Cvetanovic laboratuvarındaki Austin Ferro ve Juao-Guilherme Rosa'ya, diseksiyonların giderilmesinde ve RNA ekstraksiyonu ve RTqPCR'de yardımları için minnettarız. Bu araştırma M. Cvetanovic, R01 NS197387 tarafından finanse edilir; HHS | Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH).

1. Kurulum
<ol><li>Kafa kesme makası, künt forseps, diseksiyon makası, vasküler makas, mikrospatula, sagittal fare beyin matrisi, jilet, 200 μL pipet ucu, cam petri kabı, cam kaydırak ve buz kovası dahil olmak üzere gerekli ekipmanları toplayın. Tüm ekipmanları emici bir ped üzerine yer edin.</li>
	<li>Petri kabı, cam tabak ve beyin matrisini buza yerleştirin.</li>
	<li>Dik bir açıda jilet kullanarak, bir 200 μL pipet ucunun ucundan yaklaşık 5 mm kesin. Bu, ucun ucundaki açıklığın boyutunu yaklaşık 1 mm genişliğinde yapar. Bu DCN'i delmek için yeterli olmalı. Ancak bu, diseksiyona bağlı olarak gerektiği gibi de ayarlanabilir. Kolay değiştirme ve ayarlama için birçok ipucunu hazırlayın.</li>
	<li>Etiket 1.5 mL mikrofuge tüpleri hayvan tanımlama ve serebellar bölge (hayvan başına dört tüp).</li>
	<li>Ekstraksiyondan sonra dokuyu flaş dondurmak için cryosafe kabını sıvı nitrojenle doldurun.</li>
</ol>2. Beyin çıkarma ve diseksiyon
Tüm deneyler Minnesota Üniversitesi Hayvan Bakım Komitelerinin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi.
<ol><li>%5 CO2 pozlaması kullanarak fareyi ötenazi edin. Solunum durduktan sonra servikal çıkık gerçekleştirin. Kafa kesme makası ile farenin kafasını koparın ve karkası uygun kapta atın.</li>
	<li>Burundan başlayıp geriye doğru devam eden başın medial sagittal çizgisi boyunca jiletle bir kesi yapın. Orta çizginin her iki tarafına ayrılarak cildi ayırın. Her iki taraftaki kası kesmek için jilet kullanın, kulak kanallarını kesin.</li>
	<li>Kesme makası kullanarak, beyin sapının beyincikle buluştuğu yere kadar herhangi bir omurilik bölgesini kırpın, beyinciğin zarar görmemesine dikkat edin.</li>
	<li>Damar makası bıçaklarından birini beyin sapı ve omur sütunu arasındaki boşluğa yerleştirin ve kulak kanalına doğru kesin, kemiği temiz bir şekilde kesmek için makası kaldırın, ancak dokudaki hasarı sınırlayın.</li>
	<li>Kafatasının kenarı boyunca koku ampullerine doğru kesmeye devam edin, beyin dokusundaki hasarı sınırlamak için keserken kaldırmaya devam edin.</li>
	<li>Künt tokaları kullanarak, kafatasının arkasını yavaşça soyun ve beynin ve beyincik bölgesini ortaya çıkarın.</li>
	<li>Kafatasının kenarındaki künt künt zımsaları kullanarak kafatasının geri kalanını beynin üzerinden soyun. Bu adım kafatası kapağının çoğunu çıkarmalı ve beyni ortaya çıkarmalıdır.</li>
	<li>Kafatasının geri kalanını damar makası ve künt tokalarla kırparak kafatasının çoğunu beynin tepesinden temizleyin.</li>
	<li>Mikrospatula kullanarak, beyni hafifçe kaldırın ve kalan kafatasından koku ampullerini çıkarmak ve optik sistem liflerini kesmek için altına kepçe ve yukarı kaydırın. Beyin bu noktada kolayca serbest gelmelidir.</li>
	<li>Beyni buz üzerinde oturan petri kabına yerleştirin ve kalan kafatasını veya diğer kalıntıları çıkarın.</li>
	<li>Mikrospatulayı kullanarak, beyni dorsal tarafı yukarı olacak şekilde beyin matrisine hafifçe yerleştirin. Matriste seviye ayarlı olduğundan emin olmak için zaman ayırın, özellikle orta çizgi matriste merkezi düşer. Bu matris yetişkin fare beyin dokusu için tasarlanmıştır, genç veya hastalıklı hayvanlardan gelen doku matriste daha düşük dayanabilir, ancak numuneler arasında tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek hala mümkün olmalıdır.</li>
	<li>Yaylı orta çizgi boyunca bir jilet yerleştirin, bıçağın matrisin altına kadar itmesini sağlamak (Şekil 1B).</li>
	<li>İlk bıçağın yanına 1 mm daha jilet yerleştirin (Şekil 1B). Birbirinden 1 mm uzakta iki bıçak daha yerleştirin. Sonuç, beynin bir tarafına yerleştirilmiş üç bıçak olmalıdır, hepsi birbirinden 1 mm uzakta. Aynısını diğer tarafa da yap. Toplamda, 7 bıçak 1mm aralıklarla yerleştirilecektir (Şekil 1C).</li>
	<li>Dikkatlice, jiletlerin ön ve arka uçlarını alın ve matristen yukarı kaldırın. Jiletlerin dışındaki doku atılabilir.</li>
	<li>Yavaşça, doku bölümlerine zarar vermemeye dikkat derek bir seferde bir jilet ayırın.</li>
	<li>Doku bölümünü jiletten dikkatlice kaydırın ve mikrospatula ile cam kaydırağa kaydırın. Toplamda altı sagittal beyin bölümü olacaktır (Şekil 1D).</li>
	<li>En yanal 4 bölüm DCN görünür olacaktır (Mor kutu, Şekil 1D). DCN'yi izole etmek için, kesilmiş 200 μL pipet ucunu DCN üzerinde dik olarak tutun ve dcn'yi çevre dokudan tamamen kesmek için her yöne sallanarak dokudan sıkıca aşağı itin. DCN'yi temiz bir şekilde çıkarmak için doğrudan yukarı kaldırın ve ucundaki dokunun varlığını görsel olarak onaylayın.</li>
	<li>Bir parmağınızı ucun üstüne yerleştirin ve aşağı itin, bu da dokunun şişkinlik yapmasına neden oldu. Ucu doğru etiketlenmiş mikroyakıt tüpüne yerleştirin ve doku delme tüpünün altına yerleştirildiğından emin olun. Kalan üç bölüm için 2.17'yi tekrarlayın ve DCN zımbalarını aynı tüpe yerleştirin. Flaş dondurmak için tüpü sıvı nitrojene yerleştirin. Şekil 1E'deher bir zımbanın boyutunun gösterimi.</li>
	<li>DCN çıkarılan bölümler serebellar yarımküre olarak nitelendirilir. Beyin dokusunun geri kalanını bu bölümlerdeki beyinciklerin etrafına itin. Künt tokalar kullanın ve bu yarımküre serebellar korteks bölümlerini hafifçe alın ve ilgili mikrofuge tüpüne yerleştirin. Flaş dondurun.</li>
	<li>Son iki vermal bölüm için (açık mavi kutu, Şekil1D),sadece beyincik bırakarak çevreleyen beyin dokusunu uzaklaştırın. Jilet kullanarak, ön lobülleri arka lobüllerden ayıran bir kesim yapın. Kesim lobule 6 oluşumundan hemen sonra olmalı ve lobule 10(Şekil 1F)içermemelidir.</li>
	<li>Künt forseps kullanarak, ön serebellar korteks bölümlerini ve posterior serebellar korteks bölümlerini dikkatlice ilgili mikrofuge tüplerine yerleştirin ve tüpleri 5 dakika boyunca sıvı nitrojende bırakarak flaş dondurun. Buradan RNA ekstraksiyonuna ilerleyin veya tüpleri -80 °C'de saklayabilir.</li>
</ol>3. RNA ekstraksiyonu 
NOT: Bu protokol, TRIzol20ile RNA Ekstraksiyonu için Soğuk Bahar Limanı Protokolü'nden değiştirilmiştir. TRIzol biyolojik malzemeyi çözünür ve RNA çıkarılmasını mümkün hale getirir.
<ol><li>Dokunun çok hızlı çözülmesini önlemek için mikrobuj tüplerini buza yerleştirin, mikroyapı tüpüne 150 μL soğuk TRIzol uygulayın. Sterilize edilmiş bir pestle ile homojenize edin. Doku homojenize olduktan sonra, kalan dokunun bozulmadığından emin olmak için çözeltiyi yukarı ve aşağı borulayın. Ayrıca küçük doku parçalarını birkaç kez insülin şırındına çekerek parçalayın.</li>
	<li>350 μL daha TRIzol ekleyin ve iyice karıştırmak için yukarı ve aşağı borulayın. Oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.</li>
	<li>Tüpe 150 μL kloroform ekleyin ve kuvvetlice çalkalayın ve ardından 2-3 dakika dinlendirin. Kloroform homojenize doku çözeltisini fazlara (RNA, DNA ve protein) ayırır.</li>
	<li>12.000 x g'da, 15°C'de 10 dakika santrifüj. Tüm tüplerin aynı yönde olduğundan emin olun.</li>
	<li>Tüpleri dikkatlice çıkarın ve santrifüjün sıcaklığını 4 °C'ye ayarlayın. Sadece berrak sulu fazı yeni bir tüpe çıkarın (bu RNA'dır), opak ara fazı (DNA) bozmamaya dikkat edin.  En düşük faz kırmızı olacaktır ve protein içerir. Tüplerde kalan çözelti kaydedilebilir veya atılabilir.</li>
	<li>1:2 oranında% 100 izopropil alkol ekleyin (200 ul sulu faz çıkarılırsa, 100 μL izopropil alkol ekleyin). Yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika dinlendirin. İzopropil alkol RNA'yı çözeltiden çıkarır.</li>
	<li>12.000 x g'da, 4°C'de 10 dakika santrifüj. Peletin görselleştirilmesini kolaylaştırmak için tüm tüpleri aynı yönde yerleştirebildiğinden emin olun. Elde edilen pelet çıkarılan RNA olacaktır.</li>
	<li>Tüpleri dikkatlice çıkarın, peletin bozulmamasına dikkat eden bir pipet ile üsttantı çıkarın. Pelet biraz jel benzeridir ve görülmesi zor olacaktır, ancak santrifüjdeki tüplerin yönüne göre nerede olduğunu tahmin edebilmelidir.</li>
	<li>Tüm süpernatantı çıkardıktan sonra, 5 dakika boyunca 5 dakika boyunca 7500 x g'da 500 μL% 75 etanol, girdap ve santrifüj ekleyin. Etanol peletin daha da yıkanır.</li>
