Este trabalho foi apoiado por doações do Cancer Research Prevention & Research Institute of Texas [RR150076], a National Science Foundation [1751174]; os Institutos Nacionais de Saúde [NS-111236], a Fundação Welch [1-1923-20170325]; a Fundação Lupe Murchison, a Fundação Ted Nash Long Life e a Kinship Foundation (Searle Scholars Program) para k.K.F.

1. Cultura e crioproteção de células mamíferas
<ol><li>Cultura e colheita de células de mamíferos<ol>
<li>Descongele uma alíquota de células renais embrionárias humanas congeladas (HEK 293).</li>
		<li>Cultura HEK 293 células em mídia de crescimento (por exemplo, DMEM com soro bovino fetal de 10% e 1% Pen-Strep) a 37 °C com 5% de CO2 em placas de 100 mm para duas a três passagens (7-10 dias).</li>
		<li>Divida as células e a cultura em uma placa de 150 mm até que as células atinjam 90-95% de confluência. NOTA: Uma placa de 150 mm a > confluência de 90% será suficiente para encher dois rotores de safira com diâmetro de 3,2 mm.</li>
		<li>Células de colheita usando 4 mL de trippsina (ver Tabela de Materiais) e 10 mL de mídia. Transfira a suspensão para um concânico e centrífuga de 15 mL estéril a 673 x g (1000 rpm) por 5 min a temperatura ambiente. Remova o supernatante.</li>
		<li>Lave a pelota celular com soro fisiológico tamponado de fosfato (PBS) (pH 7.4, −CaCl2, −MgCl2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Crioproteção das células<ol>
<li>Colete uma pelota de célula de 50 μL em um tubo de microcentrifuuagem. Prepare uma mistura de 50 μL de PBS e 18 μL de glicerol em um tubo separado.</li>
		<li>Misture suavemente a pelota de célula de 50 μL com 68 μL de mistura glicerol-PBS adicionando a mistura glicerol-PBS ao topo da pelota e reutilizando a pelota batendo suavemente na lateral do tubo até que não restem aglomerados. NOTA: A tubulação suave também pode ser usada para resususpensar a célula, no entanto, certifique-se de que a integridade celular não esteja comprometida.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Criopreservação de células mamíferas em um rotor de RMN
<ol><li>Transferência de células para um rotor de safira de 3,2 mm.<ol>
<li>Para fazer um funil, corte uma ponta de pipeta de 200 μL e insira a extremidade estreita da ponta de pipeta cortada no rotor de 3,2 mm.</li>
		<li>Transfira as células para o funil sentado no rotor. Coloque o rotor junto com o funil em um tubo de microcentrifuuge e pelota as células na parte inferior do rotor por centrifugação a 673 x g para 2-3 min à temperatura ambiente.</li>
		<li>Remova o supernatante e qualquer amostra em excesso do rotor. Repita estes dois passos até que o rotor esteja totalmente embalado com as células. NOTA: Opcionalmente, determine a viabilidade celular da amostra antes de congelar. Resuspend 10 μL da pelota de célula em excesso de pelotas em 100 μL de DMEM livre de FBS. Misture 10 μL da suspensão com solução azul trypan de 0,4% e avalie imediatamente a viabilidade usando um contador automático de células. Use apenas mídia livre FBS para diluir células à medida que o soro interfere com a coloração azul trypan.</li>
		<li>Sele o rotor com um plugue de silício usando uma ferramenta de embalagem comercialmente disponível.</li>
		<li>Feche o rotor com uma ponta de acionamento de cerâmica pressionando-o verticalmente para baixo. Evite tocar nas delicadas aletas na lateral da ponta da unidade.</li>
		<li>Marque metade da borda inferior do rotor de safira com um marcador permanente prateado e a outra metade da borda inferior do rotor com um marcador permanente preto para permitir o monitoramento preciso da fiação do rotor dentro do espectrômetro. NOTA: As imperfeições na marcação do rotor evitarão uma contagem precisa da frequência giratória, resultando na falha em alcançar uma fiação estável. Porque os marcadores não escreverão em um rotor congelado e o aquecimento do rotor compromete a integridade da amostra, marcar o rotor antes de congelar é um passo crítico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Criopreservação de células dentro de um rotor de safira de 3,2 mm.<ol>
<li>Coloque uma almofada feita por um pedaço de tecido ou toalha de papel sob a tampa e na parte inferior do frasco criogênico (ver Tabela de Materiais). NOTA: O papel de tecido protege a marcação do rotor contra danos incorridos batendo contra os lados dos frascos criogênicos.</li>
		<li>Coloque o rotor de safira de 3,2 mm no frasco criogênico acolchoado com o papel de tecido com extremidade marcada voltada para o fundo do frasco criogênico.</li>
		<li>Congele lentamente o rotor colocando o frasco criogênico no recipiente de resfriamento de taxa controlada (-1 °C/min) e coloque o recipiente no congelador de -80 °C por um mínimo de 3h.</li>
		<li>Transfira o frasco criogênico contendo o rotor congelado para o armazenamento líquido de nitrogênio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Transferência criogênica de uma amostra congelada para o espectrômetro NMR
<ol><li>Transporte a amostra congelada para a instalação da RMN.<ol>
<li>Transfira o frasco criogênico contendo o rotor congelado para uma pequena de guerra cheia de nitrogênio líquido para transporte para a instalação da RMN.</li>
	</ol></li>
	<li>Transferência de rotor congelado para o banho de nitrogênio líquido.<ol>
<li>Encha uma espuma de boca larga seca e isolada termicamente com 500 mL – 1 L de nitrogênio líquido.</li>
		<li>Transfira o rotor do frasco criogênico para a espuma de espuma da boca larga recheada com nitrogênio líquido.<ol>
<li>Pegue o frasco criogênico da transferência de guerra na mão e segure-o logo acima da superfície do nitrogênio líquido para protegê-lo da atmosfera.</li>
			<li>Enquanto segura o frasco criogênico com a boca apontando ligeiramente para baixo, desaparafusar a tampa e deixar o rotor deslizar para o banho de nitrogênio líquido. NOTA: Uma vez que a tampa esteja desparafusada, o rotor deve cair do frasco criogênico para o banho de nitrogênio líquido rapidamente (menos de 1 segundo) para evitar que a condensação seja coletado no rotor. A evaporação do nitrogênio líquido forma uma "nuvem de nitrogênio" na de guerra da espuma da boca larga e previne a condensação do rotor antes de ser submerso no nitrogênio líquido. A maior exposição do rotor ao ar pode levar à condensação da umidade nas paredes do rotor que se re condensarão no gelo.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Transferência criogênica de rotor para receptor de amostras NMR.<ol>
<li>Prechill um tubo de microcentrifutura de 1,5 mL submergindo-o no banho de nitrogênio líquido. Não feche o tubo. NOTA: Inspecione o rotor antes de transferir para o tubo de microcentrifuuagem. Usando pinças, segure o rotor logo abaixo da superfície do nitrogênio líquido e verifique se as marcas do rotor estão intactas, que nenhum depósito de gelo se formou em suas paredes e que a ponta da unidade está intacta. Depósitos de cristal de gelo nas paredes do rotor aparecem como pó branco. Tenha cuidado para sempre segurar o rotor pelo corpo e não pela ponta da unidade. Não arranhe a marcação do rotor com as pontas da pinça.</li>
