MAM, FS ve MGM NIEHS (Proje 4, P42ES027704, PI, Rusyn) tarafından finanse edilmektedir. MAM, FS, RMM, MGM ve PKS, CPRIT tarafından finanse edilen GCC İleri Mikroskopi ve Görüntü Bilişim Merkezi (RP170719) tarafından desteklenmektedir. Görüntüleme ayrıca Baylor College of Medicine'daki Entegre Mikroskopi Çekirdeği tarafından NIH (DK56338 ve CA125123), CPRIT (RP150578), Dan L. Duncan Kapsamlı Kanser Merkezi ve John S. Dunn Gulf Coast Kimyasal Genomik Konsorsiyumu tarafından desteklenmektedir.

En iyi sonuçları elde etmek için, bu protokolün ıslak laboratuvar kısmı tüm adımlarda standart RNase içermeyen önlemler gerektirir. Örneğin, filtrelenmiş pipet uçları, steril kaplar ve RNase içermeyen tamponların kullanımı oldukça teşvik edilir. Özellikle düşük bolluk hedef RNA'ları için vanadyl ribononcleoside kompleksleri gibi RNaz inhibitörlerinin kullanılması da önerilir.
1. Hücre kültürü ve deneysel kurulum
<ol><li>Bir T75 doku kültürü şişesinde yapışık MCF-7 meme kanseri hücrelerini (ATCC #HTB-22) fenol-kırmızı içermeyen (sadece hormon stimülasyon deneyleri için gereklidir) Dulbecco'nun modifiye Eagle's medium (DMEM) ile desteklenmiş % 10 fetal sığır serumu (FBS), 2 mM L-glutamin, 1 nM sodyum piruvat, 50 I.U./mL penisilin ve 50 μg/mL streptomisin.</li>
	<li>Asitle kazınmış, poli-D-lizin kaplı yuvarlak kapakları (0,16 ila 0,19 mm kalınlığında, 12 mm çapında) 24 çokwell doku kültürü plakasına yerleştirin. NOT: Standart protokollere göre steril PBS'de (Ca++ ve Mg ++ içermeyen fosfat tamponlu salin)yeniden inşa edilmiş 1 mg/mL poli-D-lizin çözeltisi ile kapakları ve kaplamayı asitle kazımak için 1 M HCl kullanın.</li>
	<li>Büyüme ortamını hücrelerden çıkarın ve 5 mL steril PBS (Ca++ ve Mg++içermeyen fosfat tamponlu salin) ile bir kez yıkayın. MCF-7 hücrelerini 2-3 mL Trypsin-EDTA%0.25 çözeltisi kullanarak ayırın. Hücreler ayrıldıktan sonra, Trypsin-EDTA% 0.25 çözeltisini eşit hacimli büyüme ortamıyla nötralize edin.</li>
	<li>Ortam süspansiyonundaki hücreleri 15 mL konik bir tüpe aktarın, hücreleri saçmak için 1 dakika boyunca 391 x g'da aşağı çevirin. Hücre peletini bozmadan ortamı konik tüpten dikkatlice çıkarın ve hücreleri uygun miktarda tedavi ortamına yeniden biriktirin. NOT: Tedavi ortamı% 5 kömür-dektran soyulmuş ve dialyzed FBS, 2 mM L-glutamin, 1 nM sodyum piruvat, 50 I.U./mL penisilin ve 50 μg/mL streptomisin ile desteklenmiş fenol-kırmızısız DMEM'dir. Bu medya steroid hormon stimülasyon deneyleri için gereklidir, çünkü serum bileşeni büyük ölçüde medyayı sıyırarak steroidlerin tükendi ve diyaliz yoluyla büyüme faktörlerini azalttı.</li>
	<li>Hücreleri, 500 μL tedavi medyasında kuyu başına 60.000 ila 70.000 hücrede 24 multiwell plakadaki kapaklara tohumlayın. Bu deney için tedavi başlatmada hücre konflüensi %70-80 civarında olmalıdır. Görüntü analizini zorlaştıran izdiahtan kaçınmak için hücre tipine, büyüme hızına ve denemenin uzunluğuna bağlı olarak hücre tohumlama yoğunluğunu optimize edin. NOT: En iyi görüntüleme ve görüntü analizi için hücre topaklamadan kaçının. Bu amaçla, kuyulara dağıtmadan önce hücreleri birkaç kez pipetleme (veya kısaca girdap) ile hücrelerin aliquot'unu iyice karıştırın. Kaplamalı hücreleri inkübatöre geri yerleştirmeden önce, hücrelerin doku kültürü başlığına yaklaşık 20 dakika yerleşmesine izin vermek hücre topaklamayı azaltmaya yardımcı olur.</li>
	<li>Büyüme ortamlarının sıyrılmış/çaprazlanmış serumunda kalan sinyal molekülleri nedeniyle hücre döngüsü senkronizasyonunu ve arka plan küçültmesini sağlamak için tedavilerden önce hücreleri en az iki gün kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>Tedavi ortamlarında 48 saatlik bir inkübasyondan sonra, MCF-7 hücrelerini 24 saat boyunca tedavi medyasında seyreltilmiş 10 nM 17β-estradiol (E2) ve araç kontrolü (DMSO) ile tedavi edin. Bu tedavi, maksimum tepki vermek için doygun bir E2 dozu kullanır. Farklı hedef genler, hücre modelleri ve tedavi türü için koşulları ampirik olarak belirlemek için zaman seyri ve doz-yanıt deneyleri yapın. Örnek olarak, son yayınımıza bakın7.</li>
</ol>2. Tamponların hazırlanması
<ol><li>Fiksasyon tamponunu hazırlamak için, saflaştırılmış, monomerik formaldehit (elektron-mikroskopi tedarikçileri tarafından% 16 paraformaldehit olarak satılır) steril PBS Ca++/ Mg++ (fosfat tamponlu salin artı Ca++ ve Mg++) içinde% 4'e seyreltin. RNA bozulmasını geciktirmek için 2 mM'lik son konsantrasyon için fiksasyon tamponuna vanadyl ribonucleoside kompleksleri (VRC) ekleyin.<ol>
<li>24 multiwell plakanın kuyusu başına 300-500 μL sabitleyici gerektirerek toplam sabitleme tamponu miktarını hesaplayın. %4 formaldehiti sabitleme adımında gerekli olana kadar buzda saklayın. NOT: Sabitleme arabelleği her deneme için taze hale getirin. DİkKAT: Formaldehit, deriden emilen bir teraojendir. Bu kimyasalı, kurumsal düzenlemelerinize göre uygun KKD ile birlikte duman kaputunda kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Permeabilizasyon adımı için çekirdeksiz suda% 70 etanol hazırlayın. Alternatif bir seçenek steril PBS Ca++ /Mg ++artı 2 mM VRC'de %0,5 Triton-X100'dür. Kuyu başına 500 μL tampon kullanarak gereken toplam permeabilizasyon tampon miktarını hesaplayın.</li>
	<li>Hibridizasyon tamponunun 9 mL'sini hazırlamak için, 6 mL çekirdeksiz suya 2 mL stok% 50 dektran sülfat ve 1 mL 20x SSC (salin sodyum sitrat) tamponu ekleyin. Hibridizasyon tamponunu iyice karıştırmak için girdap. Bu tampon 4 °C'de bir haftaya kadar saklanabilir.</li>
	<li>2x salin sodyum sitrat (SSC) tampon gerektiren beş ayrı yıkama adımı vardır. Yıkama adımı başına kapak parçası başına 500 μL tampon öngörerek gereken 2x SSC tamponun son hacmini hesaplayın. Gerekli stok miktarını çekirdeksiz suda 20x SSC tamponu seyreltin. Ekstra bir önlem olarak yıkama adımlarına 2 mM VRC eklenebilir. Bu tampon, işlem adımları süresince oda sıcaklığında saklanabilir.</li>
</ol>3. RNA FISH için fiksasyon
<ol><li>Tedaviden sonra, medyayı kuyulardan çıkarın ve steril, soğuk PBS Ca++/ Mg++ile bir kez yıkayın. Düşük yapışma hücresi modeli kullanılıyorsa, sıvıyı aspire etmek için vakum kullanmayın; ortamı kuyunun kenarından dikkatlice çıkarmak ve ilk yıkama adımını atlamak için manuel pipetleme kullanın. Buz üzerinde 30 dakika boyunca 500 μL sabitleme tamponu ekleyin. NOT: Numune RNA bozulmasına eğilimliyse, bu noktada yıkama adımı için 2 mM VRC'li steril PBS kullanın.</li>
	<li>Kurumsal düzenlemelere göre fiksatifi kaldırın ve kimyasal atıklara atın. Hücreleri soğuk steril PBS Ca++/Mg++ ile iki kez 3 dakika yıkayın.</li>
	<li>PBS'yi çıkarın ve her kuyuya 500 μL% 70 etanol ekleyin. 24 kuyu plakasını bir parafin plastik filmle kapatın. En az dört saat boyunca 4 °C'de bir rotator üzerine yerleştirin. Örnekleri bir gecede% 70 etanolde bırakmak en iyisidir. Protokol bu noktada duraklatılabilir ve numuneler% 70 etanolde bir haftaya kadar saklanabilir. NOT: Alternatif olarak 2 mM VRC solüsyonlu PBS'de %0,5 Triton-X100 kullanılabilir. Numuneleri bu permeabilizasyon tamponunun 500 μL'sinde bir rotatörde oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatırın. Bu permeabilizasyon arabelleği kullanılırsa, iletişim kuralı bu noktada duraklatılamaz ve karma oluşturma adımı boyunca devam etmelidir.</li>
</ol>4. RNA FISH için hibridizasyon
<ol><li>Permeabilizasyon tamponunu çıkarın ve bir rotatörde oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 500 μL 2x SSC tampon artı% 10 formamid olarak bir kez yıkayın.</li>
	<li>Tüm karma arabelleği hazırlayın. Kapak sapası başına yaklaşık 30 μL tam hibridizasyon tamponu hesaplayın. Gereken yüzdeye ulaşmak için karma arabelleğe formamid ekleyin. Örneğin, 500 μL tam hibridizasyon tamponu gerekiyorsa, daha önce yapılan hibridizasyon tamponunun 450 μL'sine ek olarak% 10 vol/ vol'a ulaşmak için 50 μL moleküler sınıf formamidden oluşacaktır. Vortex kısaca karıştırmak için. DİkKAT: Formamid, deriden emilen bir teraratojendir. Bu kimyasalı, kurumsal düzenlemelere göre uygun KKD ile birlikte duman kaputunda kullanın.</li>
	<li>Greb1 intronunu (Atto 647N ile etiketlenmiştir) ve GREB1 eksonunu (Quasar 570 ile etiketlenmiştir) probları 1:300 hibridizasyon tamponunda seyreltin. Pipetleme ile karıştırın. Bu arabelleği ışığa karşı koruyun ve hemen kullanın. NOT: Problar Stossi ve ark7'deayrıntılı olarak belirtildiği gibi tasarlanmış ve üretilmiştir. Problar genellikle üretici protokolü14'egöre RNA içermeyen TE arabelleği içinde yeniden uzlaştırılması gereken kurutulmuş bir oligonükleotid prob havuzu olarak sağlanır. Bu problar için stok çözeltisi 12,5 μM idi, bu nedenle; probların çalışma konsantrasyonu 42 nM'dir.</li>
	<li>Gece hibridizasyon adımı için nemlendirici bir oda hazırlayın. RNases kaldırmak için bir yüzey dekontaminant ile temizlenmiş bir cam Petri kabı içine, pozlanmamış tarafı yukarı bir parafin plastik film parçası yerleştirin. İki kağıt havluyu steril suyla doyutun ve kurutma belirli etiketlemeyi yok edebileceğinden, nem sağlamak için Petri kabının kenarlarına yerleştirin.</li>
	<li>Parafin plastik filminin temiz tarafına hibridizasyon tamponunda 30 μL prob noktalama ile probları aliquot. Kapakların birbirleriyle temas etmemeleri için probların aliquotlarını dağıtın.</li>
	<li>Sterilize edilmiş tokseps kullanarak, kapak hücre tarafını cam Petri kabındaki problara hafifçe aşağı çevirin. Hava kabarcıklarından kaçının ve kapaklara basınç uygulamayın. NOT: Sonraki adımlar için gerekli olacağından, doku kültürü plakasını 2x SSC tamponu ile atmayın.</li>
	<li>Cam Petri kabını parafin plastik filmle kapatın ve floroforlara ışığın maruz kalmasını önlemek için plakayı folyo ile örtün. Düz dönmeyen bir yüzeyde 37 °C'de 16 saate kadar gece boyunca kuluçkaya yatırın. Kuluçka süresi ampirik olarak değiştirilebilir, ancak en az 4 saat önerilir. NOT: Kapaklar, hibridizasyon tamponunda kuluçka yaparken kaymaya karşı hassastır, bu da kapakta kuru noktalara yol açabilir ve numuneye zarar verebilir.</li>
