Bu çalışma, Teksas Kanser Araştırma Önleme ve Araştırma Enstitüsü [RR150076], Ulusal Bilim Vakfı [1751174]; Ulusal Sağlık Enstitüleri [NS-111236], Welch Vakfı [1-1923-20170325]; Lupe Murchison Vakfı, Ted Nash Uzun Yaşam Vakfı ve Akrabalık Vakfı (Searle Scholars Programı) K.K.F.

1. Memeli hücrelerinin kültürü ve kriyoproteksiyon
<ol><li>Kültür ve hasat memeli hücreleri<ol>
<li>Donmuş insan embriyonik böbrek hücrelerinin bir aliquot'unun çözülmesi (HEK 293).</li>
		<li>Büyüme ortamlarında Kültür HEK 293 hücreleri (örneğin, %10 fetal sığır serumu ve %1 Pen-Strep ile DMEM) 37 °C'de iki ila üç pasaj(7-10 gün) boyunca 100 mm plakalarda %5 CO 2 ile.</li>
		<li>Hücreler% 90-95 izdiah elde edene kadar hücreleri ve kültürü 150 mm'lik bir plakada bölün. NOT: 3,2 mm çapında iki safir rotorun doldurulması için %90 > 150 mm'lik bir plaka yeterli olacaktır.</li>
		<li>4 mL tripsin (bkz. Malzeme Tablosu)ve 10 mL ortam kullanarak hücreleri hasat edin. Süspansiyonu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 673 x g (1000 rpm) sıcaklıkta steril 15 mL konik ve santrifüje aktarın. Üsttekini çıkarın.</li>
		<li>Hücre peletini fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın (pH 7.4, −CaCl2, −MgCl2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücrelerin kriyoproteksiyon<ol>
<li>Bir mikrosantrifüj tüpünde 50 μL hücre pelet toplayın. Ayrı bir tüpte 50 μL PBS ve 18 μL gliserol karışımı hazırlayın.</li>
		<li>Gliserol-PBS karışımını peletin üstüne ekleyerek ve küme kalmayana kadar tüpün kenarına hafifçe dokunarak peleti yeniden oluşturarak 50 μL hücre peletini 68 μL gliserol-PBS karışımı ile hafifçe karıştırın. NOT: Hücreyi yeniden canlandırmak için nazik pipetleme de kullanılabilir, ancak hücresel bütünlüğün tehlikeye atılmamasını sağlamak için.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. NMR rotorunda memeli hücrelerinin kriyoprezervasyonu
<ol><li>Hücrelerin 3,2 mm safir rotora aktarılması.<ol>
<li>Huni yapmak için 200 μL pipet ucu kesin ve kesilmiş pipet ucunun dar ucunu 3,2 mm rotoraya yerleştirin.</li>
		<li>Hücreleri rotorda oturan huniye aktarın. Rotorun huni ile birlikte bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve hücreleri oda sıcaklığında 2-3 dakika boyunca 673 x g'da santrifüjleme ile rotorun dibine peletin.</li>
		<li>Süpernatant ve fazla numuneyi rotordan çıkarın. Rotor hücrelerle tamamen dolu olana kadar bu iki adımı tekrarlayın. NOT: İsteğe bağlı olarak, donmadan önce numunenin hücresel canlılığını belirleyin. 100 μL FBS içermeyen DMEM'de fazla hücre peletinin 10 μL'sini yeniden boşaltın. Süspansiyonun 10 μL'sini % 0,4 trypan mavi çözelti ile karıştırın ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak canlılığı hemen değerlendirin. Serum trippan mavisi boyamaya müdahale ettiği için hücreleri seyreltmek için sadece FBS ücretsiz medya kullanın.</li>
		<li>Rotoru piyasada bulunan paketleme aletini kullanarak silikon bir fişle kapatın.</li>
		<li>Rotorunu dikey olarak aşağı doğru bastırarak seramik tahrik ucuyla kapatın. Tahrik ucunun yan tarafındaki hassas yüzgeçlere dokunmaktan kaçının.</li>
		<li>Rotorun alt kenarının yarısını gümüş kalıcı bir işaretleyici ile, diğer yarısını da rotorun alt kenarının diğer yarısını siyah kalıcı bir işaretleyici ile işaretleyin, böylece rotorun spektrometrenin içindeki dönmesinin doğru bir şekilde izlenmesini sağlar. NOT: Rotorun işaretlenmesindeki kusurlar, eğirme frekansının doğru sayımını önleyecek ve kararlı eğirme elde edilmemesine neden olacaktır. İşaretleyiciler donmuş bir rotoraya yazmayacağından ve rotor ısınması numune bütünlüğünü tehlikeye attığından, rotoru donmadan önce işaretlemek kritik bir adımdır.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3,2 mm safir rotor içindeki hücrelerin kriyoprezervasyonu.<ol>
<li>Kapağın altına ve kriyojenik şişenin altına bir parça mendil veya kağıt havlu ile yapılmış bir yastık yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu). NOT: Kağıt mendil, rotor işaretini kriyojenik şişelerin yanlarına çarparak oluşan hasarlardan korur.</li>
		<li>3,2 mm safir rotorunu, kriyojenik şişenin altına bakan ucu işaretli kağıt mendille yastıklanmış kriyojenik şişeye yerleştirin.</li>
		<li>Kriyojenik şişeyi kontrollü hız (-1 °C/dk) soğutma kabına yerleştirerek rotoru yavaşça dondurun ve kabı en az 3 saat boyunca -80 °C dondurucuya yerleştirin.</li>
		<li>Donmuş rotoru içeren kriyojenik şişeyi sıvı azot depolamaya aktarın.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Donmuş bir numunenin NMR spektrometresine kriyojenik transferi
<ol><li>Donmuş numuneyi NMR tesisine taşıyın.<ol>
<li>Donmuş rotoru içeren kriyojenik şişeyi NMR tesisine taşınmak üzere sıvı nitrojenle dolu küçük bir dewar'a aktarın.</li>
	</ol></li>
	<li>Donmuş rotorun sıvı nitrojen banyosuna aktarılması.<ol>
<li>Kuru, termal yalıtımlı geniş ağız köpük dewar'ı 500 mL – 1 L sıvı azotla doldurun.</li>
		<li>Rotoru kriyojenik şişeden sıvı nitrojenle dolu geniş ağız köpük dewar'a aktarın.<ol>
<li>Kriyojenik şişeyi eldeki transfer dewar'ından alın ve atmosferden korumak için sıvı nitrojenin yüzeyinin hemen üzerinde tutun.</li>
			<li>Kriyojenik şişeyi ağzı hafifçe aşağı bakacak şekilde tutarken, kapağı sökün ve rotorun sıvı azot banyosuna kaymasına izin verin. NOT: Kapak söküldükten sonra, kondenslerin rotorda toplanmasını önlemek için rotor kriyojenik şişeden sıvı azot banyosuna hızlı bir şekilde (1 saniyenin altında) düşmelidir. Sıvı nitrojenin buharlaşması, geniş ağız köpüğünde bir "azot bulutu" oluşturur ve sıvı nitrojene batırılmadan önce rotorda yoğuşmayı önler. Rotorun havaya daha uzun süre maruz kalması, rotor duvarlarındaki nemin yoğunlaşmasına neden olabilir ve bu da yeniden yoğunlaşarak buza dönüşebilir.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Rotorun NMR örnek yakalayıcıya kriyojenik transferi.<ol>
