワードプライマーの0.2 μL、10 μMリバースプライマーの0.2 μL、無菌、RNaseおよびDNaseフリーH2のプライマーを使用します。DNAサンプルとコントロールごとに3つの複製を実行します。<ol>
<li>処理されるサンプルの数に応じて qPCR HRM マスターミックスを準備します。試薬の転送中に生じる損失に対して余分な体積を提供するために、計算に少なくとも10%の過剰体積を含める。</li>
	</ol></li>
	<li>軽くタップしてチューブを反転し、2~3sの渦を入れ、反応内容物を混ぜます。短いスピンでチューブの壁から底まで、すべての散乱液滴を収集します。</li>
	<li>計測器およびHRM実験に適した反応プレートを用意します( 材料表を参照)。qPCR HRMマスターミックスの19 μLを96ウェル光学反応プレートの適切なウェルに移します。</li>
	<li>陰性制御、正のコントロール、およびサンプルのピペット1 μLは、光学反応プレートの適切なウェルに入ります。NTCの場合、DNAの代わりにqPCR HRMマスターミックスを調製するために使用される無菌、RNaseおよびDNaseフリーH2Oの1 μLを移す。</li>
	<li>反応板を光学粘着フィルムで密封します。走行中の蒸発を防ぐためにしっかりと行います。光学粘着フィルムが反応板内のすべてのウェルを横切って平面であることを確認し、正しい蛍光検出を確実に行います。</li>
	<li>反応板を室温(RT)で780xgで1分間回転させます。 液体が反応板のウェルの底にあることを確認します。アッセイを実行するに進みます。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。プレートは4°Cで24時間以内に保管してください。4°Cに保存されたプレートをRTに温め、それを実行する前にプレートを短時間回転させます。</li>
	<li>メーカーの指示によると、DNAを増幅して溶融させ、qPCR装置でHRM蛍光データを生成するために、実行を準備して開始します。計測器システムソフトウェアで、コントロールとサンプルを適切なウェルに割り当てます。</li>
	<li>CALR遺伝子変異体検出では、デフォルトの器械増幅プロトコルを変更し、次の熱サイクリングプロトコルを使用してDNAを増幅する:95°C10分間、95°Cの50サイクルが10s、60sで62.5°Cが続きます。</li>
	<li>製造元の指示に従ってqPCRの直後にメルト曲線/解離(HRM)ステージを実行します12: 95 °C 10 s, 60 °C 1 min, 95 °Cまでランプレート 0.025 °C/s. 温度を95°Cで15s、60°Cで15sに保ちます。</li>
	<li>実行は自動的に終了します。まず、増幅プロットを確認して確認します(図2)。</li>
	<li>計測器システムソフトウェアの実験メニューで、増幅プロットオプションを選択します。データが表示されない場合は、緑の [ 分析] ボタンをクリックします。<ol>
<li>増幅プロットタブで、プロットタイプドロップダウンメニューから、サイクル数の関数としてパッシブ参照(ΔRn)から蛍光に正規化された生蛍光測定値として増幅データを表示するプロットを選択します(ΔRn vs Cycle)。[印刷色] ドロップダウン メニューで、[ サンプル] を選択します。</li>
	</ol></li>
	<li>グラフタイプドロップダウンメニューから、線形増幅グラフタイプを選択します。ベースラインの開始と終了のサイクルを、ベースラインの開始オプションを選択して、線形増幅グラフに表示します。ベースラインが正しく設定されていることを確認します。終了サイクルは、重要な蛍光シグナルが検出されるサイクル数の前に数サイクル設定する必要があります。ベースラインは通常、3~15 サイクルに設定されます (図 2)。</li>
	<li>グラフタイプドロップダウンメニューから、log10増幅グラフタイプを選択します。しきい値オプションを選択して、グラフにしきい値の線を表示します。正しく設定されていない場合は、それに応じてしきい値を調整します。正しく設定されたしきい値は、しきい値の線が qPCR 曲線の指数位相を超えて行くということを意味します (図 2)。</li>
	<li>正常な増幅曲線が、すべてのサンプルおよびポジティブコントロールウェルに含まれているかどうかを確認します。サイクル 40 の前に NTC ウェルに増幅がないことを確認します。正常増幅プロットは、サイクル15と35の間の閾値を超える蛍光の指数関数的増加を示す(図2)。ウェル位置に増幅がない場合は、分析からサンプルウェルを除外します。 注: 増幅プロットが異常に見えるか、NTC が増幅を示している場合は、製造元のトラブルシューティング ガイドに従って問題を特定し、解決します。</li>
	<li>計器システムソフトウェア12で 2 を超える反復とは異なる定量化サイクル(Cq)値を持つ外れ値を除外します。外れ値は誤ったHRM結果を生じる可能性があります。</li>
	<li>派生メルトカーブで、溶融前および後の領域/温度線を確認します。プレ融解領域とポストメルト領域は、蛍光レベルに大きなピークや傾斜がない平坦な領域内にあるべきである(図3)。必要に応じて調整してください。溶融前と後の温度ラインの開始と停止を、互いに約0.5 °C離れた位置に設定します(図3)。パラメータが[分析]ボタンをクリックして調整された場合は、 解析 を再開します。</li>
	<li>[差異プロット]タブのプロット設定タブで、参照DNAとして複製する野生型制御(ホモ接合体)のいずれかを選択し、[ 解析 ]ボタンをクリックして解析を再開します。</li>
	<li>整列メルトカーブタブで、正のコントロールがすべて正しい遺伝子型を持ち、NTCが増幅に失敗したことを確認します(図4)。ウェルテーブルから、正のコントロールを含むウェルを選択して、解析プロット内の対応するメルトカーブをハイライト表示します。線の色が正しい遺伝子型に対応していることを確認します。他の正のコントロールと NTC を含むウェルに対して手順を繰り返します。</li>
	<li>整列メルトカーブタブで、未知のサンプルのプロット表示を慎重に確認し、それらをコントロールのプロットディスプレイと比較します(図4)。ウェルテーブルから、未知のサンプル複製を含むウェルを選択し、メルトカーブの色を確認し、正のコントロールを含むウェルを1つずつ選択して、順序付けられた順序でコントロールに合わせます。すべての不明なサンプルに対してこのプロセスを繰り返します。 注: 不明なサンプルには、その融解曲線がしっかりと整列している場合、コントロールの 1 つのバリアントが含まれています。異なるバリアントグループ(異なる色)は、未知のサンプルが未知のバリアントで構成されていることを示し、コントロールに対応していないことを示す可能性があります(図8)。体細胞の遺伝的変異体の低レベルは、患者のサンプルに存在することができる。これは、HRM結果の解釈、特にアッセイの検出限界に影響を与える可能性があります(図9)。このような場合、線の色や形状は野生型の遺伝子型の色と似ている可能性があります。<ol>
<li>結果が決定的でない場合は、HRMの結果をアガロースゲル電気泳動およびシーケンシング法の結果と組み合わせます。サンプルを再テストするか、必要に応じて新しいサンプルを要求し、再テストします。</li>
		<li>データ セットの複製カーブを慎重に確認し、グループ内の各反復のアライメントが緊密であることを確認します。グループ内の他のサンプルと緊密に整列しない場合は、レプリケートを除外します(外れ値)。さらに外れ値が存在し、結果が決定的でない場合は、サンプルを再テストします。DNAサンプルの量と品質がHRMの結果に影響を与える点に注意してください。</li>
	</ol></li>
	<li>[差異プロット]タブで未知のサンプルの結果を分析します。ステップ 1.21 で説明されている手順を繰り返し、不明なサンプルに対して得られた結果が同じであることを確認します。</li>
	<li>次に、アガロースゲル上でqPCR HRM製品を実行します。 注: プロトコルはここで一時停止することができます。プレートは、4°Cで24時間以内、または-20°Cで長期間保管しますが、7日以下です。4°Cに保存されたプレートをRTに温め、それを実行する前にプレートを短時間回転させます。20°Cで保存されたプレートを解凍してRTに温め、それを実行する前にプレートを短時間回転させます。</li>
</ol>2. アガロースゲル電気泳動
<ol><li>適切なゲル電気泳動システムを使用して、蛍光核酸染色を含む4%アガロースプレキャストゲル上でqPCR HRM製品を実行する( 材料表、 図5を参照)。正、負、NTC、サンプルの qPCR HRM レプリケートを 1 つだけ実行します。 注:手袋は、ゲルを扱うときに常に着用する必要があります。他のゲル電気泳動システムは、同等のアガロース率、蛍光核酸染色および良好なフォーマットが選択された場合、この目的を果たすことができます。</li>