</ol>5. Görüntüleme için numunelerin hazırlanması 
<ol><li>Ertesi gün, kapakları nemlendirici hazneden tokmaklar kullanarak çıkarın ve hücre tarafı yukarı olacak şekilde 24 kuyu plakasına geri döndürün. Fazla probu ve spesifik olmayan hibridizasyonu yıkamak için 500 μL taze 2x SSC tampon artı% 10 formamid ekleyin. NOT: Numuneleri bu noktadan itibaren ışıktan koruyun.</li>
	<li>Isıtılmış bir rotatörde her biri 37°C'de 15 dakika boyunca 500 μL 2x SSC tampon artı %10 formamid ile hücreleri iki kez yıkayın.</li>
	<li>DNA'yı 2x SSC tamponda 1 μg/mL'de DAPI ile bir rotatörde oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karşı verin.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2x SSC tampon ile bir kez yıkayın.</li>
	<li>Kapakları, fazla tuzları ortadan kaldırmak için kağıt havlu ve nükleaz içermeyen suda hızlı bir yıkama ile fazla 2x SSC tamponu çıkardıktan sonra sertleşmeyen montaj ortamı kullanarak cam slaytlara monte edin. Son olarak, kapakları açık oje ile kapatın.</li>
</ol>6. Yüksek çözünürlüklü mikroskopi ve görüntü işleme
<ol><li>Örnekleri 60x veya 100x yağ hedefi ve bir sCMOS kamera kullanarak geniş alan epifluoresans mikroskobuna görüntüleyin. Bu deney için kullanılan belirli mikroskop ve amaç için malzeme tablosuna bakın.<ol>
<li>Sinyalin zamana bağlı bozulmasını önlemek için numuneler tam olarak işlenir işlenmez görüntülemeyi tamamlayın. NOT: Bu deneyde kırılma indisi (RI) 1.516 olan daldırma yağı kullanılmaktadır. RI uyuşmazlıkları görüntü bozulmasını etkileyecek nokta yayılma işlevinin sapmalarına neden olacağından, yağ RI'sını belirli örneklerle eşleştirmek için ampirik test yapılmalıdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Görüntüler 0,10827 μm yanal piksel boyutuyla yakalanır.</li>
	<li>En yüksek yoğunluğa (yani pozitif kontrollere) sahip olması beklenen örneği kullanarak ışık kaynağından aydınlatma miktarını (yani, yüzde geçirgenlik) ve her kanal için pozlama sürelerini (bu özel örnekteki DAPI, TRITC, CY5 filtreleri) optimize edin. Bu deneyde, E2 ile işlenmiş numunenin her iki GREB1 prob seti için daha yüksek yoğunluğa sahip olması beklenmiştir. Genellikle GREB1 intron ve exon probları için yüzde geçirgenlik %50 – 100'dür ve maruz kalma süreleri 0,25 – 0,60 saniye arasında değişmektedir.</li>
	<li>Ayrıca, fotobleaching ve/veya kamera piksellerinin doygunluğunu önleyen koşullar altında görüntüler alıp alın. Deneyimlerimize göre, arka plan ve sinyal yoğunluğu arasında en az ~ on kat fark olmalıdır. Birkaç piksel/alanın doygunluğu, numunedeki spesifik olmayan sinyaller (örneğin, kapaktaki kir, hücre dışındaki prob agregaları) nedeniyle oluşabilir, ancak yalnızca doymuş bölgeler niceme dahil değilse.</li>
	<li>z yığınının alımını ayarlamak için DAPI kanalındaki örneğe odaklanın. DAPI lekeli çekirdeklerin odak dışı kaldığı mesafelerde z yığınının üst ve alt kısmını seçin. Kullandığımız z-yığını adım boyutu dilim başına 0,25 μm'dir ve toplam z-yığını tüm hücreyi kapsamalıdır (MCF-7 hücrelerinde yaklaşık 10 μm). Ancak, z-yığını adım boyutu kullanılan hedefe göre değişecektir ve Nyquist örnekleme kriterini izlemelidir. NOT: intronlar genellikle sadece çekirdekte bulunur; ancak, eksonlar hem çekirdekte hem de sitoplazmdadır. Bu nedenle, z yığınını yukarıda açıklandığı gibi ayarlamak, z yığını tüm hücreyi kapsadığı için intron ve exon etiketlemesinin çoğunu yakalar.</li>
	<li>Tipik olarak, hücreler arasındaki yanıt ve varyasyonun büyüklüğünün anlık görüntüsünü yakalamak için ön deneylerde nicel analiz için en az 200 hücre görüntüleyin.</li>
	<li>Bazı görüntülenmiş hücreler, analiz ardışık düzeni (örneğin, görüntünün kenarlıklarına dokunan hücreler, apoptotik/mitotik hücreler) tarafından filtrelenecekleri için son analizden (yani bırakma oranından) hariç tutulur. NOT: Görüntü alanlarını seçerken, akılda tutulması gereken birkaç faktör vardır. DAPI etiketli, nükleer floresan tarafından tanımlanan eşit yayılmış, örtüşmeyen hücrelere sahip alanları seçin. Ayrıca, kısmi hücrelerin sayılmasını önlemek için görüntü alanının kenarları boyunca en az çekirdek sayısına sahip alanları seçmeye çalışın. İstatistiksel analiz gerektiren deneyler için her zaman otomatik, tarafsız görüntüleme tercih edilir.</li>
	<li>Edinimden sonra, 10 döngü (yani yineleme sayısı) kullanarak agresif bir restoratif algoritma kullanarak görüntüleri deconvolve edin. Görüntü analizi için maksimum yoğunluklu projeksiyonlar oluşturun (belirli bir 3D analiz gerekiyorsa bu adımı atla). Kullanılan kameranın bit derinliğine göre tüm projeksiyon görüntülerini kaydedin; Bizim durumumuzda 16-bit TIFF gri tonlamalı görüntüler kaydedildi. RGB görüntüler, bilgi kaybına neden olan daha az bit derinliğine sahiptir; bu nedenle, RGB görüntüler görüntü analizi için uygun değildir.</li>
</ol>7. Görüntü analizi 
<ol><li>Talimatları okuyun ve jupyter dizüstü bilgisayarı github'dan indirin(https://github.com/pankajmath/RNA_FISH_analysis).</li>
	<li>Python anakonda dağıtımını (https://www.anaconda.com/distribution/) sürüm 3.6 veya üst sürümünü yükleyin.</li>
	<li>Anaconda istemini açın ve anakonda için Basit ITK Yüklemek için yükleme komutunu yazın(https://anaconda.org/SimpleITK/simpleitk).</li>
	<li>Anaconda navigator'ı açın ve jupyter dizüstü bilgisayarı başlatın. Dizinleri ve dosyaları gösteren bir web tarayıcısı açacaktır. Github'dan indirilen jupyter not defterini içeren dizine ulaşmak için dizin yapılarına göz atın.</li>
	<li>Not defterini açın ve Shift ve Enter tuşlarına aynı anda basarak her hücreyi çalıştırın.</li>
	<li>Not defterinde sağlanan her işlevin ve adımın ayrıntılarını izleyin. Farklı bir görüntü kümesi için bazı parametre değerlerinin değiştirilmesi gerekebilir. NOT: Kısacası, çekirdekler 251 piksel blok boyutuyla yerel eşik kullanılarak DAPI kanalından bölünür, delikler doldurulur ve 100 pikselden küçük nesneler kaldırılır. Dokunan çekirdekler bir havza algoritması kullanılarak bölündü. Nükleer maske daha sonra 100 piksel genişletildi ve çekirdekleri havza olarak kullanarak dokunaklı nesneleri ayırmak için su havzası kullanıldı. Sabit durum RNA'sını (eksonları) tanımlamak için Otsu eşiği kullanıldı; transkripsiyonel aktif aleller (intron) için önce Gauss bulanıklığı (sigma=1) uygulandı ve daha sonra maksimum entropi eşiği kullanıldı.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Russell, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+Expression:+Transcription.">Gene Expression: Transcription.</a> iGenetics: A Mendelian Approach. , 331-352 (2006).</li><li>Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variety+in+the+level+of+gene+control+in+eukaryotic+cells.">Variety in the level of gene control in eukaryotic cells.</a> Nature. 297, 365-371 (1982).</li><li>K&#246;hler, A., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exporting+RNA+from+the+nucleus+to+the+cytoplasm.">Exporting RNA from the nucleus to the cytoplasm.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 761-773 (2007).</li><li>Kolodziejczyk, A. A., Kim, J. K., Svensson, V., Marioni, J. C., Teichmann, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Technology+and+Biology+of+Single-Cell+RNA+Sequencing.">The Technology and Biology of Single-Cell RNA Sequencing.</a> Molecular Cell. 58, 610-620 (2015).</li><li>Shah, S., Lubeck, E., Zhou, W., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+Transcription+Profiling+of+Single+Cells+Reveals+Spatial+Organization+of+Cells+in+the+Mouse+Hippocampus.">In situ Transcription Profiling of Single Cells Reveals Spatial Organization of Cells in the Mouse Hippocampus.</a> Neuron. 92, 342-357 (2016).</li><li>Halpern, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bursty+Gene+Expression+in+the+Intact+Mammalian+Liver.">Bursty Gene Expression in the Intact Mammalian Liver.</a> Molecular Cell. 58, 147-156 (2015).</li><li>Stossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen-induced+transcription+at+individual+alleles+is+independent+of+receptor+level+and+active+conformation+but+can+be+modulated+by+coactivators+activity.">Estrogen-induced transcription at individual alleles is independent of receptor level and active conformation but can be modulated by coactivators activity.</a> Nucleic Acids Research. 48, 1800-1810 (2020).</li><li>Coassin, S. R., Orjalo, A. V., Semaan, S. J., Johansson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+Detection+of+Nuclear+and+Cytoplasmic+RNA+Variants+Utilizing+Stellaris+RNA+Fluorescence+In+situ+Hybridization+in+Adherent+Cells.">Simultaneous Detection of Nuclear and Cytoplasmic RNA Variants Utilizing Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization in Adherent Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1211, 189-199 (2014).</li><li>Gall, J. G., Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+detection+of+RNA-DNA+hybrid+molecules+in+cytological+preparations.">Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 63, 378-383 (1969).</li><li>Bauman, J. G., Wiegant, J., Borst, P., van Duijn, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+method+for+fluorescence+microscopical+localization+of+specific+DNA+sequences+by+in+situ+hybridization+of+fluorochrome+labelled+RNA.">A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA.</a> Experimental Cell Research. 128, 485-490 (1980).</li><li>Singer, R. H., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+gene+expression+visualized+in+chicken+muscle+tissue+culture+by+using+in+situ+hybridization+with+biotinated+nucleotide+analog.">Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with biotinated nucleotide analog.