Bu çalışma Çocuk Kanser araştırma fonu (CCRF) ve NIH R01 AI146009 tarafından B.S.M'a finanse edildi.

Sağlıklı donörlerden lökerez örnekleri yerel bir kan bankasından alındı. Burada açıklanan tüm deneyler Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından araştırmadan muaf olarak belirlenmiş ve Minnesota Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Tüm deneyler kan kaynaklı patojenler için evrensel önlem doğrultusunda, steril/aseptik teknikler ve uygun biyogüvenlik seviye-2 ekipmanları ile gerçek gerçekleştirildi.
1. B hücre genişletme ortamı için takviyeler hazırlayın
<ol><li>CpG oligonükleotidini 1 mg/mL konsantrasyona yeniden inşa edin.</li>
	<li>CD40 ligandını (CD40L) 100 μg/mL konsantrasyonda yeniden inşa edin.</li>
	<li>Rekombinant insan IL-10'u (rhIL-10) 50 μg/mL konsantrasyona yeniden inşa edin.</li>
	<li>Rekombinant insan IL-15'i (rhIL-15) 10 μg/mL konsantrasyona yeniden inşa edin. NOT: Her takviyeyi -20 °C ila -80 °C'de 6 aya kadar küçük aliquotlarda saklayın.</li>
</ol>2. Bazal ortam hazırlayın
<ol><li>B hücreli bazal ortamı, in vitro immün hücre genişlemesi (örneğin, CTS Immune Cell SR) ve% 1 (v/v) penisilin ve streptomisiin için% 5 (v/v) medya takviyesi ile birleştirin.</li>
	<li>Bazal ortamı 0,22 μm filtre adaptörü kullanarak sterilize edilmiş bir şişeye filtreleyin.</li>
	<li>Bazal ortamı 1 aya kadar 4 °C'de tutun.</li>
</ol>3. B hücre genişletme ortamını hazırlayın
<ol><li>B hücrelerini 5 × 105 hücre/mL'de kültüre etmek için gerekli miktarda bazal ortamı steril bir kaba aktarın.</li>
	<li>Bazal ortamı 1 μg/mL CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10 ve 10 ng/mL rhIL-15 ile destekleyin.</li>
	<li>B hücre genişletme ortamını 0,22 μm filtre kullanarak filtreleyin.</li>
	<li>B hücre genleşme ortamını doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de, %5 CO2'de kullanmadan önce en az 30 dakika boyunca nemle dengeler. NOT: Bir gün boyunca kullanmak üzere taze B hücre genişletme ortamı hazırlayın. B hücresi genişletme ortamını birden çok gün boyunca kullanmak üzere hazırlamayın. Bu medya tarifi, bellek B hücrelerinin ve aktif birincil insan B hücrelerinin çoğalmasını teşvik eder.</li>
</ol>4. İnsan B hücreli arınma ve genişleme
NOT: Üreticinin talimatına uyarak sıcaklık kontrollü bir dondurma kabına %99-100 izopropil alkol ekleyin ve 4.1. adıma başlamadan önce dondurma kabını 4 °C'de soğutun.
<ol><li>PBMC'leri lökorezis örneğinden ayırma
	<ol>
<li>Lökorezis örneğini (yaklaşık 8-10 mL) steril 50 mL konik tüpe aktarın.</li>
		<li>Steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile hacmi 35 mL'ye getirin.</li>
		<li>35 mL lökorezis örneğini 15 mL yoğunluk degrade ortamına dikkatlice katmanlayın.</li>
		<li>Fren olmadan 25 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj yapın, buffy coat'u (PBMC katmanı) rahatsız etmeden plazma tabakasını çıkarın, PBMC'leri arayüzden toplayın ve yeni bir steril 50 mL konik tüpe aktarın.</li>
		<li>PBMC'leri 1x PBS ile 50 mL'ye getirin.</li>
		<li>Frensiz 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj. Kırmızı görünebilecek PBMC peletini bozmadan üst düğmeyi çıkarın.</li>
		<li>7 mL amonyum-klorür-potasyum lizis tamponu, iyice karıştırmak için pipet 3 kez ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 3 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>1x PBS ile sesi 50 mL'ye getirin.</li>
		<li>Düşük direnç freni ile 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj. Peletin rahatsız etmeden süpernatant çıkarın. Pelet pembemsi veya beyaz görünmelidir. NOT: Yeni yalıtılmış B hücrelerini kültüre etmeye devam etmek için, B hücre yalıtımını başlatmadan önce B hücresi genişletme ortamını hazırlayın (adım 4.2).</li>
	</ol></li>
	<li>İnsan birincil B hücresi negatif izolasyon kiti kullanan PBMC'lerden B hücresi yalıtımı
	<ol>
<li>İzolasyon arabelleğindeki PBMC'leri 5 × 107 hücre/mL konsantrasyona yeniden biriktirin. NOT: PBMC'lerin toplam sayısı 5 × 107 hücreden azsa, 5 × 107 hücre/mL korumak için yalıtım arabelleği hacmini küçültün. Minimum ve maksimum hücre süspansiyonu hacimleri sırasıyla 0,25 mL ve 8 mL'dir.</li>
		<li>8 mL'ye (5 × 107 hücre/mL) kadar steril, polipropilen, kapaklı yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.</li>
		<li>PBMC'lere 50 μL/mL Kokteyl Arttırıcı ekleyin.</li>
		<li>PBMC'lere 50 μL/mL İzolasyon Kokteyli ekleyin, tüpü kaplayın ve karıştırmak için 2-3 kez ters çevirin.</li>
		<li>RT'de 5 dakika kuluçkaya yatır; inkübasyonun4. dakikasında, en az 30 sn boyunca girdap manyetik mikrobeadlar.</li>
		<li>1 mL PBMC başına 50 μL manyetik mikrobead aktarın, tüpü kaplayın ve karıştırmak için 2-3 kez ters çevirin.</li>
		<li>İzolasyon tamponu ile 10 mL'ye kadar üst üste yerleştirin ve 2-3 kez hafifçe pipetleyin.</li>
		<li>Tüpü manyetik bir istasyona yerleştirin ve RT'de 3 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Mıknatısı ve tüpü bir arada tutun ve bir hareketle, hücre süspansiyonu yeni tüpe dökmek için mıknatısı ve tüpü birlikte ters çevirin. Eski tüpü atın.</li>
		<li>4.2.8 adımını tekrarlayın (kuluçka süresini 2 dakikaya düşürün) ve B hücre süspansiyonunu temiz bir konik tüpe dökün.</li>
		<li>Zenginleştirilmiş B hücreleri kullanıma hazırdır. Hücreler hemen kullanılacaksa, bölüm 4.3'e (İnsan B hücresi genişlemesi) devam edin. İzole edilmiş B hücrelerinin saflığını akış sitometrisine göre kontrol edin (isteğe bağlı). Hücreler kullanılmadan önce dondurulacaksa, 4.2.12 adımına devam edin.</li>
		<li>B hücrelerini dondurmak için, 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjün ve peletin rahatsız etmeden süpernatantı atın.</li>
		<li>Hücreleri 10 7 hücre/mL ve aliquot1 mL/cryovial'da donma ortamında yeniden depolar.</li>
		<li>Cryovial'ı soğutulmuş dondurma kabına yerleştirin ve gece boyunca -80 °C'de saklayın; daha sonra, dondurulmuş cryovial'ı sıvı bir azot tankına aktarın; donmuş hücreleri 1 yıla kadar saklayın. NOT: İzole B hücrelerinin beklenen verimi toplam PBMC'lerin %2-%8'idir ve %95-%99 yaşayabilirlik oranına sahiptir.</li>