<li>Prechill, sıvı nitrojen banyosuna batırarak 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü. Tüpü kapatmayın. NOT: Mikrosantrifüj tüpüne transfer etmeden önce rotorun incelensin. Cımbız kullanarak, rotoru sıvı nitrojenin yüzeyinin hemen altında tutun ve rotor işaretlerinin sağlam olup olmadığını, duvarlarında buz birikintisi oluşmadığını ve tahrik ucunun sağlam olup olmadığını kontrol edin. Rotor duvarlarındaki buz kristali birikintileri beyaz toz olarak görünür. Rotoru her zaman tahrik ucuyla değil, gövdesinden tutmaya dikkat edin. Rotordaki işareti cımbız uçlarıyla çizmeyin.</li>
		<li>Sıvı azot banyosunun yüzeyinin altında, rotoru mikrosantrifüj tüpünün altına bakan tahrik ucu ve tüpün açılmasına bakan işaretler ile mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için cımbız kullanın. NOT: Sıvı nitrojene batırmadan veya rotora dokunmadan önce her zaman cımbız kurulayın.</li>
		<li>Cımbız kullanarak, rotoru içeren tüpü boynundan sıvı nitrojen altında tutun.</li>
		<li>Elinizde ikinci bir çift cımbızla, NMR numune tutucusunu sıvı azot banyosuna batırmaya ve mikrosantrifüj tüpüne göre akut bir açıyla eğimli olacak şekilde tutmaya hazır olun. NOT: O-ringin donmasını önlemek için numune tutucunun sıvı nitrojenle temas ettiği süreyi en aza indirin. O-ring donarsa, yakalayıcıyı spektrometreye yerleştirmek çok zor olacaktır.</li>
	</ol></li>
	<li>NMR numune tutucudan NMR spektrometresine kriyojenik rotor transferi NOT: Bu adım, biri kriyosbiyeni çalıştırmak ve biri sıvı nitrojenden prob içine numuneyi aktarmak için iki kişi gerektirir.<ol>
<li>Kabin üzerinde 'EJECT' tuşuna basarak kriyobineti çıkarma moduna yerleştirin. NOT: Fırlatma modu, atmosferik nemin girişini önlemek için probdan atmosfere yüksek basınçta kuru ve soğuk azot gazı akışını temizler.</li>
		<li>Rotorun NMR örnek yakalayıcıya aktarılması.<ol>
<li>NMR numune tutucunun açık ucunun açık ucunun sıvı nitrojenin yüzeyinin altındayken mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilmesi.</li>
			<li>Rotorun numune tutucuya düşmesini sağlamak için hem mikrosantrifüj tüpünü hem de NMR numune tutucuyu kaldırın. Rotorun numune tutucunun kenarına sıkışması durumunda NMR numune tutucuyu ve mikrosantrifüj tüpünü sallayın.</li>
			<li>Rotorun havadan korunması için boş mikrosantrifüj tüpünü NMR numune tutucusunun üzerine bırakın.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Diğer boş NMR numune tutucuyu probundan çıkarın ve yere yatırın.</li>
		<li>Rotor içeren NMR numune tutucuyu serbest elinize aktarın, mikrosantrifüj tüpünü çıkarın ve hemen prob içine yerleştirin. NOT: O-ring donarsa, numune tutucuyu sıkmak zor olacaktır. Yerine kayana kadar kuvvet uygulamaya devam edin.</li>
		<li>Kriyobinet'i işleten kişiye 'EJECT'i DURDUR' ve 'INSERT' için sinyal ver. NOT: Ekleme modu rotorun numune yakalayıcıdan probun içine yönlendirir.</li>
		<li>Kriyobinet tarafından kontrol edilen rulman ve sürüş akış basıncını ayarlayarak numuneyi istediğiniz eğirme hızına (örneğin, 12 kHz) döndürün. (örneğin, rulman gazını derhal ~200 mBar'a ve tahrik gazını 10 mBar'a çıkarın. Numune döndükten sonra rulman gazını 1000 mBar'a çıkarın ve gazı 200 mBar'a sürün. İplik stabilize oldukça, rulmanı 2400 mBar'a çıkarın ve ardından tahrik gazını birkaç dakika içinde 200 mBar'dan 1700 mBar'a çıkarın. VT soğutma gazı ~1070 L/h'de sabittir.) NOT: Mikrosantrifüj tüpünü ve NMR numune tutucuyu sıvı nitrojen banyosundan çıkarırken, mikrosantrifüj tüpünün rotoru çevrelemesi için yeterli sıvı nitrojen olduğundan emin olun. Rotorun NMR numune yakalayıcıya aktarılması ile NMR numune tutucusuna spektrometreye yerleştirilmesi arasındaki süreyi en aza indirin. 3.4'teki tüm adımlar 30 s içinde tamamlanmalıdır.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Numunenin NMR spektrometresinden kriyojenik olarak çıkarılması
<ol><li>Sıvı azot banyosu ve kriyojenik şişenin hazırlanması<ol>
<li>Geniş ağız köpüğü dewar içine 500 mL - 1 L sıvı azot dökün ve banyoyu spektrometrenin altına yerleştirin.</li>
		<li>Kriyojenik şişeyi önceden soğutun. Sıvı nitrojen banyosuna bir parça kağıt içeren boş kriyojenik şişeyi batırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rotorun probdan kriyojenik şişeye kriyojenik transferi<ol>
<li>Sürüş ve rulman gazı akışını azaltarak eğirme hızını 0 kHz'e düşürün ve fırlatma moduna geçerek rotordan dışarı çiyin.</li>
		<li>Fırlatma modunu açık tutun, numune tutucuyu probdan çıkarın, rotoru doğrudan sıvı nitrojen içeren geniş ağız köpük dewar'a bırakın.</li>
		<li>Önceden soğutulmuş cımbız kullanarak rotoru sıvı nitrojen yüzeyinin altındaki önceden soğutulmuş kriyojenik şişeye aktarın.</li>
		<li>Kriyojenik şişeyi kapla. Kriyojenik şişe kapağını sıvı nitrojene batırarak ön kontrol edin. Rotor ve sıvı nitrojen içeren kriyojenik şişeyi banyodan çıkarın ve tüpü önli benlikli kapakla kaplayın. Buharlaştırıcı nitrojenin güvenli bir şekilde salınabilmesi için kapağı sıkmayın.</li>
		<li>Kriyojenik şişeyi sıvı nitrojene yeniden batırın. Numune daha uzun süreli sıvı azot depolamaya aktarılabilir veya daha fazla analiz için hemen açılabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Rotor ve canlılık ölçümlerinin açılması
<ol><li>Rotorların açılması ve canlılığın ölçülmesi<ol>
<li>Önceden ısınan serumsuz ortam (DMEM) veya PBS ila 37 °C.</li>
		<li>Rotoru sıvı nitrojenden çıkarın. Sürücü ucunu ve silikon fişi çıkarın. NOT: Safir mükemmel bir ısı iletkenidir. Rotora parmaklarınızla dokunmaktan kaçının, çünkü ısı transferi hücresel canlılığı tehlikeye atan yerel donma-çözülme olaylarına neden olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Canlılığı ölçme<ol>
<li>Rotordaki donmuş hücre peletine 20 μL sıcak ortam ekleyin ve hücreleri yeniden depolayın. Süspansiyonu pipetle çıkarın ve süspansiyonu 100 μL ortamla karıştırın.</li>
