Laboratuvar protokolümüz, insan genom düzenlemesinin CAR T hücre tedavisi ile birleştirilmesine olanak sağlar. Laboratuvar prosedürü CRISPR-Cas9 ile yüksek verimli üç gen hedefleme yaklaşımıdır. Ve son olarak, yaklaşımımız insan klinik deneylerine çevrilebiliyor.
Açıklanan yöntemler diğer CAR yapılarına ve hedef genlere uygulanabilir. Tekniklerin temeli, daha büyük ölçekli ve daha fazla gelişme için akademik ve endüstri işbirlikçilerine çevrilecek kadar sağlamdır. Bu protokolü ilk kez denerken, doğru inkübasyon sürelerini etkinleştirmek için kılavuz RNA ekranındaki grup sayısını sınırlayın.
Kültür koşullarına bağlı kalmak ve tarif edilen tohumlama yoğunluğu deneyimlerimizde kritik öneme sahiptir. Başlamak için, sağlıklı gönüllü bağışçılardan otolog periferik kan mononükleer hücreleri veya PBMC'ler elde edin ve piyasada bulunan CD4 ve CD8 seçim kitlerini kullanarak CD4 ve CD8 pozitif T hücrelerini izole edin. CD4 pozitif ve CD8 pozitif T hücrelerini bire bir oranda birleştirin ve R10'da mililitre başına 3 milyon hücreyi kuluçkaya yatırın, her bir insan IL7 ve insan IL15 mililitresi başına 5 nanogram ile 37 santigrat derecede bir gecede desteklenir.
Ertesi gün, T hücrelerini sayın ve beş dakika boyunca 300 kez G'de 5 ila 10 milyon hücre santrifüjleyin. Tüm süpernatant atın ve hücre peletini azaltılmış serum minimum esansiyel ortamda yıkayın. Peleti, üreticinin talimatlarına göre 100 mikrolitre nükleer sevgi çözeltisinde yeniden askıya alın.
Hücreleri yıkarken, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 5 mikrogram tek kılavuz RNA ile 10 mikrogram Cas9 çekirdeğini inkübe ederek bir ribonucleoprotein veya RNP kompleksi hazırlayın. Tek kılavuz RNA'sız sahte bir kontrol ekleyin. Yeniden askıya alınan hücreleri RNP kompleksi ile birleştirin ve dört mikromoler elektroporasyon arttırıcıdan oluşan 4,2 mikrolitre ekleyin.
İyice karıştırın ve elektroporasyon cuvettes içine aktarın. Eh111 darbe kodunu kullanarak hücreleri elektroporatlayın, daha sonra R10'da mililitre başına 5 milyon hücreyi kuluçkaya yatırın, mililitre insan IL7 başına 5 nanogram ve 12 kuyu plakasında 48 saat boyunca 30 santigrat derecede insan IL15 ile desteklenmiştir. Kuluçkadan sonra, T hücre aktivasyonu ve genişlemesi ile devam edin.
PCR amplicon'un sırasını standart bir astar tasarım yazılımına girerek sıralama astarlarını tasarlayın. Tasarım yazılımı, Sanger dizilimi için uygun olan birden fazla astar dizisi önerecektir. İndellerin etrafında iyi sıralama kalitesi sağlamak için gRNA kesim bölgesinin yukarı veya aşağı akışlarında en az 150 baz çifti amplicon ile bağlanan ileri ve ters astarları seçin.
Genomik düzeyde nakavt verimliliğini tespit etmek için TIDE analizini kullanın. Algoritma, dizi izlemelerinden gelen indel spektrumu doğru bir şekilde yeniden yapılandırır ve R kare değerlerini hesaplar. Aktivasyondan sonra, T hücreleri kültürde genişletilir ve gelecekteki çalışmalar için kriyopreziteserved edilir.
Genişleme sırasında, popülasyon iki katına çıkma ve hacim değişiklikleri hem sahte hem de düzenlenmiş CAR T hücreleri için protokol boyunca izlenir. Genişleme sırasında çoğalma ve aktivasyonda önemli bir değişiklik tespit edildi. Hücreler kriyopreziserv edildikten sonra, hem sahte düzenlenmiş hem de nakavt CAR T hücreleri için daha fazla işlevsel çalışma için CAR ekspresyon seviyeleri belirlendi.
Önemli bir değişiklik gözlenmedi. Nakavt verimliliği birden fazla teknik kullanılarak belirlenebilir. Bu temsili akış sitometrisi grafiklerinde, PDCD1 ve TRAC loci, PDCD1 tek kılavuz RNA'sı için% 90 ve birden fazla sağlıklı donör arasında TRAC tek kılavuz RNA'sı için% 98 verimlilik göstererek tek kılavuz RNA kullanılarak hedeflenmiştir.
Cas9 ve kılavuz RNA'ların azı dişleri oranlarının doğru olduğundan emin olmak önemlidir. İşlem sırasında, hücreler her zaman dört santigrat derecede tutulmalı ve uzun süre elektroporasyon çözeltisinde bırakılmamalıdır. CAR korumasından sonra CRISPR tarafından tasarlanan CAR T hücreleri, sitotoksiklik tahlilleri, sitokin üretimi ve singenetik veya ksinograf tümör fare modelleri gibi in-vitro ve in-vivo fonksiyonel tahliller için kullanılabilir.
CRISPR Cas9 teknolojisini kullanan yaklaşımımız artık klinik çalışmalara da uygulanıyor. Yaklaşım hem kanser hem de dünya çapında milyonlarca çocuğu ve yetişkini etkileyen hemoglobinofaties gibi kötü huylu olmayan genetik bozukluklar için kullanılabilir.
