Bu protokol, fibro adipojenik, progenitörler ve kas kök hücrelerinin floresan aktivatörleri kullanılarak eşzamanlı izolasyonu için bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu hücrelerin saf popülasyonları, fizyolojik ve patolojik koşullardaki biyolojik rollerini anlamak için bir ön koşuldur. Bu teknik kullanılarak, Forbes ve kas kök hücreleri tanımlandı ve koltuk altından veya yaralı kastan izole edildi.
Forbes ve kas kök hücrelerinin yüksek dolgulu dokunulmazlığı, bu hücreleri sakarin transplantasyonu ve çamurlu karışım analizi gibi farklı aşağı akış teknikleri için kullanmamıza izin vermiştir. Başlamak için, ötenazi fare sırtüstü yatağını bir diseksiyon pedine yerleştirin ve% 70 etanol ile püskürtün Kirlenmeyi önlemek için fare göbek derisinin merkezini sıkıştırmak ve yatay olarak yaklaşık bir santimetre açıklığı kesmek için forseps kullanın. Altındaki kasları ortaya çıkarmak için açıklığı ters yönlere çekerek faredeki yara kenarlarını ve diski kavrayın, o sırada arka bacağın bir tarafını ortaya çıkarın.
Kasları toplamadan önce, fibro adipojenik progenitör hücrelerin ve kas kök hücrelerinin izolasyonunu iyileştirmek için kuadrisepsin proksimal ucundaki hamstringler arasındaki intermüsküler yağları çıkarın. Daha sonra, dokuya zarar vermeden, alt tibialis anterior veya TA ve ekstansör digitorum longus veya EDL kaslarını açığa çıkarmak için fasyayı kırmak ve soymak için keskin forseps kullanın. Kasları tibiadan ayırmak için forsepslerin keskin ucunu TA EDL kaslarının altında çalıştırın.
Tendonları kesin, TA EDL'yi ayak bileğine takın ve forseps ile tutarken, kasları TA EDL'nin uzunlamasına çizgisi boyunca makasla kesin. Tüm TA EDL kaslarını ayırmak için diz çevresindeki tendonları kesin. Kasları buz üzerinde tutulan altı santimetrelik bir kaba yerleştirin.
Gastroknemius kaslarını izole etmek için ayak bileğindeki tüm tendonları kesin ve kasları tibia ve fibuladan ayırın. Diz çevresini kesin ve kasları tabağa aktarın. Kuadrisepslerin etrafındaki fasyayı soyun ve forsepslerin keskin ucunu kas ve kemik arasında çalıştırarak femurdan ayırın.
Diz çevresindeki tendonları kesin ve kuadrisepsleri distal uçta forseps ile tutarken femur boyunca keserek kasın geri kalanını kesin. Kasları altı santimetrelik tabağa yerleştirin. Hamstringleri ve femur etrafındaki kalan kasları ayırın ve bunları yemeğe aktarın.
Arka bacak kaslarını buz üzerinde tutulan bir tabakta toplayın. Bulaşıktan yıkama ortamını aspire edin ve kasları nemli tutmak için bir ila iki mililitre kas ayrışma tamponu ekleyin. Daha sonra, kasları iyice kıyın Kasları yırtmak ve dilimlemek için bir neşter kullanın ve daha sonra iyi kıyılmış dokudan oluşan bir bulamaç macunu elde edene kadar kası bir ila iki dakika boyunca küçük parçalara ayırmaya devam etmek için makas kullanın.
Daha sonra kıyılmış kasları kas ayrışma tamponu içeren konik tüpe aktarın. Tüpleri laboratuvar filmi ile kapatın ve bir saat boyunca ajitasyonlu 37 santigrat derecelik bir su banyosunda inkübe edin. Bir saat sonra, tüpü çalkalayıcıdan çıkarın ve 50 mililitreye kadar doldurun Yıkama ortamı ile, karıştırmayı sağlamak için tüpü iki kez yavaşça ters çevirin.