		<li>Sob a superfície do banho de nitrogênio líquido, use pinças para transferir o rotor para o tubo de microcentrifuuge com a ponta de acionamento voltada para a parte inferior do tubo de microcentrifuuge e as marcas voltadas para a abertura do tubo. NOTA: Sempre seque pinças antes de submergir em nitrogênio líquido ou tocar no rotor.</li>
		<li>Usando pinças, segure o tubo contendo o rotor sob nitrogênio líquido pelo pescoço.</li>
		<li>Com um segundo par de pinças na mão, prepare-se para submergir o apanhador de amostras de NMR no banho de nitrogênio líquido e segurá-lo para que ele esteja inclinado a um ângulo agudo em relação ao tubo de microcentrifuuge. NOTA: Minimize o tempo em que o apanhador de amostras esteja em contato com o nitrogênio líquido para evitar o congelamento do anel O. Se o anel O congelar, será muito difícil inserir o apanhador no espectrômetro.</li>
	</ol></li>
	<li>Transferência de rotor criogênico do apanhador de amostras NMR para espectrômetro NMR NOTA: Esta etapa requer duas pessoas, uma para operar a criocabinet e outra para transferir a amostra do nitrogênio líquido para a sonda.<ol>
<li>Coloque o criocabinet no modo de ejeção pressionando 'EJETAR' no gabinete. NOTA: O modo de ejeção elimina o fluxo de gás nitrogênio seco e frio em alta pressão da sonda para a atmosfera, a fim de evitar a entrada de umidade atmosférica.</li>
		<li>Transfira o rotor para o apanhador de amostras NMR.<ol>
<li>Insira a extremidade aberta do apanhador de amostras de NMR no tubo de microcentrifuuuagem enquanto ainda estiver sob a superfície do nitrogênio líquido.</li>
			<li>Levante o tubo de microcentrifuge e o apanhador de amostras de NMR para permitir que o rotor caia no receptor de amostras. Agite o apanhador de amostras de NMR e o tubo de microcentrifuuge no caso de o rotor ficar preso na borda do receptor de amostras.</li>
			<li>Deixe o tubo de microcentrifuuge vazio em cima do apanhador de amostras NMR para proteger o rotor do ar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Remova o outro apanhador de amostras NMR vazio da sonda e coloque-o no chão.</li>
		<li>Transfira o apanhador de amostras de NMR contendo o rotor para a mão livre, remova o tubo de microcentrifuuagem e insira-o imediatamente na sonda. NOTA: Se o anel O congelar, será difícil apertar o apanhador de amostras. Continue aplicando força até que ele deslize no lugar.</li>
		<li>Sinalize a pessoa que opera o cryocabinet para 'STOP EJECT' e 'INSERT'. NOTA: O modo de inserção guia o rotor do receptor de amostra para dentro da sonda.</li>
		<li>Gire a amostra para a taxa de fiação desejada (por exemplo, 12 kHz) ajustando a pressão de fluxo de rolamento e condução controlada pela criocabinet. (por exemplo, aumente imediatamente o gás de rolamento para ~200 mBar e o gás de acionamento para 10 mBar. Uma vez que a amostra gire, aumente o gás de rolamento para 1000 mBar e leve o gás para 200 mBar. À medida que a fiação se estabiliza, aumente o rolamento para 2400 mBar e, em seguida, aumente o gás de condução de 200 mBar para 1700 mBar ao longo de vários minutos. O gás de resfriamento VT é constante em ~1070 L/h.) NOTA: Ao levantar o tubo de microcentrifuuge e o apanhador de amostras de NMR do banho de nitrogênio líquido, certifique-se de que o tubo de microcentrífuga tenha nitrogênio líquido suficiente dentro dele para cercar o rotor. Minimize o tempo entre transferir o rotor para o apanhador de amostras de RMN e inserir o apanhador de amostras de RMN no espectrômetro. Todas as etapas do 3.4 devem ser concluídas dentro dos 30 s.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Remoção criogênica da amostra do espectrômetro NMR
<ol><li>Preparação do banho de nitrogênio líquido e do frasco criogênico<ol>
<li>Despeje 500 mL - 1 L de nitrogênio líquido na espuma de espuma da boca larga e coloque o banho sob o espectrômetro.</li>
		<li>Pré-esfrie o frasco criogênico. Submergir o frasco criogênico vazio contendo um pedaço de papel de tecido no banho de nitrogênio líquido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transferência criogênica de rotor da sonda para o frasco criogênico<ol>
<li>Reduza a taxa de rotação para 0 kHz, reduzindo o fluxo de fluxo de vapor e rolamento do gás e ejete o rotor mudando para o modo de ejeção.</li>
		<li>Mantenha o modo de ejeção ligado, remova o apanhador de amostras da sonda, solte o rotor diretamente na dewar da espuma da boca larga contendo nitrogênio líquido.</li>
		<li>Usando pinças pré-refrigeradas, transfira o rotor para um frasco criogênico pré-refrigerado sob a superfície do nitrogênio líquido.</li>
		<li>Tampe o frasco criogênico. Prechill a tampa de frasco criogênico mergulhando-o em nitrogênio líquido. Remova o frasco criogênico contendo o rotor e nitrogênio líquido do banho e tampa o tubo com tampa pré-filhada. Não aperte a tampa para que o nitrogênio vaporizador possa ser liberado com segurança.</li>
		<li>Submergir o frasco criogênico em nitrogênio líquido. A amostra pode ser transferida para armazenamento de nitrogênio líquido a longo prazo ou desembalada imediatamente para análise suplementar.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Desempacotar as medidas do rotor e da viabilidade
<ol><li>Desempacotamento do rotor e viabilidade de medição<ol>
<li>Mídia livre de soro pré-quente (DMEM) ou PBS a 37 °C.</li>
		<li>Remova o rotor do nitrogênio líquido. Remova a ponta da unidade e o plugue de silicone. NOTA: Safira é um excelente condutor de calor. Evite tocar no rotor com os dedos, pois a transferência de calor pode causar eventos locais de congelamento que comprometem a viabilidade celular.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Medindo a viabilidade<ol>
<li>Adicione 20 μL de mídia quente à pelota de célula congelada no rotor e células resusgasentas. Retire a suspensão com uma pipeta e misture a suspensão com 100 μL de mídia.</li>
		<li>Remova 10 μL de suspensão celular e misture com o mesmo volume de 0,4% de solução azul trypan (v/v). Incubar em temperatura ambiente por 30 a 1 min.</li>
		<li>Medir a viabilidade usando o contador automático de células.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Costello, W. N., Xiao, Y., Frederick, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNP-Assisted+NMR+Investigation+of+Proteins+at+Endogenous+Levels+in+Cellular+Milieu.">DNP-Assisted NMR Investigation of Proteins at Endogenous Levels in Cellular Milieu.</a> Methods Enzymology. 615 (1), 373-406 (2019).</li><li>Hall, D. 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Os autores não têm nada a revelar.