	</ol></li>
	<li>İnsan B hücresi genişlemesi NOT: Yeni yalıtılmış B hücreleri kullanıyorsanız, 4.3.1–4.3.5 adımlarını atlayın. Hücreleri sayın ve gerekli sayıda hücreyi steril konik bir tüpe aktarın ve 4.3.6 adımına devam edin.<ol>
<li>B hücrelerini çözmeden önce bir su banyosunda önceden ısınan fetal sığır serumu (FBS). 20 mL B hücreli genleşme ortamı hazırlayın, bir T25 şişesine aktarın ve ortamı kullanımdan en az 15 dakika önce bir doku kültürü inkübatöründe (37 °C,% 5 CO2, nem ile) ön aşındırın.</li>
		<li>B hücrelerini 37 °C su banyosunda çözün. Beklerken, önceden ısıtılmış 2 mL FBS'yi steril 15 mL konik bir tüpe aktarın.</li>
		<li>B hücreleri tamamen çözüldükten sonra, hemen numuneye damla açısından 1 mL önceden ısıtılmış FBS ekleyin. RT'de 1 dakika kuluçkaya yaslanın.</li>
		<li>Numuneyi yeniden çıkarmak ve tüm hacmi damla yönünde, önceden ısıtılmış 2 mL FBS içeren konik bir tüpe aktarmak için hafifçe pipet.</li>
		<li>Steril 1x PBS, kapak ile hacmi 15 mL'ye getirin ve tüpü 2-3 kez hafifçe ters çevirin.</li>
		<li>5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj.</li>
		<li>Hücre peletini bozmadan süpernatantı atın, hücre peletini 1 mL önceden dengelenmiş B hücre genişletme ortamı ile yeniden atın ve hücreleri sayın. Toplam hücre sayısı yaklaşık 107 hücre olmalıdır.</li>
		<li>Hücreleri önceden dengelenmiş B hücre genişletme ortamının 20 mL'lik bir şişeye aktarın. Hücrelerin son konsantrasyonu yaklaşık 5 x 105 hücre/mL olmalıdır.</li>
		<li>Şişeyi bir doku kültürü inkübatöründe dikey olarak kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>B hücrelerinin tüm hacmini steril konik bir tüpe aktararak genişletme ortamını her 2 günde bir tamamen yenileyin ve 4.3.6–4.3.9 adımlarını tekrarlayın. NOT: T25 şişesi 10-20 mL orta dayanabilir; T75 şişesi 20-60 mL'ye kadar orta dayanabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Birincil insan B hücre mühendisliği
<ol><li>Mühendis B hücreleri, optimum sonuçlar için genişleme/aktivasyondan sonra 48 ± 2 saat. B hücre genleşme ortamını hazırlayın, ortamın 1 mL'lik aliquot'ını 48 kuyulu bir doku kültürü plakasına hazırlayın ve kullanımdan en az 15 dakika önce bir doku kültürü inkübatöründe ön dengeyi kullanın. NOT: İlgi çekici bir gen için CRISPR/Cas9 sgRNA tasarlarken, aşağıda özetlenen adımları izleyin. - Çevrimiçi bir araç kullanarak sgRNA'lar tasarlayın11. - Proteinin tüm izoformlarında ortak olan bir ekson üzerinde sgRNA'lar tasarlayın. - Saygın şirketlerden kimyasal olarak değiştirilmiş sgRNA sipariş edin. - sgRNA genellikle lyophilized formda gelir; steril DNase/RNase içermeyen Tris-EDTA (TE) tamponunda sgRNA'yı 1 μg/μL konsantrasyonda yeniden inşa edin.</li>
	<li>Kimyasal olarak modifiye edilmiş 1,5 μL (1 μg/μL) kimyasal modifiye Streptococcus pyogenes Cas 9 (S.p. Cas9) nükleaz per transeksiyon reaksiyonu ile 1 μL (1 μg/μL) karıştırarak CRISPR/Cas9 transfecting substratı hazırlayın. Kontrol için sgRNA yerine 1 μL TE arabelleği kullanın. NOT: CD19 sgRNA gen KO deneyi için kullanıldığında, sonuçlar için Şekil 2'ye bakın. Bir gen KI deneyi için AAVS1 sgRNA kullanıldığında, sonuçlar için Şekil 5'e bakın.<ul>
<li>Tüm bileşenleri buzda tutun.</li>
	</ul></li>
	<li>Hafifçe karıştırın ve reaksiyon başına 2,5 μL CRISPR/Cas9 transfeksiyon substratını 0,2 mL 8 tüplü bir şeritli bir tüpe aktarın; RT'de bir kenara koyun.</li>
	<li>Bir nükleofector (elektroporatör) açın ve Tablo 1'degösterildiği gibi transfeksiyon reaktifleri hazırlayın. NOT: Bu, gerekirse tüm reaktifleri buza koyarak duraklama için iyi bir adımdır. Deneye devam etmeye hazır olduğunuzda tüm reaktifleri buzdan çıkarın. S.p. Cas9 proteinini kullanırken, araştırmacı CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoprotein'i 1 μg sgRNA'yı 5 μg S.p. Cas9 proteini ile karıştırarak, kabarcıklardan kaçınarak ve optimum sonuçlar için kullanmadan önce karışımı RT'de en az 20 dakika inkübe ederek önceden karmaşık hale etmelidir.</li>
	<li>Transeksiyon reaksiyonuna 106 B hücreyi steril konik bir tüpe sayın ve aktarın.</li>
	<li>Steril 1x PBS ile hacmi 15 mL'ye getirin ve 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj. Beklerken, birincil hücre transfeksiyon reaktifini (Tablo 2) hazırlayın ve RT'de bir kenara koyun.</li>
	<li>Hücre peletini bozmadan süpernatant atın.</li>
	<li>Hücre peletini 10 mL steril 1x PBS ve santrifüj ile 400 × g'da 5 dakika boyunca yeniden ıslatın.</li>
	<li>Hücre peletini bozmadan süpernatant'ı tamamen atın.</li>
	<li>106 B hücre başına 0,5 μg kimyasal olarak modifiye edilmiş GFP mRNA'yı (transfeksiyon muhabiri olarak) hücre peletine aktarın (isteğe bağlı).</li>
	<li>Hücre peletini 106 B hücre başına 20 μL birincil hücre transfeksiyon reaktifi ile yeniden biriktirin; 5-6 kez pipetleme ile hafifçe karıştırın. CRISPR/Cas9 transfeksiyon substratının 2,5 μL'sini içeren 8 tüplü şeridin 0,2 mL tüpüne transfeksiyon reaksiyonu başına 20,5 μL aktarın.</li>
	<li>Pipet, tüm hacmi (23 μL) bir transfection cuvette'e karıştırmak ve aktarmak için bir kez yukarı ve aşağı. Sıvının cuvette'in altını kapladığından emin olmak için tezgah üzerindeki cuvette'i hafifçe kaplayın ve dokunun.</li>
	<li>Transfection için nükleofectorda insan birincil B hücre protokolünü kullanın. NOT: Nükleofector (elektroporatör) doku kültürü başlığının dışına yerleştirilecek ve kullanılabilir. Steriliteyi sağlamak için cuvette'i kapla.</li>
	<li>Elektroporlu hücreleri 15 dakika boyunca RT'de cuvette dinlendirin.</li>
	<li>Önceden dengelenmiş B hücre genleşme ortamının 80 μL'lik kısmını doku kültürü plakasından cuvette transfeksiyon reaksiyonuna aktarın. Cuvette'i doku kültürü inkübatörüne 30 dakika yerleştirin.</li>
	<li>Numunenin tüm hacmini cuvetten B hücre genleşme ortamının 1 mL'lik 48 kuyulu doku kültürü plakasının uygun bir kuyusuna karıştırmak ve aktarmak için birkaç kez hafifçe pipetlayın. Hücrelerin son konsantrasyonu 106 hücre/mL olmalıdır.</li>