Hücreleri sallanan bir kova Rotorunda 250 kez G'de dört santigrat derecede beş dakika boyunca santrifüj yapın. 42 mililitre süpernatantı iki yeni tüpe aktarın ve orijinal tüpte sekiz mililitre bırakın. 21 mililitre süpernatant içeren yeni tüpleri 50 mililitreye kadar yıkama ortamı ile doldurun.
Daha sonra hücreleri dört santigrat derecede sekiz dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj edin. Süpernatantı aspire edin ve peletleri buz üzerinde tutun. Daha sonra, sekiz mililitre kas ayrışma tamponu içeren orijinal tüpe bir mililitre kollajenaz iki stok ve bir mililitre dis bazlı stok ekleyin.
Beş mililitrelik serolojik pipet kullanarak peleti tıkanmadan 10 kez askıya alın. Çözeltiyi tüpün duvarına doğru çıkarın ve oluşum kabarcıklarından kaçının. Tüpleri laboratuvar filmi ile kapatın ve 30 dakika boyunca ajitasyonlu 37 santigrat derece su banyosunda inkübe edin.
30 dakika sonra, tüpü çalkalayıcı aspirattan çıkarın ve kas süspansiyonunu 20 gauge iğneli 10 mililitrelik bir şırıngadan 10 kez çıkarın, her tüpü 50 mililitreye kadar yıkama ortamı ile doldurun ve tüpü ters çevirin. Daha sonra dört santigrat derecede beş dakika boyunca 250 kez G'de santrifüj yapın ve süpernatantı yeni bir tüpe aktarın. Orijinal tüpte sekiz mililitre bırakmak.
Yeni tüpü 50 mililitreye kadar yıkama ortamıyla doldurun, hücreleri dört santigrat derecede sekiz dakika boyunca 350 kez G'de santrifüj edin. Süpernatantı çıkarın ve peleti buz üzerinde tutun. Sekiz mililitre yıkama ortamı içeren orijinal 50 mililitrelik konik tüpe 40 mikron naylon hücre süzgeci yerleştirin ve süzgeci bir ila iki mililitre yıkama ortamı ile önceden ıslatın.
Süzgeci tutarken, peleti nazikçe yeniden askıya almak için 10 mililitrelik bir pipet kullanın. Hücre kaybını en aza indirmek için süspansiyonu hücre süzgecinden aynı tüpe geri filtreleyin. Peletleri yeniden askıya almak ve çözeltiyi orijinal tüpte bulunan kendinden süzgeçlere aktarmak için her boruya dört ila beş mililitre yıkama ortamı ekleyerek diğer boru peletlerini orijinal tüpe geri filtreleyin.
Tüm peletleri orijinal 50 mililitrelik tüpe topladıktan sonra, kendinden süzgeci dört ila beş mililitre başka bir yıkama ortamı ile durulayın. Kendinden süzgeçlerin alt tarafındaki tüm sıvıyı toplamak için 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Her tüpü 50 mililitreye kadar yıkama ortamıyla doldurun ve tüpü ters çevirin.
Tüpü dört santigrat derecede beş dakika boyunca 250 kez G'de santrifüj yapın. Pelet rahatsız etmeden süpernatantı derhal çıkarın ve peleti 600 mikrolitre yıkama ortamında yeniden askıya alın. Süspansiyonu iki mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarın.
Hücre süspansiyonu içeren iki milimetrelik bir tüpe CD 31 APC CD 45 APC SCA bir Pasifik Mavisi VCAM bir biyotin ve alfa yedi Integrin PE antikorları ekleyin. Hücreleri nazikçe karıştırın ve dört santigrat derecede dönen bir çalkalayıcıda 45 dakika boyunca ışıktan koruyun. Kuluçkadan sonra, iki mililitreye kadar olan tüm tüpleri yıkama ortamı ile doldurun ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 250 kez G'de santrifüj yapın.