A transferência criogênica de amostras congeladas em um espectrômetro NMR é bem sucedida em preservar a viabilidade das células de mamíferos congelados através da aquisição de dados NMR. O sucesso dessa metodologia é demonstrado em medições de viabilidade pré e pós-MAS NMR. Esta abordagem é bem sucedida e generalizável para qualquer sistema onde flutuações de temperatura possam comprometer a integridade da amostra. O protocolo apresentado atualmente é realizado com a linha de células HEK 293. Como as condições de criopreservação para muitas linhas de células de mamíferos são muito semelhantes, é provável que as condições aqui relatadas sejam traduzíveis para outros sistemas celulares; no entanto, podem exigir maior otimização dos crioprotetores, volumes amostrais e taxas de congelamento para alcançar os mesmos resultados.
Essa metodologia pode ser melhorada desempacotando o rotor mais rápido pós-NMR. Esta etapa é atualmente sub ideal e sua execução afeta a viabilidade das células. Antes que as células possam ser resuspendidas em mídia, a ponta da unidade e o plugue de silício devem ser removidos do rotor. A amostra descongela de forma irregular quando o rotor é mantido durante a remoção da ponta da unidade e o plugue de silício de modo tão curto os tempos de manuseio do rotor resultam em maiores viabilidades. O desenvolvimento de suportes de rotor ou outras ferramentas para facilitar o descongelamento uniforme e a remoção rápida da ponta da unidade e o plugue de silício ajudaria a tornar a avaliação pós-NMR da viabilidade mais precisa.
A abordagem do carregamento de amostras criogênicas descrita neste artigo limita-se a sondas NMR que suportam a inserção e ejeção da amostra com a sonda no suporte do ímã NMR. Embora a inserção e a ejeção de amostras externas seja padrão para sistemas DNP comerciais, os testes personalizados nem sempre têm essa opção. Além disso, essa abordagem para o carregamento de amostras criogênicas pode exigir alguma modificação para sondas NMR construídas para serem compatíveis com rotores de tamanho diferente. Este protocolo foi otimizado para rotores de 3,2 mm e pode exigir modificação se o diâmetro externo do receptor de amostra exceder o diâmetro interno de um tubo de microcentrída (por exemplo, passo 3.4.2).
Com a aplicação de DNP ao MAS NMR, agora é possível detectar proteínas e outras biomoléculas em concentrações fisiológicas endógenas24,25,26. Isso abre a possibilidade de estudar biomoléculas em seus ambientes nativos. A manutenção da integridade celular e da viabilidade ao longo do experimento provavelmente será fundamental para conectar os resultados experimentais da espectroscopia a fenômenos biológicos. O congelamento descontrolado de amostras contendo proteínas purificadas ou lises celulares normalmente não compromete a qualidade da amostra7,27, embora existam algumas indicações de que a taxa de congelamento pode ser uma variável importante mesmo nos sistemas purificados28. No entanto, amostras de células mamíferas precisam ser congeladas a uma taxa controlada se preservar a intactidade e a viabilidade celular é importante para a interpretação. Aqui apresentamos um protocolo para congelar e transferir amostras congeladas de células mamíferas para um instrumento de NMR DNP MAS pré-resfriado que evita flutuações de temperatura potencialmente prejudiciais e suporta a medição em células viáveis.

