Bu teknik, replisome antijen etiketli DNA addukt karşılaşmalarının görselleştirilmesini kolaylaştırır ve herhangi bir proteinin immünodespeksiyona uygun bir DNA yapısı veya lezyonu ile etkileşimlerine genişletilebilir. Bu yöntem, bir popülasyon yerine bireysel hücreler içindeki etkileşim frekanslarını değerlendirmek için kullanılabilir ve hücrelere zarar vermeden hücre döngüsüne bağlı etkileşimlerin yerinde görselleştirilmesine izin verir. Prosedürü gösteren, Seidman Laboratuvarı'ndan bir post-doc olan Ishani Majumdar olacak.
Deneyden önceki gün, hücre yapıştırıcı çözeltisi ile önceden işlenmiş 35 milimetrelik cam tabanlı kültür tabaklarına iki mililitre ortamda 1,5 kez 10 ila beşinci hücre tohumlayın. Ertesi gün, her bir tabaktaki süpernatantı 37 santigrat derece Beş mikromolar Dig TMP takviyeli ortamla% 50 ila% 70 oranında birleşen hücre kültürlerine değiştirin ve Dig TMP'nin dengelenmesini sağlamak için plakaları 30 dakika boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri koyun. Hücreler inkübe edilirken, bir UV kutusunu 37 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın.
Dengenin sonunda, hücreleri santimetre kare başına beş dakikalık üç joule UVA ışık dozuna maruz bırakmak için plakaları önceden ısıtılmış kutuya aktarın ve plakaları bir saat boyunca hücre kültürü inkübatörüne geri döndürmeden önce süpernatantları iki mililitre taze önceden ısıtılmış kültür ortamı ile değiştirin. İnkübasyonun sonunda, kültürleri PBS ile nazikçe yıkayın ve hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca PBS'de bir mililitre% 0.1 formaldehit ile sabitleyin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri iki kez tedavi etmeden önce, sitoplazmayı çıkarmak için tedavi başına oda sıcaklığında beş dakika boyunca RNaz ile desteklenmiş 80 mikrolitre sitoiskelet ekstraksiyon tamponu ile iki kez tedavi etmeden önce hücreleri bir kez PBS ile yıkayın.
İkinci inkübasyondan sonra, hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS'de bir mililitre% 4 formaldehit ile sabitlemeden önce hücreleri iki mililitre PBS ile üç kez yıkayın. İkinci fiksasyondan sonra, hücreleri gösterildiği gibi PBS ile üç kez yıkayın, ardından eksi 20 santigrat derecede 20 dakika boyunca bir mililitre soğuk% 100 metanol ile muamele edin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri iki mililitre PBS'de üç kez yıkayın, ardından dört santigrat derecede 80 mikrolitre beş milimolar Triton X-100'de 10 dakikalık bir inkübasyon yapın.
İnkübasyonun sonunda, hücrelere PBS'de 100 mikrolitre beş milimolar EDTA ile muamele edin, 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca mililitre başına 100 miligram RNaz A'nın bir mikrolitresi ile desteklenmiştir. Kuluçka işleminin sonunda, hücreleri PBS'de üç kez yıkayın, ardından PBS'de% 5 sığır serum albümininde ve% 10 eşek serumunda PBS'de dört santigrat derecede nemli bir odada saklayın. Bir yakınlık ligasyonu testi yapmak için, her plakanın merkezine 40 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ekleyin ve plakaları nemli odada bir saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
İnkübasyonun sonunda, hücre kültürü inkübatöründe bir saatlik inkübasyon için her bir yemeğe 40 mikrolitre taze hazırlanmış PLA prob çözeltisi eklemeden önce hücreleri iki mililitre PBST ile üç kez yıkayın. İnkübasyonun sonunda, hücreleri oda sıcaklığında eğilebilir bir platformda iki mililitre tampon A içinde üç adet 10 dakikalık yıkama ile yıkayın. Son yıkamadan sonra, 37 santigrat derecede 30 dakikalık bir inkübasyon için her plakaya 40 mikrolitre taze hazırlanmış ligasyon karışımı ekleyin, ardından eğimli platformda tampon A'da üç adet iki dakikalık yıkama yapın.
Son yıkamadan sonra, nemli bir odada 37 santigrat derecede 100 dakikalık bir inkübasyon için her plakaya 40 mikrolitre taze hazırlanmış amplifikasyon çözeltisi ekleyin. İnkübasyonun sonunda, hücreleri altı kez taze tampon B ile yıkayın ve her yıkama için 10 dakika boyunca devirme platformunda yıkayın. Son tampon B yıkamasından sonra, nemli odada uygun ikincil antikorlarla etiketlemeden önce hücreleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca 0.01x tampon B ile bir kez yıkayın ve 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca yıkayın.
İnkübasyonun sonunda, numuneleri DAPI ile desteklenmiş montaj ortamına monte etmeden önce PBST'de bir eğimli platformda oda sıcaklığında üç adet 10 dakikalık yıkama ile yıkayın. Montajdan sonraki dört gün içinde, hem deneysel hem de kontrol numuneleri için aynı pozlama ayarlarını kullanarak, bir epifloresan veya konfokal mikroskopta numune başına en az 100 gözlem veya durum hücrelerini görüntüleyin. Dig etiketi, çekirdek boyunca interstrand çapraz bağlantılarının varlığını ortaya çıkarmak için immünofloresan ile görselleştirilebilir.
Yanıtlayıcıların interstrand çapraz bağları ile etkileşimini görselleştirmek için, interstrand çapraz bağlantı girişinden bir saat sonra, MCM5 ve Dig etiketinin ilişki sıklığını görselleştirmek için PLA uygulanabilir. Replikasyon gerilimi ATR kinazını aktive ettiğinden, pMCM iki serin 108 ve Dig etiketi arasındaki PLA da pozitiftir. Tek tek çekirdeklerden elde edilen PLA sonuçları, çekirdek boyunca replisome interstrand çapraz bağlantı karşılaşmalarının görselleştirilmesine izin veren üç boyutlu bir rekonstrüksiyonda sunulabilir.
Replikasyon Çatalı analizi, interstrand çapraz bağlantı karşılaşmalarının, GINS kompleksinin proteinleri interstrand çapraz bağları ile PLA sinyali gösteremediğinden, beklenmedik bir replikasyon yeniden başlatma fenomeni gösterdiğini göstermektedir. Buna karşılık, CD 45 ile yapılan tahlil pozitiftir, bu da diğer kilitleme proteininin korunduğunu gösterir. Hücreler bir ATR inhibitörü ile inkübe edildiğinde, yeniden başlatma tamamen bastırılır ve GINS Dig PLA'ları güçlü bir şekilde pozitiftir.
CSK + R tedavisi, arka plan sinyalini azaltmak için gereklidir. Plakaları bir hücre yapıştırıcısı ile kapladığınızdan ve% 0.1 FA ile önek eklediğinizden emin olun, aksi takdirde hücreler plakayı soyacaktır.
