Bu protokol yumurtalık dokularındaki bakterileri keşfetmek ve işlevlerini tahmin etmek için tasarlanmıştır. İmmünohistokinometri lekeleme ve 16S rRNA dizilimi, kanserli ve kanserli olmayan yumurtalık dokularındaki bakterileri yerinde keşfetmek ve ayırt etmek için kullanılmıştır. Bakterilerin telafi edici ve fonksiyonel farklılıkları, göz ardı edilmeyen günlerin yeniden inşası ile boP'lar ve toplulukların hücresel-genetik araştırması kullanılarak tahmin edilir.
Protokolümüz yumurtalık dokularından in situ bakteri çıkarmayı amaçlamaktadır. Her türlü tümördeki bakterileri keşfetmek için de kullanılabilir. Protokolümüzün temel avantajları, kolay ve kullanışlı olması, hemen hemen her laboratuvarda gerçekleştirilebilmesidir.
Sonuçları almak da hızlı. Protokoldeki uygulama sırasında, tesis dışındaki tümör dokuları hariç tutulması önemlidir. Bu nedenle, bu protokoldeki tüm prosedürlerin steril olması gerekir.
Ameliyat sırasında, resektize edilmiş yumurtalıkları bir çift yeni steril cımbızla kabaca bir santimetre kalınlığında doku örneklerine ayırın. Tüm prosedür sırasında başka bir şeye dokunmaktan kaçının. Ayırmadan sonra, numuneyi steril bir tüpe çıkarın ve iletim için sıvı nitrojene koyun.
Örnekleri eksi 80 santigrat derecede koruyun. Dokuları formalin ile sabitle ve sonra parafin ile gömün. Bu protokol burada duraklatılabilir.
Dokular daha uzun süre muhafaza için oda sıcaklığında tutulabilir. Daha fazla adım atmak için numuneleri beş mikrometre seri bölümünde kesin. Sonra, örnekleri kurutun.
De-parafin ve numunelere rehidrasyon yapın. Antijeni almak için EDTA tamponunda 10 dakikalık bir mikrodalga tedavisi gereklidir. Numuneleri %0,3 hidrojen içeren PBS'ye batırın.
Endojen peroksidaz aktivitesini durdurmak için 20 dakika peroksidize edin. Antikor EMA'yı LPS çekirdeğinde 1'den 300'ün üzerinde bir konsantrasyonda gerçekleştirin. Ve dört santigrat derecede bir gece boyunca devam ettir.
Bakterileri keşfetmek için, HRP'nin varlığını tespit etmek için bir DAP substrat kiti kullanın. Bir üreticinin talimatlarına dayanarak, HRP polimer, anti-tavşan antikor kullanın. Antikorların tamamen birleşmesi için masa konsantratörü kullanın.
Birleştirici olmayan antikorları ortadan kaldırmak için PBS kullanın. Kimyasal lekelerinizi üreticinin talimatlarına göre yapın, ardından numuneleri su altına yıkayın. Örneklere dehidrasyon yapın.
İmzalayarak örnekleri takım elbise. Ve üreticinin protokolüne göre görüntüleme Pro Plus Prepare kitaplığını kullanarak örnek olarak girin. Gene özgü diziler ve Illumina adaptörü çıkınt nükleotid dizilerinden oluşan astar desenini uygulayın.
RRNA gen dizilerinde bakteriyel 16'ların V4 bölgesinin doğum oranlarını yükseltmek için amplicon PCR kullanarak DNA örnek girdisinden şablonu güçlendirin. Reaksiyon karışımını PCR ürününden çıkarmak için Mag-Bind RxNPure Plus manyetik boncukları kullanın. Dizinlenmiş PCR amplifikasyonu ikinci kez gerçekleştirin.
Kitaplığı denetlemek için Agilent 2200 TapeStation'ı kullanın. Kitaplığı ölçmek için QuantiFluor dsDNA Sistemini kullanın. 600 döngüsü ile v3 standart akış hücresi yaklaşık 100.000 eşleştirilmiş uç üretir.
2 kere 300 taban 3. Kitaplıklar normalleştirilir, havuza alındı ve sıralandı. Her numunenin ham oranları Trimmomatic tarafından sıralama kalitesine göre filtrasyona uğrar.
Astar ve bağdaştırıcı dizilerinin her ikisi de kaldırılmalıdır. Hem çifti hem de nitelikleri 25'ten düşük olan sıra okumaları kısaltılmalıdır. QIIME yazılım paketi ile 16s rRNA'yı analiz edin.