A introdução da polarização nuclear dinâmica para espectroscopia de ressonância magnética nuclear de ângulo mágico pode aumentar a sensibilidade do MAS NMR por várias ordens de magnitude. Isso permitiu a detecção de biomoléculas em ou perto de suas concentrações fisiológicas. O DNP pode e fornece a sensibilidade necessária para detectar uma proteína isototicamente rotulada em concentrações endógenas (~1 μM) em ambiente biológico complexo1. Como existem protocolos bem estabelecidos para introduzir moléculas isototicamente rotuladas em células mamíferas sem afetar sua viabilidade, isso abre a possibilidade de estudar biomoléculas enriquecidas isototicamente em seus níveis endógenos em seu ambiente nativo. Além disso, como os aprimoramentos do DNP são mais eficientes a temperaturas mais baixas2,3,4, as temperaturas experimentais para DNP MAS NMR se alinham perfeitamente com as necessárias para o armazenamento a longo prazo de células de mamíferos viáveis5. No entanto, o método convencional de transferência de uma amostra para um espectrômetro DNP MAS NMR submete-a a taxas de flutuação de temperatura que rompem células de mamíferos.
Os experimentos de NMR mas exigem que a amostra seja girada sobre o ângulo mágico em frequências iguais ou maiores do que a magnitude da interação anisotrópica para que ela seja mediada a zero, tipicamente com pelo menos 4 kHz e muitas vezes muito maior6,7,8,9. As amostras são, portanto, embaladas em rotores que têm uma ponta afim que é usada para conduzir a rotação do rotor por um fluxo de gás e têm uma marca na outra extremidade para que a frequência de rotação possa ser monitorada por um tacômetro. A transferência de amostras para a maioria dos instrumentos MAS NMR é realizada injetando o rotor do exterior do instrumento no estator no final da sonda NMR com um fluxo de ar seco ou gás nitrogênio. Depois que o rotor atinge o estator, que segura o rotor no ângulo mágico, a rotação da amostra é impulsionada por um mecanismo de turbina de ar. Fluxos separados de suporte a gás, impulsionem e controlem a temperatura do rotor. Inserir um rotor no espectrômetro NMR e alcançar o giro MAS estável requer pontas de acionamento finamente usinadas e controle rigoroso da temperatura e pressão dos fluxos separados de gás. Apesar dessas demandas técnicas, a inserção e a obtenção de MAS estável são em grande parte automatizadas para testes comerciais de NMR MAS para aplicações de temperatura ambiente.
No entanto, a situação é mais complicada para aplicações de baixa temperatura. Amostras para aplicações de baixa temperatura são tipicamente inseridas no espectrômetro à temperatura ambiente e congeladas no estator. No primeiro minuto, a temperatura da amostra diminui rapidamente (> −100 °C/min) e a temperatura do sistema requer vários minutos para se equilibrar. Devido à interação entre temperatura e pressão, a inserção e a aproximação do MAS desejado são frequentemente manuseadas manualmente para aplicações de baixa temperatura. Apesar da exigência de intervenção manual, o congelamento do rotor dentro do instrumento é benéfico porque minimiza a introdução de água e condensação na sonda, o que é fundamental para o sucesso da fiação. Não só a condensação e o acúmulo de gelo das linhas de gás do bloco de umidade ambiente, condensação ou geada no próprio rotor podem evitar mecanicamente a MAS. Assim, as amostras para NMR mas de baixa temperatura são tipicamente congeladas dentro do instrumento a taxas que excedem -100 °C/min.
As células mamíferas podem manter sua integridade através de um ciclo de congelamento se o resfriamento for lento5,10,11,12, a uma taxa igual ou mais lenta do que 1 °C/min. Alternativamente, as células também mantêm sua integridade se a taxa de resfriamento for ultrarrápida13,14,15, a uma taxa mais rápida do que 104 °C/min. Taxas intermediárias a esses dois extremos rompem e matam células mamíferas devido à formação de cristais de gelo dentro e fora das células, mesmo na presença de agentes crioprotetores16. As taxas de resfriamento da amostra para um rotor de temperatura ambiente dentro de uma sonda pré-resfriada caem entre esses dois extremos, para estudar células de mamíferos intactas preservadas criogenicamente preservadas, as amostras devem ser congeladas antes de serem transferidas para o instrumento e transferidas para o instrumento sem flutuações de temperatura que possam danificar a amostra ou o acúmulo de geada no rotor que poderia impedir que o rotor girasse. O protocolo descreve um método de inserção de rotor pré-resfriado e sem geada em um sistema de NMR mas criogênico para o estudo de amostras de células mamárias intactas preservadas criogenicamente. A transferência de amostra criogênica descrita aqui foi desenvolvida para caracterização de RMN de células intactas viáveis. No entanto, é aplicável a qualquer sistema onde flutuações de temperatura possam comprometer a integridade da amostra. Isso inclui qualquer variedade de sistemas complexos, como o congelamento de reações saciadas para caracterização química e estrutural dos intermediários de reação preso17,18, enzima19,20 ou dobramento deproteínas 21,22.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan blue stain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>T10282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm cell culture dish</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>430167</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mm cell culture dish</td>
			<td>Nunc</td>
			<td>157150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.2 mm sapphire rotor</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>45 &#176; angled forceps</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR4-859</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMUPol</td>
			<td>Cortecnet</td>
			<td>C010P005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Black and Silver marker</td>
			<td>Sharpie</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cap removing tool</td>
			<td>Bruker ?</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture grade water</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ceramic cap</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CoolCell</td>
			<td>Corning/ Biocision</td>
			<td>UX-04392-00 (Corning) / BCS-405 (Bioscion)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess Cell Counting Chamber Slides</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C10288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Countess II automated cell counter</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AMQAF1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryogen tubes</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>03-337-7Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>d8-glycerol</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>447498</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuterium oxide, 99.8 % atom D</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td>756822-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNP NMR system with 1.7 T cryogen free gyrotron</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foam dewar</td>
			<td>Spearlab</td>
			<td>FD-800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimwipes</td>
			<td>Kimwipes</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Packaging tool</td>
			<td>Bruker ?</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Powdered PBS</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRRV0780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protonated PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon plug</td>
			<td>Bruker</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Vessel forceps</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryp-L</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cryogenic sample loading into a magic angle spinning nuclear magnetic resonance spectrometer that preserves cellular viability

A polarização nuclear dinâmica (DNP) pode aumentar drasticamente a sensibilidade da espectroscopia de ressonância magnética nuclear (NMR) de ângulo mágico. Esses ganhos de sensibilidade aumentam à medida que as temperaturas diminuem e são grandes o suficiente para permitir o estudo de moléculas em concentrações muito baixas nas temperaturas operacionais (~100 K) da maioria dos espectrômetros NMR equipados com DNP comerciais. Isso leva à possibilidade de biologia estrutural em células em células criopreservadas para macromoléculas em seus níveis endógenos em seus ambientes nativos. No entanto, as taxas de congelamento exigidas para a criopreservação celular são excedidas durante o manuseio típico da amostra para DNP MAS NMR e isso resulta em perda de integridade celular e viabilidade. Este artigo descreve um protocolo detalhado para a preparação e transferência criogênica de uma amostra congelada de células mamíferas em um espectrômetro MAS NMR.