	<li>Peletin bozulmasına neden olmadan süpernatantı dikkatlice çıkarın. Numuneyi kurutmak için kapakları açık bırakın. Bu genellikle 5-10 dakika sürer, ancak pelet üzerinde ne kadar etanol kaldığına bağlı olarak değişebilir. Fazla kurutma.</li>
	<li>Kurutuktan sonra peletin DNase serbest suyuna yeniden koyun. DCN için örneklere 20 μL ve diğerleri için 30 μL ekleyin.</li>
	<li>Yeniden depolandıktan sonra, numuneler -80 °C'de saklanabilir veya daha fazla teste devam edebilir.</li>
</ol>4. Gerçek Zamanlı Nicel Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RTqPCR)
<ol><li>Bu adımdan önce, herhangi bir genomik DNA'yı çıkarmak için RNA'yı tedavi etmek ve BioRad'dan iScript kullanarak cDNA oluşturmak gerekecektir. CDNA yapmadan önce RNA konsantrasyonunun normale döndürdürülmesini unutmayın. Ek olarak, qPCR için astarları optimize etmek önemlidir. Bu adım21'itamamlamak için burada açıklanan yöntemleri izleyin. Aşağıdaki qPCR'nin kısa açıklaması.</li>
	<li>Primer'ların tümü IDT'den satın alınmaktadır. İleri ve ters diziler aynı numune tüpündedir ve 20x konsantrasyonda depolanır. Rps18 (kontrol geni): İleri – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3' Ters – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3' Parvalbumin (Kalsiyum bağlayıcı protein, inhibitör hücreler): İleri – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3' Ters – '5-AGCGTCTTTGTTTCTTTAGCAG-3' Kcng4 (Potasyum kanalı alt birliği): İleri – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3' Ters – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3' Aldolaz C (Zebrin II, serebellar korteks boyunca farklı olarak ifade edilir): İleri – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3' Ters – 5'-TCAGTAGGCATGGGGGGC-3'</li>
	<li>qPCR koşulları aşağıdaki gibidir. Ön kuluçka süresi, 5 dakika, 95°C'de. Amplifikasyon süresi, 50 döngü: 95°C'de 10 dakika, 62°C'de 10 dakika ve 72°C'de 10 dakika. Erime eğrisi süresi, 95°C'de 5 saniye, 65°C'de bir dakika ve rampa hızını 97°C hedef sıcaklığına kadar .07°C/saniye olarak ayarlayın. Daha sonra 10 dakika ila 40 °C arasında soğutma süresi.  Tüm qPCR reaksiyonları üç taraflı olarak gerçekleştirildi ve gen ekspresyonunun normalleştirilmesi için yükleme kontrolü olarak Rps18 ile 2- ΔΔCt kullanılarak gen ekspresyörü analiz edildi. Referans olarak dökme serebellar ekstre kullanılmıştır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glia/neuron+ratio:+How+it+varies+uniformly+across+brain+structures+and+species+and+what+that+means+for+brain+physiology+and+evolution.">The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution.</a> Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).</li><li>Schmahmann, J. D., Caplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognition,+enotion,+and+the+cerebellum.">Cognition, enotion, and the cerebellum.</a> Brain. 129 (2), 290-292 (2006).</li><li>Badura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+cognitive+and+social+development+require+posterior+cerebellar+activity.">Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity.</a> eLife. 7, 36401 (2018).</li><li>Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+Transform+or+Multiple+Functionality?+Understanding+the+Contribution+of+the+Human+Cerebellum+across+Task+Domains.">Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains.</a> Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).</li><li>Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum+and+Nonmotor+Function.">Cerebellum and Nonmotor Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).</li><li>King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+boundaries+in+the+human+cerebellum+revealed+by+a+multi-domain+task+battery.">Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery.</a> Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).</li><li>Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+the+human+cerebellum+estimated+by+intrinsic+functional+connectivity.">The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity.</a> Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).</li><li>Schmahmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+movement+to+thought:+Anatomic+substrates+of+the+cerebellar+contribution+to+cognitive+processing.">From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing.</a> Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).</li><li>Kelly, R. M., Strick, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Loops+with+Motor+Cortex+and+Prefrontal+Cortex+of+a+Nonhuman+Primate.">Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).</li><li>Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Location+of+lesion+determines+motor+vs.+cognitive+consequences+in+patients+with+cerebellar+stroke.">Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke.</a> NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).</li><li>Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network-selective+vulnerability+of+the+human+cerebellum+to+Alzheimer's+disease+and+frontotemporal+dementia.">Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer's disease and frontotemporal dementia.</a> Brain. 139 (5), (2016).</li><li>Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+regional+cerebellar+atrophy+in+genetic+frontotemporal+dementia.">Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia.</a> NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).</li><li>Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum.">Cerebellum.</a> The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).</li><li>Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Excitability+and+Parallel+Fiber+Synaptic+Properties+of+Zebrin-Positive+and+-Negative+Purkinje+Cells+in+Lobule+VIII+of+the+Mouse+Cerebellar+Slice.">Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).</li><li>Manto, M., Oulad Ben Taib, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+nuclei:+Key+Roles+for+Strategically+Located+Structures.">Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures.</a> The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).</li><li>Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathway+analysis+towards+understanding+tissue+vulnerability+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1.</a> eLife. , (2018).</li><li>Grabert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+brain+region+-+dependent+diversity+and+selective+regional+sensitivities+to+aging.">Microglial brain region - dependent diversity and selective regional sensitivities to aging.</a> Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).</li><li>Ingram, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Transcriptome+Profiles+of+ATXN1+Transgenic+Mice+Reveal+SCA1+Disease+Progression+and+Protection+Pathways.">Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways.</a> Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).</li><li>Cendelin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+Using+TRIzol+(TRI+Reagent).">Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).</li><li>Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglia+contribute+to+the+pathogenesis+of+spinocerebellar+ataxia+Type+1+(SCA1)+in+a+biphasic,+stage-of-disease+specific+manner.">Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner.</a> Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).</li><li>Chopra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Capicua+expression+drives+regional+Purkinje+neuron+vulnerability+through+ion+channel+gene+dysregulation+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1.</a> Human Molecular Genetics. , (2020).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada açıklanan yöntem, dört ayrı serebellar bölgede altta kalan gen ekspresyonunu ve moleküler mekanizmaların değerlendirilmesini mümkün kılar - derin serebellar çekirdek (DCN), vermisin ön serebellar korteksi (CCaV), vermisin arka serebellar korteksi (CCpV) ve yarımkürelerin serebellar korteksi (CCH). Bu bölgeleri ayrı ayrı değerlendirme yeteneği, belirli serebellar bölgelerin heterojenliği hakkındaki bilgimizi genişletecek ve muhtemelen çeşitli davranışlara katkılarına ışık tutacakt?...