	<li>メーカーのプロトコルに従ってゲル電気泳動システムを実行します( 材料表を参照)。カセットのプレキャストゲルをパッケージから取り出し、コームを取り外し、メーカーの指示に従って装置に挿入します( 材料表を参照)。 メモ:パッケージを開けてから15分以内にゲルをロードします。</li>
	<li>滅菌、RNaseおよびDNaseフリーH2Oで10μLのサンプルを20 μLに希釈し、希釈サンプルを20 μLずつずつ積み込みます。</li>
	<li>無菌、RNaseおよびDNaseフリーH2 Oで20 μLのDNAサイズ標準溶液の3 μLを希釈します(材料表を参照)。希釈されたDNAサイズ標準溶液の20 μLでMウェルをロードする(図6)。</li>
	<li>無菌、RNaseおよびDNaseフリーH2Oの20 μLで空の井戸を充填します。</li>
	<li>直ちに実行されるゲルの割合に応じてプログラムを選択し、装置上での実行時間を10分に設定します。</li>
	<li>GOボタンを押して、負荷サンプルから1分以内に電気泳動を開始します。分解能が不足すれば、電気泳動時間を延長できます。 注:メーカーの指示に従って、最大推奨アガロース電気泳動の実行時間を超えないでください。</li>
	<li>電気泳動が完了したら、青色光またはUVトランスイルミネーションを使用してゲル内のDNAを可視化します。電気泳動画像の視覚化、解析、保存は、主に写真ドキュメンテーションシステムを備えたゲルイメージャーによって行われます(図5)。</li>
	<li>未知のサンプルの結果を正の対照と比較して、可視化されたqPCR HRM製品のゲルパターンを分析し、解釈する(図7および図8)。</li>
	<li>未知のサンプルHRMおよびゲル電気泳動結果が未知の遺伝的変異体が存在することを示す場合、13に記載されたプロトコルに従って材料表に記載のプライマーを用いてqPCR HRM産物を配列する。 注意:蛍光核酸染色を含むアガロースゲルは、機関ごとに適切に廃棄する必要があります。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nangalia, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+CALR+mutations+in+myeloproliferative+neoplasms+with+nonmutated+JAK2.">Somatic CALR mutations in myeloproliferative neoplasms with nonmutated JAK2.</a> New England Journal of Medicine. 369, 2391-2405 (2013).</li><li>Klampfl, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Somatic+mutations+of+calreticulin+in+myeloproliferative+neoplasms.">Somatic mutations of calreticulin in myeloproliferative neoplasms.</a> New England Journal of Medicine. 369, 2379-2390 (2013).</li><li>Vainchenker, W., Kralovics, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+basis+and+molecular+pathophysiology+of+classical+myeloproliferative+neoplasms.">Genetic basis and molecular pathophysiology of classical myeloproliferative neoplasms.</a> Blood. 129, 667-679 (2017).</li><li>Pietra, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+clinical+effects+of+different+mutation+subtypes+in+CALR-mutant+myeloproliferative+neoplasms.">Differential clinical effects of different mutation subtypes in CALR-mutant myeloproliferative neoplasms.</a> Leukemia. 30, 431-438 (2016).</li><li>Lim, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+detection+of+CALR+exon+9+mutations+using+high-resolution+melting+analysis.">Rapid and sensitive detection of CALR exon 9 mutations using high-resolution melting analysis.</a> Clinica Chimica Acta. 440, 133-139 (2015).</li><li>Lay, M. J., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+fluorescence+genotyping+of+factor+V+leiden+during+rapid-cycle+PCR.">Real-time fluorescence genotyping of factor V leiden during rapid-cycle PCR.</a> Clinical Chemistry. 43, 2262-2267 (1997).</li><li>Vossen, R. H. A. M., Aten, E., Roos, A., Den Dunnen, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+melting+analysis+(HRMA)+-+More+than+just+sequence+variant+screening.">High-resolution melting analysis (HRMA) - More than just sequence variant screening.</a> Human Mutation. 30, 860-866 (2009).</li><li>Barbui, T., Thiele, J., Vannucchi, A. M., Tefferi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationale+for+revision+and+proposed+changes+of+the+WHO+diagnostic+criteria+for+polycythemia+vera,+essential+thrombocythemia+and+primary+myelofibrosis.">Rationale for revision and proposed changes of the WHO diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocythemia and primary myelofibrosis.</a> Blood Cancer Journal. 5, 337-338 (2015).</li><li>Reed, G. H., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity+and+specificity+of+single-nucleotide+polymorphism+scanning+by+high-resolution+melting+analysis.">Sensitivity and specificity of single-nucleotide polymorphism scanning by high-resolution melting analysis.</a> Clinical Chemistry. 50, 1748-1754 (2004).</li><li>Belcic Mikic, T., Pajic, T., Sever, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CALR+mutations+in+a+cohort+of+JAK2+V617F+negative+patients+with+suspected+myeloproliferative+neoplasms.">CALR mutations in a cohort of JAK2 V617F negative patients with suspected myeloproliferative neoplasms.