</a> Proceedings of the National Academy of the Sciences of the United States of America. 79, 7331-7335 (1982).</li><li>Femino, A. M., Fay, F. S., Fogarty, K., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+single+RNA+transcripts+in+situ.">Visualization of single RNA transcripts in situ.</a> Science. 280, 585-590 (1998).</li><li>Raj, A., van den Bogaard, P., Rifkin, S. A., van Oudenaarden, A., Tyagi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+individual+mRNA+molecules+using+multiple+singly+labeled+probes.">Imaging individual mRNA molecules using multiple singly labeled probes.</a> Nature Methods. 5, 877-879 (2008).</li><li>Orjalo, A. V., Johansson, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stellaris+RNA+Fluorescence+In+situ+Hybridization+for+the+Simultaneous+Detection+of+Immature+and+Mature+Long+Noncoding+RNAs+in+Adherent+Cells.">Stellaris RNA Fluorescence In situ Hybridization for the Simultaneous Detection of Immature and Mature Long Noncoding RNAs in Adherent Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1402, 119-134 (2016).</li><li>Johnson, C. V., Singer, R. H., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+3+Fluorescent+Detection+of+Nuclear+RNA+and+DNA:+Implications+for+Genome+Organization.">Chapter 3 Fluorescent Detection of Nuclear RNA and DNA: Implications for Genome Organization.</a> Methods in Cell Biology. 35, 73-99 (1991).</li><li>Levsky, J. M., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+in+situ+hybridization:+Past,+present+and+future.">Fluorescence in situ hybridization: Past, present and future.</a> Journal of Cell Science. 116, 2833-2838 (2003).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+A+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: A novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li><li>Stossi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+estrogenic+mechanisms+of+bisphenol+A+analogs+through+high+throughput+microscopy-based+contextual+assays.">Defining estrogenic mechanisms of bisphenol A analogs through high throughput microscopy-based contextual assays.</a> Chemistry and Biology. 21, 743-753 (2014).</li><li>Szafran, A. T., Stossi, F., Mancini, M. G., Walker, C. L., Mancini, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+properties+of+non-estrogenic+substituted+bisphenol+analogs+using+high+throughput+microscopy+and+image+analysis.">Characterizing properties of non-estrogenic substituted bisphenol analogs using high throughput microscopy and image analysis.</a> PLoS One. 12, 1-19 (2017).</li><li>Rae, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GREB1+is+a+critical+regulator+of+hormone+dependent+breast+cancer+growth.">GREB1 is a critical regulator of hormone dependent breast cancer growth.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 92, 141-149 (2005).</li><li>Heldring, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptors:+How+do+they+signal+and+what+are+their+targets.">Estrogen receptors: How do they signal and what are their targets.</a> Physiological Reviews. 87, 905-931 (2007).</li><li>Hah, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid,+extensive,+and+transient+transcriptional+response+to+estrogen+signaling+in+breast+cancer+cells.">A rapid, extensive, and transient transcriptional response to estrogen signaling in breast cancer cells.</a> Cell. 145, 622-634 (2011).</li><li>Kadam, P., Bhalerao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+size+calculation.">Sample size calculation.</a> International Journal of Ayurveda Research. 1, 55-57 (2010).</li><li>Kocanova, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+estrogen-responsive+genes+does+not+require+their+nuclear+co-localization.">Activation of estrogen-responsive genes does not require their nuclear co-localization.</a> PLoS Genetics. 6, (2010).</li><li>Shaffer, S. M., Wu, M. T., Levesque, M. J., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Turbo+FISH:+A+Method+for+Rapid+Single+Molecule+RNA+FISH.">Turbo FISH: A Method for Rapid Single Molecule RNA FISH.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>Kim, S. O., Kim, J., Okajima, T., Cho, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+paraformaldehyde-treated+individual+cells+investigated+by+atomic+force+microscopy+and+scanning+ion+conductance+microscopy.">Mechanical properties of paraformaldehyde-treated individual cells investigated by atomic force microscopy and scanning ion conductance microscopy.</a> Nano Convergence. 4, (2017).</li><li>Shieh, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+ribonucleoside+vanadyl+complex+(RVC)+for+developing+a+multifunctional+tissue+preservative+solution.">Application of ribonucleoside vanadyl complex (RVC) for developing a multifunctional tissue preservative solution.</a> PLoS One. 13, 1-14 (2018).</li><li>Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accuracy+and+precision+in+quantitative+fluorescence+microscopy.">Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy.</a> Journal of Cell Biology. 185, 1135-1148 (2009).</li><li>Vinegoni, C., Feruglio, P. F., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+dynamic+range+fluorescence+imaging.">High dynamic range fluorescence imaging.</a> IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 25, (2019).</li><li>Tam, R., Shopland, L. S., Johnson, C. V., McNeil, J. A., Lawrence, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+RNA+FISH+for+visualizing+gene+expression+and+nuclear+architecture.">Application of RNA FISH for visualizing gene expression and nuclear architecture.</a> FISH: A Practical Approach. , 93-117 (2002).</li><li>Jonkman, J., Brown, C. M., Wright, G. D., Anderson, K. I., North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial:+guidance+for+quantitative+confocal+microscopy.">Tutorial: guidance for quantitative confocal microscopy.</a> Nature Protocols. , (2020).</li><li>Trcek, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-mRNA+counting+using+fluorescent+in+situ+hybridization+in+budding+yeast.">Single-mRNA counting using fluorescent in situ hybridization in budding yeast.</a> Nature Protocols. 7, 408-419 (2012).</li><li>Kwon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+fluorescence+in+situ+hybridization:+Quantitative+imaging+of+single+RNA+molecules.">Single-molecule fluorescence in situ hybridization: Quantitative imaging of single RNA molecules.</a> BMB Reports. 46, 65-72 (2013).</li><li>Sibarita, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deconvolution+microscopy.">Deconvolution microscopy.</a> Advcances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 201-243 (2005).</li><li>Takei, Y., Shah, S., Harvey, S., Qi, L. S., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+Dynamic+Imaging+of+Genomic+Loci+by+Combined+CRISPR+Imaging+and+DNA+Sequential+FISH.">Multiplexed Dynamic Imaging of Genomic Loci by Combined CRISPR Imaging and DNA Sequential FISH.</a> Biophysical Journal. 112, 1773-1776 (2017).</li><li>Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Imaging+with+Multiplexed+Error-Robust+Fluorescence+in+situ+Hybridization+(MERFISH).">RNA Imaging with Multiplexed Error-Robust Fluorescence in situ Hybridization (MERFISH).</a> Methods in Enzymology. 572, 1-49 (2016).</li><li>Shah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+Spatial+Genomics+of+the+Nascent+Transcriptome+by+Intron+seqFISH.">Dynamics and Spatial Genomics of the Nascent Transcriptome by Intron seqFISH.</a> Cell. 174, 363-376 (2018).</li><li>Xia, C., Babcock, H. P., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+detection+of+RNA+using+MERFISH+and+branched+DNA+amplification.">Multiplexed detection of RNA using MERFISH and branched DNA amplification.</a> Scientific Reports. 9, 1-13 (2019).</li><li>Lubeck, E., Coskun, A. F., Zhiyentayev, T., Ahmad, M., Cai, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+in+situ+RNA+profiling+by+sequential+hybridization.">Single-cell in situ RNA profiling by sequential hybridization.</a> Nature Methods. 11, 360-361 (2014).</li><li>Wang, G., Moffitt, J. R., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+imaging+of+high-density+libraries+of+RNAs+with+MERFISH+and+expansion+microscopy.">Multiplexed imaging of high-density libraries of RNAs with MERFISH and expansion microscopy.</a> Scientific Reports. 8, (2018).</li><li>Wassie, A. T., Zhao, Y., Boyden, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expansion+microscopy:+principles+and+uses+in+biological+research.">Expansion microscopy: principles and uses in biological research.</a> Nature Methods. 16, 33-41 (2019).</li><li>Zimmerman, S. G., Peters, N. C., Altaras, A. E., Berg, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+RNA+ISH,+RNA+FISH+and+protein-RNA+double+labeling+(IF/FISH)+in+Drosophila+ovaries.">Optimized RNA ISH, RNA FISH and protein-RNA double labeling (IF/FISH) in Drosophila ovaries.</a> Nature Protocols. 8, 2158-2179 (2013).</li><li>Kochan, J., Wawro, M., Kasza, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+detection+of+mRNA+and+protein+in+single+cells+using+immunofluorescence-combined+single-molecule+RNA+FISH.">Simultaneous detection of mRNA and protein in single cells using immunofluorescence-combined single-molecule RNA FISH.</a> Biotechniques. 59, 209-221 (2015).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Açıklanan smFISH metodolojisi daha önce yayınlanan7, 12,14protokollerine dayanmaktadır. Bu protokolde, ıslak laboratuvardan (tohumlama yoğunluğu, sabitleme süresi, permeabilizasyon ve prob konsantrasyonu dahil) görüntüleme ve görüntü analizine kadar optimize edilen kritik adımları açıklıyoruz ve gen transkripsiyonunun tek hücreli analizini yapmak isteyen laboratuvarlar için tam bir deneysel boru hattı sağ...