Beyincik beyindeki nöronların yarısından fazlasını içerir ve tarihsel olarak beyinde motor kontrol ve denge merkezi olarak adlandırılır1. Daha yakın zamanlarda, çalışmalar serebellumun biliş, ödül işleme dahil olmak üzere diğer çeşitli işlevlerde kilit bir rol oynadığını ve 2 , 3,4,5'i etkilediğinigöstermiştir.
Beyincik iyi tanımlanmış anatomiye sahiptir: korteks bölgesi granül, Purkinje ve moleküler katmanlardan oluşur. Granül hücreler granül hücre tabakasını oluşturur ve paralel lifler aracılığıyla moleküler tabakanın Purkinje hücre dendritlerine giriş gönderir ve bu da alt zeytinden kaynaklanan tırmanma liflerinden giriş alır. Purkinje hücreleri, beyincikten ana çıktı görevi gören derin serebellar çekirdekteki (DCN) hücrelere inhibitör projeksiyonlar gönderir. Bu serebellar devrenin çıkışı, Golgi, stellat ve sepet hücreleri de dahil olmak üzere serebellar korteksteki inhibitör internöronların aktivitesi ile daha da modüle edilir4. Bu serebellar fonksiyonel ünite serebellar korteksin tüm lobüllerine dağılmıştır. Beyincik boyunca bu nispeten düzgün devreye rağmen, insan nörogörüntüleme literatüründen ve hasta çalışmalarından elde edilen kanıtlar beyincik6,7'ninfonksiyonel heterojenliğini göstermektedir.
Serebellar korteks iki ana bölgeye ayrılabilir: orta çizgi tanımlı vermis ve lateral yarımküreler. Vermis daha da ön ve arka lobüllere ayrılabilir. Beyinciklerin bu farklı bölgeleri farklı davranışlara katkıda bulunmakla suçlanmıştır. Görev çağrışan veya görevsiz aktivite kalıpları, vermis'in ön bölgelerinin motor fonksiyona daha fazla katkıda bulunduğunu, posterior vermis'in ise biliş6,7'yedaha fazla katkıda bulunduğunu ortaya çıkardı. Vermis ayrıca etki ve duygularla bağlantılıdır, serebellar yarımküreler yürütme, görsel-mekansal, dil ve diğer anımsatıcı işlevlere katkıda bulunur8. Ek olarak, anatomik çalışmalar fonksiyonel olarak farklı serebellar bölgelerin farklı kortikal bölgelerle bağlantılı olduğuna dair kanıtlar sağlamıştır9. Lezyon semptom haritalaması, ön lobları etkileyen inmeleri olan hastaların (lob VI'ya kadar uzanan) ince motor görevlerde daha düşük performansa sahip olduğunu, arka lob bölgelerinde ve yarımkürelerde hasarı olan hastaların serebellar motor sendromunun yokluğunda bilişsel eksiklikler sergilediğini ortaya koydu10. Son olarak, hastalıkta bölgesel serebellar patoloji, fonksiyonel olarak farklı serebellar bölgelerin de hastalığa farklı şekilde duyarlı olduğunu gösterir11,12.
Çok daha az araştırılsa da, ön kanıtlar serebellar kortikal bölgelerde belirgin gen ekspresyon imzaları göstermektedir. Zebrin II'nin Purkinje hücre ifadesi, vermiste bölgeye özgü desenleme gösterir, böylece arka lobüllerde daha fazla Zebrin II pozitif hücre ve ön lobüllerde dahaazdır 13. Bu aynı zamanda Zebrin II negatif Purkinje hücreleri Zebrin II pozitif14olan Purkinje hücrelerinden daha yüksek tonik ateşleme sıklığı gösterdiğinden bölgesel olarak farklı fizyolojik işlevle de ilişkilidir.
Serebellar kortekse ek olarak, serebellum, beyincik için birincil çıktı görevi gören derin serebellar çekirdeği (DCN) içerir. Çekirdekler medial (MN), interposed (IN) ve lateral çekirdeklerden (LN) oluşur. Fonksiyonel görüntüleme ve hasta çalışmaları, DCN'nin çeşitli davranışlara da katıldığını göstermiştir15, ancak çok az çalışma DCN'deki gen ekspresyon değişimini inceler.
Moleküler tekniklerdeki gelişmeler beyindeki bölgesel gen ekspresyonun değerlendirilmesini mümkün kıldı ve hem fizyolojik hem de hastalık durumlarında farklı beyin bölgelerinde ve içinde heterojenliği ortaya çıkardı16. Bu tür çalışmalar, beyinciğerinin diğer beyin bölgelerinden farklı olduğunu ima eder. Örneğin, nöronların glial hücrelere oranı beyincikte diğer beyin bölgelerine göre ters çevrilmiş1. Normal fizyolojik koşullarda bile, proinflamatuar genlerin ekspresyonu beyincikte diğer beyin bölgelerine göre artmaktadır17. Moleküler teknikler, serebellar hastalıkların patogenezine katkıda bulunan yolların tanımlanmasında da çok yararlı olmuştur. Örneğin, tüm serebellar özlerin RNA dizilimi, vahşi tip kontrollerine kıyasla spinocerebellar ataksi tip 1'in (SCA1) Purkinje hücresine özgü transgenik fare modelinde değiştirilen genleri tanımladı. Bu tür kanıtlar, serebellar Purkinje hücrelerinde patogenezin altında kalan temel moleküler yolları ortaya çıkarmıştır ve potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesine yardımcı olmuştur18. Bununla birlikte, son çalışmalar serebellar bölgelerde hastalıklara karşı savunmasızlıkta farklılıklar olduğunu göstermektedir11,12,19. Bu, tüm serebellar özlerle maskelenmiş veya tespit edilmemiş olabilecek farklı serebellar bölgelerde meydana gelen önemli değişiklikler olduğunu gösterebilir. Bu nedenle, araştırmacıların farklı serebellar bölgelerdeki moleküler profilleri incelemelerini sağlayan teknikler geliştirmeye ihtiyaç vardır.
Burada önerilen teknik, RNA'yı bu bölgelerden izole etmek ve gen ifadesindeki bölgesel farklılıkları araştırmak için fare beyinciğinin dört farklı bölgesini parçalamak için tekrarlanabilir bir yöntemi açıklar. Şekil 1A'daki fare beyinciliğinin şeması, vermis'i mavi ve yarımküreleri sarı renkle vurgular. Özellikle, Bu teknik dört bölgenin izole olmasını mümkün kılar: derin serebellar çekirdek (DCN) (Şekil 1A'dakikırmızı noktalı kutular), ön vermis (CCaV) serebellar korteksi (koyu mavi inç) Şekil 1A), arka vermis (CCpV) serebellar korteksi (Şekil 1A'daaçık mavi) ve yarımkürelerin serebeller korteksi (CCH) (Şekil 1A'dasarı). Bu bölgelerin gen ekspresyonunun ayrı ayrı değerlendirilmesi ile bu farklı bölgelerin ayrık fonksiyonlarının altında kalan moleküler mekanizmaların yanı sıra hastalıktaki kırılganlıklarındaki potansiyel farklılıkların araştırılması mümkün olacaktır.