	<li>Bir gen KI deneyi yapıyorsanız, 500.000 çok miktarda enfeksiyonun rAAV6 vektörü elektroporlu hücreler (yaklaşık 45 dk post-electroporation) içeren uygun kuyuya aktarın. Şekil 4A'dakirAAV6 vektör yapısına bakın. NOT: Örneğin: Bir kontrol numunesi CRISPR/Cas9 veya rAAV6 vektörü olmadan elektroporlu hale gelecektir. Crispr/Cas9 olmadan yalnızca vektöre özel bir numune elektroporlanacak ve daha sonra rAAV6 vektörü ile transdüklenecektir. Bir KI numunesi CRISPR/Cas9 ile elektropore edilecek ve daha sonra rAAV6 vektörü ile transdüklenecektir. rAAV6, HDR için hedeflenen DSB sitesinin yukarı ve aşağı akış homoloji kollarını içermelidir.</li>
	<li>Plakayı 37 °C'de bir doku kültürü inkübatörüne ve nem ile% 5 CO2'ye yerleştirin.</li>
	<li>Hücreleri sayın ve mühendislik sonrası 1.</li>
	<li>Hücreleri sayarak ve ardından hücrelerin tüm hacmini temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktararak B hücre genişletme ortamını her 2 günde bir yenileyin. 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj ve peletı bozmadan süpernatantı atın. Hücreleri 100 μL taze B hücre genleşme ortamı ile yeniden biriktirin ve 24 kuyulu bir doku kültürü plakası kuyusuna aktarın. 5 × 105 hücre/mL'de son hücre konsantrasyonuna ulaşmak için orta hacmi getirin. NOT: 48 kuyulu bir plaka 1 mL'ye kadar orta / kuyu tutabilir; 24 kuyulu bir plaka 2 mL'ye kadar orta / kuyu tutabilir; 12 kuyulu bir plaka 4 mL orta / kuyuya kadar dayanabilir ve 6 kuyulu bir plaka 8 mL orta / kuyuya kadar tutabilir.</li>
	<li>Akış sitometrisi analizi, TIDE analizi ve bağlantı PCR'si gibi aşağı akış analizleri yapmadan önce tasarlanmış hücrelerin en az 5 gün boyunca genişlemesine izin verin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>LeBien, T. W., Thomas, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes:+how+they+develop+and+function.">B lymphocytes: how they develop and function.</a> Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).</li><li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells.">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).</li><li>Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immunity+due+to+long-lived+plasma+cells.">Humoral immunity due to long-lived plasma cells.</a> Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).</li><li>Spriggs, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+CD40+ligand+stimulates+B+cell+proliferation+and+immunoglobulin+E+secretion.">Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion.</a> Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).</li><li>Fusil, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentiviral+vector+allowing+physiologically+regulated+membrane-anchored+and+secreted+antibody+expression+depending+on+B-cell+maturation+status.">A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status.</a> Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).</li><li>Luo, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+hematopoietic+stem/progenitor+cells+to+produce+a+broadly+neutralizing+anti-HIV+antibody+after+in+vitro+maturation+to+human+B+lymphocytes.">Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes.</a> Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).</li><li>Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+lentiviral+transduction+and+transgene+expression+in+primary+human+B+cells.">Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).</li><li>Heltemes-Harris, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon+screen+identifies+signaling+modules+that+cooperate+with+STAT5+activation+to+induce+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).</li><li>Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+primary+human+B+cells+with+CRISPR/Cas9+targeted+nuclease.">Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease.</a> Scientific Reports. 8, 12144 (2018).</li><li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+protein-secreting+plasma+cells+by+homology-directed+repair+in+primary+human+B+cells.">Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells.</a> Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).</li><li>Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+CRISPR/Cas9+sgRNA+design+tools.">Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools.</a> Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).</li><li>Rees, H. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base+editing:+precision+chemistry+on+the+genome+and+transcriptome+of+living+cells.">Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).</li><li>Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jim&#233;nez, G., Sarov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+knockout+pipeline+for+reverse+genetics+in+mammalian+cell+culture.">CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture.</a> Methods. 164-165, 49-58 (2019).</li><li>Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+system+for+simultaneous+or+sequential+integration+of+multiple+gene-loading+vectors+into+a+defined+site+of+a+human+artificial+chromosome.">A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome.</a> PLoS One. 9, 110404 (2014).</li><li>Bak, R. O., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+integration+of+large+gene+cassettes+using+AAV+donor+vectors.">CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors.</a> Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).</li><li>Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+viral+gene+therapy+vectors.">Immune responses to viral gene therapy vectors.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).</li><li>Martino, A. T., Markusic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+mechanisms+against+AAV+vectors+in+animal+models.">Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).</li></ol>