		<li>10 μL hücre süspansiyonu çıkarın ve % 0,4 trippan mavi çözeltisi (v / v) eşit hacimde karıştırın. Oda sıcaklığında 30 s ila 1 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Otomatik hücre sayacı kullanarak canlılığı ölçün.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Costello, W. N., Xiao, Y., Frederick, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNP-Assisted+NMR+Investigation+of+Proteins+at+Endogenous+Levels+in+Cellular+Milieu.">DNP-Assisted NMR Investigation of Proteins at Endogenous Levels in Cellular Milieu.</a> Methods Enzymology. 615 (1), 373-406 (2019).</li><li>Hall, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization-Enhanced+NMR+Spectroscopy+of+Biomolecules+in+Frozen+Solution.">Polarization-Enhanced NMR Spectroscopy of Biomolecules in Frozen Solution.</a> Science. 276 (5314), 930-932 (1997).</li><li>Akbey, &. #. 2. 2. 0. ;., Oschkinat, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+applications+of+solid+state+MAS+DNP+NMR.">Structural biology applications of solid state MAS DNP NMR.</a> Journal of Magnetic Resonance. 269 (1), 213-224 (2016).</li><li>Matsuki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helium-cooling+and+-spinning+dynamic+nuclear+polarization+for+sensitivity-enhanced+solid-state+NMR+at+14T+and+30K.">Helium-cooling and -spinning dynamic nuclear polarization for sensitivity-enhanced solid-state NMR at 14T and 30K.</a> Journal of Magnetic Resonance. 225 (1), 1-9 (2012).</li><li>Miyamoto, Y., Ikeuchi, M., Noguchi, H., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+Cryopreservation+of+Human+and+other+Mammalian+Cells+at+-80+&#176;C+for+8+Years.">Long-term Cryopreservation of Human and other Mammalian Cells at -80 &#176;C for 8 Years.</a> Cell Medicine. 10 (1), 1-7 (2018).</li><li>Lopez del Amo, J. M., Schneider, D., Loquet, A., Lange, A., Reif, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryogenic+solid+state+NMR+studies+of+fibrils+of+the+Alzheimer's+disease+amyloid-&#946;+peptide:+perspectives+for+DNP.">Cryogenic solid state NMR studies of fibrils of the Alzheimer's disease amyloid-&#946; peptide: perspectives for DNP.</a> Journal of Biomolecular NMR. 56 (4), 359-363 (2013).</li><li>Gupta, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+nuclear+polarization+enhanced+MAS+NMR+spectroscopy+for+structural+analysis+of+HIV-1+protein+assemblies.">Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies.</a> The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).</li><li>Lim, B. J., Ackermann, B. E., Debelouchina, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targetable+Tetrazine-Based+Dynamic+Nuclear+Polarization+Agents+for+Biological+Systems.">Targetable Tetrazine-Based Dynamic Nuclear Polarization Agents for Biological Systems.</a> ChemBioChem. 21 (9), 1315-1319 (2020).</li><li>Jaudzems, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+nuclear+polarization-enhanced+biomolecular+NMR+spectroscopy+at+high+magnetic+field+with+fast+magic-angle+spinning.">Dynamic nuclear polarization-enhanced biomolecular NMR spectroscopy at high magnetic field with fast magic-angle spinning.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (25), 7458-7462 (2018).</li><li>Chaytor, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibiting+ice+recrystallization+and+optimization+of+cell+viability+after+cryopreservation.">Inhibiting ice recrystallization and optimization of cell viability after cryopreservation.</a> Glycobiology. 22 (1), 123-133 (2012).</li><li>Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+water+loss+from+cells+at+subzero+temperatures+and+the+likelihood+of+intracellular+freezing.">Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing.</a> The Journal of General Physiology. 47 (2), 347-369 (1963).</li><li>Lovelock, J. E., Bishop, M. W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+of+Freezing+Damage+to+Living+Cells+by+Dimethyl+Sulphoxide.">Prevention of Freezing Damage to Living Cells by Dimethyl Sulphoxide.</a> Nature. 183 (4672), 1394-1395 (1959).</li><li>Bald, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relative+merits+of+various+cooling+methods.">The relative merits of various cooling methods.</a> Journal of Microscopy. 140 (1), 17-40 (1985).</li><li>Akiyama, Y., Shinose, M., Watanabe, H., Yamada, S., Kanda, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoprotectant-free+cryopreservation+of+mammalian+cells+by+superflash+freezing.">Cryoprotectant-free cryopreservation of mammalian cells by superflash freezing.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7738-7743 (2019).</li><li>Shi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+non-contact+vitrification+of+cell-laden+droplets+based+on+cell+printing.">High-throughput non-contact vitrification of cell-laden droplets based on cell printing.</a> Scientific Reports. 5 (1), 17928 (2015).</li><li>Pegg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cryopreservation.">Principles of cryopreservation.</a> Methods in Molecular Biology. 1257, 3-19 (2015).</li><li>Ramilo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+the+covalent+intermediate+of+UDP-N-acetylglucosamine+enolpyruvyl+transferase+by+solution-state+and+time-resolved+solid-state+NMR+spectroscopy.">Detection of the covalent intermediate of UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase by solution-state and time-resolved solid-state NMR spectroscopy.</a> Biochemistry. 33 (50), 15071-15079 (1994).</li><li>Jeon, J., Thurber, K. R., Ghirlando, R., Yau, W. M., Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+millisecond+time-resolved+solid+state+NMR+to+the+kinetics+and+mechanism+of+melittin+self-assembly.">Application of millisecond time-resolved solid state NMR to the kinetics and mechanism of melittin self-assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16717 (2019).</li><li>Pievo, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+freeze-quench+setup+for+multi-frequency+EPR+spectroscopy+of+enzymatic+reactions.">A rapid freeze-quench setup for multi-frequency EPR spectroscopy of enzymatic reactions.</a> Chemphyschem. 14 (18), 4094-4101 (2013).