<table><tbody><tr><td>1.5 Microcentrifuge tubes</td><td>ThermoScietific</td><td>3456</td><td></td></tr><tr><td>100% Isopropyl Alcohol</td><td>VWR Life sciences</td><td>1106C361</td><td></td></tr><tr><td>200 ul Pipet tips</td><td>GeneMate</td><td>P-1237-200</td><td></td></tr><tr><td>Adult Mouse Brain Matrix Sagittal</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>RBMA-200S</td><td></td></tr><tr><td>Blunt forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Macron</td><td>220905</td><td></td></tr><tr><td>Decapitation Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol</td><td>Pharmco</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Glass Slide (for electrophoresis)</td><td>BIORAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogenizer</td><td>Kimble</td><td>6HAZ6</td><td></td></tr><tr><td>Ice Bucket</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin Syringe (.5ml)</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR</td><td>BIORAD</td><td>1725037</td><td></td></tr><tr><td>Micro Spatula</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Needle Nose forceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri Dish</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primetime Primer for Aldolase C</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.58&gt;43415246</td><td></td></tr><tr><td>Primetime Primer for Kcng4</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.56a.9448518</td><td></td></tr><tr><td>Primetime Primer for Parvalbumin</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.58.7596729</td><td></td></tr><tr><td>Primetime Primer Rps18&amp;nbsp;</td><td>IDT</td><td>Mm.PT.58.12109666</td><td></td></tr><tr><td>Single Edge Rzor Blades</td><td>Personna GEM</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile, sigle-use pestles</td><td>FisherScientific</td><td>12141364</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Ambion by Life technologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Vascular Scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cerebellar regional dissection for molecular analysis