A inserção criogênica de amostras pré-congeladas de células mamíferas no espectrômetro NMR suporta viabilidade durante todo o experimento NMR. Esquemas de transferência criogênica de uma amostra congelada em uma sonda NMR pré-resfriada é mostrado na Figura 1. A viabilidade celular e a inintegridade podem ser avaliadas usando uma variedade de métodos. Aqui usamos uma medida padrão baseada em corante da integridade da membrana, que se alinha bem com outros métodos23. Células intactas são impermeáveis ao azul trypan enquanto células com integridade de membrana comprometida são permeáveis. O número de células permeáveis e impermeáveis do trypan azul pode ser rapidamente avaliado usando um contador automatizado de células. Usando o protocolo descrito aqui, a permeabilidade azul trippan das células mamíferas após o MAS NMR (ou seja, no ponto 5.2.3) é semelhante à permeabilidade azul tripupan das células mamíferas antes de qualquer mudança de temperatura (ou seja, ponto 2.1.3). No entanto, se as células são congeladas lentamente, então aquecidas à temperatura ambiente antes da inserção (ou seja, seguindo o protocolo para o ponto 3 antes de aquecer o rotor à temperatura ambiente antes de inserir na sonda refrigerada), a viabilidade celular avaliada pelo azul trypan diminui para menos de 10% das células(Figura 2). Assim, o congelamento de células dentro do espectrômetro resulta na perda da integridade da membrana celular, enquanto a inserção criogênica de amostras congeladas de células mamíferas suporta a viabilidade celular durante todo o experimento de RMN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61733/61733fig01.jpg"> Figura 1: Esquema de transferência criogênica de uma amostra congelada em uma sonda NMR pré-resfriada. (A) Aproxime-se da superfície do nitrogênio líquido e desaparafusar o topo do frasco criogênico. (B) Deslize o rotor para o banho de nitrogênio líquido. (C) Submerse um tubo de microcentrífuga usando pinças e segure-o no lugar até esfriar completamente. (D) Insira o rotor no microcentrifuso com a ponta da unidade voltada para a parte inferior do tubo. Empurre, em vez de agarrar, com a pinça. (E) Segure o tubo de microcentrifuuge logo abaixo da superfície do banho de nitrogênio líquido e inspecione visualmente o rotor para garantir que ele esteja livre de geada e bem marcado. (F) Segure o apanhador de amostras em um ângulo acima da superfície. (G) Retire o apanhador de amostras e o tubo do nitrogênio líquido assim que o apanhador de amostras estiver dentro do tubo de microcentrifuuagem. (H) Agite o apanhador de amostras se o rotor estiver preso na borda. (I) Remova o apanhador de amostras vazio da sonda e coloque-o no chão. (J) Remova o tubo de microcentrifutura do receptor de amostras com o rotor dentro, insira, aperte o apanhador de amostras na sonda e pressione "INSERT" no console de controle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61733/61733fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61733/61733fig02.jpg"> Figura 2: A inserção criogênica de uma amostra pré-congelada de células mamíferas resulta em medições de intactidade celular semelhantes às amostras de células mamíferas que nunca foram congeladas. A porcentagem de células impermeáveis azuis para amostras que nunca foram congeladas (por exemplo, passo 2.1.3) é semelhante à das células para amostras após MAS NMR (por exemplo, passo 5.2.3 com 12 kHz MAS). As células congeladas lentas (por exemplo, passo 3) que foram aquecidas à temperatura ambiente antes da inserção no instrumento NMR que havia sido pré-resfriado para 100 K tinham percentuais muito menores de células intactas após MAS NMR com MAS de 12 kHz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61733/61733fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Apresentado aqui é um protocolo para transferência criogênica de amostras congeladas para a dinâmica polarização nuclear (DNP) sonda de ressonância magnética nuclear (MAS). O protocolo inclui instruções para armazenamento de rotores antes do experimento e direções para medições de viabilidade antes e depois do experimento.

Amostra criogênica carregando em um espectrômetro de ressonância magnética nuclear de ângulo mágico que preserva a viabilidade celular

Dynamic nuclear polarization (DNP) can dramatically increase the sensitivity of magic angle spinning (MAS) nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. ...

cryogenic-sample-loading-into-magic-angle-spinning-nuclear-magnetic

Research

JoVE Journal

Biology

3.3K visualizações.  University of Texas Southwestern Medical Center. Apresentado aqui é um protocolo para transferência criogênica de amostras congeladas para a dinâmica polarização nuclear (DNP) sonda de ressonância magnética nuclear (MAS). O protocolo inclui instruções para armazenamento de rotores antes do experimento e direções para medições de viabilidade antes e depois do experimento.

Vídeo: Cryogenic Sample Loading into a Magic Angle Spinning Nuclear Magnetic Resonance Spectrometer that Preserves Cellular Viability

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying development, differentiation and aging are epigenetic rather than genetic processes. The reversibility of these processes opens exciting perspectives in basic research, and in the more distant future, in regenerative medicine. In the mouse, embryonic stem cells can be derived from cloned preimplantation stage embryos. Such embryonic stem cells have the ability to give rise to all cell types of the adult organism. Importantly, these cells are genetically identical to the donor. If applicable to human, this would allow the derivation of stem cells from a patient. These cells could then be differentiated into the affected cell type of the patient and studied in vitro, or used to replace the damaged or missing cells. The study of nuclear transfer in the mouse remains important as it can inform us about the principles of nuclear reprogramming. This movie and the accompanying protocol are intended to help learning nuclear transfer in the mouse, a method initially developed in the group of Prof. Yanagimachi (WAKAYAMA et al. 1998).