</li><li>Cherepanov, A. V., de Vries, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microsecond+freeze-hyperquenching:+development+of+a+new+ultrafast+micro-mixing+and+sampling+technology+and+application+to+enzyme+catalysis.">Microsecond freeze-hyperquenching: development of a new ultrafast micro-mixing and sampling technology and application to enzyme catalysis.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1656 (1), 1-31 (2004).</li><li>Hu, K. N., Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+can+solid+state+NMR+contribute+to+our+understanding+of+protein+folding.">What can solid state NMR contribute to our understanding of protein folding.</a> Biophysical Chemistry. 151 (1), 10-21 (2010).</li><li>Hu, K. N., Yau, W. M., Tycko, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+a+transient+intermediate+in+a+rapid+protein+folding+process+by+solid-state+nuclear+magnetic+resonance.">Detection of a transient intermediate in a rapid protein folding process by solid-state nuclear magnetic resonance.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (1), 24-25 (2010).</li><li>Johnson, S., Nguyen, V., Coder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+cell+viability.">Assessment of cell viability.</a> Current Protocols in Cytometry. 64 (1), 1-26 (2013).</li><li>Frederick, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitivity-enhanced+NMR+reveals+alterations+in+protein+structure+by+cellular+milieus.">Sensitivity-enhanced NMR reveals alterations in protein structure by cellular milieus.</a> Cell. 163 (3), 620-628 (2015).</li><li>Van Der Cruijsen, E. A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomolecular+DNP-supported+NMR+spectroscopy+using+Site-directed+spin+labeling.">Biomolecular DNP-supported NMR spectroscopy using Site-directed spin labeling.</a> Chemistry. 21 (37), 12971-12977 (2015).</li><li>Schlagnitweit, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observing+an+antisense+drug+complex+in+intact+human+cells+by+in-cell+NMR+spectroscopy.">Observing an antisense drug complex in intact human cells by in-cell NMR spectroscopy.</a> ChemBioChem. 20 (19), 2474-2478 (2019).</li><li>Debelouchina, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+nuclear+polarization-enhanced+solid-state+NMR+spectroscopy+of+GNNQQNY+nanocrystals+and+amyloid+fibrils.">Dynamic nuclear polarization-enhanced solid-state NMR spectroscopy of GNNQQNY nanocrystals and amyloid fibrils.</a> Physical Chemistry Chemical Physics : PCCP. 12 (22), 5911-5919 (2010).</li><li>Schmidt, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submillisecond+freezing+permits+cryoprotectant-free+EPR+doubled+electron-electron+resonance+spectroscopy.">Submillisecond freezing permits cryoprotectant-free EPR doubled electron-electron resonance spectroscopy.</a> ChemPhysChem. 21, 1224-1229 (2020).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Donmuş numunelerin bir NMR spektrometresine kriyojenik transferi, NMR veri toplama yoluyla donmuş memeli hücrelerinin canlılığını korumada başarılıdır. Bu metodolojinin başarısı MAS NMR öncesi ve sonrası canlılık ölçümlerinde gösterilmiştir. Bu yaklaşım, sıcaklık dalgalanmalarının numune bütünlüğünü tehlikeye atabileceği herhangi bir sistem için başarılı ve genelleştirilebilir. Şu anda sunulan protokol HEK 293 hücre hattı ile gerçekleştirilir. Birçok memeli hücre hattı için kriyoprezervasyon koşulları çok benzer olduğundan, burada bildirilen koşulların diğer hücresel sistemlere çevrilebilir olması muhtemeldir; ancak, aynı sonuçları elde etmek için kriyoprotektanların, numune hacimlerinin ve donma oranlarının daha fazla optimizasyonu gerekebilir.
Bu metodoloji, rotorun NMR sonrası daha hızlı bir şekilde açılmasıyla geliştirilebilir. Bu adım şu anda alt optimal ve yürütülmesi hücrelerin uygulanabilirliğini etkiler. Hücrelerin ortama yeniden kullanılabilmesi için önce tahrik ucu ve silikon fişin rotordan çıkarılması gerekir. Tahrik ucunun çıkarılması sırasında rotor tutulduğunda numune düzensiz bir şekilde çözülür ve silikon fiş çok daha kısa rotor kullanım süreleri daha yüksek canlılıklara neden olur. Rotor tutucuların veya diğer aletlerin geliştirilmesi, tahrik ucunun ve silikon fişin düzgün çözülmesini ve hızlı bir şekilde çıkarılmasını kolaylaştırmak için NMR sonrası canlılık değerlendirmesini daha doğru hale getirmeye yardımcı olacaktır.
Bu makalede açıklanan kriyojenik numune yükleme yaklaşımı, NMR mıknatısının deliğinde bulunan prob ile numune ekleme ve çıkarmayı destekleyen NMR probları ile sınırlıdır. Harici numune ekleme ve çıkarma ticari DNP sistemleri için standart olsa da, özel problar her zaman bu seçeneğe sahip değildir. Ayrıca, kriyojenik numune yüklemeye yönelik bu yaklaşım, farklı boyutlu rotorlarla uyumlu olacak şekilde oluşturulmuş NMR probları için bazı değişiklikler gerektirebilir. Bu protokol 3,2 mm rotorlar için optimize edilmiştir ve numune tutucunun dış çapı bir mikrosantrifüj tüpünün iç çapını aşarsa (örneğin, adım 3.4.2) değişiklik gerektirebilir.
DNP'nin MAS NMR'ye uygulanmasıyla, endojen fizyolojik konsantrasyonlarda proteinleri ve diğer biyomolekülleri tespit etmek artık mümkündür24,25,26. Bu, biyomolekülleri kendi ortamlarında inceleme olasılığını açar. Deney boyunca hücresel bütünlüğün ve canlılığın korunması, spektroskopinin deneysel sonuçlarını biyolojik olaylara bağlamada kritik öneme sahip olacaktır. Saflaştırılmış proteinler veya hücresellyatlar içeren numunelerin kontrolsüz dondurulması tipik olarak numune kalitesinden ödün vermez7,27, ancak saflaştırılmış sistemlerde bile donma oranının önemli bir değişken olabileceğine dair bazı göstergeler vardır28. Bununla birlikte, hücresel sağlamlığı ve canlılığı korumak yorum için önemliyse, memeli hücrelerinin örneklerinin kontrollü bir hızda dondurulması gerekir. Burada, memeli hücrelerinin donmuş örneklerinin dondurulması ve önceden soğutulmuş bir DNP MAS NMR cihazına aktarılması için potansiyel olarak zarar verici sıcaklık dalgalanmalarını önleyen ve uygulanabilir hücreler üzerinde ölçümü destekleyen bir protokol sunuyoruz.