Gen transkripsiyon ve çeviri, DNA dizisinden RNA'ya ve protein1'ekadar biyolojinin merkezi dogmasında yer alan iki ana süreçtir. Bu çalışmada transkripsiyon sırasında haberci RNA (mRNA) üretimine odaklanıyoruz. Nascent RNA molekülü hem kodlamayan intronları hem de kodlama eksonlarını içerir. Intronlar, mRNA ribozomlar üzerinde çeviri için sitoplazma hareket etmeden önce eş-transkripsiyonel olarak birlenir2,3.
Geleneksel olarak, mRNA ölçümü, RT-qPCR veya Kuzey şişkinliği gibi klasik tahlillerle hücrelerin toplu popülasyonlarında (yüzlerce ila milyon) gerçekleştirilir. Çok güçlü olsa da, bu yöntemler hücreden hücreye varyasyon (fenotipik heterojenlik), transkripsiyonel olarak aktif alellerin sayısının tanımlanması ve belki de daha da önemlisi mekansal bilgi eksikliği hakkında içgörü sağlamadıkları için sınırlıdır. Daha yakın zamanda, tek hücreli RNA dizilimine (RNAseq) izin sağlayan genom geniş teknolojileri görüntüleme yöntemleri ile sıralama4arasındaki boşluğu kapatmaya başladı. Bununla birlikte, RNAseq nispeten düşük algılama verimliliklerinden muzdariptir ve işleme adımları uzamsal bilgilerin tamamen kaybolmasına neden5. Tek hücreli RNAseq, izojenik hücre popülasyonu arasında fenotipik heterojenlik hakkında içgörüler sağlayabilse de, RNA floresan in situ hibridizasyon (RNA-FISH) mekansal düzeyde ve aletle bazında hedef gen ekspresyonunun daha eksiksiz bir şekilde araştırılmasını kolaylaştırabilir6,7.
RNA FISH, sabit hücrelerdeki hedef RNA moleküllerinin tespitini ve lokalizasyonunu sağlayan bir tekniktir. Daha önceki, zahmetli yöntemlerden farklı olarak, mevcut son teknoloji RNA-FISH, hedef RNA dizilerinin tamamlayıcısı olan ticari olarak mevcut nükleik asit problarını kullanır ve bu problar Watson-Crick tabaneşleştirmesi 8ile hedeflerine melezlenir. Erken yerinde hibridizasyon teknikleri, Gall ve Pardue tarafından 1969'da kurulan benzer bir protokolü içeriyordu, çünkü bir örnek özellikle bir hedef RNA9'amelezlenen nükleik asit probları ile işlendi. Başlangıçta test radyoaktif veya kolorimetrik algılama kullanılarak gerçekleştirildi; bununla birlikte, 1980'lerde, DNA FISH ve daha sonra RNA FISH'e floresan in situ hibridizasyon (FISH) protokollerinin geliştirilmesi, daha hassas tespite giden yolu ve çoklama potansiyelini10,11'e açtı.
RNA FISH'teki diğer gelişmeler, tek RNA moleküllerini (smFISH)12 , 13tespit etme ve ölçmeyeteneğineyolaçmıştır. Doğrudan algılama, probların kendilerinin floroforlarla etiket edildiği bir yöntemdir. SmFISH ile ilgili bir zorluk, floresan sinyallerin farklı, kırınım sınırlı noktalar olarak algılanmasını kolaylaştırmak için yeterli melezleme problarına / hedefine ihtiyaç olmasıdır. Bu sorunu gidermek için, hedef RNA 8,12,14'ünçeşitli bölgelerine tamamlayıcıkısa tek iplikli DNA oligonükleotidlerinden oluşan bir prob kümesi kullanılabilir. Birden fazla probun bağlanması yerel florofor yoğunluğunu arttırır ve RNA'yı floresan mikroskopi ile belirgin, yüksek yoğunluklu bir nokta olarak görünür hale getirir. Bu yöntem avantajlıdır, çünkü prob kümesi havuzundaki oligonükleotidlerin hedef dışı bağlanması, gerçek sinyal ve sahte oligonükleotid bağlama arasında ayrım yapmak için spot boyutunu ve yoğunluğunu nicel olarak analiz ederek gerçek RNA spot sinyalinden ayırt edilebilir, böylece yanlış pozitifleri azaltarak daha doğru analizleri kolaylaştırır12.
mRNA'yı tespit etmek için alternatif yöntemler klasik BAC klon tabanlı nick çeviri yöntemi ve daha yeni geliştirilen dallı DNA sistemidir. BAC klonlanmış, nick çeviri yönteminde, etiketlenecek DNA enzimmatik olarak çalınır ve maruz kalan 3' uca yeni bir nükleotid eklenir. DNA polimerazının aktivitesi I, istenen prob15 , 16ile sonuçlanan etiketli bir nükleotid ekler. Dallı DNA tekniği, RNA hedeflerine çiftler halinde melezlenen oligonükleotid probları içerir ve bu problar birden fazla sinyal amplifikasyon molekülü kullanılarak yükseltilir. Bu yöntem sinyal-gürültü oranını önemli ölçüde artırabilir, ancak floresan lekeler boyut ve yoğunluk bakımından çılgınca farklı olabileceğinden amplifikasyon doğru miktarlamayı çarpıtabilir17.
Galveston Körfezi/Houston Gemi Kanalı'nda endokrin bozucu kimyasalların etkilerini ölçmek için NIEHS Superfund Araştırma Programı katılımının bir parçası olarak tam olarak kullanılan bu protokol için bir model sistem olarak, bir ER agonisti, 17β-estradiol (E2) 7 ,18,19 ile bir gecede tedavi edilen östrojen reseptör (ER) pozitif meme kanseri hücre hattı MCF-7'yi kullandık. E2, prototipik ER hedef geni, GREB17, 20,21,22dahil olmak üzere birçok ER-hedef geni düzenler. Burada açıklanan smFISH protokolü, GREB1'i hedefleyen iki spektral olarak ayrılmış prob kümesinden yararlanır; biri akonlara ve diğeri intronlara melezlenerek hem olgun hem de nascent RNA7'ninölçülenliğine izin verir. Daha sonra görüntü smFISH etiketli örneklere dekonvolüsiyon ile birlikte epifluoresans mikroskopisi kullanıyoruz ve ardından hücre başına aktif alel ve olgun RNA'ların sayısını ölçmek için görüntü analizi rutinleri uyguluyoruz.