This movie and the protocol are intended to help learning nuclear transfer.

Transferência nuclear em oócitos de camundongos

Nuclear transfer into an unfertilized oocyte can restore developmental potential to a differentiated cell. This demonstrates that the processes underlying ...

Biologia

Assembly, Loading, and Alignment of an Analytical Ultracentrifuge Sample Cell

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed centrifugation. When properly planned and executed, an AUC sedimentation velocity or sedimentation equilibrium experiment can reveal a great deal about a protein in regards to size and shape, sample purity, sedimentation coefficient, oligomerization states and protein-protein interactions.
This technique, however, requires a rigorous level of technical attention. Sample cells hold a sectored center piece sandwiched between two window assemblies. They are sealed with a torque pressure of around 120-140 in/lbs. Reference buffer and sample are loaded into the centerpiece sectors and then after sealing, the cells are precisely aligned into a titanium rotor so that the optical detection systems scan both sample and reference buffer in the same radial path midline through each centerpiece sector while rotating at speeds of up to 60, 000 rpm and under very high vacuum
Not only is proper sample cell assembly critical, sample cell components are very expensive and must be properly cared for to ensure they are in optimum working condition in order to avoid leaks and breakage during experiments. Handle windows carefully, for even the slightest crack or scratch can lead to breakage in the centrifuge. The contact between centerpiece and windows must be as tight as possible; i.e. no Newton s rings should be visible after torque pressure is applied. Dust, lint, scratches and oils on either the windows or the centerpiece all compromise this contact and can very easily lead to leaking of solutions from one sector to another or leaking out of the centerpiece all together. Not only are precious samples lost, leaking of solutions during an experiment will cause an imbalance of pressure in the cell that often leads to broken windows and centerpieces. In addition, plug gaskets and housing plugs must be securely in place to avoid solutions being pulled out of the centerpiece sector through the loading holes by the high vacuum in the centrifuge chamber. Window liners and gaskets must be free of breaks and cracks that could cause movement resulting in broken windows.
This video will demonstrate our procedures of sample cell assembly, torque, loading and rotor alignment to help minimize component damage, solution leaking and breakage during the perfect AUC experiment.

The analytical ultracentrifuge (AUC) sample cell holds sample and reference buffer and during experiments and is exposed to high vacuum and rotor speeds up to 60,000 rpm. This video will demonstrate the rigorous attention to detail necessary for assembly, loading and alignment of this very important component of an AUC experiment.

Montagem, de carga, e alinhamento de uma célula Analytical ultracentrífuga Amostra

The analytical ultracentrifuge (AUC) is a powerful biophysical tool that allows us to record macromolecular sedimentation profiles during high speed ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude stringent methods for the isolation and identification of protein networks around a protein of interest. The use of chemical crosslinkers allows the selective stabilization of labile interactions, thus bypassing biochemical limitations for purification. Here we present a protocol amenable for cells in culture that uses a homobifunctional crosslinker with a spacer arm of 12 &Aring;, dithiobis-(succinimidyl proprionate) (DSP). DSP is cleaved by reduction of a disulphide bond present in the molecule. Cross-linking combined with immunoaffinity chromatography of proteins of interest with magnetic beads allows the isolation of protein complexes that otherwise would not withstand purification. This protocol is compatible with regular western blot techniques and it can be scaled up for protein identification by mass spectrometry1.
Stephanie A. Zlatic and Pearl V. Ryder contributed equally to this work.

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

The cell permeable crosslinker DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizes transient and labile interactions in vivo, which allows their isolation using stringent protein complex purification techniques. Here we present a technique for crosslinking cells grown in culture followed by isolation of protein complexes by immunoprecipitation.

Isolamento de proteínas lábeis Multi-Complexos por In vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Imuno-magnética cromatografia de afinidade

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Concentration of Metabolites from Low-density Planktonic Communities for Environmental Metabolomics using Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy

Environmental metabolomics is an emerging field that is promoting new understanding in how organisms respond to and interact with the environment and each other at the biochemical level1. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is one of several technologies, including gas chromatography&#x2013;mass spectrometry (GC-MS), with considerable promise for such studies. Advantages of NMR are that it is suitable for untargeted analyses, provides structural information and spectra can be queried in quantitative and statistical manners against recently available databases of individual metabolite spectra2,3. In addition, NMR spectral data can be combined with data from other omics levels (e.g. transcriptomics, genomics) to provide a more comprehensive understanding of the physiological responses of taxa to each other and the environment4,5,6. However, NMR is less sensitive than other metabolomic techniques, making it difficult to apply to natural microbial systems where sample populations can be low-density and metabolite concentrations low compared to metabolites from well-defined and readily extractable sources such as whole tissues, biofluids or cell-cultures. Consequently, the few direct environmental metabolomic studies of microbes performed to date have been limited to culture-based or easily defined high-density ecosystems such as host-symbiont systems, constructed co-cultures or manipulations of the gut environment where stable isotope labeling can be additionally used to enhance NMR signals7,8,9,10,11,12. Methods that facilitate the concentration and collection of environmental metabolites at concentrations suitable for NMR are lacking. Since recent attention has been given to the environmental metabolomics of organisms within the aquatic environment, where much of the energy and material flow is mediated by the planktonic community13,14, we have developed a method for the concentration and extraction of whole-community metabolites from planktonic microbial systems by filtration. Commercially available hydrophilic poly-1,1-difluoroethene (PVDF) filters are specially treated to completely remove extractables, which can otherwise appear as contaminants in subsequent analyses. These treated filters are then used to filter environmental or experimental samples of interest. Filters containing the wet sample material are lyophilized and aqueous-soluble metabolites are extracted directly for conventional NMR spectroscopy using a standardized potassium phosphate extraction buffer2. Data derived from these methods can be analyzed statistically to identify meaningful patterns, or integrated with other omics levels for comprehensive understanding of community and ecosystem function.