Sihirli açı dönen nükleer manyetik rezonans spektroskopisi için dinamik nükleer polarizasyonun tanıtılması MAS NMR'nin hassasiyetini çeşitli büyüklük sıralarıyla artırabilir. Bu, biyomoleküllerin fizyolojik konsantrasyonlarında veya yakınında tespitini sağlamıştır. DNP, karmaşık biyolojik ortamda endojen (~1 μM) konsantrasyonlarda izotopik olarak etiketlenmiş bir proteini tespit etmek için gereken hassasiyeti sağlayabilir ve sağlar1. İzotopik olarak etiketlenmiş molekülleri canlılıklarını etkilemeden etiketlenmemiş memeli hücrelerine tanıtmak için iyi kurulmuş protokoller olduğundan, bu, izotopik olarak zenginleştirilmiş biyomolekülleri kendi doğal ortamlarında endojen seviyelerinde inceleme imkanını açar. Ayrıca, DNP geliştirmeleri daha düşük sıcaklıklarda daha verimli olduğundan2,3,4, DNP MAS NMR için deneysel sıcaklıklar, canlı memeli hücrelerinin uzun süreli depolanması için gerekli olanlarla düzgün bir şekilde hizalanır5. Bununla birlikte, bir numuneyi DNP MAS NMR spektrometresine aktarmanın geleneksel yöntemi, onu memeli hücrelerini yırtan sıcaklık dalgalanma oranlarına maruz bırakmaz.
MAS NMR deneyleri, örneğin sıfıra ortalaması için anisotropik etkileşimin büyüklüğüne eşit veya daha büyük frekanslarda sihirli açı hakkında döndürülmesi gerekir, genellikle en az 4 kHz ve genellikle çok daha yüksek6,7,8,9. Bu nedenle, numuneler, rotorun dönüşünü bir gaz akışıyla yönlendirmek için kullanılan ve diğer ucunda bir işarete sahip olan kanatlı bir ucu olan rotorlara paketlenmiştir, böylece dönüş frekansı bir takometre ile izlenebilir. Çoğu MAS NMR cihazı için numune transferi, rotorun cihazın dış kısmından NMR probunun sonundaki statora kuru hava veya azot gazı akışı ile enjekte ederek gerçekleştirilir. Rotor, rotoru sihirli açıda tutan statora ulaştıktan sonra, numune dönüşü bir hava türbini mekanizması tarafından tahrik edilir. Ayrı gaz akışları rotorun sıcaklığını destekler, iter ve kontrol eder. NMR spektrometresine bir rotor takmak ve kararlı MAS eğirme elde etmek, ince işlenmiş tahrik uçları ve ayrı gaz akışlarının sıcaklığının ve basıncının sıkı kontrolünü gerektirir. Bu teknik taleplere rağmen, oda sıcaklığı uygulamaları için ticari MAS NMR probları için kararlı MAS ekleme ve elde etme büyük ölçüde otomatikleştirilmiştir.
Ancak, düşük sıcaklık uygulamaları için durum daha karmaşıktır. Düşük sıcaklık uygulamaları için numuneler tipik olarak oda sıcaklığında spektrometreye yerleştirilir ve statorda dondurulur. İlk dakikada, numune sıcaklığı hızla azalır (> −100 °C/dk) ve sistem sıcaklığının dengeye girmesi birkaç dakika sürer. Sıcaklık ve basıncın etkileşimi nedeniyle, istenen MAS'ın yerleştirilmesi ve yaklaşması genellikle düşük sıcaklık uygulamaları için manuel olarak ele alınır. Manuel müdahale gereksinimine rağmen, rotorun cihazın içinde dondurulması faydalıdır, çünkü başarılı eğirme için kritik olan prob içine su ve yoğuşma girişini en aza indirir. Sadece ortam nem bloğu gaz hatlarından yoğuşma ve buz birikmesi, rotorun kendisi üzerindeki yoğuşma veya don MAS'ı mekanik olarak önleyebilir. Bu nedenle, düşük sıcaklık MAS NMR örnekleri genellikle cihazın içinde -100 °C/dk'yi aşan oranlarda dondurulur.
Memeli hücreleri, soğutma 5 , 10 ,11,12,1°C / dak'tan eşit veya daha yavaş bir hızda yavaşsa, donma-çözülme döngüsü ile bütünlüklerini koruyabilirler. Alternatif olarak, soğutma hızı ultra hızlıysa hücreler de bütünlüğünü korur13,14,15 ,104 °C/dak'tan daha hızlı bir hızda. Bu iki uç noktaya orta oranlar, kriyoprotektif ajanların varlığında bile, hücrelerin içinde ve dışında buz kristali oluşumu nedeniyle memeli hücrelerini yırtıyor ve öldürüyor16. Önceden soğutulmuş bir probun içindeki bir oda sıcaklığı rotorunun numune soğutma oranları bu iki uç nokta arasına düşer, böylece kriyogenik olarak korunmuş bozulmamış canlı memeli hücrelerini incelemek için, numuneler cihaza aktarılmadan önce dondurulmalı ve rotordaki don örneğine veya birikmesine zarar verebilecek sıcaklık dalgalanmaları olmadan cihaza aktarılmalıdır. Protokol, kriyojenik bir MAS NMR sistemine donmayan, önceden soğutulmuş rotor yerleştirme için kriyogenik olarak korunmuş bozulmamış canlı memeli hücre örneklerinin incelenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan kriyojenik örnek transferi, canlı sağlam hücrelerin NMR karakterizasyonu için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, sıcaklık dalgalanmalarının numune bütünlüğünü tehlikeye atabileceği herhangi bir sistem için geçerlidir. Bu, sıkışmış reaksiyon ara maddelerinin kimyasal ve yapısal karakterizasyonu için dondurulan söndürülen reaksiyonlar17 , 18,enzymoloji19,20 veya protein katlama21,22gibi çeşitli karmaşık sistemleri içerir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm cell culture dish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>157150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm sapphire rotor</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45 &#176; angled forceps</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMUPol</td>
			<td>Cortecnet</td>
			<td>C010P005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black and Silver marker</td>
			<td>Sharpie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap removing tool</td>
			<td>Bruker ?</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic cap</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell</td>
			<td>Corning/ Biocision</td>
			<td>UX-04392-00 (Corning) / BCS-405 (Bioscion)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogen tubes</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>03-337-7Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d8-glycerol</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide, 99.8 % atom D</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>756822-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNP NMR system with 1.7 T cryogen free gyrotron</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam dewar</td>
			<td>Spearlab</td>
			<td>FD-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Packaging tool</td>
			<td>Bruker ?</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powdered PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRRV0780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protonated PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon plug</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Vessel forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryp-L</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryogenic sample loading into a magic angle spinning nuclear magnetic resonance spectrometer that preserves cellular viability