</a> Scientific Reports. 9, 19838 (2019).</li><li>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> QubitTM dsDNA HS Assay Kits. Manual (MAN0002326, MP32851, Revision: B.0). , (2015).</li><li>Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High Resolution Melt Module for ViiA TM 7 Software v1. Getting Started Guide. Part Number 4443531 Rev. B. , (2011).</li><li>Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> High-Resolution Melt Analysis for Mutation Scanning Prior to Sequencing. Application Note. , (2010).</li><li>Reed, G. H., Kent, J. O., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+DNA+melting+analysis+for+simple+and+efficient+molecular+diagnostics.">High-resolution DNA melting analysis for simple and efficient molecular diagnostics.</a> Pharmacogenomics. 8, 597-608 (2007).</li><li>Gonzalez-Bosquet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+somatic+mutations+by+high-resolution+DNA+melting+(HRM)+analysis+in+multiple+cancers.">Detection of somatic mutations by high-resolution DNA melting (HRM) analysis in multiple cancers.</a> PLoS One. 6, 14522 (2011).</li><li>Van Der Stoep, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+guidelines+for+high-resolution+melting+curve+(HRM)+analysis:+An+interlaboratory+validation+of+BRCA1+mutation+scanning+using+the+96-well+LightScanner.">Diagnostic guidelines for high-resolution melting curve (HRM) analysis: An interlaboratory validation of BRCA1 mutation scanning using the 96-well LightScanner.</a> Human Mutation. 30, 899-909 (2009).</li><li>Singdong, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+Prognosis+Significance+of+JAK2+(V617F),+MPL,+and+CALR+Mutations+in+Philadelphia-Negative+Myeloproliferative+Neoplasms.">Characterization and Prognosis Significance of JAK2 (V617F), MPL, and CALR Mutations in Philadelphia-Negative Myeloproliferative Neoplasms.</a> Asian Pacific Journal of Cancer Prevention. 17, 4647-4653 (2016).</li><li>Erali, M., Wittwer, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+melting+analysis+for+gene+scanning.">High resolution melting analysis for gene scanning.</a> Methods. 50, 250-261 (2010).</li><li>Bilbao-Sieyro, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Resolution+Melting+Analysis:+A+Rapid+and+Accurate+Method+to+Detect+CALR+Mutations.">High Resolution Melting Analysis: A Rapid and Accurate Method to Detect CALR Mutations.</a> PLoS One. 9, 103511 (2014).</li><li>S&#322;omka, M., Sobalska-Kwapis, M., Wachulec, M., Bartosz, G., Strapagiel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+melting+(HRM)+for+high-throughput+genotyping-limitations+and+caveats+in+practical+case+studies.">High resolution melting (HRM) for high-throughput genotyping-limitations and caveats in practical case studies.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18, 2316 (2017).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+common+DNA+concentration+measurement+methods.">Comparison of three common DNA concentration measurement methods.</a> Analytical Biochemistry. 451, 18-24 (2014).</li><li>Voytas, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis.">Agarose Gel Electrophoresis.</a> Current Protocols in Immunology. 2, (1992).</li><li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agarose+Gel+Electrophoresis+for+the+Separation+of+DNA+Fragments.">Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.</a> Journal of Visualized Experiments. , e3923 (2012).</li><li>Helling, R. B., Goodman, H. M., Boyer, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Endonuclease+R&#183;EcoRI+Fragments+of+DNA+from+Lambdoid+Bacteriophages+and+Other+Viruses+by+Agarose-Gel+Electrophoresis.">Analysis of Endonuclease R&#183;EcoRI Fragments of DNA from Lambdoid Bacteriophages and Other Viruses by Agarose-Gel Electrophoresis.</a> Journal of Virology. , 1235-1244 (1974).</li></ol>