M.J.J, K.L. ve B.S.'nin mucit olarak bulunduğu genom düzenlemeli B hücrelerinin yapım ve kullanma yöntemleri hakkında bir patent başvurusu .M. B.S.M, Immusoft Inc.M.

Birincil insan B hücrelerinde hassas genom mühendisliği yakın zamana kadar zorlu olmuştur9,10. Daha önce crispr/cas9 kullanarak birincil insan B hücrelerini tasarlamak için protokoller yayınlamıştık9. Burada, CD19'un verimli KO'suna izin vermek veya EGFP'yivurmak için B hücre yalıtımı, genişletme ve mühendislik için geliştirilmiş protokolleri özetliyoruz.
Burada genişleme protokolümüzün B hücrelerinin kültürde 7 günde 44 kata kadar hızla genişlemesine izin verdiğini gösteriyoruz (Şekil 1). Bu protokol, Johnson ve ark.9 ve Hung ve ark.10 tarafından bildirilenlerden daha hızlı bir genişleme oranı gösterdi Birincil B hücrelerinin sağlıklı ve hızlı genişlemesini sağlamak için kritik adımlar, ortamı her iki günde bir taze aktivasyon faktörleriyle yeniliyor ve kültürdeki toplam B hücre sayısının 2 × 106 hücre / mL'yi geçmemesini sağlıyor.
Ayrıca, CRISPR/Cas9 sistemini CD19 KO için transfecting için geliştirilmiş protokolümüzün yüksek CD19 KO verimliliğine neden olduğunu gördük (Şekil 2 ve Şekil 3). Önceki bir çalışmaya benzer9, 24 saat içinde hücre iyileşmesinde ve elektroporasyon sonrası canlılıkta hafif bir azalma gözlemledik. Bu, elektroporasyonun birincil B hücrelerinin genel hücre sağlığını etkilediğini gösterir; ancak, hücreler sonunda 48 saat içinde geri tepti (veriler gösterilmedi).
Bu elektroporatör protokolünü kullanmanın yararı, numuneleri çok daha hızlı bir hızda (1 dakikadan daha kısa sürede 16 reaksiyon) elektroporat haline getirebilirken, önceki protokoller9,10 16 reaksiyon için yaklaşık 10-12 dakika sürer. Ek olarak, bu transfeksiyon sistemi, önceki çalışmalarda gözlemlenen elektroporatörnün potansiyel elektrik arkını ortadan kaldırır9,10. Ayrıca, bu mühendislik yöntemi daha büyük, piyasada bulunan cuvettes kullanılarak daha fazla sayıda B hücresi için ölçeklendirilebilir (veriler gösterilmez).
En iyi genel hücre sağlığını ve KO verimliliğini sağlamak için birkaç kritik adım: İlk olarak, B hücre genişletme ortamının kullanımdan önce en az 15 dakika boyunca hazırlandığından ve ön dengede olduğundan emin olun. İkinci olarak, transfeksiyon substratının toplam hacmi nükleofeksiyon reaktifinin% 20'sini (v / v) geçmemelidir. Üçüncü olarak, en iyi sonuçlar için hücreler 48 ± 2 saat boyunca genişletilmeli/aktive edilmelidir. Dördüncü olarak, transfeksiyon reaksiyon çözeltisinin cuvette'in altını kapladığından emin olmak için elektroporatöre yerleştirmeden önce elektroporasyon cuvette'e hafifçe dokunun. Beşinci olarak, elektroporlu hücreleri cuvette rt'de sadece 15 dakika dinlendirerek emin olun; elektroporasyondan sonra hücreleri nükleofeksiyon reaktifinde çok uzun süre bırakmak genel hücre sağkalımını zarar verebilir. Altıncı olarak, hücreleri cuvette'de 30 dakikadan daha uzun süre medya ile kuluçkaya yatırdığınızdan emin olun. Yedinci olarak, ilk 48 saat için 1 mL'ye 106 elektroporlu hücre yerleştirmek, hücrelerin daha düşük yoğunlukta kültlemekten daha hızlı iyileşmesine yardımcı olma eğilimindedir (veriler gösterilmez). Son olarak, Cas9 mRNA veya Cas9 proteini kullanmak benzer düzenleme verimliliklerine neden olur (veriler gösterilmez); ancak, kolaylık ve maliyet için Cas9 mRNA kullandık.
CRISPR/Cas9 kullanırken iki önemli endişe hedef dışı etkiler ve kromozomal translokasyonlardır. SgRNA'nın uyumsuz baz çiftlerinin hedef diziye neden olduğu hedef dışı etkiler, genomda çok sayıda olası bağlama bölgesine yol açar ve birden fazla istenmeyen gen KO'su oluşturur. Bu nedenle, bu sorunu en aza indirmek için hedefteki puanla birlikte öngörülen hedef dışı puan dikkate alınmalıdır. Kromozomal translokasyon, hedef dışı etkilere bağlı olarak veya birden fazla geni nakavt ederken ortaya çıkabilir. Bu deneysel ve klinik olarak feci olaylara neden olabilir. Temel editörler12, birleştirme elemanını bozmak, erken bir durdurma kodon oluşturmak veya DSB olmadan gen KO'yu hedeflemeye yol açan bir nokta mutasyonu oluşturmak için tek bir nükleotid (iki sınıf: sitozin temel editörü ve adenin baz editörü) değiştirir (başka bir yerde kapsamlı olarakincelenmiştir 12). Bu nedenle, baz düzenleme yaklaşımı kromozomal translokasyonları atlatmak için tek veya çok genli KO'lar için kullanılabilir.
Crispr/Cas9'un rAAV6 ile birlikte, AAVS1 lokusunda haline özgü KI ve EGFP'nin ekspresyonuna verimli bir şekilde aracılık etmek için kullanılabileceğini de gösteriyoruz. Egfp ekspresyonlarını mühendislik sonrası en az 12 gün boyunca gözlemledik. Ayrıca iki EGFP pozitif popülasyon gözlemledik: 12. günde KI örneğinde yüksek ve orta-EGFP ekspresyolü (Şekil 5A), sadece vektör örneği ise ara EGFP ekspresyonlu hücrelerin minimum yüzdesini gösterdi. Bu "yüksek ve orta popülasyonlar" olgusunun vektörün iki yönlü entegrasyonundan kaynaklandığını tahmin ediyoruz. Bu hipotezi doğrulamak için orta ve yüksek EGFP hücrelerinin PCR13'üne yayılan daha fazla araştırma yapılabilir. AAV'nin vektör olarak kullanılması konusunda iki uyarı: İlk olarak, AAV vektörleri 4,7 kilobases'e kadar küçük bir kargo kapasitesine sahiptir ve büyük bir geni çalarken sorunlara neden oluyor. Homoloji kollarının boyutunu azaltmak, daha büyük bir genin konaklamasına izin verecek ve bu da KI verimliliğini azaltacaktır (veriler gösterilmez). Alternatif olarak, birden fazla gen yükleme vektörün eşzamanlı veya sıralı entegrasyonukullanılabilir 14,15. Çalışmalar, immün özürlü hayvan modellerinde immün yanıt ve AAV transdüklenmiş hücrelerin açıklığı bildirilmiştir16,17. Alternatif olarak, bu sorunu atlatmak için viral tabanlı olmayan bir donör HDR şablonu araştırılabilir.
Özetle, yüksek gen modifikasyon verimlilikleri ile sonuçlanan B hücrelerinin izolasyonu, genişletilmesi ve mühendisliğinin kapsamlı, adım adım süreçlerini gösterdik. Bu mühendislik yöntemi gen KO'sunda ve B hücrelerindeki genlerin fonksiyonlarını incelemek için kullanılabilir. Ek olarak, bu yöntem enfeksiyona karşı savaşmak için rekombinant bir antikor ifade etmek için B hücrelerini tasarlamak için kullanılabilir. Son olarak, bu yöntem, enzimopatikleri tedavi etmek için otolog hücre bazlı bir tedavi olarak kullanılabilecek terapötik enzimleri ifade etmek ve salgılamak için mühendis B hücrelerine uygulanabilir.