A method for metabolite extraction from microbial planktonic communities is presented. Whole community sampling is achieved by filtration onto specially prepared filters. After lyophilization, aqueous-soluble metabolites are extracted. This approach allows for application of environmental metabolomics to trans-omics investigations of natural or experimental microbial communities.

Concentração de metabólitos de comunidades de baixa densidade fitoplanctônicas para Metabolomics ambiental utilizando Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear

Environmental metabolomics is an emerging field that is promoting new understanding in how organisms respond to and interact with the environment and each ...

Quantifying Mixing using Magnetic Resonance Imaging

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture. This work involves mixing two viscous liquid streams using an in-line static mixer. The mixer is a split-and-recombine design that employs shear and extensional flow to increase the interfacial contact between the components. A prototype split-and-recombine (SAR) mixer was constructed by aligning a series of thin laser-cut Poly (methyl methacrylate) (PMMA) plates held in place in a PVC pipe. Mixing in this device is illustrated in the photograph in Fig. 1. Red dye was added to a portion of the test fluid and used as the minor component being mixed into the major (undyed) component. At the inlet of the mixer, the injected layer of tracer fluid is split into two layers as it flows through the mixing section. On each subsequent mixing section, the number of horizontal layers is duplicated. Ultimately, the single stream of dye is uniformly dispersed throughout the cross section of the device.
 Using a non-Newtonian test fluid of 0.2% Carbopol and a doped tracer fluid of similar composition, mixing in the unit is visualized using magnetic resonance imaging (MRI). MRI is a very powerful experimental probe of molecular chemical and physical environment as well as sample structure on the length scales from microns to centimeters. This sensitivity has resulted in broad application of these techniques to characterize physical, chemical and/or biological properties of materials ranging from humans to foods to porous media 1, 2. The equipment and conditions used here are suitable for imaging liquids containing substantial amounts of NMR mobile 1H such as ordinary water and organic liquids including oils. Traditionally MRI has utilized super conducting magnets which are not suitable for industrial environments and not portable within a laboratory (Fig. 2). Recent advances in magnet technology have permitted the construction of large volume industrially compatible magnets suitable for imaging process flows. Here, MRI provides spatially resolved component concentrations at different axial locations during the mixing process. This work documents real-time mixing of highly viscous fluids via distributive mixing with an application to personal care products.

Magnetic resonance imaging (MRI) provides a powerful tool to evaluate the effectiveness of process equipment during operation. We discuss the use of MRI to visualize mixing in a static mixer. The application is relevant to personal care products, but can be applied to a broad range of food, chemical, biomass and biological fluids.

Quantificar mistura usando Ressonância Magnética

Mixing is a unit operation that combines two or more components into a homogeneous mixture.  This work involves mixing two viscous liquid streams using an ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself Dispositivo de Recuperação de amostras criopreservadas cair acidentalmente em Tanques de armazenamento criogênico

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

An Analytical Tool that Quantifies Cellular Morphology Changes from Three-dimensional Fluorescence Images

The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for inclusion and exclusion of data points, and computer-aided pattern recognition to support the interpretation and findings of the analysis. It has become increasingly important to be able to measure fluorescence images constructed from three-dimensional (3D) datasets in order to be able to capture the complexity of cellular dynamics and understand the basis of cellular plasticity within biological systems. Sophisticated microscopy instruments have permitted the visualization of 3D fluorescence images through the acquisition of multispectral fluorescence images and powerful analytical software that reconstructs the images from confocal stacks that then provide a 3D representation of the collected 2D images. Advanced design-based stereology methods have progressed from the approximation and assumptions of the original model-based stereology1 even in complex tissue sections2. Despite these scientific advances in microscopy, a need remains for an automated analytic method that fully exploits the intrinsic 3D data to allow for the analysis and quantification of the complex changes in cell morphology, protein localization and receptor trafficking. 
Current techniques available to quantify fluorescence images include Meta-Morph (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) and Image J (NIH) which provide manual analysis. Imaris (Andor Technology, Belfast, Northern Ireland) software provides the feature MeasurementPro, which allows the manual creation of measurement points that can be placed in a volume image or drawn on a series of 2D slices to create a 3D object. This method is useful for single-click point measurements to measure a line distance between two objects or to create a polygon that encloses a region of interest, but it is difficult to apply to complex cellular network structures. Filament Tracer (Andor) allows automatic detection of the 3D neuronal filament-like however, this module has been developed to measure defined structures such as neurons, which are comprised of dendrites, axons and spines (tree-like structure). This module has been ingeniously utilized to make morphological measurements to non-neuronal cells3, however, the output data provide information of an extended cellular network by using a software that depends on a defined cell shape rather than being an amorphous-shaped cellular model. To overcome the issue of analyzing amorphous-shaped cells and making the software more suitable to a biological application, Imaris developed Imaris Cell. This was a scientific project with the Eidgen&ouml;ssische Technische Hochschule, which has been developed to calculate the relationship between cells and organelles. While the software enables the detection of biological constraints, by forcing one nucleus per cell and using cell membranes to segment cells, it cannot be utilized to analyze fluorescence data that are not continuous because ideally it builds cell surface without void spaces. To our knowledge, at present no user-modifiable automated approach that provides morphometric information from 3D fluorescence images has been developed that achieves cellular spatial information of an undefined shape (Figure 1). 
We have developed an analytical platform using the Imaris core software module and Imaris XT interfaced to MATLAB (Mat Works, Inc.). These tools allow the 3D measurement of cells without a pre-defined shape and with inconsistent fluorescence network components. Furthermore, this method will allow researchers who have extended expertise in biological systems, but not familiarity to computer applications, to perform quantification of morphological changes in cell dynamics.

We developed a software platform that utilizes Imaris Neuroscience, ImarisXT and MATLAB to measure the changes in morphology of an undefined shape taken from three-dimensional confocal fluorescence of single cells. This novel approach can be used to quantify changes in cell shape following receptor activation and therefore represents a possible additional tool for drug discovery.