著者らは開示する利益相反はない。

DNAの高解像度融解は、遺伝子型入力および遺伝的変異体走査14のための簡単なソリューションである。それは、融解曲線の形状を変化させるヘテロ二重鎖をもたらすシーケンスの違いに依存する。多様な頻度を有する異なる種類の遺伝的変異体は、癌1、2、15、16、10の特定のグループに特異的な遺伝子で観?...

カレチクリン遺伝子の体細胞遺伝学的変異体(CALR)は、2013年に骨髄増殖性新生物(MPN)の患者(必須血小板血症および原発性骨髄線維症1,2)で認識された。それ以来、CALR遺伝子の50以上の遺伝的変異体が発見され、+1(−1+2)フレームシフト3を誘導している。2つの最も頻繁なCALR遺伝的変異体は、タイプ1突然変異とも呼ばれる52bp欠失(NM_004343.3(CALR):c.1099_1150del52 p.(leu367Thrfs*46))、および5bp挿入(NM_004343.3(CALR):c.1154_1155insTTGTC、p.(Lys385Asnfs*47))、タイプ2突然変異とも呼ばれる。これら2つの遺伝的変異体は、全CALR遺伝的変異体の80%を表す。他のものは、野生型CALR4に近いαらせんの保存に基づくアルゴリズムを使用して、タイプ1-likeまたはタイプ2に分類されています。ここでは、CALR遺伝子変異体検出のための高感度かつ迅速な方法の1つ、高分解能融解解析法(HRM)を紹介する。この方法は、CALR突然変異5の大部分を表す1型および2型遺伝的変異体の迅速な検出を可能にする。HRMは、因子Vライデン6の変異を検出するためのツールとして1997年にリアルタイム»ポリメラーゼ連鎖反応«(qPCR)と組み合わせて導入されました。黄金の標準技術を表すサンガーシーケンシングと比較して、HRMはより敏感で、より特異的でない方法5です。HRM法は、多くのサンプルを迅速に分析し、費用便益5を実現する優れたスクリーニング方法である。蛍光色素の存在下で行う簡単なPCR法であり、特定のスキルを必要としません。もう一つの利点は、手順自体がHRM手順7の後に電気泳動またはサンガーシーケンシングのためにサンプルを再利用することを可能にする分析されたサンプルを損傷または破壊しないことである。唯一の欠点は、結果を解釈することが困難な場合もあるということです。さらに、HRMは、非タイプ1またはタイプ2突然変異8を有する患者において正確な突然変異を検出しない。これらの患者では、サンガーシーケンシングを行う必要があります(図1)。
HRMは、飽和DNA蛍光色素の存在下で特異的DNA領域の増幅に基づいており、これは二本鎖DNA(dsDNA)に組み込まれる。蛍光色素は、dsDNAに組み込まれると発光します。徐々に温度が上昇した後、dsDNAは一本鎖DNAに分解し、蛍光強度の急激な低下として融解曲線上で検出することができる。融解曲線の形状は、変異を検出するために使用されるDNA配列に依存する。試料の融解曲線は既知の突然変異または野生型CALRの融解曲線と比較される。明確な融解曲線は、タイプ 1 またはタイプ 29以外の異なる突然変異を表します。
HRMによる CALR 遺伝子における体細胞遺伝学的変異体検出のためのアルゴリズムとしては、アガロースゲル電気泳動およびシーケンシング法(図1)が使用され、10以前に発表された遡及研究で検証された。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>E-Gel EX 4% Agarose</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>G401004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fuorometer 3.0 QUBIT</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Invitrogen E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager Combo Kit</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>G6465EU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeltDoctor HRM MasterMix 2X</td>
			<td>Applied Biosystem, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4415440</td>
			<td>Components: AmpliTaqGold 360 DNA Polymerase, MeltDoctor trade HRM dye, dNTP blend including dUTP, Magnesium salts and other buffer components, precisely formulated to obtain optimal HRM results</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate (0.1 mL)</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4346907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical adhesive film</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4311971</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NuGenius</td>
			<td>Syngene</td>
			<td>NG-1045</td>