B hücreleri hematopoetik kök hücrelerden elde edilen lenfosit soyunun bir alt grubudur. Bağışıklık sorunlarına yanıt olarak büyük miktarlarda antikor üreterek adaptif humoral bağışıklık sisteminde kritik bir rol oynarlar1. B hücreleri aynı zamanda bellek B hücrelerinin ve ölümcül olarak farklılaştırılmış, uzun ömürlü plazma hücrelerinin öncüleridir, böylece kalıcı humoral bağışıklıksağlar 2. Plazma hücreleri, özellikle, yıllarca veya onlarca yıl hayatta kalırken belirli bir antikorun büyük miktarlarda üretme yeteneklerinde bağışıklık hücreleri arasında benzersizdir3. Ek olarak, periferik kandan izolasyon kolaylığı, B hücre soyunun yeni hücre bazlı tedaviler için mükemmel bir aday olduğunu yapar4.
Daha önce, lentiviral vektörler veya Uyuyan Güzel transposon kullananlar gibi rastgele entegrasyon yöntemleri, transgene doğum ve ifade 5 , 6,7,8için B hücrelerini tasarlamak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşımların spesifik olmayan doğası, B hücrelerindeki belirli bir genin biyolojik fonksiyonlarının incelenmesini zorlaştırır ve terapötik ortamda eklemeli mutajensis ve değişken transgene ekspresyonu ve / veya susturma riski taşır.
CRISPR/Cas9 sistemi, araştırmacıların çok sayıda türdeki çeşitli hücrelerin genomunu hassas bir şekilde düzenlemelerini sağlayan güçlü bir genom mühendisliği aracıdır. Son zamanlarda, bizimki de dahil olmak üzere iki grup, ex vivo genişleme için yöntemler geliştirdi ve birincil insan B hücrelerinin genom mühendisliğini hedefledi9,10. Birincil insan B hücrelerini lökorezis örneğinden arındırma sürecini açıklayacağız. Bundan sonra, B hücresi genişletme ve izole B hücrelerinin aktivasyonu için güncellenmiş protokolümüzü açıklayacağız. Daha sonra CRISPR/Cas9 mRNA'yı CD19 sgRNA ile birlikte aktif B hücrelerine tanıtmak için elektroporasyon yoluyla belirli bir B hücre reseptörü ve B hücrelerinin ayırt edici bir özelliği olan 19 (CD19) farklılaşma kümesini devirmek için bir süreç açıklayacağız.
CAS9 mRNA çevrilir ve CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoprotein kompleksi (RNP) oluşturmak için CD19 sgRNA'ya bağlanır. Daha sonra, kompleksteki sgRNA, Cas9'un genin ekson 2'sinde hedef sırada çift iplikçik kırılması (DSB) oluşturmasına neden olur. Hücreler, nükleotidleri tanıtarak veya silerek, frameshift mutasyona yol açarak ve genin bayıltılmasına neden olarak DSB'yi "homolog olmayan uç birleştirme" ile onaracak. Daha sonra akış sitometrisi ile CD19 kaybını ölçecek ve ayrışma (TIDE) analizi ile indellerin takibi ile indel oluşumunu analiz edeceğiz.
Daha sonra CRISPR/Cas9'u, adeno ile ilişkili virüs entegrasyon sitesi 1 (AAVS1) genine gelişmiş yeşil floresan proteinin(EGFP) raya özgü yerleştirilmesine aracılık etmek için rekombinant bir AAV6 vektörü (rAAV6, homolojiye yönelik onarım (HDR) için bir donör şablonu) ile birlikte kullanma sürecini açıklayacağız. AAVS1 geni, bilinen biyolojik işlevleri olmayan aktif bir lokus ve insan genomunda bir AAV viral entegrasyon bölgesidir; bu nedenle, genom mühendisliği için "güvenli bir liman" olarak kabul edilir. Burada, B hücrelerinin genişlemesi ve aktivasyonunun 7 günlük kültürde 44 kata kadar genişlemeye izin verdiğini bildiriyoruz (Şekil 1). B hücrelerinin elektroporasyonunun transeksiyon sonrası 24 saat genel hücre sağlığında(Şekil 2A)hafif bir azalma gösterdiği görüldü. CD19 işaretleyicisinin dağılım grafiği analizi (Şekil 2B) düzenlenen hücrelerde% 83'e kadar azalma gösterdi (Şekil 2C).
Kromatografların GELGIT analizi (Şekil 3A) % indellerin akış sitometrisi ile % protein kaybına benzer olduğunu ortaya koydu (Şekil 3B). KI deneyinin akış sitometrisi analizi, RNP ile birlikte AAV vektörü alan hücrelerin (Şekil 4), % 64'e kadar EGFP pozitif hücreleri (Şekil 5A) ifade ettiğini ve daha sonra kavşak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile başarılı entegrasyon gösterdiğini göstermiştir (Şekil 5B). Hücre sayımları, tüm örneklerin mühendislik sonrası 3 gün içinde hızla kurtarıldığunu göstermiştir (Şekil 5C).

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug</td>
			<td>IDT</td>
			<td>1081059</td>
			<td>smaller size is also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>V4XP-3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer</td>
			<td>Quality Biological</td>
			<td>118-156-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanCap chemically modified Cas9 mRNA</td>
			<td>Trilink Biotechnology</td>
			<td>L-7206-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg</td>
			<td>Invivogen</td>
			<td>TLRL-2006-5</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryostor CS10, 100 mL</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>7930</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CTS Immune Cell SR</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A2596101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EasySep human B cells isolation kit</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>17954</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eBioscience fixable viability dye eFlour 780</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>65-0865-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excellerate B cell media, Xeno-free</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>CCM031</td>
			<td>B-cell basal medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>S11550</td>
			<td>For thawing B cells only</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque Plus</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GeneMate SnapStrip&#174; 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps</td>
			<td>BioExpress</td>
			<td>T-3035-1 / 490003-692</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS</td>
			<td>GE lifesciences</td>
			<td>SH30256.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza 4D Nucleofector core unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza 4D Nucleofector X unit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>AAF-1002X</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mega CD40 Ligand</td>
			<td>Enzo Life Sciences</td>
			<td>ALX-522-110-C010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mr. Frosty</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1562-1EA</td>
			<td>For freezing cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep 100X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>TMS-AB2-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerCP anti-human CD19 clone HIB19</td>
			<td>biolegend</td>
			<td>302228</td>
			<td>smaller size is also available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)</td>
			<td>Vigene Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td>large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-10 protein 250 ug</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>217-IL-250</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant human IL-15 protein 25 ug</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>247-ILB-025</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>The Big Easy EasySep Magnet</td>
			<td>STEMCELL Technology</td>
			<td>18001</td>
			<td>different sizes available</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-EDTA (TE) buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP2476100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome engineering of primary human b cells using crispr/cas9

B hücreleri hematopoetik kök hücrelerden elde edilen lenfositlerdir ve adaptif bağışıklık sisteminin humoral kolunun önemli bir bileşenidir. Periferik kandan izolasyon kolaylığı, in vitroyu genişletme yetenekleri ve in vivo olarak uzun ömürlü olmaları nedeniyle hücre bazlı tedaviler için çekici adaylar yaparlar. Ek olarak, normal biyolojik işlevleri -büyük miktarlarda antikor üretmek için- enfeksiyonla savaşmak için rekombinant antikor veya enzimopatiklerin tedavisi için bir enzim gibi çok büyük miktarlarda terapötik proteini ifade etmek için kullanılabilir. Burada, primer insan B hücrelerini periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC) izole etmek ve izole edilmiş B hücrelerini in vitro olarak etkinleştirmek / genişletmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Daha sonra B hücrelerindeki endojen genlerin bölgeye özgü KO'su için CRISPR/Cas9 sisteminin kullanılmasıyla ilgili adımları gösteriyoruz. Bu yöntem, ilgi çekici genlerin biyolojik işlevlerini incelemek için kullanılabilecek çeşitli genlerin verimli KO'suna izin verir. Daha sonra CRISPR/Cas9 sistemini kullanma adımlarını, B hücrelerindeki transgene ifade kasetinin raya özgü verimli entegrasyonu için rekombinant, adeno ilişkili, viral (rAAV) vektör ile birlikte gösteriyoruz. Birlikte, bu protokol, birincil insan B hücrelerinde genlerin biyolojik işlevlerini incelemek ve B hücre terapötiklerinin geliştirilmesi için kullanılabilecek adım adım bir mühendislik platformu sağlar.

