Cvetanovic laboratuvarındaki Austin Ferro ve Juao-Guilherme Rosa'ya, diseksiyonların giderilmesinde ve RNA ekstraksiyonu ve RTqPCR'de yardımları için minnettarız. Bu araştırma M. Cvetanovic, R01 NS197387 tarafından finanse edilir; HHS | Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH).

1. Kurulum
<ol><li>Kafa kesme makası, künt forseps, diseksiyon makası, vasküler makas, mikrospatula, sagittal fare beyin matrisi, jilet, 200 μL pipet ucu, cam petri kabı, cam kaydırak ve buz kovası dahil olmak üzere gerekli ekipmanları toplayın. Tüm ekipmanları emici bir ped üzerine yer edin.</li>
	<li>Petri kabı, cam tabak ve beyin matrisini buza yerleştirin.</li>
	<li>Dik bir açıda jilet kullanarak, bir 200 μL pipet ucunun ucundan yaklaşık 5 mm kesin. Bu, ucun ucundaki açıklığın boyutunu yaklaşık 1 mm genişliğinde yapar. Bu DCN'i delmek için yeterli olmalı. Ancak bu, diseksiyona bağlı olarak gerektiği gibi de ayarlanabilir. Kolay değiştirme ve ayarlama için birçok ipucunu hazırlayın.</li>
	<li>Etiket 1.5 mL mikrofuge tüpleri hayvan tanımlama ve serebellar bölge (hayvan başına dört tüp).</li>
	<li>Ekstraksiyondan sonra dokuyu flaş dondurmak için cryosafe kabını sıvı nitrojenle doldurun.</li>
</ol>2. Beyin çıkarma ve diseksiyon
Tüm deneyler Minnesota Üniversitesi Hayvan Bakım Komitelerinin yönergelerine uygun olarak gerçekleştirildi.
<ol><li>%5 CO2 pozlaması kullanarak fareyi ötenazi edin. Solunum durduktan sonra servikal çıkık gerçekleştirin. Kafa kesme makası ile farenin kafasını koparın ve karkası uygun kapta atın.</li>
	<li>Burundan başlayıp geriye doğru devam eden başın medial sagittal çizgisi boyunca jiletle bir kesi yapın. Orta çizginin her iki tarafına ayrılarak cildi ayırın. Her iki taraftaki kası kesmek için jilet kullanın, kulak kanallarını kesin.</li>
	<li>Kesme makası kullanarak, beyin sapının beyincikle buluştuğu yere kadar herhangi bir omurilik bölgesini kırpın, beyinciğin zarar görmemesine dikkat edin.</li>
	<li>Damar makası bıçaklarından birini beyin sapı ve omur sütunu arasındaki boşluğa yerleştirin ve kulak kanalına doğru kesin, kemiği temiz bir şekilde kesmek için makası kaldırın, ancak dokudaki hasarı sınırlayın.</li>
	<li>Kafatasının kenarı boyunca koku ampullerine doğru kesmeye devam edin, beyin dokusundaki hasarı sınırlamak için keserken kaldırmaya devam edin.</li>
	<li>Künt tokaları kullanarak, kafatasının arkasını yavaşça soyun ve beynin ve beyincik bölgesini ortaya çıkarın.</li>
	<li>Kafatasının kenarındaki künt künt zımsaları kullanarak kafatasının geri kalanını beynin üzerinden soyun. Bu adım kafatası kapağının çoğunu çıkarmalı ve beyni ortaya çıkarmalıdır.</li>
	<li>Kafatasının geri kalanını damar makası ve künt tokalarla kırparak kafatasının çoğunu beynin tepesinden temizleyin.</li>
	<li>Mikrospatula kullanarak, beyni hafifçe kaldırın ve kalan kafatasından koku ampullerini çıkarmak ve optik sistem liflerini kesmek için altına kepçe ve yukarı kaydırın. Beyin bu noktada kolayca serbest gelmelidir.</li>
	<li>Beyni buz üzerinde oturan petri kabına yerleştirin ve kalan kafatasını veya diğer kalıntıları çıkarın.</li>