			<td>Gel documentation systems</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CALRex9 Forward</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>Sequence: 5&#39;GGCAAGGCCCTGAGGTGT&#39;3 (High-Purity, Salt-Free)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer CALRex9 Reverse</td>
			<td>Eurofins Genomics</td>
			<td></td>
			<td>Sequence: 5&#39;GGCCTCAGTCCAGCCCTG&#39;3 (High-Purity, Salt-Free)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAamp DNA Mini Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>51306</td>
			<td>DNA isolation kit with the buffer for DNA dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QUBIT dsDNA HS assay</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>Q32854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trackit 100bp DNA Ladder</td>
			<td>Invitrogen, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>10488058</td>
			<td>Ladder consists of 13 individual fragments with the reference bands at 2000, 1500, and 600 bp.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViiA7 Real-Time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems, Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>4453534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water nuclease free</td>
			<td>VWR, Life Science</td>
			<td>436912C</td>
			<td>RNase, DNase and Protease free water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genetic variant detection in the calr gene using high resolution melting analysis

高分解能溶融解析(HRM)は、遺伝子型入力や遺伝子変異スキャンのための強力な方法です。ほとんどのHRMアプリケーションは、配列の違いを検出する飽和DNA色素と、融解曲線の形状を変化させるヘテロ二重鎖に依存しています。優れた装置分解能および特殊なデータ解析ソフトウェアは、変異体または遺伝子型を識別する小さな融解曲線の違いを識別するために必要とされます。さまざまな頻度を有する異なる種類の遺伝的変異体は、特定の疾患を有する患者、特に癌、およびフィラデルフィア染色体-陰性骨髄増殖性新生物の患者における CALR 遺伝子に特異的な遺伝子で観察することができる。関心のある遺伝子における単一ヌクレオチドの変化、挿入および/または欠失(インデル)は、HRM分析によって検出され得る。異なる種類の遺伝的変異体の同定は、主にqPCR HRMアッセイで使用されるコントロールに基づいています。しかし、製品の長さが長くなるにつれて、野生型とヘテロ接合曲線の差が小さくなり、遺伝的変異体の種類を特定することがより困難になります。したがって、インデルが目的の遺伝子に期待される一般的な遺伝的変異体である場合、アガロースゲル電気泳動などの追加の方法をHRM結果の解明に使用することができる。場合によっては、決定的な結果を、標準のサンガーシーケンシングによって再チェック/再診断する必要があります。本回顧研究では、MPNを有する JAK2 V617F陰性患者にこの方法を適用した。

循環15と35の間の閾値を超える蛍光の指数関数的増加と、すべての複製されたサンプルおよびコントロールにおける定量サイクルの非常に狭い値(Cq)を有する目的のDNA領域の増幅に成功した(図2)は、HRM分析による遺伝的変異体の確実な同定のための前提条件である。これは、qPCR HRM実験で蛍光染色と同量のDNAを正確に測定することによって達成される(ステップ1.2参照)。 <st...

Watch this Scientific Journal Video about Genetic Variant Detection in the CALR gene using High Resolution Melting Analysis at JoVE.com

Genetic Variant Detection in the CALR gene using High Resolution Melting Analysis

高分解能溶融解析(HRM)は、遺伝的変異体検出のための敏感で迅速なソリューションです。それは、ヘテロ二重鎖が融解曲線の形状を変化させる結果となるシーケンスの違いに依存する。HRMとアガロースゲル電気泳動を組み合わせて、インデルなどの異なる種類の遺伝的変異体を同定することができる。

高分解能融解解析を用いた CALR 遺伝子の遺伝的変異体検出

High resolution melting analysis (HRM) is a powerful method for genotyping and genetic variation scanning. Most HRM applications depend on saturating DNA ...