Serebellum, hareket kontrolü, denge, biliş, ödül ve etki dahil olmak üzere çeşitli temel işlevlerde önemli bir rol oynar. Görüntüleme çalışmaları farklı serebellar bölgelerin bu farklı fonksiyonlara katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bölgesel serebellar farklılıkları inceleyen moleküler çalışmalar, çoğunlukla serebellar özlerin tamamında yapıldığı için geride kalmaktadır ve böylece belirli serebellar bölgelerdeki ayrımları maskelemektedir. Burada dört farklı serebellar bölgeyi tekrar ve hızlı bir şekilde parçalama tekniğini açıklıyoruz: derin serebellar çekirdek (DCN), ön ve arka vermal serebellar korteks ve yarımkürelerin serebellar korteksi. Bu farklı bölgelerin diseksiyonunun, denge, hareket, etki ve bilişe benzersiz katkılarının altında yatan moleküler mekanizmaların araştırılmasına izin verir. Bu teknik, çeşitli fare hastalığı modellerinde bu belirli bölgelerin patolojik duyarlılığındaki farklılıkları araştırmak için de kullanılabilir.

Bu deneyler için dört on bir haftalık dişi vahşi tip C57/Black6 fare kullanıldı. Bir fare, 'dökme beyincik' olarak adlandırılan ve kesilen bölgelerdeki RNA seviyelerinin tam bir diseksiyonla karşılaştırılmasına izin verilen tam bir serebellar diseksiyon yapmak için kullanıldı. Diğer üç fare, bu protokolde açıklanan serebellar diseksiyonu yapmak için kullanılmıştır. Üç fare kullanmak, RNA seviyelerinde tespit edilen eğilimlerin fareler arasında tekrarlanab...

Watch this Scientific Journal Video about Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis at JoVE.com

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Farklı serebellar bölgelerin farklı davranışsal çıktılarda rol oynadığı belirtilmiştir, ancak alttaki moleküler mekanizmalar bilinmemektedir. Bu çalışma, RNA'yı izole ederek ve gen ifadesindeki farklılıkları test ederek moleküler farklılıkları araştırmak için yarımkürelerin serebellar korteksini, vermisin ön ve arka bölgelerini ve derin serebellar çekirdekleri tekrar ve hızlı bir şekilde parçalama yöntemini açıklar.