<table><tbody><tr><td>17&amp;beta; Estradiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2257</td><td>CAS Number 50-28-2</td></tr><tr><td>Ambion SSC (20X) Buffer, Rnase-free</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM9770</td><td></td></tr><tr><td>Corning DMEM with L-Glutamine and 4.5 g/L Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT10017CV</td><td>Manufactured by Invitrogen</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8417</td><td>Without sodium pyruvate</td></tr><tr><td>Dextran Sulfate, 50% Solution Sterile</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3730-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline Ca++/Mg++</td><td>Corning</td><td>21030CV</td><td>Manufactured by Calbiochem</td></tr><tr><td>Ethanol, 200 Proof (100%)</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-678-005</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24-Well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Cell Culture Plate</td><td>Corning</td><td>353047</td><td>Manufactured by Decon Laboratories</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS), 500 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-753-2978</td><td>Manufactured by Gemini Bio Products</td></tr><tr><td>GE Healthcare DeltaVision LIVE High Resolution Deconvolution Microscope</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Water, Molecular Biology Grade</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3053802</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil 1.516</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>29162940</td><td>Manufactured by GE Healthcare Bio-Science</td></tr><tr><td>L-glutamine Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25005Cl</td><td>Manufactured by Corning</td></tr><tr><td>MCF-7 cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Grade Formamide</td><td>Promega</td><td>PAH5051</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 60x/1.42 NA Objective</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis Company, Inc.</td><td>52858-076</td><td>Distributed by VWR</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde, 16% Solution, EM Grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin-Streptomycin Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT3001Cl</td><td>Manufactured by Corning</td></tr><tr><td>Ribonucleoside Vanadyl Complex</td><td>VWR</td><td>101229-716</td><td>Manufactured by New England Biosciences</td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Ambion</td><td>9780</td><td></td></tr><tr><td>Sodium pyruvate, 100 mM</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-360-070</td><td>Manufactured by Gibco</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Glass Coverslips, #1.5</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-81P</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100, 100 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>Manufactured by Fisher BioReagents</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA Solution 0.25%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Mounting Medium 10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9265087</td><td>Manufactured by Vector Laboratories</td></tr></tbody></table>