Güncellenmiş genişletme ve aktivasyon protokolü, B hücrelerinin 7 günde 44 kata kadar hızlı genişlemesini sağladı(Şekil 1; n =3 donörler). KO deneyinde, Trypan mavi boyama kullanan B hücre sayısı, hem kontrolde hem de CD19 KO örneklerinde 24 saat post-elektroporasyonda hücre iyileşmesinde hafif bir azalma ile% 80'den fazla uygulanabilir hücre gösterdi(Şekil 2A; p ≥ 0.05, n = 3 donör). Bu sonuç, elektroporasyonun genel B hücre sağlığını biraz etkilediğini gösterir. Akış sitometrisi ve TIDE analizleri için 5. Kontrolün ve KO örneğinin temsili saçılma çizimleri sırasıyla% 14 ve% 95 CD19 negatif hücreler göstermiştir (Şekil 2B). Akış çizilerinin niceliği, kontrol ile karşılaştırıldığında KO örneklerinde CD19 ekspresyonunda önemli bir azalma göstermiştir(Şekil 2B; s ≤ 0.0001, n = 3 donör). Genomik dizileme kromatogramları (Tablo 3'tekiastar dizilerine bakın), CD19 KO B hücrelerinde CRISPR/Cas9 aracılı DSB sonrası nükleotidlerin eklemelerini/delesyonlarını gösteren çift tepeler gösterirken, kontrolde tek tepeler gözlendi ve bu örnekte DSB oluşmadığını gösterdi(Şekil 3A). KO örneklerinin kromatograflarının indel analizi (ücretsiz bir çevrimiçi TIDE analiz aracı kullanılarak) yüksek oranda indel oluşumu gösterdi (>%90) akış sitometrisi ile saptanan % CD19 protein kaybı ile uyumlu olan CD19 lokusta(Şekil 3B; p ≥ 0.05, n = 3 donör). Bu sonuçlar CRISPR/Cas9'un B hücrelerinde verimli bir cd19 KO oluşturduğunu göstermektedir. KI deneyinden B hücreleri, akış sitometrisi ve kavşak PCR analizleri için mühendisliksonrası 12. Dağılım çizelhleri RNP ile birlikte rAAV6 vektörünü alan örnekte EGFP pozitif hücrelerin%64'ünügösterirken, kontrolde EGFP pozitif hücre gözlenmedi; sadece AAV vektörü alan örnekte minimal EGFP pozitifliği gözlenmiştir(Şekil 5A). Bir bağlantı PCR amplifikasyonu (Tablo 3'tekiastar dizilerine bakın) KI örneğinde (Şekil 5B) 1,5Kbps amplicon gösterirken, kontrol veya sadece vektör örneğinde PCR ürünü gözlenmedi. Hücre sayıları, mühendislik sürecinin KI örneğindeki hücre iyileşmesini kontrolden veya yalnızca vektör örneklerinden daha fazla etkilediğini göstermiştir (Şekil 5B). Bununla birlikte, tüm numuneler mühendislik sonrası 3 gün içinde hızla geri tepti (Şekil 5B). Birlikte, bu sonuçlar EGFP'nin AAVS1 lokusta başarılı bir şekilde entegrasyonunun EGFP'nin mühendislik sonrası en az 12 gün istikrarlı bir şekilde ifade etmesine yol açtığını göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig01.jpg"> Şekil 1: B hücre genleşme in vitro. B hücreleri 0. günde 1 ×10 6 hücrede (sıfır) mL başına 5 × 10 5 yoğunlukta tohumlandı ve7 günde 44 kat genişletildi (n=3 bağımsız donör). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61855/61855fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2A" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig02a.jpg"> Şekil 2A: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61855/61855fig02alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2B" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig02b.jpg"> Şekil 2B: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61855/61855fig02blarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2C" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig02c.jpg"> Şekil 2C: B hücrelerinde CRISPR/Cas9 aracılı CD19 nakavt (KO). (A) Çubuk grafikte, elektroporasyon sonrası 24 saatte hem kontrolde hem de CD19 KO örneklerinde transeksiyon sonrası hücrelerin %70 hücre kurtarma (sol panel) ve %80 canlılığı (sağ panel) gözlenmiştir. (B) Canlı hücrelerin CD19 gating'inin temsili akış çizikleri, kontrol örneğinde ve CD19 KO örneğinde sırasıyla% 84.3 ve% 3.43 CD19 pozitif hücreleri gösterir. (C) Çubuk grafik CRISPR/Cas9 aracılı CD19 KO grubunda CD19'un önemli ölçüde azalmasını gösterir (s ≤ 0.0001). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61855/61855fig02clarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3A" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig03a.jpg"> Şekil 3A: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61855/61855fig03alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3B" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig03b.jpg"> Şekil 3B: CD19 protein kaybı vs indel oluşumu. (A) Kromatogramlar, kontrolün sıralama tepelerini ve CD19 nakavt (KO) örneğini tasvir eder. Denetim tepelerindeki gri kutu, cd19 gRNA'nın hedef sırasını bir okla gösterilen tahmin edilen kesim bölgesiyle vurgular. CD19 KO, tahmin edilen kesim bölgesinin etrafında çift iplikli kırılmadan sonra nükleotitlerin yerleştirilmesini / silindiğini gösteren "çift tepeler" dizilimi gösterdi. (B) CD19 lokusunda % CD19 protein kaybı ve % indel oluşumu arasında tutarlı sonuçlar gösteren çubuk grafik (p ≥ 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61855/61855fig03blarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig04.jpg"> Şekil 4: rAAV6 AAVS1 MND-GFP vektör yapısı. İfade kaseti güçlü bir sentetik promotör (MND) dizisi içerir, hemen ardından gelişmiş bir yeşil floresan proteini (EGFP) kodlama dizisi ve poli adenilasyon (Poli A) dizisi. AAVS1 homoloji kolları, MND promotörünün yukarısını ve poli A dizilerinin aşağı akışını yansır. EGFP, MND organizatörünün düzenlemesi kapsamında ifade edilecektir. Sıra uzunlukları yapının her bileşeninin üzerinde gösterilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61855/61855fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5A" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig05a.jpg"> Şekil 5A: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61855/61855fig05alarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5B" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig05b.jpg"> Şekil 5B: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61855/61855fig05blarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5C" src="/files/ftp_upload/61855/61855fig05c.jpg"> Şekil 5C: CRISPR/Cas9- ve rAAV6 aracılı 12. (A) Temsili akış grafiği, kontrolde veya sadece vektör örneğinde EGFP pozitif B hücresi ve knockin (KI) örneğinden EGFP pozitif B hücrelerinin% 64,4'üne karşı hiçbir EGFP pozitif B hücresi göstermiyor. (B) KI örneğinin kavşak polimeraz zincir reaksiyonu tahmin edilen 1,5 Kbps bandını gösterir; denetimde veya yalnızca vektör örneğinde bant bulunamadı. PCR işlemi sırasında kirlenme olmamasını sağlamak için su kullanılmıştır. (C) Çubuk grafik, mühendislik sonrası 3 gün boyunca kontrolün, yalnızca vektörün ve EGFP-KI örneklerinin hücre büyümesini tasvir eder. Kırık çizgi 1 × 106 hücre girişini gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61855/61855fig05clarge.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Adı</td>
			<td>gRNA sırası</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19</td>
			<td>5'-GCTGTGCTGCAGTGCCTCAA-3'</td>
		</tr>
<tr>
<td>AAVS1</td>
			<td>5'-GTCACCAATCCTGTCCCTAG-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: gRNA dizileri.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Reaktif</td>
			<td>1 reaksiyon başına hacim</td>
		</tr>
<tr>
<td>P3 Birincil Hücre çözümü</td>
			<td>16,4 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ek 1</td>
			<td>3,6 mL</td>
		</tr>
<tr>
<td>Toplam</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 2: Nükleofeksiyon reaktif karışımının hazırlanması.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Açıklama</td>
			<td>Sıra</td>
			<td>Amaç</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19 ileri astarlar</td>
			<td>5'-AAATTCAGGAAGGGGGAAG-3'</td>
			<td>Indel analizi için CD19 lokusu güçlendirin</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD19 Ters astar</td>
			<td>5'-GCGGACCTTCTGTCCATG-3'</td>
			<td>Indel analizi için CD19 lokusu güçlendirin</td>
		</tr>
<tr>
<td>Junction PCR ileri astar</td>
			<td>5'-GGACGAGCTGTACAAGTAACG-3'</td>
			<td>Kavşak PCR</td>
		</tr>
<tr>
<td>Kavşak PCR Ters astar</td>
			<td>5'-GAGACAGTGACCAACCATCC-3</td>
			<td>Kavşak PCR</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 3: Kullanılan astarlar.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Açıklama</td>
			<td>Florofor</td>
			<td>Klon</td>
		</tr>
<tr>
<td>İnsan karşıtı CD19</td>
			<td>PerCP</td>
			<td>Hİb19</td>
		</tr>
<tr>
<td>Uygulanabilirlik Boyası</td>
			<td>eFlour 780</td>
			<td>-</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 4: Akış sitometri antikoru ve canlılık boyası.