Dinamik nükleer polarizasyon (DNP), sihirli açı eğirme (MAS) nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisinin hassasiyetini önemli ölçüde artırabilir. Sıcaklıklar azaldıkça bu hassasiyet artar ve çoğu ticari DNP donanımlı NMR spektrometresinin çalışma sıcaklıklarında (~100 K) çok düşük konsantrasyonlarda moleküllerin çalışmasını sağlayacak kadar büyüktür. Bu, kriptoopreze edilmiş hücreler üzerinde hücre içi yapısal biyolojinin, makromoleküller için kendi yerel ortamlarında endojen seviyelerinde olma olasılığına yol açar. Bununla birlikte, DNP MAS NMR için tipik numune kullanımı sırasında hücresel kriyoprezervasyon için gereken donma oranları aşılır ve bu da hücresel bütünlük ve canlılık kaybına neden olur. Bu makalede, donmuş bir memeli hücresi örneğinin MAS NMR spektrometresine hazırlanması ve kriyojenik transferi için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

Memeli hücrelerinin önceden dondurulmuş örneklerinin NMR spektrometresine kriyojenik olarak yerleştirilmesi, NMR deneyi boyunca canlılığı destekler. Donmuş bir numunenin önceden soğutulmuş bir NMR probuna kriyojenik transferinin şemaları Şekil 1'degösterilmiştir. Hücresel canlılık ve sağlamlık çeşitli yöntemler kullanılarak değerlendirilebilir. Burada, diğer yöntemlerle iyi hizalanan standart bir boya bazlı membran bütünlüğü ölçüsü kullandık23. Sağlam hücreler maviyi denemek için geçirimsizken, membran bütünlüğü bozulabilir. Trippan mavi geçirgen ve geçirimsiz hücrelerin sayısı otomatik bir hücre sayacı kullanılarak hızla değerlendirilebilir. Burada açıklanan protokolü kullanarak, MAS NMR'den sonra memeli hücrelerinin trypan mavi geçirgenliği (yani 5.2.3 noktasında), herhangi bir sıcaklık değişiminden önce memeli hücrelerinin trypan mavi geçirgenliğine benzer (yani, nokta 2.1.3). Bununla birlikte, hücreler yavaş donmuşsa, yerleştirmeden önce oda sıcaklığına ısıtılırsa (yani soğutulmuş prob içine sokmadan önce rotorun oda sıcaklığına ısınmadan önce 3 noktasına kadar protokolü takip ederek), trypan mavisi tarafından değerlendirilen hücresel canlılık hücrelerin% 10'undan daha azına düşer(Şekil 2). Böylece, spektrometre içindeki hücrelerin dondurulması hücresel zar bütünlüğünün kaybına neden olurken, memeli hücrelerinin donmuş örneklerinin kriyojenik olarak yerleştirilmesi NMR deneyi boyunca hücre canlılığını destekler.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61733/61733fig01.jpg"> Şekil 1: Donmuş bir numunenin önceden soğutulmuş bir NMR probuna kriyojenik transferinin şeması. (A) Sıvı nitrojenin yüzeyine yaklaşın ve kriyojenik şişenin üst kısmını sökün. (B) Rotoru sıvı azot banyosuna kaydırın. (C) Bir mikrosantrifüj tüpünü cımbız kullanarak batırın ve tamamen soğuyana kadar yerinde tutun. (D) Rotorunu, tahrik ucu tüpün altına bakacak şekilde mikrosantrifüje yerleştirin. Cımbızla tutmak yerine itin. (E) Mikrosantrifüj tüpünü sıvı azot banyosunun yüzeyinin hemen altında tutun ve donmayan ve iyi işaretlenmiş olduğundan emin olmak için rotoru görsel olarak inceleyin. (F) Numune tutucuyu yüzeyin üzerinde bir açıyla tutun. (G) Numune tutucuyu ve tüpü mikrosantrifüj tüpünün içine girer girmez sıvı nitrojenden çıkarın. (H) Rotor janta takılırsa numune tutucuyu sallayın. (I) Boş numune tutucuyu probundan çıkarın ve yere yatırın. (J) Mikrosantrifüj tüpünü rotor içindeyken numune tutucudan çıkarın, yerleştirin, probdaki numune tutucuyu sıkın ve kontrol konsolunda "INSERT" tuşuna basın. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61733/61733fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61733/61733fig02.jpg"> Şekil 2: Önceden dondurulmuş bir memeli hücresi örneğinin kriyojenik olarak yerleştirilmesi, hiç dondurulmamış memeli hücre örneklerine benzer hücresel bozulma ölçümleriyle sonuçlanır. Hiç dondurulmayan örnekler için trypan mavi geçirimsiz hücrelerin yüzdesi (örneğin adım 2.1.3), MAS NMR'den sonraki örnekler için hücrelerinkine benzer (örneğin, 12 kHz MAS ile 5.2.3 adımı). 100 K'ya önceden soğutulan NMR cihazına takılmadan önce oda sıcaklığına ısıtılan yavaş donmuş hücreler (örneğin adım 3), 12 kHz MAS ile MAS NMR'den sonra bozulmamış hücrelerin çok daha düşük yüzdelerine sahipti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61733/61733fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability at JoVE.com

Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Burada, donmuş örneklerin dinamik nükleer polarizasyon (DNP) sihirli açı eğirme (MAS) nükleer manyetik rezonans (NMR) probuna kriyojenik transferi için bir protokol sunulmaktadır. Protokol, deneyden önce rotor depolaması için yol tariflerini ve deneyden önce ve sonra uygulanabilirlik ölçümleri için yol tariflerini içerir.

Hücresel Canlılığı Koruyan Sihirli Açı Dönen Nükleer Manyetik Rezonans Spektrometresine Kriyojenik Örnek Yükleme

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

cryogenic-sample-loading-into-magic-angle-spinning-nuclear-magnetic

Research

JoVE Journal

Biology

3.4K Görüntüleme.  University of Texas Southwestern Medical Center. Burada, donmuş örneklerin dinamik nükleer polarizasyon (DNP) sihirli açı eğirme (MAS) nükleer manyetik rezonans (NMR) probuna kriyojenik transferi için bir protokol sunulmaktadır. Protokol, deneyden önce rotor depolaması için yol tariflerini ve deneyden önce ve sonra uygulanabilirlik ölçümleri için yol tariflerini içerir.

Video: Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

Fare Oosit içine Nükleer Transfer

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Biyoloji

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Kurul, Yükleme ve Analitik ultrasantrifüjdeki Örnek Hücre Hizalama

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Dayanıksız Multi-protein Kompleksleri izolasyonu In vivo Kontrollü Hücresel Çapraz Bağlama ve immuno-manyetik Afinite Kromatografisi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Environmental metabolomics is an emerging field that is promoting new understanding in how organisms respond to and interact with the environment and each other at the biochemical level1. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is one of several technologies, including gas chromatography&#x2013;mass spectrometry (GC-MS), with considerable promise for such studies. Advantages of NMR are that it is suitable for untargeted analyses, provides structural information and spectra can be queried in quantitative and statistical manners against recently available databases of individual metabolite spectra2,3. In addition, NMR spectral data can be combined with data from other omics levels (e.g. transcriptomics, genomics) to provide a more comprehensive understanding of the physiological responses of taxa to each other and the environment4,5,6. However, NMR is less sensitive than other metabolomic techniques, making it difficult to apply to natural microbial systems where sample populations can be low-density and metabolite concentrations low compared to metabolites from well-defined and readily extractable sources such as whole tissues, biofluids or cell-cultures. Consequently, the few direct environmental metabolomic studies of microbes performed to date have been limited to culture-based or easily defined high-density ecosystems such as host-symbiont systems, constructed co-cultures or manipulations of the gut environment where stable isotope labeling can be additionally used to enhance NMR signals7,8,9,10,11,12. Methods that facilitate the concentration and collection of environmental metabolites at concentrations suitable for NMR are lacking. Since recent attention has been given to the environmental metabolomics of organisms within the aquatic environment, where much of the energy and material flow is mediated by the planktonic community13,14, we have developed a method for the concentration and extraction of whole-community metabolites from planktonic microbial systems by filtration. Commercially available hydrophilic poly-1,1-difluoroethene (PVDF) filters are specially treated to completely remove extractables, which can otherwise appear as contaminants in subsequent analyses. These treated filters are then used to filter environmental or experimental samples of interest. Filters containing the wet sample material are lyophilized and aqueous-soluble metabolites are extracted directly for conventional NMR spectroscopy using a standardized potassium phosphate extraction buffer2. Data derived from these methods can be analyzed statistically to identify meaningful patterns, or integrated with other omics levels for comprehensive understanding of community and ecosystem function.

A method for metabolite extraction from microbial planktonic communities is presented. Whole community sampling is achieved by filtration onto specially prepared filters. After lyophilization, aqueous-soluble metabolites are extracted. This approach allows for application of environmental metabolomics to trans-omics investigations of natural or experimental microbial communities.

Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi ile Çevre metabolomik için düşük yoğunluklu Planktonik topluluklardan Metabolitlerinin Konsantrasyon

Environmental metabolomics is an emerging field that is promoting new understanding in how organisms respond to and interact with the environment and each ...

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture. This work involves mixing two viscous liquid streams using an in-line static mixer. The mixer is a split-and-recombine design that employs shear and extensional flow to increase the interfacial contact between the components. A prototype split-and-recombine (SAR) mixer was constructed by aligning a series of thin laser-cut Poly (methyl methacrylate) (PMMA) plates held in place in a PVC pipe. Mixing in this device is illustrated in the photograph in Fig. 1. Red dye was added to a portion of the test fluid and used as the minor component being mixed into the major (undyed) component. At the inlet of the mixer, the injected layer of tracer fluid is split into two layers as it flows through the mixing section. On each subsequent mixing section, the number of horizontal layers is duplicated. Ultimately, the single stream of dye is uniformly dispersed throughout the cross section of the device.
 Using a non-Newtonian test fluid of 0.2% Carbopol and a doped tracer fluid of similar composition, mixing in the unit is visualized using magnetic resonance imaging (MRI). MRI is a very powerful experimental probe of molecular chemical and physical environment as well as sample structure on the length scales from microns to centimeters. This sensitivity has resulted in broad application of these techniques to characterize physical, chemical and/or biological properties of materials ranging from humans to foods to porous media 1, 2. The equipment and conditions used here are suitable for imaging liquids containing substantial amounts of NMR mobile 1H such as ordinary water and organic liquids including oils. Traditionally MRI has utilized super conducting magnets which are not suitable for industrial environments and not portable within a laboratory (Fig. 2). Recent advances in magnet technology have permitted the construction of large volume industrially compatible magnets suitable for imaging process flows. Here, MRI provides spatially resolved component concentrations at different axial locations during the mixing process. This work documents real-time mixing of highly viscous fluids via distributive mixing with an application to personal care products.

Magnetic resonance imaging (MRI) provides a powerful tool to evaluate the effectiveness of process equipment during operation. We discuss the use of MRI to visualize mixing in a static mixer. The application is relevant to personal care products, but can be applied to a broad range of food, chemical, biomass and biological fluids.

Manyetik Rezonans Görüntüleme kullanarak Karışım miktarının

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

KRİYOPREZERVE Numune Kurtarma için Do-It-Yourself Aygıt yanlışlıkla Kriyojenik Depolama Tankları içine Dropped

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

Üç boyutlu Floresans Images Hücresel Morfoloji Değişiklikleri rakamlarla Analitik Aracı

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly using MALDI (matrix&#160;assisted laser desorption/ionization)-based analytical techniques. New matrices for small-molecule MSI, which can improve the analysis of low-molecular weight (MW) compounds, are needed. These matrices should provide increased analyte signals while decreasing MALDI background signals. In addition, the use of ultrahigh-resolution instruments, such as Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR) mass spectrometers, has&#160;the ability to resolve analyte signals from matrix signals, and this can partially overcome many problems associated with the background originating from the MALDI matrix. The reduction in the intensities of the metastable matrix clusters by FTICR MS can also help to overcome some of the interferences associated with matrix peaks on other instruments. High-resolution instruments such as the FTICR mass spectrometers are advantageous as they can produce distribution patterns of many compounds simultaneously while still providing confidence in chemical identifications. Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging. In this work, a protocol for the use of DT for MALDI imaging of endogenous lipids from the surfaces of mammalian tissue sections, by positive-ion MALDI-MS, on an ultrahigh-resolution hybrid quadrupole FTICR instrument has been provided.

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging of small molecules; protocols for the use of DT for the MALDI imaging of endogenous lipids on the surface of tissue sections&#160;by positive-ion MALDI-MS on an ultrahigh-resolution quadrupole-FTICR instrument are provided here.

Bir Fourier Matrix Yardımlı Lazer Dezorpsivon / İyonizasyon Görüntüleme için bir Matrix olarak ditranol İyon Cyclotron Rezonans Kütle Spektrometresi Dönüşümü

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking metabolism and inflammation (e.g.&#160;hepatic steatosis)1,2. There has been much progress in the identification of agonist ligands for PXR, however, there are limited descriptions of drug-like antagonists and their binding sites on PXR3,4,5. A critical barrier has been the inability to efficiently purify full-length protein for structural studies with antagonists despite the fact that PXR was cloned and characterized in 1998. Our laboratory developed a novel high throughput yeast based two-hybrid assay to define an antagonist, ketoconazole&#39;s, binding residues on PXR6. Our method involves creating mutational libraries that would rescue the effect of single mutations on the AF-2 surface of PXR expected to interact with ketoconazole. Rescue or &#34;gain-of-function&#34; second mutations can be made such that conclusions regarding the genetic interaction of ketoconazole and the surface residue(s) on PXR are feasible. Thus, we developed a high throughput two-hybrid yeast screen of PXR mutants interacting with its coactivator, SRC-1. Using this approach, in which the yeast was modified to accommodate the study of the antifungal drug, ketoconazole, we could demonstrate specific mutations on PXR enriched in clones unable to bind to ketoconazole. By reverse logic, we conclude that the original residues are direct interaction residues with ketoconazole. This assay represents a novel, tractable genetic assay to screen for antagonist binding sites on nuclear receptor surfaces. This assay could be applied to any drug regardless of its cytotoxic potential to yeast as well as to cellular protein(s) that cannot be studied using standard structural biology or proteomic based methods. Potential pitfalls include interpretation of data (complementary methods useful), reliance on single Y2H method, expertise in handling yeast or performing yeast two-hybrid assays, and assay optimization.

Ketoconazole binds to and antagonizes Pregnane X Receptor (PXR) activation. Yeast high throughput screens of PXR mutants define a unique region for ketoconazole binding. This yeast-based genetic method discovers novel nuclear receptor interactions with ligands that associate with surface binding sites.

Memeli Nükleer Reseptör kalıntıları tespit Maya İki melez Sistemi ters olduğunu Ligandlannın ve / veya antagonistleri ile Etkileşim

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Kırılan numune hazırlama için iletim elektron mikroskobu

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...