Tadej Paji&#269; 1,2, Tanja Bel&#269;i&#269; Miki&#269;1, Helena Podgornik1,3, Jurka Klun1, Sandra &#352;u&#263;urovi&#263;1,&#160;

genetic-variant-detection-calr-gene-using-high-resolution-melting

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetic Variant Detection in the CALR gene using High Resolution Melting Analysis

4.7K ビュー.  University Medical Centre Ljubljana. Tadej Pajič 1,2, Tanja Belčič Mikič1, Helena Podgornik1,3, Jurka Klun1, Sandra Šućurović1, 

ビデオ: Genetic Variant Detection in the CALR gene using High Resolution Melting Analysis

Perturbations of Circulating miRNAs in Irritable Bowel Syndrome Detected Using a Multiplexed High-throughput Gene Expression Platform

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in a single reaction. The miRNA assay counts transcripts by directly imaging and digitally counting miRNA molecules that are labeled with color-coded fluorescent barcoded probe sets (a reporter probe and a capture probe). Barcodes are hybridized directly to mature miRNAs that have been elongated by ligating a unique oligonucleotide tag (miRtag) to the 3&#39; end. Reverse transcription and amplification of the transcripts are not required. Reporter probes contain a sequence of six color positions populated using a combination of four fluorescent colors. The four colors over six positions are used to construct a gene-specific color barcode sequence. Post-hybridization processing is automated on a robotic prep station. After hybridization, the excess probes are washed away, and the tripartite structures (capture probe-miRNA-reporter probe) are fixed to a streptavidin-coated slide via the biotin-labeled capture probe. Imaging and barcode counting is done using a digital analyzer. The immobilized barcoded miRNAs are visualized and imaged using a microscope and camera, and the unique barcodes are decoded and counted. Data quality control (QC), normalization, and analysis are facilitated by a custom-designed data processing and analysis software that accompanies the assay software. The assay demonstrates high linearity over a broad range of expression, as well as high sensitivity. Sample and assay preparation does not involve enzymatic reactions, reverse transcription, or amplification; has few steps; and is largely automated, reducing investigator effects and resulting in high consistency and technical reproducibility. Here, we describe the application of this technology to identifying circulating miRNA perturbations in irritable bowel syndrome.

We describe the use of a multiplexed high-throughput gene expression platform that quantitates gene expression by barcoding and counting molecules in biological substrates without the need for amplification. We used the platform to quantitate microRNA (miRNA) expression in whole blood in subjects with and without irritable bowel syndrome.

過敏性腸症候群におけるmiRNA循環の摂動は多重化ハイスループット遺伝子発現プラットフォームを使用して検出します

The gene expression platform assay allows for robust and highly reproducible quantification of the expression of up to 800 transcripts (mRNA or miRNAs) in ...

遺伝学

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

単一細胞のシーケンシングを使用したコピー数変化の検出

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer's Disease Gene Susceptibility Assessment

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but especially on red blood cells (RBCs). As a receptor for the complement components C3b and C4b, CR1 regulates the activation of the complement cascade and promotes the phagocytosis of immune complexes and cellular debris, as well as the amyloid-beta (A&#946;) peptide in Alzheimer's disease (AD). Several studies have confirmed AD-associated single nucleotide polymorphisms (SNPs), as well as a copy-number variation (CNV) in the CR1 gene. Here, we describe an innovative method for determining the length polymorphism of the CR1 receptor. The receptor includes three domains, called long homologous repeats (LHR)-LHR-A, LHR-C, and LHR-D-and an n domain, LHR-B, where n is an integer between 0 and 3. Using a single pair of specific primers, the genetic material is used to amplify a first fragment of the LHR-B domain (the variant amplicon B) and a second fragment of the LHR-C domain (the invariant amplicon). The variant amplicon B and the invariant amplicon display differences at five nucleotides outside of the hybridization areas of said primers. The numbers of variant amplicons B and of invariant amplicons is deduced using a quantitative tool (high-resolution melting (HRM) curves), and the ratio of the variant amplicon B to the invariant amplicon differs according to the CR1 length polymorphism. This method provides several advantages over the canonical phenotype method, as it does not require fresh material and is cheaper, faster, and therefore applicable to larger populations. Thus, the use of this method should be helpful to better understand the role of CR1 isoforms in the pathogenesis of diseases such as AD.

High-resolution Melting PCR for Complement Receptor 1 Length Polymorphism Genotyping: An Innovative Tool for Alzheimer&#039;s Disease Gene Susceptibility Assessment

Here, we describe an innovative method to determine complement receptor 1 (CR1) length polymorphisms for use in several applications, particularly the assessment of susceptibility to diseases such as Alzheimer&#39;s disease (AD). This method could be useful to better understand the role of CR1 isoforms in the pathogenesis of AD.