Watch this Scientific Journal Video about Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Burada, B hücrelerindeki genlerin biyolojik fonksiyonlarını ve B hücre terapötiklerinin gelişimini incelemek için gen nakavt (KO) ve knock-in (KI) için birincil insan B hücrelerinin CRISPR/ Cas9 tabanlı genom mühendisliği için ayrıntılı, adım adım bir protokol sunuyoruz.

CRISPR/Cas9 Kullanarak Birincil İnsan B Hücrelerinin Genom Mühendisliği

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

genome-engineering-of-primary-human-b-cells-using-crisprcas9

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

6.1K Görüntüleme.  University of Minnesota. Burada, B hücrelerindeki genlerin biyolojik fonksiyonlarını ve B hücre terapötiklerinin gelişimini incelemek için gen nakavt (KO) ve knock-in (KI) için birincil insan B hücrelerinin CRISPR/ Cas9 tabanlı genom mühendisliği için ayrıntılı, adım adım bir protokol sunuyoruz.

Video: Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Yetişkin Zebra balığı İç Kulak Duyu Epiteli Brüt ve Güzel Diseksiyon ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Biyoloji

Generation of Human CD40-activated B cells

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer immunotherapy 1-3. Compared to Dendritic cells (DCs), the best characterized APC, CD40-B cells have several distinct biological and technical properties. Similar to DCs, B cells show an increased expression of MHC and co-stimulatory molecules (Fig.1b), exhibit a strong migratory capacity and present antigen presentation efficiently to T cells, after stimulation with interleukin-4 and CD40 ligand (CD40L). However, in contrast to immature or mature DCs, CD40-B cells express the full lymph node homing triad consisting of CD62L, CCR7/CXCR4, and leukocyte function antigen-1 (LFA1, CD11a/CD18), necessary for homing to secondary lymphoid organs (Fig.1a) 3. CD40-B cells can be generated without difficulties from very small amounts of peripheral blood which can be further expanded in vitro to very large amounts of highly-pure CD40-B cells (&gt;109 cells per patient) from healthy donors as well as cancer patients (Fig.1c,d) 1,4. 
In this protocol we demonstrate how to obtain fully activated CD40-B cells from human PBMC. Key molecules for the cell culture are CD40 ligand, interleukin-4 (IL-4) and cyclosporin A (CsA), which are replenished in a 3-4 day culture cycle. For laboratory purposes CD40-stimulation is provided by NIH/3T3 cells expressing recombinant human CD40 ligand (tCD40L NIH/3T3) 5. To avoid contamination with non-transfected cells, expression of the human CD40 ligand on the transfectants has to be checked regularly (Fig.2). 
After 14 days CD40-B cell cultures consist of more than 95% pure B cells and an expansion of CD40-B cells over 65 days is frequently possible without any loss of function 1, 4. CD40-B cells efficiently take up, process and present antigens to T cells 6. They do not only prime na&#970;ve, but also expand memory T cells 7,8. CD40-activated B cells can be used to study B-cell activation, differentiation and function. Moreover, they represent a promising tool for therapeutic or preventive vaccination against tumors 9.

In this video we present the ex vivo generation and expansion of human CD40-activated B cells (CD40-B) from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) by stimulation with CD40 ligand and interleukin-4.

İnsan CD40 aktive B hücreleri üretilmesi

CD40-activated B cells (CD40-B cells) have been identified as an alternative source of immuno-stimulatory antigen-presenting cells (APC) for cancer ...

Na&iuml;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

Over the last decade, several adult stem cell populations have been identified in human skin 1-4. The isolation of multipotent adult dermal precursors was first reported by Miller F. D laboratory 5, 6. These early studies described a multipotent precursor cell population from adult mammalian dermis 5. These cells--termed SKPs, for skin-derived precursors-- were isolated and expanded from rodent and human skin and differentiated into both neural and mesodermal progeny, including cell types never found in skin, such as neurons 5. Immunocytochemical studies on cultured SKPs revealed that cells expressed vimentin and nestin, an intermediate filament protein expressed in neural and skeletal muscle precursors, in addition to fibronectin and multipotent stem cell markers 6. Until now, the adult stem cells population SKPs have been isolated from freshly collected mammalian skin biopsies.
Recently, we have established and reported that a population of skin derived precursor cells could remain present in primary fibroblast cultures established from skin biopsies 7. The assumption that a few somatic stem cells might reside in primary fibroblast cultures at early population doublings was based upon the following observations: (1) SKPs and primary fibroblast cultures are derived from the dermis, and therefore a small number of SKP cells could remain present in primary dermal fibroblast cultures and (2) primary fibroblast cultures grown from frozen aliquots that have been subjected to unfavorable temperature during storage or transfer contained a small number of cells that remained viable 7. These rare cells were able to expand and could be passaged several times. This observation suggested that a small number of cells with high proliferation potency and resistance to stress were present in human fibroblast cultures 7.
We took advantage of these findings to establish a protocol for rapid isolation of adult stem cells from primary fibroblast cultures that are readily available from tissue banks around the world (Figure 1). This method has important significance as it allows the isolation of precursor cells when skin samples are not accessible while fibroblast cultures may be available from tissue banks, thus, opening new opportunities to dissect the molecular mechanisms underlying rare genetic diseases as well as modeling diseases in a dish.

Na&#239;ve Adult Stem Cells Isolation from Primary Human Fibroblast Cultures

We report a method to isolate na&#239;ve multipotent skin-derived precursor (SKP) cells from primary human fibroblast cultures. We show that these SKPs derived from fibroblast cultures share similar stem cell properties to the ones derived directly from human skin biopsies. These cells express the neural crest marker, nestin, in addition to the multipotent markers such as OCT4 and Nanog.

İlköğretim İnsan fibroblast Kültürler gelen naif Erişkin Kök Hücre İzolasyon

Over the last decade, several adult stem cell  populations have been identified in human skin 1-4.  The isolation of multipotent adult dermal precursors ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

Br.rerio kullanarak Morbid İnsan Genomu İn Vivo Modelleme

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Mouse Genome Engineering Using Designer Nucleases

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well as for modeling human diseases and testing therapeutic strategies. Recent advances in the use of designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), and the clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system for site-specific genome engineering open the possibility to perform rapid targeted genome modification in virtually any laboratory species without the need to rely on embryonic stem (ES) cell technology. A genome editing experiment typically starts with identification of designer nuclease target sites within a gene of interest followed by construction of custom DNA-binding domains to direct nuclease activity to the investigator-defined genomic locus. Designer nuclease plasmids are in vitro transcribed to generate mRNA for microinjection of fertilized mouse oocytes. Here, we provide a protocol for achieving targeted genome modification by direct injection of TALEN mRNA into fertilized mouse oocytes.

Designer nucleases such as zinc finger nucleases (ZFNs) and transcription activator-like effector nucleases (TALENs) can be used to modify the genome of mouse preimplantation embryos by triggering both the nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR) pathways. These advances enable the rapid generation of mice with precise genetic modifications.

Tasarımcı nükleazlar kullanılması Fare Genom Mühendisliği

Transgenic mice carrying site-specific genome modifications (knockout, knock-in) are of vital importance for dissecting complex biological systems as well ...

Whole Cell Electrophysiology of Primary Cultured Murine Enterochromaffin Cells

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory cells, EC cells sense luminal stimuli and convert them into serotonin (5-hyroxytryptamine, 5-HT) release events. However, the electrophysiology of these cells is poorly understood because they are difficult to culture and to identify. The method presented in this paper outlines primary EC cell cultures optimized for single cell electrophysiology. This protocol utilizes a transgenic cyan fluorescent protein (CFP) reporter to identify mouse EC cells in mixed primary cultures, advancing the approach to obtaining high-quality recordings of whole cell electrophysiology in voltage- and current-clamp modes.

Enterochromaffin (EC) cells comprise a small subset of gastrointestinal epithelial cells. EC cells are electrically excitable and release serotonin, yet difficulties in culturing and identifying EC cells have limited physiological studies. The method presented here establishes a primary culture model amenable to examination of single EC cells by electrophysiology.

Tüm cep telefonu Elektrofizyoloji birincil kültürlü fare Enterochromaffin hücre

Enterochromaffin (EC) cells in the gastrointestinal (GI) epithelium constitute the largest subpopulation of enteroendocrine cells. As specialized sensory ...

In Situ Monitoring of Transiently Formed Molecular Chaperone Assemblies in Bacteria, Yeast, and Human Cells

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the JDP family could form transient heterocomplexes in eukaryotes to fine-tune substrate selection for the 70 kDa heat shock protein (Hsp70) chaperone-based protein disaggregases. The JDP complexes target acute/chronic stress induced aggregated proteins and presumably help assemble the disaggregases by recruiting multiple Hsp70s to the surface of protein aggregates. The extent of the protein quality control (PQC) network formed by these physically interacting JDPs remains largely uncharacterized in vivo. Here, we describe a microscopy-based in situ protein interaction assay named the proximity ligation assay (PLA), which is able to robustly capture&#160;these transiently formed chaperone complexes in distinct cellular compartments of eukaryotic cells. Our work expands the employment of PLA from human cells to yeast (Saccharomyces cerevisiae) and bacteria (Escherichia coli), thus rendering an important tool to monitor the dynamics of transiently formed protein assemblies in both prokaryotic and eukaryotic cells.

Cognate J-domain proteins cooperate with the Hsp70 chaperone to assist in a myriad of biological processes ranging from protein folding to degradation. Here, we describe an in situ proximity ligation assay, which allows the monitoring of these transiently formed chaperone machineries in bacterial, yeast and human cells.

Bakteri, Maya ve İnsan Hücrelerinde Geçici Olarak Oluşan Moleküler Şaperon Meclislerinin Yerinde İzlenmesinde

J-domain proteins (JDPs) form the largest and the most diverse co-chaperone family in eukaryotic cells. Recent findings show that specific members of the ...

Silencing the Spark: CRISPR/Cas9 Genome Editing in Weakly Electric Fish

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these independently derived phenotypes, which share a common genetic architecture. This is perhaps best exemplified by the numerous convergent features of gymnotiforms and mormyrids, two species-rich teleost clades that produce and detect weak electric fields and are called weakly electric fish. In the 50 years since the discovery that weakly electric fish use electricity to sense their surroundings and communicate, a growing community of scientists has gained tremendous insights into evolution of development, systems and circuits neuroscience, cellular physiology, ecology, evolutionary biology, and behavior. More recently, there has been a proliferation of genomic resources for electric fish. Use of these resources has already facilitated important insights with regards to the connection between genotype and phenotype in these species. A major obstacle to integrating genomics data with phenotypic data of weakly electric fish is a present lack of functional genomics tools. We report here a full protocol for performing CRISPR/Cas9 mutagenesis that utilizes endogenous DNA repair mechanisms in weakly electric fish. We demonstrate that this protocol is equally effective in both the mormyrid species Brienomyrus brachyistius and the gymnotiform Brachyhypopomus gauderio by using CRISPR/Cas9 to target indels and point mutations in the first exon of the sodium channel gene scn4aa. Using this protocol, embryos from both species were obtained and genotyped to confirm that the predicted mutations in the first exon of the sodium channel scn4aa were present. The knock-out success phenotype was confirmed with recordings showing reduced electric organ discharge amplitudes when compared to uninjected size-matched controls.

Here, a protocol is presented to produce and rear CRISPR/Cas9 genome knockout electric fish. Outlined in detail are the required molecular biology, breeding, and husbandry requirements for both a gymnotiform and a mormyrid, and injection techniques to produce Cas9-induced indel F0 larvae.

Kıvılcım Susturma: CRISPR/Cas9 Zayıf Elektrikli Balıklarda Genom Düzenleme

Electroreception and electrogenesis have changed in the evolutionary history of vertebrates. There is a striking degree of convergence in these ...

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by filarial nematodes such as canine heartworm and elephantasis. Recently, CRISPR/Cas9 genome editing has been used to induce site-directed mutations by injecting a Cas9 protein that has been complexed with a guide RNA (gRNA) into freshly laid embryos of several insect species, including mosquitoes that belong to the genera Anopheles and Aedes. Manipulating and injecting Culex mosquitoes is slightly more difficult as these mosquitoes lay their eggs upright in rafts rather than individually like other species of mosquitoes. Here we describe how to design gRNAs, complex them with Cas9 protein, induce female mosquitoes of Culex pipiens to lay eggs, and how to prepare and inject newly laid embryos for microinjection with Cas9/gRNA. We also describe how to rear and screen injected mosquitoes for the desired mutation. The representative results demonstrate that this technique can be used to induce site-directed mutations in the genome of Culex mosquitoes and, with slight modifications, can be used to generate null-mutants in other mosquito species as well.&#160;

Preparing and Injecting Embryos of Culex Mosquitoes to Generate Null Mutations using CRISPR/Cas9

CRISPR/Cas9 is increasingly used to characterize gene function in non-model organisms. This protocol describes how to generate knock-out lines of Culex pipiens, from preparing injection mixes, to obtaining and injecting mosquito embryos, as well as how to rear, cross, and screen injected mosquitoes and their progeny for desired mutations.

CRISPR/Cas9 Kullanarak Boş Mutasyonlar Oluşturmak için Culex Sivrisineklerinin Embriyolarının Hazırlanması ve EnjekteSi

Culex mosquitoes are the major vectors of several diseases that negatively impact human and animal health including West Nile virus and diseases caused by ...

Construction of Homozygous Mutants of Migratory Locust Using CRISPR/Cas9 Technology

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an important research model for insect metamorphosis. The CRISPR/Cas9 system can accurately locate at a specific DNA locus and cleave within the target site, efficiently introducing double-strand breaks to induce target gene knockout or integrate new gene fragments into the specific locus. CRISPR/Cas9-mediated genome editing is a powerful tool for addressing questions encountered in locust research as well as a promising technology for locust control. This study provides a systematic protocol for CRISPR/Cas9-mediated gene knockout with the complex of Cas9 protein and single guide RNAs (sgRNAs) in migratory locusts. The selection of target sites and design of sgRNA are described in detail, followed by in vitro synthesis and verification of the sgRNAs. Subsequent procedures include egg raft collection and tanned-egg separation to achieve successful microinjection with low mortality rate, egg culture,&#160;preliminary estimation of the mutation rate, locust breeding as well as detection, preservation, and passage of the mutants to ensure population stability of the edited locusts. This method can be used as a reference for CRISPR/Cas9 based gene editing applications in migratory locusts as well as in other insects.

This study provides a systematically optimized procedure of CRISPR/Cas9 ribonuclease-based construction of homozygous locust mutants as well as a detailed method for cryopreservation and resuscitation of the locust eggs.

CRISPR/Cas9 Teknolojisi Kullanılarak Göçmen Locust'un Homozigot Mutantlarının İnşası

The migratory locust, Locusta migratoria, is not only one of the worldwide plague locusts that caused huge economic losses to human beings but also an ...