single cell analysis of transcriptionally active alleles by single molecule fish

Gen transkripsiyon, hücre biyolojisinde önemli bir süreçtir ve hücrelerin iç ve dış ipuçlarını yorumlamasına ve yanıt vermesine izin verir. mRNA düzeylerini ölçen geleneksel toplu popülasyon yöntemleri (Kuzey blot, PCR ve RNAseq), yanıtlarda hücreden hücreye varyasyon hakkında bilgi sağlama yeteneğinden yoksundur. Hassas tek hücreli ve alelik görselleştirme ve niceleme, tek moleküllü RNA floresan in situ hibridizasyon (smFISH) ile mümkündür. RNA-FISH, hedef RNA'ların etiketli oligonükleotid problarla hibridize ederek gerçekleştirilir. Bunlar orta/yüksek aktarım hızı yöntemleriyle görüntülenebilir ve görüntü analizi işlem hatları aracılığıyla, hem olgun hem de nascent RNA'lar üzerinde tek hücre düzeyinde nicel veriler sağlar. Fiksasyon, permeabilizasyon, hibridizasyon ve görüntüleme adımları, burada açıklanan model sistemi kullanılarak laboratuvarda uzun yıllar boyunca optimize edilmiştir ve bu da smFISH etiketlemesinin başarılı ve sağlam tek hücre analizi ile sonuçlanır. Numune hazırlama ve işleme ile temel amaç, yanlış pozitifleri azaltmak ve daha doğru veriler sağlamak için yüksek sinyal-gürültü oranı ile karakterize yüksek kaliteli görüntüler üretmektir. Burada, belirli örneklere uyarlamak için öneriler ve optimizasyon adımlarıyla birlikte numune hazırlamadan veri analizine kadar işlem hattını açıklayan bir protokol sunuyoruz.