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The most common software analysis tools available for measuring fluorescence images are for two-dimensional (2D) data that rely on manual settings for ...

Dithranol as a Matrix for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Imaging on a Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly using MALDI (matrix&#160;assisted laser desorption/ionization)-based analytical techniques. New matrices for small-molecule MSI, which can improve the analysis of low-molecular weight (MW) compounds, are needed. These matrices should provide increased analyte signals while decreasing MALDI background signals. In addition, the use of ultrahigh-resolution instruments, such as Fourier transform ion cyclotron resonance (FTICR) mass spectrometers, has&#160;the ability to resolve analyte signals from matrix signals, and this can partially overcome many problems associated with the background originating from the MALDI matrix. The reduction in the intensities of the metastable matrix clusters by FTICR MS can also help to overcome some of the interferences associated with matrix peaks on other instruments. High-resolution instruments such as the FTICR mass spectrometers are advantageous as they can produce distribution patterns of many compounds simultaneously while still providing confidence in chemical identifications. Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging. In this work, a protocol for the use of DT for MALDI imaging of endogenous lipids from the surfaces of mammalian tissue sections, by positive-ion MALDI-MS, on an ultrahigh-resolution hybrid quadrupole FTICR instrument has been provided.

Dithranol (DT; 1,8-dihydroxy-9,10-dihydroanthracen-9-one) has previously been reported as a MALDI matrix for tissue imaging of small molecules; protocols for the use of DT for the MALDI imaging of endogenous lipids on the surface of tissue sections&#160;by positive-ion MALDI-MS on an ultrahigh-resolution quadrupole-FTICR instrument are provided here.

Dithranol como Matrix Assisted Laser Matrix para dessorção / ionização de imagem em um Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometer

Mass spectrometry imaging (MSI) determines the spatial localization and distribution patterns of compounds on the surface of a tissue section, mainly ...

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking metabolism and inflammation (e.g.&#160;hepatic steatosis)1,2. There has been much progress in the identification of agonist ligands for PXR, however, there are limited descriptions of drug-like antagonists and their binding sites on PXR3,4,5. A critical barrier has been the inability to efficiently purify full-length protein for structural studies with antagonists despite the fact that PXR was cloned and characterized in 1998. Our laboratory developed a novel high throughput yeast based two-hybrid assay to define an antagonist, ketoconazole&#39;s, binding residues on PXR6. Our method involves creating mutational libraries that would rescue the effect of single mutations on the AF-2 surface of PXR expected to interact with ketoconazole. Rescue or &#34;gain-of-function&#34; second mutations can be made such that conclusions regarding the genetic interaction of ketoconazole and the surface residue(s) on PXR are feasible. Thus, we developed a high throughput two-hybrid yeast screen of PXR mutants interacting with its coactivator, SRC-1. Using this approach, in which the yeast was modified to accommodate the study of the antifungal drug, ketoconazole, we could demonstrate specific mutations on PXR enriched in clones unable to bind to ketoconazole. By reverse logic, we conclude that the original residues are direct interaction residues with ketoconazole. This assay represents a novel, tractable genetic assay to screen for antagonist binding sites on nuclear receptor surfaces. This assay could be applied to any drug regardless of its cytotoxic potential to yeast as well as to cellular protein(s) that cannot be studied using standard structural biology or proteomic based methods. Potential pitfalls include interpretation of data (complementary methods useful), reliance on single Y2H method, expertise in handling yeast or performing yeast two-hybrid assays, and assay optimization.

Ketoconazole binds to and antagonizes Pregnane X Receptor (PXR) activation. Yeast high throughput screens of PXR mutants define a unique region for ketoconazole binding. This yeast-based genetic method discovers novel nuclear receptor interactions with ligands that associate with surface binding sites.

Reverter levedura Sistema de dois híbridos para identificar mamíferos Receptor Nuclear Resíduos que interagem com ligantes e / ou antagonistas

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein complexes to atomic resolution. However, protein isolation techniques and sample preparation methods for EM remain a bottleneck. A relatively small number (100,000 to a few million) of individual protein particles need to be imaged for the high-resolution analysis of proteins by the single particle EM approach, making miniaturized sample handling techniques and microfluidic principles feasible.
A miniaturized, paper-blotting-free EM grid preparation method for sample pre-conditioning, EM grid priming and post processing that only consumes nanoliter-volumes of sample is presented. The method uses a dispensing system with sub-nanoliter precision to control liquid uptake and EM grid priming, a platform to control the grid temperature thereby determining the relative humidity above the EM grid, and a pick-and-plunge-mechanism for sample vitrification. For cryo-EM, an EM grid is placed on the temperature-controlled stage and the sample is aspirated into a capillary. The capillary tip is positioned in proximity to the grid surface, the grid is loaded with the sample and excess is re-aspirated into the microcapillary. Subsequently, the sample film is stabilized and slightly thinned by controlled water evaporation regulated by the offset of the platform temperature relative to the dew-point. At a given point the pick-and-plunge mechanism is triggered, rapidly transferring the primed EM grid into liquid ethane for sample vitrification. Alternatively, sample-conditioning methods are available to prepare nanoliter-sized sample volumes for negative stain (NS) EM.
The methodologies greatly reduce sample consumption and avoid approaches potentially harmful to proteins, such as the filter paper blotting used in conventional methods. Furthermore, the minuscule amount of sample required allows novel experimental strategies, such as fast sample conditioning, combination with single-cell lysis for &#34;visual proteomics,&#34; or &#34;lossless&#34; total sample preparation for quantitative analysis of complex samples.

An instrument and methods for the preparation of nanoliter-sized sample volumes for transmission electron microscopy is presented. No paper-blotting steps are required, thus avoiding the detrimental consequences this can have for proteins, significantly reducing sample loss and enabling the analysis of single cell lysate for visual proteomics.

Preparação da amostra miniaturizada para microscopia eletrônica de transmissão

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...