Süpernatantı çıkarın ve peleti 300 mikrolitre yıkama ortamında yeniden askıya alın. Daha sonra, tüplere streptavidin antikoru ekleyin ve hücreleri 20 dakika boyunca dört santigrat derecede dönen bir çalkalayıcıda inkübe edin. Kuluçkadan sonra, streptavidin antikoru içeren tüpleri yıkama ortamı ile iki mililitreye doldurun.
Daha sonra, tüpleri santrifüj edin ve süpernatantı tamamen aspire edin. İkinci yıkamadan sonra, deney tüpündeki hücreleri 500 mikrolitre yıkama ortamında yeniden askıya alın. 200 mikrolitre yıkama ortamına sahip beş mililitrelik polistiren yuvarlak alt tüpün bir hücre süzgeci kapağını önceden ıslatın.
Hücre süspansiyonunu deney tüpünden beş mililitrelik polistiren yuvarlak alt tüpe aktarın ve yerçekimi ile filtrelenmesine izin verin. Deneysel numune süspansiyonunu içeren iki mililitrelik tüpü 300 mikrolitre yıkama ortamı ile yazdırın ve aynı süzgeç kapağından geçirin. Hücre süzgecinin alt tarafındaki tüm sıvıyı toplamak için 200 mikrolitrelik bir pipet kullanın.
Bir kapakla kapatın, tüpleri buz üzerinde bırakın ve ışıktan koruyun. Fibro adipojenik progenitör ve kas kök hücrelerinin izolasyonu için benimsenen geçit stratejisi burada gösterilmiştir. Muhabir farelerdeki PD GFR alfa E G F P vuruşu, endojen PD G FFR alfa lokusundaki H iki B E G F P füzyon genini ifade eder ve PD G GFR alfa soyunun verimli ve spesifik olarak etiketlenmesini sağlar.
İzole hücre popülasyonlarının saflığı, ko-kültür GFP pozitif fibro adipojenik progenitör ve kas kök hücrelerinin PAC-yedi antikorları ile immün boyanması ile doğrulandı. GFP pozitif fibro adipojenik progenitör PAC-seven belirtecini eksprese etmezken, kas kök hücreleri bu antikor ile reaksiyona girdi. Tüm GFP eksprese eden hücreler SCA bir için pozitif ve CD 31, CD 45 VCAM bir ve alfa yedi integrin için negatifti.
Fibro adipojenik progenitör ve yaralanmadan yedi gün sonra toksin içermeyen intramüsküler enjeksiyonlarla yaralanan farelerden izole edilen kas kök hücreleri gösterilmiştir. Kas kök hücreleri aktive edildikçe hücresel boyutta bir artış. F SCA ve SS CA parametrelerini ayarlamak ve kapıyı bu hücreleri merkeze dahil edecek şekilde genişletmek önemlidir.
Fibro adipojenik progenitör ve kas kök hücrelerinin yaralanmamış ve yaralanma sonrası yedi gün sonraki TA kaslarında nicelleştirilmesi burada gösterilmiştir. Her ne kadar pik ve proliferasyon iki ila üç gün arasında gözlense de, düşük proliferasyon hücresi oranı, yaralanmadan yedi gün sonra hala kayda değerdi. Uygun kas kıyma işleminin yapılması, tek bir hücrenin serbest bırakılması için kritik öneme sahiptir.
Ayrıca, mononükleotid hücre izolasyonu, süspansiyonun 20 ölçülü bir iğne ile 10 mililitrelik bir şırıngaya çalıştırılmasıyla elde edilir. Bu teknik, bilim adamlarının Forbes ve kas kök hücrelerinin biyolojik transkripsiyonel ve epigenomik profilini normal durumda ve kas rejenerasyonunun daha derin aşamalarında incelemelerine yardımcı olacaktır.