Moleküler Analiz için Serebellar Bölgesel Diseksiyon

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

cerebellar-regional-dissection-for-molecular-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.9K Görüntüleme.  University of Minnesota. Farklı serebellar bölgelerin farklı davranışsal çıktılarda rol oynadığı belirtilmiştir, ancak alttaki moleküler mekanizmalar bilinmemektedir. Bu çalışma, RNA'yı izole ederek ve gen ifadesindeki farklılıkları test ederek moleküler farklılıkları araştırmak için yarımkürelerin serebellar korteksini, vermisin ön ve arka bölgelerini ve derin serebellar çekirdekleri tekrar ve hızlı bir şekilde parçalama yöntemini açıklar.

Video: Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Wholemount Immunohistochemistry for Revealing Complex Brain Topography

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its relatively uniform cytoarchitecture is a complex array of parasagittal domains of gene and protein expression. The molecular compartmentalization of the cerebellum is mirrored by the anatomical and functional organization of afferent fibers. To fully appreciate the complexity of cerebellar organization we previously refined a wholemount staining approach for high throughput analysis of patterning defects in the mouse cerebellum. This protocol describes in detail the reagents, tools, and practical steps that are useful to successfully reveal protein expression patterns in the adult mouse cerebellum by using wholemount immunostaining. The steps highlighted here demonstrate the utility of this method using the expression of zebrinII/aldolaseC as an example of how the fine topography of the brain can be revealed in its native three-dimensional conformation. Also described are adaptations to the protocol that allow for the visualization of protein expression in afferent projections and large cerebella for comparative studies of molecular topography. To illustrate these applications, data from afferent staining of the rat cerebellum are included.

Neural circuits are topographically organized into functional compartments with specific molecular profiles. Here, we provide the practical and technical steps for revealing global brain topography using a versatile wholemount immunohistochemical staining approach. We demonstrate the utility of the method using the well-understood cytoarchitecture and circuitry of cerebellum.

Revealing Kompleksi Beyin Topografya Wholemount İmmünohistokimya

The repeated and well-understood cellular architecture of the cerebellum make it an ideal model system for exploring brain topography. Underlying its ...

Nörobilim

Isolation of Distinct Cell Populations from the Developing Cerebellum by Microdissection

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. This method was first utilized in the study of Nestin-expressing progenitors (NEPs), a newly identified population of cells in the cerebellar external germinal layer (EGL). Using microdissection in combination with fluorescent-activated cell sorting (FACS), a pure population of NEPs was collected separately from conventional granule neuron precursors in the EGL and from other contaminating Nestin-expressing cells in the cerebellum. Without microdissection, functional analyses of NEPs would not have been possible with the current methods available, such as Percoll gradient centrifugation and laser capture microdissection. This technique can also be applied for use with various tissues that contain either recognizable regions or fluorescently-labeled cells. Most importantly, a major advantage of this microdissection technique is that isolated cells are living and can be cultured for further experimentation, which is currently not possible with other described methods.

Nestin-expressing&#160;progenitors are a newly identified population of neuronal progenitors in the developing cerebellum. Using the microdissection technique presented here in combination with fluorescent-activated cell sorting, this cell population can be purified with no contamination from other cerebellar regions and can be cultured for further studies.

Mikrodisseksiyon tarafından Gelişmekte Serebellumunda farklı olarak hücre popülasyonlarının İzolasyonu

Microdissection is a novel technique that can isolate specific regions of a tissue and eliminate contamination from cellular sources in adjacent areas. ...

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of intellectual disability and account for 20-40% of drug-resistant epilepsy in childhood. High-resolution brain imaging has facilitated in vivo identification of a large group of MCD phenotypes. Despite the advances in brain imaging, genomic analysis and generation of animal models, a straightforward workflow to systematically prioritize candidate genes and to test functional effects of putative mutations is missing. To overcome this problem, an experimental strategy enabling the identification of novel causative genes for MCD was developed and validated. This strategy is based on identifying candidate genomic regions or genes via array-CGH or whole-exome sequencing and characterizing the effects of their inactivation or of overexpression of specific mutations in developing rodent brains via in utero electroporation. This approach led to the identification of the C6orf70 gene, encoding for a putative vesicular protein, to the pathogenesis of periventricular nodular heterotopia, a MCD caused by defective neuronal migration.

A Novel Strategy Combining Array-CGH, Whole-exome Sequencing and In Utero Electroporation in Rodents to Identify Causative Genes for Brain Malformations

Periventricular nodular heterotopia (PNH) is the most common form of malformation of cortical development (MCD) in adulthood but its genetic basis remains unknown in most sporadic cases. We have recently developed a strategy to identify novel candidate genes for MCDs and to directly confirm their causative role in vivo.

Dizi-CGH, Bütün exome sıralama ve rahim içinde elektroporasyon Rodents beyin malformasyonlar için sorumlu genlerin tanımlamak için birleştirerek yeni bir strateji

Birth defects that involve the cerebral cortex &#8212; also known as malformations of cortical development (MCD) &#8212; are important causes of ...

Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex (mPFC) or nucleus accumbens. The challenge in this work is to dissect the correct area while preserving the microenvironment to be examined. In this paper, we describe a simple, low-cost method using resources readily available in most labs. This method preserves nucleic acid and proteins by keeping the tissue frozen throughout the process. Brains are cut into 0.5&#8211;1.0 mm sections using a brain matrix and arranged on a frozen glass plate. Landmarks within each section are compared to a reference, such as the Allen Mouse Brain Atlas, and regions are dissected using a cold scalpel or biopsy punch. Tissue is then stored at -80 &#176;C until use. Through this process rat and mouse mPFC, nucleus accumbens, dorsal and ventral hippocampus and other regions have been successfully analyzed using qRT-PCR and Western assays. This method is limited to brain regions that can be identified by clear landmarks.