補体受容体1長多型のための高分解能Melting PCR Genotyping：アルツハイマー病の遺伝子感受性評価のための革新的なツール

Complement receptor 1 (CR1), a transmembrane glycoprotein that plays a key role in the innate immune system, is expressed on many cell types, but ...

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of tissues, we have developed numerous modifications and improvements to our original fluorescent in situ hybridization (FISH) protocol. To facilitate throughput and cost effectiveness, all steps, from probe generation to signal detection, are performed using exon 96-well microtiter plates. Digoxygenin (DIG)-labelled antisense RNA probes are produced using either cDNA clones or genomic DNA as templates. After tissue fixation and permeabilization, probes are hybridized to transcripts of interest and then detected using a succession of anti-DIG antibody conjugated to biotin, streptavidin conjugated to horseradish peroxidase (HRP) and fluorescently conjugated tyramide, which in the presence of HRP, produces a highly reactive intermediate that binds to electron dense regions of immediately adjacent proteins. These amplification and localization steps produce a robust and highly localized signal that facilitates both cellular and subcellular transcript localization. The protocols provided have been optimized to produce highly specific signals in a variety of tissues and developmental stages. References are also provided for additional variations that allow the simultaneous detection of multiple transcripts, or transcripts and proteins, at the same time.

High Resolution Fluorescent In Situ Hybridization in Drosophila Embryos and Tissues Using Tyramide Signal Amplification

The described RNA in situ hybridization protocol allows the detection of RNA in whole Drosophila embryos or dissected tissues. Using 96-well microtiter plates and tyramide signal amplification, transcripts can be detected at high resolution, sensitivity, and throughput, and at a relatively low cost.

ショウジョウバエの胚とパスチラミドシグナル信号増幅を利用した生体表面の高解像度蛍光In Situハイブリダイゼーション

In our efforts to determine the patterns of expression and subcellular localization of Drosophila RNAs on a genome-wide basis, and in a variety of ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

プロモーター キャプチャこんにちは-c: 高解像度, ゲノム プロモーターの相互作用のプロファイリング

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

High-Resolution Comparison of Bacterial Conjugation Frequencies

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons of conjugation frequency under different conditions are required to understand how the conjugative element spreads in nature. However, conventional methods for comparing conjugation frequency are not appropriate for in-depth comparisons because of the high background caused by the occurrence of additional conjugation events on the selective plate. We successfully reduced the background by introducing a most probable number (MPN) method and a higher concentration of antibiotics to prevent further conjugation in selective liquid medium. In addition, we developed a protocol for estimating the probability of how often donor cells initiate conjugation by sorting single donor cells into recipient pools by fluorescence-activated cell sorting (FACS). Using two plasmids, pBP136 and pCAR1, the differences in conjugation frequency in Pseudomonas putida cells could be detected in liquid medium at different stirring rates. The frequencies of conjugation initiation were higher for pBP136 than for pCAR1. Using these results, we can better understand the conjugation features in these two plasmids.

With an aim to understand the behaviors of various bacterial conjugative DNA elements under different conditions, we describe a protocol for detecting differences in conjugation frequency, with high resolution, to estimate how efficiently the donor bacterium initiates conjugation.

細菌の活用頻度の高解像度の比較

Bacterial conjugation is an important step in the horizontal transfer of antibiotic resistance genes via a conjugative DNA element. In-depth comparisons ...

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture (4C-seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and effect sizes of regulatory elements to a target gene. Some progress has been made with the bioinformatic prediction of the existence and function of proximal epigenetic modifications associated with activated gene expression using conserved transcription factor binding sites. Chromatin conformation capture studies have revolutionized our ability to discover physical chromatin contacts between sequences and even within an entire genome. Circular chromatin conformation capture coupled with next-generation sequencing (4C-seq), in particular, is designed to discover all possible physical chromatin interactions for a given sequence of interest (viewpoint), such as a target gene or a regulatory enhancer. Current 4C-seq strategies directly sequence from within the viewpoint but require numerous and diverse viewpoints to be simultaneously sequenced to avoid the technical challenges of uniform base calling (imaging) with next generation sequencing platforms. This volume of experiments may not be practical for many laboratories. Here, we report a modified approach to the 4C-seq protocol that incorporates both an additional restriction enzyme digest and qPCR-based amplification steps that are designed to facilitate a greater capture of diverse sequence reads and mitigate the potential for PCR bias, respectively. Our modified 4C method is amenable to the standard molecular biology lab for assessing chromatin architecture.

High-throughput Identification of Gene Regulatory Sequences Using Next-generation Sequencing of Circular Chromosome Conformation Capture 4C-seq

The identification of physical interactions between genes and regulatory elements is challenging but has been facilitated by chromosome conformation capture methods. This modification to the 4C-seq protocol mitigates PCR bias by minimizing over-amplification of PCR templates and maximizes the mappability of reads by incorporating an addition restriction enzyme digest step.