SmFISH yoluyla hormonal yanıtları analiz etmek için, örnek olarak, NIEHS Superfund Araştırma Programı7'yekatılım bağlamında çevre felaketlerinde endokrin bozucu kimyasalların varlığını belirlemek için yüksek verim testlerinde kullanılan östrojen reseptör (ER) modelini seçtik. Bu deneyde, bağlı MCF-7 meme kanseri hücreleri 24 saat boyunca ER agonist 17β-estradiol (E2, 10 nM) veya araç (DMSO) ile tedavi edildi. GREB1 intronic (Atto 647N, Şekil 1'de</...

Watch this Scientific Journal Video about Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH at JoVE.com

Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Tek moleküllü RNA floresan in situ hibridizasyon (smFISH), belirli RNA'ların seviyelerini ve lokalizasyonunu tek hücre düzeyinde doğru bir şekilde ölçmek için bir yöntemdir. Burada, belirli RNA'ların tek hücreli nicelleştirilmesi için ıslak tezgah işleme, görüntüleme ve görüntü analizi için onaylanmış laboratuvar protokollerimizi rapor ediyoruz.

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Gene transcription is an essential process in cell biology, and allows cells to interpret and respond to internal and external cues. Traditional bulk ...

single-cell-analysis-transcriptionally-active-alleles-single-molecule

Research

JoVE Journal

Biochemistry

3.1K Görüntüleme.  GCC Center for Advanced Microscopy and Image Informatics. Tek moleküllü RNA floresan in situ hibridizasyon (smFISH), belirli RNA'ların seviyelerini ve lokalizasyonunu tek hücre düzeyinde doğru bir şekilde ölçmek için bir yöntemdir. Burada, belirli RNA'ların tek hücreli nicelleştirilmesi için ıslak tezgah işleme, görüntüleme ve görüntü analizi için onaylanmış laboratuvar protokollerimizi rapor ediyoruz.

Video: Single Cell Analysis Of Transcriptionally Active Alleles By Single Molecule FISH

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Genetik

Transcriptome Analysis of Single Cells

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in culture.1,2,3 In the case of the brain, regions such as the hippocampus contain a complex arrangement of different cell types, each with distinct mRNA profiles. The ability to harvest single cells allows for a more in depth investigation into the molecular differences between and within cell populations. We describe a simple and rapid method for harvesting cells for further processing. Pipettes often used in electrophysiology are utilized to isolate (using aspiration) a cell of interest and conveniently deposit it into an Eppendorf tube for further processing with any number of molecular biology techniques. Our protocol can be modified for the harvest of dendrites from cell culture or even individual cells from acute slices.
We also describe the aRNA amplification method as a major downstream application of single cell isolations. This method was developed previously by our lab as an alternative to other gene expression analysis techniques such as reverse-transcription or real-time polymerase chain reaction (PCR).4,5,6,7,8 This technique provides for linear amplification of the polyadenylated RNA beginning with only femtograms of material and resulting in microgram amounts of antisense RNA. The linearly amplified material provides a more accurate estimation than PCR exponential amplification of the relative abundance of components of the transcriptome of the isolated cell. The basic procedure consists of two rounds of amplification. Briefly, a T7 RNA polymerase promoter site is incorporated into double stranded cDNA created from the mRNA transcripts. An overnight in vitro transcription (IVT) reaction is then performed in which T7 RNA polymerase produces many antisense transcripts from the double stranded cDNA. The second round repeats this process but with some technical differences since the starting material is antisense RNA. It is standard to repeat the second round, resulting in three rounds of amplification. Often, the third round in vitro transcription reaction is performed using biotinylated nucleoside triphosphates so that the antisense RNA produced can be hybridized and detected on a microarray.7,8

In this article we describe a simple method for the harvesting of single cells from rat primary neuronal cultures and subsequent transcriptome analysis using aRNA amplification. This approach is generalizable to any cell type.

Tek Hücre Transcriptome Analizi

Many gene expression analysis techniques rely on material isolated from heterogeneous populations of cells from tissue homogenates or cells in ...

Nörobilim

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is inherently a single-cell assay, however prior to molecular analysis, the target cells are often prospectively isolated in bulk, thereby losing single-cell resolution. Single-cell gene expression analysis provides a means to understand molecular differences between individual cells in heterogeneous cell populations. In bulk cell analysis an overrepresentation of a distinct cell type results in biases and occlusions of signals from rare cells with biological importance. By utilizing FACS index sorting coupled to single-cell gene expression analysis, populations can be investigated without the loss of single-cell resolution while cells with intermediate cell surface marker expression are also captured, enabling evaluation of the relevance of continuous surface marker expression. Here, we describe an approach that combines single-cell reverse transcription quantitative PCR (RT-qPCR) and FACS index sorting to simultaneously characterize the molecular and immunophenotypic heterogeneity within cell populations.
In contrast to single-cell RNA sequencing methods, the use of qPCR with specific target amplification allows for robust measurements of low-abundance transcripts with fewer dropouts, while it is not confounded by issues related to cell-to-cell variations in read depth. Moreover, by directly index-sorting single-cells into lysis buffer this method, allows for cDNA synthesis and specific target pre-amplification to be performed in one step as well as for correlation of subsequently derived molecular signatures with cell surface marker expression. The described approach has been developed to investigate hematopoietic single-cells, but have also been used successfully on other cell types.
In conclusion, the approach described herein allows for sensitive measurement of mRNA expression for a panel of pre-selected genes with the possibility to develop protocols for subsequent prospective isolation of molecularly distinct subpopulations.

Bulk gene expression measurements cloud individual cell differences in heterogeneous cell populations. Here, we describe a protocol for how single-cell gene expression analysis and index sorting by Florescence Activated Cell Sorting (FACS) can be combined to delineate heterogeneity and immunophenotypically characterize molecularly distinct cell populations.