This procedure describes the collection of discrete frozen brain regions to obtain high-quality protein and RNA using inexpensive and commonly available tools.

Downstream Analizleri için Dondurulmuş Kemirgen Beyin Bölgeleri Koleksiyonu

As our understanding of neurobiology has progressed, molecular analyses are often performed on small brain areas such as the medial prefrontal cortex ...

Ex Vivo Myelination and Remyelination in Cerebellar Slice Cultures as a Quantitative Model for Developmental and Disease-Relevant Manipulations

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in vitro, although scalable,&#160;does not recapitulate axonal myelination. OPC-neuron cocultures and OPC-fiber cultures allow for the examination of in vitro myelination, but they lack additional cell types that are present in vivo, such as astrocytes and microglia. In vivo&#160;mouse models, however, are less amenable to chemical, environmental, and genetic manipulation and are much more labor intensive. Here, we describe&#160;an&#160;ex vivo mouse cerebellar slice culture (CSC) quantitative system that is useful for: 1) studying developmental myelination, 2) modeling demyelination and remyelination, and 3) conducting translational research. Sagittal sections of the cerebellum and hindbrain are isolated from postnatal day (P) 0&#8211;2 mice, after which they myelinate&#160;ex vivo&#160;for 12 days. During this period, slices can be manipulated in various ways, including the addition of compounds to test for an effect on developmental myelination. In addition, tissue can be fixed for electron microscopy to assess myelin ultrastructure and compaction. To model disease, CSC can be subjected to acute hypoxia to induce hypomyelination. Demyelination in these explants can also be induced by lysolecithin, which allows for the identification of factors that promote remyelination. Aside from chemical and environmental modifications, CSC can be isolated from transgenic mice and are responsive to genetic manipulation induced with Ad-Cre adenoviruses and tamoxifen. Thus, cerebellar slice cultures are a fast, reproducible, and quantifiable model for recapitulating myelination.

Presented is a protocol for an ex vivo quantitative model of demyelination and remyelination using mouse cerebellar slice cultures. This method closely recapitulates an in vivo model with its full complement of CNS cell types in intact tissue, while maintaining the chemical, genetic, and environmental amenability of an in vitro system.

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in ...

Microdissection of Mouse Brain into Functionally and Anatomically Different Regions

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain consists of an outer covering of grey matter over the hemispheres known as the cerebral cortex. Underneath this layer reside many other specialized structures that are essential for multiple phenomenon important for existence. Acquiring samples of specific gross brain regions requires quick and precise dissection steps.&#160;It is understood that at the microscopic level, many sub-regions exist and likely cross the arbitrary regional boundaries that we impose for the purpose of this dissection.
Mouse models are routinely used to study human brain functions and diseases. Changes in gene expression patterns may be confined to specific brain areas targeting a particular phenotype depending on the diseased state. Thus, it is of great importance to study regulation of transcription with respect to its well-defined structural organization. A complete understanding of the brain requires studying distinct brain regions, defining connections, and identifying key differences in the activities of each of these brain regions. A more comprehensive understanding of each of these distinct regions may pave the way for new and improved treatments in the field of neuroscience. Herein, we discuss a step-by-step methodology for dissecting the mouse brain into sixteen distinct regions. In this procedure, we have focused on male mouse C57Bl/6J (6-8 week old) brain removal and dissection into multiple regions using neuroanatomical landmarks to identify and sample discrete functionally-relevant and behaviorally-relevant&#160;brain regions. This work will help lay a strong foundation in the field of neuroscience, leading to more focused approaches in the deeper understanding of brain function.

We present a hands-on, step-by-step, rapid protocol for mouse brain removal and dissection of discrete regions from fresh brain tissue. Obtaining brain regions for molecular analysis has become routine in many neuroscience labs. These brain regions are immediately frozen to obtain high quality transcriptomic data for system level analysis.

Fare Beyninin İşlevsel ve Anatomik Olarak Farklı Bölgelere Mikrodiseksiyonu

The brain is the command center for the mammalian nervous system and an organ with enormous structural complexity. Protected within the skull, the brain ...

Cryo-section Dissection of the Adult Subependymal Zone for Accurate and Deep Quantitative Proteome Analysis

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone (SEZ) is a thin and distinct region exposed to the ventricles and cerebrospinal fluid. The isolation of this niche allows the analysis of a neurogenic stem cell microenvironment. However, extraction of small tissues for proteome analysis&#160;is challenging, especially for the maintenance of considerable measurement depth and the achievement of reliable robustness. A new method termed cryo-section-dissection (CSD), combining high precision with minimal tissue perturbation, was developed to address these challenges. The method is compatible with state-of-the-art mass spectrometry (MS) methods that allow the detection of low-abundant niche regulators. This study compared the CSD and its proteome data to the method and data obtained by laser-capture-microdissection (LCM) and a standard wholemount dissection. The CSD method resulted in twice the quantification depth in less than half the preparation time compared to the LCM and simultaneously clearly outperformed the dissection precision of the wholemount dissection. Hence, CSD is a superior method for collecting the SEZ for proteome analysis.

Cryo-section-dissection allows fresh, frozen preparation of the largest neurogenic niche in the murine brain for deep quantitative proteome analysis. The method is precise, efficient, and causes minimal tissue perturbation. Therefore, it is ideally suited for studying the molecular microenvironment of this niche, as well as other organs, regions, and species.

Doğru ve Derin Nicel Proteom Analizi için Yetişkin Subependymal Bölgesinin Kriyo-kesit Diseksiyonu

The subependymal neurogenic niche consists of a paraventricular ribbon of the lateral ventricular wall of the lateral ventricle. The subependymal zone ...

A Standardized Pipeline for Examining Human Cerebellar Grey Matter Morphometry using Structural Magnetic Resonance Imaging

Multiple lines of research provide compelling evidence for a role of the cerebellum in a wide array of cognitive and affective functions, going far beyond its historical association with motor control. Structural and functional neuroimaging studies have further refined understanding of the functional neuroanatomy of the cerebellum beyond its anatomical divisions, highlighting the need for the examination of individual cerebellar subunits in healthy variability and neurological diseases. This paper presents a standardized pipeline for examining cerebellum grey matter morphometry that combines high-resolution, state-of-the-art approaches for optimized and automated cerebellum parcellation (Automatic Cerebellum Anatomical Parcellation using U-Net Locally Constrained Optimization; ACAPULCO) and voxel-based registration of the cerebellum (Spatially Unbiased Infra-tentorial Template; SUIT) for volumetric quantification. 
The pipeline has broad applicability to a range of neurological diseases and is fully automated, with manual intervention only required for quality control of the outputs. The pipeline is freely available, with substantial accompanying documentation, and can be run on Mac, Windows, and Linux operating systems. The pipeline is applied in a cohort of individuals with Friedreich ataxia (FRDA), and representative results, as well as recommendations on group-level inferential statistical analyses, are provided. This pipeline could facilitate reliability and reproducibility across the field, ultimately providing a powerful methodological approach for characterizing and tracking cerebellar structural changes in neurological diseases.

A standardized pipeline is presented for examining cerebellum grey matter morphometry. The pipeline combines high-resolution, state-of-the-art approaches for optimized and automated cerebellum parcellation and voxel-based registration of the cerebellum for volumetric quantification.

Yapısal Manyetik Rezonans Görüntüleme Kullanarak İnsan Serebellar Gri Madde Morfometrisini İncelemek için Standartlaştırılmış Bir Boru Hattı

Multiple lines of research provide compelling evidence for a role of the cerebellum in a wide array of cognitive and affective functions, going far beyond ...

Validation of a Mouse Model to Disrupt LINC Complexes in a Cell-specific Manner

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the Nucleoskeleton and Cytoskeleton (LINC complexes). These protein scaffolds span the nuclear envelope and connect the interior of the nucleus to components of the surrounding cytoplasmic cytoskeleton. LINC complexes consist of two evolutionary-conserved protein families, Sun proteins and Nesprins that harbor C-terminal molecular signature motifs called the SUN and KASH domains, respectively. Sun proteins are transmembrane proteins of the inner nuclear membrane whose N-terminal nucleoplasmic domain interacts with the nuclear lamina while their C-terminal SUN domains protrudes into the perinuclear space and interacts with the KASH domain of Nesprins. Canonical Nesprin isoforms have a variable sized N-terminus that projects into the cytoplasm and interacts with components of the cytoskeleton. This protocol describes the validation of a dominant-negative transgenic mouse strategy that disrupts endogenous SUN/KASH interactions in a cell-type specific manner. Our approach is based on the Cre/Lox system that bypasses many drawbacks such as perinatal lethality and cell nonautonomous phenotypes that are associated with germline models of LINC complex inactivation. For this reason, this model provides a useful tool to understand the role of LINC complexes during development and homeostasis in a wide array of tissues.

Nuclear envelope proteins play a central role in many basic biological processes and have been implicated in a variety of human diseases. This protocol describes a new Cre/Lox-based mouse model that allows for the spatiotemporal control of LINC complexes disruption.

Fare Modeli Doğrulanması Hücre-spesifik şekilde LINC kompleksler bozacak

Nuclear migration and anchorage within developing and adult tissues relies heavily upon large macromolecular protein assemblies called LInkers of the ...

Biyoloji

<meta charset="utf8"></head><body>Serebellar Purkinje Hücreleri: Organotipik Kültürlerde DNA Hasar Yanıtı

Visualizing the DNA Damage Response in Purkinje Cells Using Cerebellar Organotypic Cultures

Cerebellar Purkinje cells (PCs) exhibit a unique interplay of high metabolic rates, specific chromatin architecture, and extensive transcriptional activity, making them particularly vulnerable to DNA damage. This necessitates an efficient DNA damage response (DDR) to prevent cerebellar degeneration, often initiated by PC dysfunction or loss. A notable example is the genome instability syndrome, ataxia-telangiectasia (A-T), marked by progressive PC depletion and cerebellar deterioration. Investigating DDR mechanisms in PCs is vital for elucidating the pathways leading to their degeneration in such disorders. However, the complexity of isolating and cultivating PCs in vitro has long hindered research efforts. Murine cerebellar organotypic (slice) cultures offer a feasible alternative, closely mimicking the in vivo tissue environment. Yet, this model is constrained to DDR indicators amenable to microscopic imaging. We have refined the organotypic culture protocol, demonstrating that fluorescent imaging of protein-bound poly(ADP-ribose) (PAR) chains, a rapid and early DDR indicator, effectively reveals DDR dynamics in PCs within these cultures, in response to genotoxic stress.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spotlight: Ataksi-Telenjiektazi ve İlişkili Serebellar Dejenerasyonda ATM'nin Rolünün Deşifre Edilmesi

Cerebellar Purkinje cells (PCs) are particularly sensitive to deficiencies in the DNA damage response. A protocol is presented for the visual evaluation of the dynamics of PC response to DNA damage, which involves staining protein-bound poly(ADP-ribose) chains within cerebellar organotypic cultures.