Farklı beyin bölgelerini incelemek, beynin moleküler ve yapısal karmaşıklığını anlamaya yönelik bir basamak taşıdır. Bu protokol, farklı beyin bölgelerini izole etmek için fare beyninin sistematik bir diseksiyonunu tanımlar. Beyin anatomisi perspektifinde, kolayca çoğaltılabilen yukarıdan aşağıya bir yaklaşımdır.
Bu protokolün avantajları iki yönlüdür. İlk olarak, bu yaklaşım küçük ama kritik beyin bölgelerinin moleküler temellerini anlamak için bir fırsat sağlar. İkincisi, tüm bu diseksiyon süreci, sırt ve moleküler tahlillerin kritik bir ön koşulu olan moleküler bütünlüğün korunmasını sağlamak için yeterince kısadır.
Bu prosedür pratik ve hassas kullanımı içerir. Yapısal dönüm noktalarını korumak için zamanlama burada çok önemlidir ve uygun eğitim ve uygulama ile elde edilebilir. Fare beyninin çıkarılması prosedürünü gösteren, laboratuvarımızdan bir araştırma kimyageri ve biyoinformatikçi olan Seid Muhie olacak.
Fare beyni diseksiyonu prosedürünü daha fazla gösteren, laboratuvarımızdan bir sinirbilimci olan James Meyerhoff olacaktır. Başlamak için, iyi bir kavrama için cildi temizleyin ve çıkarın. Kafası kesilmiş başın maksillasını bir hemostatla kelepçeleyin ve kafa derisini rostral olarak yansıtmak için bir gazlı bez kullanın.
İnce kavisli makasları, yapışan meninksleri ayırmak için foramen magnumuna yerleştirin. Daha sonra makasları, omuriliğin dikey olarak işaret eden bıçakla geçtiği kafatasının tabanının açıklığına yerleştirin, ancak bazal plaka kemiğinin iç yüzeyine paralel ve bastırarak, bıçağı 45 derece sola ve daha sonra sağ tarafa döndürün. Beyinciği açığa çıkarmak için intraparietal kemikteki oksipital kemiği çıkarın.
Makası orta sagital sütür boyunca rostral olarak bregmaya kadar ilerletin ve serebral kortekslerin yırtılmasını önlemek için yukarı doğru kaldırarak kesin. Parietal kemikler kaldırılırken, kalan meningeal ataşmanları tanımlayın ve kesin. Sagital düzlemde iki paralel kesim yapın ve beyin yüzeyinin yırtılmasını önleyerek ön kemiğin parçalarını çıkarın.
Meningeal ataşmanları ve kraniyal sinirleri keserken, yerçekiminin beynin tuzlu su çözeltisi ile önceden doldurulmuş küçük bir kaba çıkarılmasına yardımcı olmasına izin vermek için kafatasını ters çevirin. Hipofiz anatomisinin tanımlanabilir olması için işitsel boğayı sağlam tutun. Hipofizi yerinde tutan zarlı çadırın sırtında her iki tarafta da son derece küçük bir parasaggital kesim yapın ve hipofizin arka lobunu ultra ince forsepslerle kaldırın.
En yakın trigeminal sinirde hipofiz ön lobunun lateral kenarları arasında sagital bir kesim yapın, ardından hipofizin ön lobunu kaldırın. Beyaz ışık kaynağını doku üzerine yönlendirin. Beyni önceden soğutulmuş paslanmaz çelik bir blok üzerine yerleştirin ve buz gibi soğuk bir tuzlu su çözeltisinde buzla çevreleyerek bloğu soğuk tutun.
Yapıları korumak için dokuyu periyodik olarak buz gibi soğuk tuzlu su çözeltisi ile nemlendirin. Beyni, serebral korteksler yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Küçük kavisli forseps kullanarak, beyinciği çıkarın.