円の染色体構造の次世代シーケンシングによる遺伝子制御配列の高スループット識別キャプチャ (4 C seq)

The identification of regulatory elements for a given target gene poses a significant technical challenge owing to the variability in the positioning and ...

Determining the Likelihood of Variant Pathogenicity Using Amino Acid-level Signal-to-Noise Analysis of Genetic Variation

Advancements in the cost and speed of next generation genetic sequencing have generated an explosion of clinical whole exome and whole genome testing. While this has led to increased identification of likely pathogenic mutations associated with genetic syndromes, it has also dramatically increased the number of incidentally found genetic variants of unknown significance (VUS). Determining the clinical significance of these variants is a major challenge for both scientists and clinicians. An approach to assist in determining the likelihood of pathogenicity is signal-to-noise analysis at the protein sequence level. This protocol describes a method for amino acid-level signal-to-noise analysis that leverages variant frequency at each amino acid position of the protein with known protein topology to identify areas of the primary sequence with elevated likelihood of pathologic variation (relative to population &#34;background&#34; variation). This method can identify amino acid residue location &#34;hotspots&#34; of high pathologic signal, which can be used to refine the diagnostic weight of VUSs such as those identified by next generation genetic testing.

Amino acid-level signal-to-noise analysis determines the prevalence of genetic variation at a given amino acid position normalized to background genetic variation of a given population. This allows for identification of variant &#34;hotspots&#34; within a protein sequence (signal) that rises above the frequency of rare variants found in a population (noise).

遺伝的変異のアミノ酸レベル信号対雑音解析によるバリアント病原性の可能性を決定します。

Advancements in the cost and speed of next generation genetic sequencing have generated an explosion of clinical whole exome and whole genome testing. ...

A Bioinformatics Pipeline to Accurately and Efficiently Analyze the MicroRNA Transcriptomes in Plants

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in regulating gene expression at the post-transcriptional level. Sequencing sRNA libraries by Next Generation Sequencing (NGS) methods has been widely employed to identify and analyze miRNA transcriptomes in the last decade, resulting in a rapid increase of miRNA discovery. However, two major challenges arise in plant miRNA annotation due to increasing depth of sequenced sRNA libraries as well as the size and complexity of plant genomes. First, many other types of sRNAs, in particular, short interfering RNAs (siRNAs) from sRNA libraries, are erroneously annotated as miRNAs by many computational tools. Second, it becomes an extremely time-consuming process for analyzing miRNA transcriptomes in plant species with large and complex genomes. To overcome these challenges, we recently upgraded miRDeep-P (a popular tool for miRNA transcriptome analyses) to miRDeep-P2 (miRDP2 for short) by employing a new filtering strategy, overhauling the scoring algorithm and incorporating newly updated plant miRNA annotation criteria. We tested miRDP2 against sequenced sRNA populations in five representative plants with increasing genomic complexity, including Arabidopsis, rice, tomato, maize and wheat. The results indicate that miRDP2 processed these tasks with very high efficiency. In addition, miRDP2 outperformed other prediction tools regarding sensitivity and accuracy. Taken together, our results demonstrate miRDP2 as a fast and accurate tool for analyzing plant miRNA transcriptomes, therefore a useful tool in helping the community better annotate miRNAs in plants.

A bioinformatics pipeline, namely miRDeep-P2 (miRDP2 for short), with updated plant miRNA criteria and an overhauled algorithm, could accurately and efficiently analyze microRNA transcriptomes in plants, especially for species with complex and large genomes.

植物におけるマイクロRNA転写物を正確かつ効率的に分析するバイオインフォマティクスパイプライン

MicroRNAs (miRNAs) are 20- to 24-nucleotide (nt) endogenous small RNAs (sRNAs) extensively existing in plants and animals that play potent roles in ...

Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the TILLING system has less applicability for insertion/deletion (Indel) detection and traditional TILLING needs more complex steps, like CEL I nuclease digestion and gel electrophoresis. To improve the throughput and selection efficiency, and to make the screening of both Indels and single base substitions (SBSs) possible, a new high-resolution melting (HRM)-based TILLING system is developed. Here, we present a detailed HRM-TILLING protocol and show its application in mutation screening. This method can analyze the mutations of PCR amplicons by measuring the denaturation of double-stranded DNA at high temperatures. HRM analysis is directly performed post-PCR without additional processing. Moreover, a simple, safe and fast (SSF) DNA extraction method is integrated with HRM-TILLING to identify both Indels and SBSs. Its simplicity, robustness and high throughput make it potentially useful for mutation scanning in rice and other crops.

In this article, we present the protocol that is described as high-resolution melting analysis (HRM)-based Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING). This method utilizes fluorescence changes during the melting of the DNA duplex and is suitable for high-throughput screening of both insertion/deletion (Indel) and single base substition (SBS).

米の耕作集団における高解像度溶融による変異の同定

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) is a strategy of reverse genetics for the high-throughput screening of induced mutations. However, the ...