Bir moleküler karakterize etmek için Kombinatorik tek hücreli yaklaşım ve insan kök ve yaratıcı nüfus Immunophenotypic heterojen

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Transcriptional Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells differentiate into primary trophoblast giant cells (TGCs) while the polar trophectoderm overlying the inner cell mass continues to proliferate later differentiating into secondary TGCs. TGCs play a key role in developing placenta and are essential for a successful pregnancy. Investigation of transcriptional regulation of specific genes during post-implantation development can give insights into TGCs development. Cells of the ectoplacental cone (EPC) from embryos at 7-7.5 days of gestation (E7-7.5), derived from the polar trophectoderm, differentiate into secondary TGCs1. TGCs can be studied in situ, on cryostat sections of embryos at E7 although the number of TGCs is very low at this stage. An alternative means of analyzing secondary TGCs is to use short-term cultures of individual EPCs from E7 embryos. We propose a technique to investigate the transcriptional status of genes of interest both in vivo and in vitro at the single-cell level using fluorescent in situ hybridization (RNA FISH) to visualize nascent transcripts. This technique provides a direct readout of gene expression and enables assessment of the chromosomal status of TGCs, which are large endoreplicating cells. Indeed, a key feature of terminal differentiation of TGCs is that they exit the cell cycle and undergo multiple rounds of endoreplication.This approach can be applied to detect expression of any gene expressed from autosomes and/or sex chromosomes and can provide important information into developmental mechanisms as well as placental diseases.

Transcriptional  Analysis by Nascent RNA FISH of In Vivo Trophoblast Giant Cells or In Vitro Short-term Cultures of Ectoplacental Cone Explants

Trophoblast giant cells (TGCs) play a key role in the placenta to ensure a healthy pregnancy. We present a protocol for assessing the transcriptional status of genes in TGCs by nascent fluorescent in situ hybridization on cryostat sections of post-implantation embryos or short-term cultures of embryonic day 7 ectoplacental cones.

ve Doğan RNA FISH ile kopyalanma Analizi<em&gt; İn Vivo</em&gt; Trofoblast Dev Hücreler ya da<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ectoplacental Koni Eksplantlarından kısa vadeli Kültürler

The placenta derives from one extra-embryonic lineage, the trophectoderm. In the peri-implantation murine blastocyst, mural trophectoderm cells ...

Gelişim Biyolojisi

3D Multicolor DNA FISH Tool to Study Nuclear Architecture in Human Primary Cells

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene expression, cell identity and differentiation. Many approaches developed to study the 3D architecture of the genome can be divided into two complementary categories: chromosome conformation capture based technologies (C-technologies) and imaging. While the former is based on capturing the chromosome conformation and proximal DNA interactions in a population of fixed cells, the latter, based on DNA fluorescence in situ hybridization (FISH) on 3D-preserved nuclei, allows contemporary visualization of multiple loci at a single cell level (multicolor), examining their interactions and distribution within the nucleus (3D multicolor DNA FISH). The technique of 3D multicolor DNA FISH has a limitation of visualizing only a few predetermined loci, not permitting a comprehensive analysis of the nuclear architecture. However, given the robustness of its results, 3D multicolor DNA FISH in combination with 3D-microscopy and image reconstruction is a possible method to validate C-technology based results and to unambiguously study the position and organization of specific loci at a single cell level. Here, we propose a step by step method of 3D multicolor DNA FISH suitable for a wide range of human primary cells and discuss all the practical actions, crucial steps, notions of 3D imaging and data analysis needed to obtained a successful and informative 3D multicolor DNA FISH within different biological contexts.

3D multicolor DNA FISH represents a tool to visualize multiple genomic loci within 3D preserved nuclei, unambiguously defining their reciprocal interactions and localization within the nuclear space at a single cell level. Here, a step by step protocol is described for a wide spectrum of human primary cells.

3D Çok Renkli DNA FISH Aracı İnsan Birincil Hücrelerde Nükleer Mimari Çalışma

A major question in cell biology is genomic organization within the nuclear space and how chromatin architecture can influence processes such as gene ...

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH Detection of Locus-specific Ribosomal RNA Transcription in Drosophila melanogaster

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences that encode rRNAs, composing regions called ribosomal DNA (rDNA) loci. Many organisms' genomes contain more than one rDNA locus distributed across different chromosomes, and rRNA may be transcribed from multiple rDNA loci or only a single locus. Changes in rRNA transcription sources often indicate ribosomal distress. However, the homogeneity of rRNA obstructs distinguishing if rRNA is transcribed from multiple or a single rDNA locus. Here, we describe a method that uses single nucleotide polymorphism-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) to distinguish rRNA transcription between Drosophila melanogaster rDNA loci on the X and Y chromosomes. This method leverages locus-specific rRNA variants to enable easy detection of the source of rRNA transcription with single-cell resolution. This assay can be applied to any Drosophila cell type and may be adapted for use in other systems.

The protocol describes single nucleotide polymorphisms-sensitive fluorescence in situ hybridization (SNP-FISH) method to distinguish ribosomal RNA transcripts derived from the X or Y chromosome ribosomal DNA locus in Drosophila melanogaster.

Tek Nükleotid Polimorfizmine Duyarlı FISH Drosophila melanogaster'de Locus'a Özgü Ribozomal RNA Transkripsiyonunun Tespiti

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences ...

Drosophila'da Tek mRNA Moleküllerinin Tespiti ve Miktar Tayini

Studying Muscle Transcriptional Dynamics at Single-molecule Scales in Drosophila

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study muscle biology. The combination of both Drosophila genetics and advanced omics approaches led to the identification of key conserved molecules that regulate muscle morphogenesis and regeneration. However, the transcriptional dynamics of these molecules and the spatial distribution of their messenger RNA within the syncytia cannot be assessed by conventional methods. Here we optimized an existing single-molecule RNA fluorescence in situ hybridization (smFISH) method to enable the detection and quantification of individual mRNA molecules within adult flight muscles and their muscle stem cells. As a proof of concept, we have analyzed the mRNA expression and distribution of two evolutionary conserved transcription factors, Mef2 and Zfh1/Zeb. We show that this method can efficiently detect and quantify single mRNA molecules for both transcripts in the muscle precursor cells, adult muscles, and muscle stem cells.

Yazar Spotlight: Drosophila Kas Dokusunda mRNA Mekansal Dağılımının Araştırılması 

Drosophila is a well-established model for studying key molecules that regulate myogenesis. However, current methods are insufficient to determine mRNA transcriptional dynamics and spatial distribution within syncytia. To address this limitation, we optimized an RNA fluorescence in situ hybridization method allowing the detection and quantification of mRNAs at a single-molecule scale.

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi

Skeletal muscles are large syncytia made up of many bundled myofibers that produce forces and enable body motion. Drosophila is a classical model to study ...

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

İç Standartları FACS ve qPCR kullanma Tek hücreli Gen İfadesi Profil

Tek Hücre Transcriptome Analizi

Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Bir moleküler karakterize etmek için Kombinatorik tek hücreli yaklaşım ve insan kök ve yaratıcı nüfus Immunophenotypic heterojen

ve Doğan RNA FISH ile kopyalanma Analizi

3D Çok Renkli DNA FISH Aracı İnsan Birincil Hücrelerde Nükleer Mimari Çalışma

Tek Nükleotid Polimorfizmine Duyarlı FISH Drosophila melanogaster'de Locus'a Özgü Ribozomal RNA Transkripsiyonunun Tespiti

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi