Name: genome engineering of primary human b cells using crispr/cas9
Uploaded: 2020-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Bu çalışma Çocuk Kanser araştırma fonu (CCRF) ve NIH R01 AI146009 tarafından B.S.M'a finanse edildi.

Sağlıklı donörlerden lökerez örnekleri yerel bir kan bankasından alındı. Burada açıklanan tüm deneyler Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından araştırmadan muaf olarak belirlenmiş ve Minnesota Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBC) tarafından onaylanmıştır.
NOT: Tüm deneyler kan kaynaklı patojenler için evrensel önlem doğrultusunda, steril/aseptik teknikler ve uygun biyogüvenlik seviye-2 ekipmanları ile gerçek gerçekleştirildi.
1. B hücre genişletme ortamı için takviyeler hazırlayın
<ol><li>CpG oligonükleotidini 1 mg/mL konsantrasyona yeniden inşa edin.</li>
	<li>CD40 ligandını (CD40L) 100 μg/mL konsantrasyonda yeniden inşa edin.</li>
	<li>Rekombinant insan IL-10'u (rhIL-10) 50 μg/mL konsantrasyona yeniden inşa edin.</li>
	<li>Rekombinant insan IL-15'i (rhIL-15) 10 μg/mL konsantrasyona yeniden inşa edin. NOT: Her takviyeyi -20 °C ila -80 °C'de 6 aya kadar küçük aliquotlarda saklayın.</li>
</ol>2. Bazal ortam hazırlayın
<ol><li>B hücreli bazal ortamı, in vitro immün hücre genişlemesi (örneğin, CTS Immune Cell SR) ve% 1 (v/v) penisilin ve streptomisiin için% 5 (v/v) medya takviyesi ile birleştirin.</li>
	<li>Bazal ortamı 0,22 μm filtre adaptörü kullanarak sterilize edilmiş bir şişeye filtreleyin.</li>
	<li>Bazal ortamı 1 aya kadar 4 °C'de tutun.</li>
</ol>3. B hücre genişletme ortamını hazırlayın
<ol><li>B hücrelerini 5 × 105 hücre/mL'de kültüre etmek için gerekli miktarda bazal ortamı steril bir kaba aktarın.</li>
	<li>Bazal ortamı 1 μg/mL CpG, 100 ng/mL CD40L, 50 ng/mL rhIL-10 ve 10 ng/mL rhIL-15 ile destekleyin.</li>
	<li>B hücre genişletme ortamını 0,22 μm filtre kullanarak filtreleyin.</li>
	<li>B hücre genleşme ortamını doku kültürü inkübatöründe 37 °C'de, %5 CO2'de kullanmadan önce en az 30 dakika boyunca nemle dengeler. NOT: Bir gün boyunca kullanmak üzere taze B hücre genişletme ortamı hazırlayın. B hücresi genişletme ortamını birden çok gün boyunca kullanmak üzere hazırlamayın. Bu medya tarifi, bellek B hücrelerinin ve aktif birincil insan B hücrelerinin çoğalmasını teşvik eder.</li>
</ol>4. İnsan B hücreli arınma ve genişleme
NOT: Üreticinin talimatına uyarak sıcaklık kontrollü bir dondurma kabına %99-100 izopropil alkol ekleyin ve 4.1. adıma başlamadan önce dondurma kabını 4 °C'de soğutun.
<ol><li>PBMC'leri lökorezis örneğinden ayırma
	<ol>
<li>Lökorezis örneğini (yaklaşık 8-10 mL) steril 50 mL konik tüpe aktarın.</li>
		<li>Steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) ile hacmi 35 mL'ye getirin.</li>
		<li>35 mL lökorezis örneğini 15 mL yoğunluk degrade ortamına dikkatlice katmanlayın.</li>
		<li>Fren olmadan 25 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj yapın, buffy coat'u (PBMC katmanı) rahatsız etmeden plazma tabakasını çıkarın, PBMC'leri arayüzden toplayın ve yeni bir steril 50 mL konik tüpe aktarın.</li>
		<li>PBMC'leri 1x PBS ile 50 mL'ye getirin.</li>
		<li>Frensiz 5 dakika boyunca 500 × g'da santrifüj. Kırmızı görünebilecek PBMC peletini bozmadan üst düğmeyi çıkarın.</li>
		<li>7 mL amonyum-klorür-potasyum lizis tamponu, iyice karıştırmak için pipet 3 kez ekleyin ve oda sıcaklığında (RT) 3 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>1x PBS ile sesi 50 mL'ye getirin.</li>
		<li>Düşük direnç freni ile 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj. Peletin rahatsız etmeden süpernatant çıkarın. Pelet pembemsi veya beyaz görünmelidir. NOT: Yeni yalıtılmış B hücrelerini kültüre etmeye devam etmek için, B hücre yalıtımını başlatmadan önce B hücresi genişletme ortamını hazırlayın (adım 4.2).</li>
	</ol></li>
	<li>İnsan birincil B hücresi negatif izolasyon kiti kullanan PBMC'lerden B hücresi yalıtımı
	<ol>
<li>İzolasyon arabelleğindeki PBMC'leri 5 × 107 hücre/mL konsantrasyona yeniden biriktirin. NOT: PBMC'lerin toplam sayısı 5 × 107 hücreden azsa, 5 × 107 hücre/mL korumak için yalıtım arabelleği hacmini küçültün. Minimum ve maksimum hücre süspansiyonu hacimleri sırasıyla 0,25 mL ve 8 mL'dir.</li>
		<li>8 mL'ye (5 × 107 hücre/mL) kadar steril, polipropilen, kapaklı yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarın.</li>
		<li>PBMC'lere 50 μL/mL Kokteyl Arttırıcı ekleyin.</li>
		<li>PBMC'lere 50 μL/mL İzolasyon Kokteyli ekleyin, tüpü kaplayın ve karıştırmak için 2-3 kez ters çevirin.</li>
		<li>RT'de 5 dakika kuluçkaya yatır; inkübasyonun4. dakikasında, en az 30 sn boyunca girdap manyetik mikrobeadlar.</li>
		<li>1 mL PBMC başına 50 μL manyetik mikrobead aktarın, tüpü kaplayın ve karıştırmak için 2-3 kez ters çevirin.</li>
		<li>İzolasyon tamponu ile 10 mL'ye kadar üst üste yerleştirin ve 2-3 kez hafifçe pipetleyin.</li>
		<li>Tüpü manyetik bir istasyona yerleştirin ve RT'de 3 dakika kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Mıknatısı ve tüpü bir arada tutun ve bir hareketle, hücre süspansiyonu yeni tüpe dökmek için mıknatısı ve tüpü birlikte ters çevirin. Eski tüpü atın.</li>
		<li>4.2.8 adımını tekrarlayın (kuluçka süresini 2 dakikaya düşürün) ve B hücre süspansiyonunu temiz bir konik tüpe dökün.</li>
		<li>Zenginleştirilmiş B hücreleri kullanıma hazırdır. Hücreler hemen kullanılacaksa, bölüm 4.3'e (İnsan B hücresi genişlemesi) devam edin. İzole edilmiş B hücrelerinin saflığını akış sitometrisine göre kontrol edin (isteğe bağlı). Hücreler kullanılmadan önce dondurulacaksa, 4.2.12 adımına devam edin.</li>
		<li>B hücrelerini dondurmak için, 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüjün ve peletin rahatsız etmeden süpernatantı atın.</li>
		<li>Hücreleri 10 7 hücre/mL ve aliquot1 mL/cryovial'da donma ortamında yeniden depolar.</li>
		<li>Cryovial'ı soğutulmuş dondurma kabına yerleştirin ve gece boyunca -80 °C'de saklayın; daha sonra, dondurulmuş cryovial'ı sıvı bir azot tankına aktarın; donmuş hücreleri 1 yıla kadar saklayın. NOT: İzole B hücrelerinin beklenen verimi toplam PBMC'lerin %2-%8'idir ve %95-%99 yaşayabilirlik oranına sahiptir.</li>
	</ol></li>
	<li>İnsan B hücresi genişlemesi NOT: Yeni yalıtılmış B hücreleri kullanıyorsanız, 4.3.1–4.3.5 adımlarını atlayın. Hücreleri sayın ve gerekli sayıda hücreyi steril konik bir tüpe aktarın ve 4.3.6 adımına devam edin.<ol>
<li>B hücrelerini çözmeden önce bir su banyosunda önceden ısınan fetal sığır serumu (FBS). 20 mL B hücreli genleşme ortamı hazırlayın, bir T25 şişesine aktarın ve ortamı kullanımdan en az 15 dakika önce bir doku kültürü inkübatöründe (37 °C,% 5 CO2, nem ile) ön aşındırın.</li>
		<li>B hücrelerini 37 °C su banyosunda çözün. Beklerken, önceden ısıtılmış 2 mL FBS'yi steril 15 mL konik bir tüpe aktarın.</li>
		<li>B hücreleri tamamen çözüldükten sonra, hemen numuneye damla açısından 1 mL önceden ısıtılmış FBS ekleyin. RT'de 1 dakika kuluçkaya yaslanın.</li>
		<li>Numuneyi yeniden çıkarmak ve tüm hacmi damla yönünde, önceden ısıtılmış 2 mL FBS içeren konik bir tüpe aktarmak için hafifçe pipet.</li>
		<li>Steril 1x PBS, kapak ile hacmi 15 mL'ye getirin ve tüpü 2-3 kez hafifçe ters çevirin.</li>
		<li>5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj.</li>
		<li>Hücre peletini bozmadan süpernatantı atın, hücre peletini 1 mL önceden dengelenmiş B hücre genişletme ortamı ile yeniden atın ve hücreleri sayın. Toplam hücre sayısı yaklaşık 107 hücre olmalıdır.</li>
		<li>Hücreleri önceden dengelenmiş B hücre genişletme ortamının 20 mL'lik bir şişeye aktarın. Hücrelerin son konsantrasyonu yaklaşık 5 x 105 hücre/mL olmalıdır.</li>
		<li>Şişeyi bir doku kültürü inkübatöründe dikey olarak kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>B hücrelerinin tüm hacmini steril konik bir tüpe aktararak genişletme ortamını her 2 günde bir tamamen yenileyin ve 4.3.6–4.3.9 adımlarını tekrarlayın. NOT: T25 şişesi 10-20 mL orta dayanabilir; T75 şişesi 20-60 mL'ye kadar orta dayanabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Birincil insan B hücre mühendisliği
<ol><li>Mühendis B hücreleri, optimum sonuçlar için genişleme/aktivasyondan sonra 48 ± 2 saat. B hücre genleşme ortamını hazırlayın, ortamın 1 mL'lik aliquot'ını 48 kuyulu bir doku kültürü plakasına hazırlayın ve kullanımdan en az 15 dakika önce bir doku kültürü inkübatöründe ön dengeyi kullanın. NOT: İlgi çekici bir gen için CRISPR/Cas9 sgRNA tasarlarken, aşağıda özetlenen adımları izleyin. - Çevrimiçi bir araç kullanarak sgRNA'lar tasarlayın11. - Proteinin tüm izoformlarında ortak olan bir ekson üzerinde sgRNA'lar tasarlayın. - Saygın şirketlerden kimyasal olarak değiştirilmiş sgRNA sipariş edin. - sgRNA genellikle lyophilized formda gelir; steril DNase/RNase içermeyen Tris-EDTA (TE) tamponunda sgRNA'yı 1 μg/μL konsantrasyonda yeniden inşa edin.</li>
	<li>Kimyasal olarak modifiye edilmiş 1,5 μL (1 μg/μL) kimyasal modifiye Streptococcus pyogenes Cas 9 (S.p. Cas9) nükleaz per transeksiyon reaksiyonu ile 1 μL (1 μg/μL) karıştırarak CRISPR/Cas9 transfecting substratı hazırlayın. Kontrol için sgRNA yerine 1 μL TE arabelleği kullanın. NOT: CD19 sgRNA gen KO deneyi için kullanıldığında, sonuçlar için Şekil 2'ye bakın. Bir gen KI deneyi için AAVS1 sgRNA kullanıldığında, sonuçlar için Şekil 5'e bakın.<ul>
<li>Tüm bileşenleri buzda tutun.</li>
	</ul></li>
	<li>Hafifçe karıştırın ve reaksiyon başına 2,5 μL CRISPR/Cas9 transfeksiyon substratını 0,2 mL 8 tüplü bir şeritli bir tüpe aktarın; RT'de bir kenara koyun.</li>
	<li>Bir nükleofector (elektroporatör) açın ve Tablo 1'degösterildiği gibi transfeksiyon reaktifleri hazırlayın. NOT: Bu, gerekirse tüm reaktifleri buza koyarak duraklama için iyi bir adımdır. Deneye devam etmeye hazır olduğunuzda tüm reaktifleri buzdan çıkarın. S.p. Cas9 proteinini kullanırken, araştırmacı CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoprotein'i 1 μg sgRNA'yı 5 μg S.p. Cas9 proteini ile karıştırarak, kabarcıklardan kaçınarak ve optimum sonuçlar için kullanmadan önce karışımı RT'de en az 20 dakika inkübe ederek önceden karmaşık hale etmelidir.</li>
	<li>Transeksiyon reaksiyonuna 106 B hücreyi steril konik bir tüpe sayın ve aktarın.</li>
	<li>Steril 1x PBS ile hacmi 15 mL'ye getirin ve 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj. Beklerken, birincil hücre transfeksiyon reaktifini (Tablo 2) hazırlayın ve RT'de bir kenara koyun.</li>
	<li>Hücre peletini bozmadan süpernatant atın.</li>
	<li>Hücre peletini 10 mL steril 1x PBS ve santrifüj ile 400 × g'da 5 dakika boyunca yeniden ıslatın.</li>
	<li>Hücre peletini bozmadan süpernatant'ı tamamen atın.</li>
	<li>106 B hücre başına 0,5 μg kimyasal olarak modifiye edilmiş GFP mRNA'yı (transfeksiyon muhabiri olarak) hücre peletine aktarın (isteğe bağlı).</li>
	<li>Hücre peletini 106 B hücre başına 20 μL birincil hücre transfeksiyon reaktifi ile yeniden biriktirin; 5-6 kez pipetleme ile hafifçe karıştırın. CRISPR/Cas9 transfeksiyon substratının 2,5 μL'sini içeren 8 tüplü şeridin 0,2 mL tüpüne transfeksiyon reaksiyonu başına 20,5 μL aktarın.</li>
	<li>Pipet, tüm hacmi (23 μL) bir transfection cuvette'e karıştırmak ve aktarmak için bir kez yukarı ve aşağı. Sıvının cuvette'in altını kapladığından emin olmak için tezgah üzerindeki cuvette'i hafifçe kaplayın ve dokunun.</li>
	<li>Transfection için nükleofectorda insan birincil B hücre protokolünü kullanın. NOT: Nükleofector (elektroporatör) doku kültürü başlığının dışına yerleştirilecek ve kullanılabilir. Steriliteyi sağlamak için cuvette'i kapla.</li>
	<li>Elektroporlu hücreleri 15 dakika boyunca RT'de cuvette dinlendirin.</li>
	<li>Önceden dengelenmiş B hücre genleşme ortamının 80 μL'lik kısmını doku kültürü plakasından cuvette transfeksiyon reaksiyonuna aktarın. Cuvette'i doku kültürü inkübatörüne 30 dakika yerleştirin.</li>
	<li>Numunenin tüm hacmini cuvetten B hücre genleşme ortamının 1 mL'lik 48 kuyulu doku kültürü plakasının uygun bir kuyusuna karıştırmak ve aktarmak için birkaç kez hafifçe pipetlayın. Hücrelerin son konsantrasyonu 106 hücre/mL olmalıdır.</li>
	<li>Bir gen KI deneyi yapıyorsanız, 500.000 çok miktarda enfeksiyonun rAAV6 vektörü elektroporlu hücreler (yaklaşık 45 dk post-electroporation) içeren uygun kuyuya aktarın. Şekil 4A'dakirAAV6 vektör yapısına bakın. NOT: Örneğin: Bir kontrol numunesi CRISPR/Cas9 veya rAAV6 vektörü olmadan elektroporlu hale gelecektir. Crispr/Cas9 olmadan yalnızca vektöre özel bir numune elektroporlanacak ve daha sonra rAAV6 vektörü ile transdüklenecektir. Bir KI numunesi CRISPR/Cas9 ile elektropore edilecek ve daha sonra rAAV6 vektörü ile transdüklenecektir. rAAV6, HDR için hedeflenen DSB sitesinin yukarı ve aşağı akış homoloji kollarını içermelidir.</li>
	<li>Plakayı 37 °C'de bir doku kültürü inkübatörüne ve nem ile% 5 CO2'ye yerleştirin.</li>
	<li>Hücreleri sayın ve mühendislik sonrası 1.</li>
	<li>Hücreleri sayarak ve ardından hücrelerin tüm hacmini temiz bir 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktararak B hücre genişletme ortamını her 2 günde bir yenileyin. 5 dakika boyunca 400 × g'da santrifüj ve peletı bozmadan süpernatantı atın. Hücreleri 100 μL taze B hücre genleşme ortamı ile yeniden biriktirin ve 24 kuyulu bir doku kültürü plakası kuyusuna aktarın. 5 × 105 hücre/mL'de son hücre konsantrasyonuna ulaşmak için orta hacmi getirin. NOT: 48 kuyulu bir plaka 1 mL'ye kadar orta / kuyu tutabilir; 24 kuyulu bir plaka 2 mL'ye kadar orta / kuyu tutabilir; 12 kuyulu bir plaka 4 mL orta / kuyuya kadar dayanabilir ve 6 kuyulu bir plaka 8 mL orta / kuyuya kadar tutabilir.</li>
	<li>Akış sitometrisi analizi, TIDE analizi ve bağlantı PCR'si gibi aşağı akış analizleri yapmadan önce tasarlanmış hücrelerin en az 5 gün boyunca genişlemesine izin verin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>LeBien, T. W., Thomas, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B+lymphocytes:+how+they+develop+and+function.">B lymphocytes: how they develop and function.</a> Blood. 112 (5), 1570-1580 (2008).</li><li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells.">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nature Reviews Immunology. 15, 160-171 (2015).</li><li>Slifka, M. K., Antia, R., Whitmire, J. K., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humoral+immunity+due+to+long-lived+plasma+cells.">Humoral immunity due to long-lived plasma cells.</a> Immunity. 8 (3), 363-372 (1998).</li><li>Spriggs, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+human+CD40+ligand+stimulates+B+cell+proliferation+and+immunoglobulin+E+secretion.">Recombinant human CD40 ligand stimulates B cell proliferation and immunoglobulin E secretion.</a> Journal of Experimental Medicines. 176 (6), 1543-1550 (1992).</li><li>Fusil, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+lentiviral+vector+allowing+physiologically+regulated+membrane-anchored+and+secreted+antibody+expression+depending+on+B-cell+maturation+status.">A lentiviral vector allowing physiologically regulated membrane-anchored and secreted antibody expression depending on B-cell maturation status.</a> Molecular Therapy. 23 (11), 1734-1747 (2015).</li><li>Luo, X. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+human+hematopoietic+stem/progenitor+cells+to+produce+a+broadly+neutralizing+anti-HIV+antibody+after+in+vitro+maturation+to+human+B+lymphocytes.">Engineering human hematopoietic stem/progenitor cells to produce a broadly neutralizing anti-HIV antibody after in vitro maturation to human B lymphocytes.</a> Blood. 113 (7), 1422-1431 (2008).</li><li>Mock, U., Thiele, R., Uhde, A., Fehse, B., Horn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+lentiviral+transduction+and+transgene+expression+in+primary+human+B+cells.">Efficient lentiviral transduction and transgene expression in primary human B cells.</a> Human Gene Therapy Methods. 23 (6), 408-415 (2012).</li><li>Heltemes-Harris, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sleeping+Beauty+transposon+screen+identifies+signaling+modules+that+cooperate+with+STAT5+activation+to+induce+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Sleeping Beauty transposon screen identifies signaling modules that cooperate with STAT5 activation to induce B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Oncogene. 35 (26), 3454-3464 (2016).</li><li>Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+primary+human+B+cells+with+CRISPR/Cas9+targeted+nuclease.">Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease.</a> Scientific Reports. 8, 12144 (2018).</li><li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+protein-secreting+plasma+cells+by+homology-directed+repair+in+primary+human+B+cells.">Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells.</a> Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).</li><li>Cui, Y., Xu, J., Cheng, M., Liao, X., Peng, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+CRISPR/Cas9+sgRNA+design+tools.">Review of CRISPR/Cas9 sgRNA design tools.</a> Interdisciplinary Sciences. 10 (2), 455-465 (2018).</li><li>Rees, H. A., Liu, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Base+editing:+precision+chemistry+on+the+genome+and+transcriptome+of+living+cells.">Base editing: precision chemistry on the genome and transcriptome of living cells.</a> Nature Reviews Genetics. 19 (12), 770-788 (2018).</li><li>Spiegel, A., Bachmann, M., Jurado Jim&#233;nez, G., Sarov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR/Cas9-based+knockout+pipeline+for+reverse+genetics+in+mammalian+cell+culture.">CRISPR/Cas9-based knockout pipeline for reverse genetics in mammalian cell culture.</a> Methods. 164-165, 49-58 (2019).</li><li>Suzuki, T., Kazuki, Y., Oshimura, M., Hara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+system+for+simultaneous+or+sequential+integration+of+multiple+gene-loading+vectors+into+a+defined+site+of+a+human+artificial+chromosome.">A novel system for simultaneous or sequential integration of multiple gene-loading vectors into a defined site of a human artificial chromosome.</a> PLoS One. 9, 110404 (2014).</li><li>Bak, R. O., Porteus, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-mediated+integration+of+large+gene+cassettes+using+AAV+donor+vectors.">CRISPR-mediated integration of large gene cassettes using AAV donor vectors.</a> Cell Reports. 20 (3), 750-756 (2017).</li><li>Shirley, J. L., de Jong, Y. P., Terhorst, C., Herzog, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+responses+to+viral+gene+therapy+vectors.">Immune responses to viral gene therapy vectors.</a> Molecular Therapy. 28 (3), 709-722 (2020).</li><li>Martino, A. T., Markusic, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+response+mechanisms+against+AAV+vectors+in+animal+models.">Immune response mechanisms against AAV vectors in animal models.</a> Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 17, 198-208 (2020).</li></ol>

M.J.J, K.L. ve B.S.'nin mucit olarak bulunduğu genom düzenlemeli B hücrelerinin yapım ve kullanma yöntemleri hakkında bir patent başvurusu .M. B.S.M, Immusoft Inc.M.

Birincil insan B hücrelerinde hassas genom mühendisliği yakın zamana kadar zorlu olmuştur9,10. Daha önce crispr/cas9 kullanarak birincil insan B hücrelerini tasarlamak için protokoller yayınlamıştık9. Burada, CD19'un verimli KO'suna izin vermek veya EGFP'yivurmak için B hücre yalıtımı, genişletme ve mühendislik için geliştirilmiş protokolleri özetliyoruz.
Burada genişleme protoko...

B hücreleri hematopoetik kök hücrelerden elde edilen lenfosit soyunun bir alt grubudur. Bağışıklık sorunlarına yanıt olarak büyük miktarlarda antikor üreterek adaptif humoral bağışıklık sisteminde kritik bir rol oynarlar1. B hücreleri aynı zamanda bellek B hücrelerinin ve ölümcül olarak farklılaştırılmış, uzun ömürlü plazma hücrelerinin öncüleridir, böylece kalıcı humoral bağışıklıksağlar 2. Plazma hücreleri, özellikle, yıllarca veya onlarca yıl hayatta kalırken belirli bir antikorun büyük miktarlarda üretme yeteneklerinde bağışıklık hücreleri arasında benzersizdir3. Ek olarak, periferik kandan izolasyon kolaylığı, B hücre soyunun yeni hücre bazlı tedaviler için mükemmel bir aday olduğunu yapar4.
Daha önce, lentiviral vektörler veya Uyuyan Güzel transposon kullananlar gibi rastgele entegrasyon yöntemleri, transgene doğum ve ifade 5 , 6,7,8için B hücrelerini tasarlamak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşımların spesifik olmayan doğası, B hücrelerindeki belirli bir genin biyolojik fonksiyonlarının incelenmesini zorlaştırır ve terapötik ortamda eklemeli mutajensis ve değişken transgene ekspresyonu ve / veya susturma riski taşır.
CRISPR/Cas9 sistemi, araştırmacıların çok sayıda türdeki çeşitli hücrelerin genomunu hassas bir şekilde düzenlemelerini sağlayan güçlü bir genom mühendisliği aracıdır. Son zamanlarda, bizimki de dahil olmak üzere iki grup, ex vivo genişleme için yöntemler geliştirdi ve birincil insan B hücrelerinin genom mühendisliğini hedefledi9,10. Birincil insan B hücrelerini lökorezis örneğinden arındırma sürecini açıklayacağız. Bundan sonra, B hücresi genişletme ve izole B hücrelerinin aktivasyonu için güncellenmiş protokolümüzü açıklayacağız. Daha sonra CRISPR/Cas9 mRNA'yı CD19 sgRNA ile birlikte aktif B hücrelerine tanıtmak için elektroporasyon yoluyla belirli bir B hücre reseptörü ve B hücrelerinin ayırt edici bir özelliği olan 19 (CD19) farklılaşma kümesini devirmek için bir süreç açıklayacağız.
CAS9 mRNA çevrilir ve CRISPR/Cas9-sgRNA ribonucleoprotein kompleksi (RNP) oluşturmak için CD19 sgRNA'ya bağlanır. Daha sonra, kompleksteki sgRNA, Cas9'un genin ekson 2'sinde hedef sırada çift iplikçik kırılması (DSB) oluşturmasına neden olur. Hücreler, nükleotidleri tanıtarak veya silerek, frameshift mutasyona yol açarak ve genin bayıltılmasına neden olarak DSB'yi "homolog olmayan uç birleştirme" ile onaracak. Daha sonra akış sitometrisi ile CD19 kaybını ölçecek ve ayrışma (TIDE) analizi ile indellerin takibi ile indel oluşumunu analiz edeceğiz.
Daha sonra CRISPR/Cas9'u, adeno ile ilişkili virüs entegrasyon sitesi 1 (AAVS1) genine gelişmiş yeşil floresan proteinin(EGFP) raya özgü yerleştirilmesine aracılık etmek için rekombinant bir AAV6 vektörü (rAAV6, homolojiye yönelik onarım (HDR) için bir donör şablonu) ile birlikte kullanma sürecini açıklayacağız. AAVS1 geni, bilinen biyolojik işlevleri olmayan aktif bir lokus ve insan genomunda bir AAV viral entegrasyon bölgesidir; bu nedenle, genom mühendisliği için "güvenli bir liman" olarak kabul edilir. Burada, B hücrelerinin genişlemesi ve aktivasyonunun 7 günlük kültürde 44 kata kadar genişlemeye izin verdiğini bildiriyoruz (Şekil 1). B hücrelerinin elektroporasyonunun transeksiyon sonrası 24 saat genel hücre sağlığında(Şekil 2A)hafif bir azalma gösterdiği görüldü. CD19 işaretleyicisinin dağılım grafiği analizi (Şekil 2B) düzenlenen hücrelerde% 83'e kadar azalma gösterdi (Şekil 2C).
Kromatografların GELGIT analizi (Şekil 3A) % indellerin akış sitometrisi ile % protein kaybına benzer olduğunu ortaya koydu (Şekil 3B). KI deneyinin akış sitometrisi analizi, RNP ile birlikte AAV vektörü alan hücrelerin (Şekil 4), % 64'e kadar EGFP pozitif hücreleri (Şekil 5A) ifade ettiğini ve daha sonra kavşak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile başarılı entegrasyon gösterdiğini göstermiştir (Şekil 5B). Hücre sayımları, tüm örneklerin mühendislik sonrası 3 gün içinde hızla kurtarıldığunu göstermiştir (Şekil 5C).

<table><tbody><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 protein, 500 ug</td><td>IDT</td><td>1081059</td><td>smaller size is also available</td></tr><tr><td>Amaxa P3 primary cell 4D- Nucleofector X Kit S (32 RCT)</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium-chloride-potassium (ACK) lysing buffer</td><td>Quality Biological</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap chemically modified Cas9 mRNA</td><td>Trilink Biotechnology</td><td>L-7206-1000</td><td></td></tr><tr><td>CpG ODN 2006 (ODN 7909) 5 mg</td><td>Invivogen</td><td>TLRL-2006-5</td><td>different sizes available</td></tr><tr><td>Cryostor CS10, 100 mL</td><td>STEMCELL Technology</td><td>7930</td><td></td></tr><tr><td>CTS Immune Cell SR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A2596101</td><td></td></tr><tr><td>EasySep human B cells isolation kit</td><td>STEMCELL Technology</td><td>17954</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience fixable viability dye eFlour 780</td><td>eBiosciences</td><td>65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>Excellerate B cell media, Xeno-free</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>CCM031</td><td>B-cell basal medium</td></tr><tr><td>Falcon 14 mL Polypropylene Round-bottom Tube</td><td>Corning</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>S11550</td><td>For thawing B cells only</td></tr><tr><td>Ficoll-Paque Plus</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-03</td><td></td></tr><tr><td>GeneMate SnapStrip&amp;reg; 8-Strip 0.2 mL PCR Tubes with Individual Attached Dome Caps</td><td>BioExpress</td><td>T-3035-1 / 490003-692</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone 0.0067M PBS (No Ca, No Mg) or 1x PBS</td><td>GE lifesciences</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Lonza 4D Nucleofector core unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002B</td><td></td></tr><tr><td>Lonza 4D Nucleofector X unit</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>Mega CD40 Ligand</td><td>Enzo Life Sciences</td><td>ALX-522-110-C010</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562-1EA</td><td>For freezing cells</td></tr><tr><td>Pen/Strep 100X</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TMS-AB2-C</td><td></td></tr><tr><td>PerCP anti-human CD19 clone HIB19</td><td>biolegend</td><td>302228</td><td>smaller size is also available</td></tr><tr><td>rAAV6 SA-GFP pakaging ( with our SA-GFP cassette see Figure 4.)</td><td>Vigene Biosciences</td><td>N/A</td><td>large scale packaging, 1e13 GC/mL, 500 mL</td></tr><tr><td>Recombinant human IL-10 protein 250 ug</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>217-IL-250</td><td>different sizes available</td></tr><tr><td>Recombinant human IL-15 protein 25 ug</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>247-ILB-025</td><td>different sizes available</td></tr><tr><td>The Big Easy EasySep Magnet</td><td>STEMCELL Technology</td><td>18001</td><td>different sizes available</td></tr><tr><td>Tris-EDTA (TE) buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2476100</td><td></td></tr></tbody></table>

genome engineering of primary human b cells using crispr/cas9

B hücreleri hematopoetik kök hücrelerden elde edilen lenfositlerdir ve adaptif bağışıklık sisteminin humoral kolunun önemli bir bileşenidir. Periferik kandan izolasyon kolaylığı, in vitroyu genişletme yetenekleri ve in vivo olarak uzun ömürlü olmaları nedeniyle hücre bazlı tedaviler için çekici adaylar yaparlar. Ek olarak, normal biyolojik işlevleri -büyük miktarlarda antikor üretmek için- enfeksiyonla savaşmak için rekombinant antikor veya enzimopatiklerin tedavisi için bir enzim gibi çok büyük miktarlarda terapötik proteini ifade etmek için kullanılabilir. Burada, primer insan B hücrelerini periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC) izole etmek ve izole edilmiş B hücrelerini in vitro olarak etkinleştirmek / genişletmek için ayrıntılı yöntemler sunuyoruz. Daha sonra B hücrelerindeki endojen genlerin bölgeye özgü KO'su için CRISPR/Cas9 sisteminin kullanılmasıyla ilgili adımları gösteriyoruz. Bu yöntem, ilgi çekici genlerin biyolojik işlevlerini incelemek için kullanılabilecek çeşitli genlerin verimli KO'suna izin verir. Daha sonra CRISPR/Cas9 sistemini kullanma adımlarını, B hücrelerindeki transgene ifade kasetinin raya özgü verimli entegrasyonu için rekombinant, adeno ilişkili, viral (rAAV) vektör ile birlikte gösteriyoruz. Birlikte, bu protokol, birincil insan B hücrelerinde genlerin biyolojik işlevlerini incelemek ve B hücre terapötiklerinin geliştirilmesi için kullanılabilecek adım adım bir mühendislik platformu sağlar.

Güncellenmiş genişletme ve aktivasyon protokolü, B hücrelerinin 7 günde 44 kata kadar hızlı genişlemesini sağladı(Şekil 1; n =3 donörler). KO deneyinde, Trypan mavi boyama kullanan B hücre sayısı, hem kontrolde hem de CD19 KO örneklerinde 24 saat post-elektroporasyonda hücre iyileşmesinde hafif bir azalma ile% 80'den fazla uygulanabilir hücre gösterdi(Şekil 2A; p ≥ 0.05, n = 3 donör). Bu sonuç, elektroporasyonun genel B hücre sağlığ...

Watch this Scientific Journal Video about Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9 at JoVE.com

Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Burada, B hücrelerindeki genlerin biyolojik fonksiyonlarını ve B hücre terapötiklerinin gelişimini incelemek için gen nakavt (KO) ve knock-in (KI) için birincil insan B hücrelerinin CRISPR/ Cas9 tabanlı genom mühendisliği için ayrıntılı, adım adım bir protokol sunuyoruz.

CRISPR/Cas9 Kullanarak Birincil İnsan B Hücrelerinin Genom Mühendisliği

B cells are lymphocytes derived from hematopoietic stem cells and are a key component of the humoral arm of the adaptive immune system. They make ...

genome-engineering-of-primary-human-b-cells-using-crisprcas9

Research

JoVE Journal

Biology

6.2K Görüntüleme.  University of Minnesota. Burada, B hücrelerindeki genlerin biyolojik fonksiyonlarını ve B hücre terapötiklerinin gelişimini incelemek için gen nakavt (KO) ve knock-in (KI) için birincil insan B hücrelerinin CRISPR/ Cas9 tabanlı genom mühendisliği için ayrıntılı, adım adım bir protokol sunuyoruz.

Video: Genome Engineering of Primary Human B Cells Using CRISPR/Cas9

Using CRISPR/Cas9 Gene Editing to Investigate the Oncogenic Activity of Mutant Calreticulin in Cytokine Dependent Hematopoietic Cells

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to generate RNA-guided nucleases, such as CRISPR-associated (Cas) 9 for site-specific eukaryotic genome editing. Genome engineering by Cas9 is used to efficiently, easily and robustly modify endogenous genes in many biomedically-relevant mammalian cell lines and organisms. Here we show an example of how to utilize the CRISPR/Cas9 methodology to understand the biological function of specific genetic mutations. We model calreticulin (CALR) mutations in murine interleukin-3 (mIL-3) dependent pro-B (Ba/F3) cells by delivery of single guide RNAs (sgRNAs) targeting the endogenous Calr locus in the specific region where insertion and/or deletion (indel) CALR mutations occur in patients with myeloproliferative neoplasms (MPN), a type of blood cancer. The sgRNAs create double strand breaks (DSBs) in the targeted region that are repaired by non-homologous end joining (NHEJ) to give indels of various sizes. We then employ the standard Ba/F3 cellular transformation assay to understand the effect of physiological level expression of Calr mutations on hematopoietic cellular transformation. This approach can be applied to other genes to study their biological function in various mammalian cell lines.

Targeted gene editing using CRISPR/Cas9 has greatly facilitated the understanding of the biological functions of genes. Here, we utilize the CRISPR/Cas9 methodology to model calreticulin mutations in cytokine-dependent hematopoietic cells in order to study their oncogenic activity.

CRISPR/Cas9 kullanarak Gene sitokin bağımlı hematopoetik hücreler Mutant Calreticulin Oncogenic etkinliğini araştırmak için düzenleme

Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) is an adaptive immunity system in prokaryotes that has been repurposed by scientists to ...

Kanser Araştırmaları

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Genetik

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Generation of Defined Genomic Modifications Using CRISPR-CAS9 in Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise heterozygous genetic modifications is challenging due to CRISPR-CAS9 mediated indel formation in the second allele. Here, we demonstrate a protocol to help overcome this difficulty by using two repair templates in which only one expresses the desired sequence change, while both templates contain silent mutations to prevent re-cutting and indel formation. This methodology is most advantageous for gene editing coding regions of DNA to generate isogenic control and mutant human stem cell lines for studying human disease and biology. In addition, optimization of transfection and screening methodologies have been performed to reduce labor and cost of a gene editing experiment. Overall, this protocol is widely applicable to many genome editing projects utilizing the human pluripotent stem cell model.

This protocol provides a method to facilitate the generation of defined heterozygous or homozygous nucleotide changes using CRISPR-CAS9 in human pluripotent stem cells.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Human pluripotent stem cells offer a powerful system to study gene function and model specific mutations relevant to disease. The generation of precise ...

Primer Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlarda Kesin Gen Bozulması İçin Bir Kılavuz

High-Efficiency Gene Disruption in Primary Bone Marrow-Derived Macrophages Using Electroporated Cas9-sgRNA Complexes

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the physiology of macrophages in vivo more closely than immortalized macrophage cell lines and can be derived from mice already carrying defined genetic changes. However, disrupting gene function in BMDMs remains technically challenging. Here, we provide a protocol for efficient CRISPR/Cas9 genome editing in BMDMs, which allows for the introduction of small insertions and deletions (indels) that result in frameshift mutations that disrupt gene function. The protocol describes how to synthesize single-guide RNAs (sgRNA-Cas9) and form purified sgRNA-Cas9 ribonucleoprotein complexes (RNPs) that can be delivered by electroporation. It also provides an efficient method for monitoring editing efficiency using routine Sanger sequencing and a freely available online analysis program. The protocol can be performed within 1 week and does not require plasmid construction; it typically results in 85% to 95% editing efficiency.

Yazar Spotlight: Hassas Gen Bozulması için Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlarda Verimli CRISPR/Cas9 Genom Düzenleme

This protocol describes the procedure for genome editing in mouse bone marrow-derived macrophages using Cas9-sgRNA ribonucleoprotein complexes assembled in vitro and delivered by electroporation.

Elektropore Cas9-sgRNA Kompleksleri Kullanılarak Primer Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlarda Yüksek Verimli Gen Bozulması

Bone marrow-derived macrophages (BMDMs) from mice are a key tool for studying the complex biology of tissue macrophages. As primary cells, they model the ...

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional properties such as proliferation and differentiation, thereby promoting the development of hematologic malignancies. Efficient and precise genetic manipulation of HSPCs is required to model, characterize, and better understand the functional consequences of recurrent somatic mutations. Mutations can have a deleterious effect on a gene and result in loss-of-function (LOF) or, in stark contrast, may enhance function or even lead to novel characteristics of a particular gene, termed gain-of-function (GOF). In contrast to LOF mutations, GOF mutations almost exclusively occur in a heterozygous fashion. Current genome-editing protocols do not allow for the selective targeting of individual alleles, hampering the ability to model heterozygous GOF mutations. Here, we provide a detailed protocol on how to engineer heterozygous GOF hotspot mutations in human HSPCs by combining CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair and recombinant AAV6 technology for efficient DNA donor template transfer. Importantly, this strategy makes use of a dual fluorescent reporter system to allow for the tracking and purification of successfully heterozygously edited HSPCs. This strategy can be employed to precisely investigate how GOF mutations affect HSPC function and their progression toward hematological malignancies.

Novel strategies to faithfully model somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) are necessary to better study hematopoietic stem cell biology and hematological malignancies. Here, a protocol to model heterozygous gain-of-function mutations in HSPCs by combining the use of CRISPR/Cas9 and dual rAAV donor transduction is described.

İnsan Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerinde Onkojenik Heterozigot Fonksiyon Kazancı Mutasyonlarının Mühendisliği

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...

Generation of Knock-out Primary and Expanded Human NK Cells Using Cas9 Ribonucleoproteins

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging in primary NK cells. For example, transgene delivery using lentiviral or retroviral transduction resulted in a limited yield of genetically-engineered NK cells due to substantial procedure-associated NK cell apoptosis. We describe here a DNA-free method for genome editing of human primary and expanded NK cells using Cas9 ribonucleoprotein complexes (Cas9/RNPs). This method allowed efficient knockout of the TGFBR2 and HPRT1 genes in NK cells. RT-PCR data showed a significant decrease in gene expression level, and a cytotoxicity assay of a representative cell product suggested that the RNP-modified NK cells became less sensitive to TGF&#946;. Genetically modified cells could be expanded post-electroporation by stimulation with irradiated mbIL21-expressing feeder cells.

Here, we present a protocol to genetically modify primary or expanded human natural killer (NK) cells using Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs). By using this protocol, we generated human NK cells deficient for transforming growth factor&#8211;b receptor 2 (TGFBR2) and hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1).

Cas9 Ribonucleoproteins kullanarak Knock-out birincil ve genişletilmiş insan NK hücre üretimi

CRISPR/Cas9 technology is accelerating genome engineering in many cell types, but so far, gene delivery and stable gene modification have been challenging ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Production of Human CRISPR-Engineered CAR-T Cells

Adoptive cell therapies using chimeric antigen receptor T cells (CAR-T cells) have demonstrated remarkable clinical efficacy in patients with hematological malignancies and are currently being investigated for various solid tumors. CAR-T cells are generated by removing T cells from a patient's blood and engineering them to express a synthetic immune receptor that redirects the T-cells to recognize and eliminate target tumor cells. Gene editing of CAR-T cells has the potential to improve safety of current CAR-T cell therapies and further increase the efficacy of CAR-T cells. Here, we describe methods for the activation, expansion, and characterization of human CRISPR-engineered CD19 directed CAR-T cells. This comprises transduction of the CAR lentiviral vector and use of single guide RNA (sgRNA) and Cas9 endonuclease to target genes of interest in T cells. The methods described in this protocol can be universally applied to other CAR constructs and target genes beyond the ones used for this study. Furthermore, this protocol discusses strategies for gRNA design, lead gRNA selection and target gene knockout validation to reproducibly achieve high-efficiency, multiplex CRISPR-Cas9 engineering of clinical grade human T cells.

Here, we present a protocol for gene editing in primary human T cells using CRISPR Cas Technology to modify CAR-T cells.

CRISPR/Cas9 Kullanarak Birincil İnsan B Hücrelerinin Genom Mühendisliği

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

CRISPR/Cas9 kullanarak Gene sitokin bağımlı hematopoetik hücreler Mutant Calreticulin Oncogenic etkinliğini araştırmak için düzenleme

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Elektropore Cas9-sgRNA Kompleksleri Kullanılarak Primer Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlarda Yüksek Verimli Gen Bozulması

Elektropore Cas9-sgRNA Kompleksleri Kullanılarak Primer Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlarda Yüksek Verimli Gen Bozulması

Elektropore Cas9-sgRNA Kompleksleri Kullanılarak Primer Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlarda Yüksek Verimli Gen Bozulması

İnsan Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerinde Onkojenik Heterozigot Fonksiyon Kazancı Mutasyonlarının Mühendisliği

Cas9 Ribonucleoproteins kullanarak Knock-out birincil ve genişletilmiş insan NK hücre üretimi

İnsan CRISPR-Engineered CAR-T Hücrelerinin Üretimi