OTU'ları oluşturmak için dizileri toplayın ve benzerlik kesintisi %97 OPU'lar için, göreli bolluk her örnekte hesaplanmalıdır. Tüm dizileri sıralamak için RDP eğitim kümesinde bulunan bir Bayes sınıfılandırıcısı kullanın. OTU ile, dizilerin ana tutarlılığına sahip bir sınıflandırma OTU'lara atanır.
ATU'lar, örnek grup bilgilerine dayanarak Silva veritabanına hizalanır. Alfa çeşitliliği ve UniFrac tabanlı ana koordinat analizi gerçekleştirin. Bakterilerin özelliklerinin ilgili sunumlarını tahmin etmek için BugBase kullanın.
PICRUSt'ta bir metagenom'un işlevsel bileşimini tahmin edin. İzleme verilerinin ve referans genomları içeren bir veritabanının kullanımı ile STAMP yazılımı yardımıyla her grup arasındaki farklı işlevleri analiz edin. Sonucu hesaplamak için bir istatistik yazılımı kullanın.
İstatistiksel önemin göstergesi 0,05'ten az olarak ayarlanmalıdır. Yaş ve eşlik içeren kafa karıştırıcı faktörleri Öğrencinin t-test'ine göre hesaplayın. Ki-kare testi ile menopoz durumunu, hipertansiyon ve diyabet öyküsünün hesapını hesaplayın.
Mann-Whitney U testi ile yumurtalık bakteri taksonunun sayısını hesaplayın. Bu çalışmaya 16 hasta kayıt yaptırdı. BugBase, tahmin edilen metagenomların analizini uygulamak için kullanıldı.
Anti-bakteriyel LPS antikor kullanarak yumurtalıkların potansiyel patogenetik ve immünhistokimyası. Bu rakam kanser ve kontrol gruplarında bakteriyel zenginliği ve çeşitliliği göstermektedir. 16S rRNA dizilimi ile ortaya çıktı.
Rakamlar tür indeksi gözlenir. Chao1 endeksi, ACE endeksi, Shannon endeksi, Evenness endeksi, Simpson endeksi sırasıyla. Phyla'nın göreceli bolluğu ve yumurtalık örneklerinde en bol 12 bakteri türü bu şekilde gösterilmiştir.
Şekil A, B, C ve D.Kontrol grubundaki hastaların yumurtalıklarındaki panelin ve yumurtalık kanseri grubundaki göreceli bolluk anlamına gelir. Kontrol hastalarının ve yumurtalık kanseri grubunun yumurtalıklarındaki en bol on iki bakteri türünün göreceli bolluğu. Bu, PCoA ve Anoxynatronum sibiricum ve Methanosarcina vacuolata'nın göreceli bolluğu kullanılarak kümelenmiş en yaygın olanıdır.
Şekil A, PCoA kullanılarak kümelenen en yaygın olanları gösterir. PC1 ve PC2 x ve y ekseni üzerine çizilir. Kırmızı blok yumurtalık kanseri grubundaki örneğe eşittir.
Mavi daire denetim grubundaki bir örneğe eşittir. Yumurtalık kanseri grubundan alınan örnekler kontrol grubundaki diğer örneklerden ayrılabilir. Şekil B, PCoA kullanılarak kümelenmiş en yaygın olanları gösterir.
PC1 ve PC2 x ve y ekseninde çizilir. Kırmızı blok yumurtalık kanseri grubundaki bir örneğe eşittir. Mavi düz daire, rahim miyomu olan hastadan alınan bir örneğe eşittir.
Ve mavi içi boş daire rahim adenomiyozu olan bir hastanın örneğine eşittir. Şekil C, Anoxynatronum sibiricum'un göreceli bolluğunu göstermektedir. Şekil D, Methanosarcina vacuolata'dır.
Bu rakam, tahmin edilen metanemiklerin BugBase analizidir. Kanser grubundaki yumurtalıkların potansiyel patogenetik ve oksidatif stres tolerans fenotipi kontrol grubundan daha güçlüdür. Bu rakam PICRUSt analizi ile kanser ve kontrol grupları arasındaki KEGG yol boşluğundan önemli ölçüde farklıdır.
Numunelerimizi aldığımızda, bir çift yeni steril cımbıza ihtiyaç vardır. Numunelere olası kontaminasyona dikkat edin. Bu bakteri saha dışı tümör dokuları azmi büyük ölçüde etkileyebilir.
Denetim grubunu her adıma ayarlamak tercih edilir. Potansiyel kontaminasyonun etkisini azaltmak için.