Dorsal yaklaşımı kullanarak, küçük bir kavisli forsepsin kapalı bıçaklarını korpus kallozumun altına kaydırın ve kritik olarak göze çarpan orta hat yer işaretlerini korumak için neokorteksi iki taraflı olarak geri çekmek için yavaşça yayın. Nihai olarak, optik kiazm, hipotalamus, koku alma ampulleri, medulla oblongata, hipofiz stoğu ve pontin köprüsü gibi yapılar görülebilir. Yarımküreleri ayırmayı deneyin.
Beyin ventral bölgesini yukarı çevirin ve serebral yarımkürelerdeki koku alma ampulleri arasındaki dorsumdan başlayarak orta sagital bir kesim yapın. Medullayı çıkarın ve ardından iki yarım küreyi yavaşça ayırın. Daha sonra, arka beyni elde etmek için havuzların iç kenarında koronal bir kesim yapın ve medullayı göletlerin arka kenarından ayırın.
İki serebral yarımkürenin dikkatli bir şekilde ayrılması için beyin dokusunu çevirin. Bu adımda koku alma ampulünü çıkarın. Korpus kallozumun cinsinin bir milimetre önünde bir koronal kesim yapın ve aksesuar koku alma ampullerini çıkarın, ardından medial ve lateral prefrontal korteksi ayırın.
Septal çekirdeği dorsal olarak ve ventral striatum ventrallisini serbest bırakmak için lateral ventrikülün ön boynuzunun altındaki orta hattan anterior komissürün enine kısmından yatay veya koronal olarak kısmen kesilir. Çekirdek yenik ve koku tüberkülünü çıkarmak için az miktarda korteksi lateral yüzeyden çıkarın. Korpus striatumun rostral kısmını, dış kapsülün hemen dışında kesilmiş kavisli bir neşter ile üstteki korteksten ayırın.
Septal çekirdekleri veya septumu tanımlayın ve bunları bu bölümden izole edin. Bu adımda hipotalamusu ayırmak için kavisli bir kesim yapın. Bu, sadece hipotalamik sulkus kadar lateral olarak uzanan memeli cisimlerine posterior kısmi bir koronal kesim kullanılarak yapılacaktır.
Daha sonra hipotalamus kesitini, hipotalamik sulkus uzunluğu boyunca parasagital bir kesimle serbest bırakın. Kalan limbik sistem bileşenlerinde ek intralimbik bağlantılar ortaya çıkarmak için lateral ventrikülü kullanın. İç korteksin iç kısmında, ventrikül açıldıktan sonra fan benzeri bir yapı gözlenir.
Diseksiyon amacıyla kenar boşluklarını tanımlamak için entorinal korteksteki fan benzeri yapıyı kullanın, ardından amigdala, entorinal korteks, posterior singulat korteks ve hipokampusu tanımlayın ve çıkarın. Orta hat rostral kortikal düzlemde uzanan dorsal yüzeyinde stria medullarisin görselleştirilmesiyle talamusun tanımlandığını doğrulayın. Talamus'u orta beyinden koronal bir kesikle tamamen ayırın.
Bu protokol, beynin kafatasından derhal çıkarılması ve ardından diseksiyon için kullanılabilir. Disseke edilen dokular, çalışmanın gereksinimlerine bağlı olarak daha sonra korunabilir ve işlenebilir. Birden fazla disseke dokudan ekstrakte edilen RNA, gen ekspresyonu için test edilebilir.
Temsili sonuçlar, RNA ekstraksiyonundan önce birkaç ay boyunca eksi 80 santigrat derecede depolanan hasat edilmiş beyinler kullanılarak elde edildi. Ağırlık verileri ile birlikte farklı beyin bölgeleri, saldırgan TSSB'nin sosyal stres modeline maruz kalan çalışma kapsamında toplanmıştır. RNA konsantrasyonları ve spektrofotometrik okumalar burada gösterilmiştir.
Bu protokolü izlerken, beyni buzlu çelik bir blok üzerinde tutarak ve dokuyu periyodik olarak buzlu salin ile doldurarak dokuların her zaman soğutulmasını sağlayın. Dokular toplandıktan ve hemen dondurulduktan sonra, daha sonra transkriptomik, metabolomik ve proteomik gibi tahliller için kullanılabilirler.