	<li>Mikrospatulayı kullanarak, beyni dorsal tarafı yukarı olacak şekilde beyin matrisine hafifçe yerleştirin. Matriste seviye ayarlı olduğundan emin olmak için zaman ayırın, özellikle orta çizgi matriste merkezi düşer. Bu matris yetişkin fare beyin dokusu için tasarlanmıştır, genç veya hastalıklı hayvanlardan gelen doku matriste daha düşük dayanabilir, ancak numuneler arasında tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek hala mümkün olmalıdır.</li>
	<li>Yaylı orta çizgi boyunca bir jilet yerleştirin, bıçağın matrisin altına kadar itmesini sağlamak (Şekil 1B).</li>
	<li>İlk bıçağın yanına 1 mm daha jilet yerleştirin (Şekil 1B). Birbirinden 1 mm uzakta iki bıçak daha yerleştirin. Sonuç, beynin bir tarafına yerleştirilmiş üç bıçak olmalıdır, hepsi birbirinden 1 mm uzakta. Aynısını diğer tarafa da yap. Toplamda, 7 bıçak 1mm aralıklarla yerleştirilecektir (Şekil 1C).</li>
	<li>Dikkatlice, jiletlerin ön ve arka uçlarını alın ve matristen yukarı kaldırın. Jiletlerin dışındaki doku atılabilir.</li>
	<li>Yavaşça, doku bölümlerine zarar vermemeye dikkat derek bir seferde bir jilet ayırın.</li>
	<li>Doku bölümünü jiletten dikkatlice kaydırın ve mikrospatula ile cam kaydırağa kaydırın. Toplamda altı sagittal beyin bölümü olacaktır (Şekil 1D).</li>
	<li>En yanal 4 bölüm DCN görünür olacaktır (Mor kutu, Şekil 1D). DCN'yi izole etmek için, kesilmiş 200 μL pipet ucunu DCN üzerinde dik olarak tutun ve dcn'yi çevre dokudan tamamen kesmek için her yöne sallanarak dokudan sıkıca aşağı itin. DCN'yi temiz bir şekilde çıkarmak için doğrudan yukarı kaldırın ve ucundaki dokunun varlığını görsel olarak onaylayın.</li>
	<li>Bir parmağınızı ucun üstüne yerleştirin ve aşağı itin, bu da dokunun şişkinlik yapmasına neden oldu. Ucu doğru etiketlenmiş mikroyakıt tüpüne yerleştirin ve doku delme tüpünün altına yerleştirildiğından emin olun. Kalan üç bölüm için 2.17'yi tekrarlayın ve DCN zımbalarını aynı tüpe yerleştirin. Flaş dondurmak için tüpü sıvı nitrojene yerleştirin. Şekil 1E'deher bir zımbanın boyutunun gösterimi.</li>
	<li>DCN çıkarılan bölümler serebellar yarımküre olarak nitelendirilir. Beyin dokusunun geri kalanını bu bölümlerdeki beyinciklerin etrafına itin. Künt tokalar kullanın ve bu yarımküre serebellar korteks bölümlerini hafifçe alın ve ilgili mikrofuge tüpüne yerleştirin. Flaş dondurun.</li>
	<li>Son iki vermal bölüm için (açık mavi kutu, Şekil1D),sadece beyincik bırakarak çevreleyen beyin dokusunu uzaklaştırın. Jilet kullanarak, ön lobülleri arka lobüllerden ayıran bir kesim yapın. Kesim lobule 6 oluşumundan hemen sonra olmalı ve lobule 10(Şekil 1F)içermemelidir.</li>
	<li>Künt forseps kullanarak, ön serebellar korteks bölümlerini ve posterior serebellar korteks bölümlerini dikkatlice ilgili mikrofuge tüplerine yerleştirin ve tüpleri 5 dakika boyunca sıvı nitrojende bırakarak flaş dondurun. Buradan RNA ekstraksiyonuna ilerleyin veya tüpleri -80 °C'de saklayabilir.</li>
</ol>3. RNA ekstraksiyonu 
NOT: Bu protokol, TRIzol20ile RNA Ekstraksiyonu için Soğuk Bahar Limanı Protokolü'nden değiştirilmiştir. TRIzol biyolojik malzemeyi çözünür ve RNA çıkarılmasını mümkün hale getirir.
<ol><li>Dokunun çok hızlı çözülmesini önlemek için mikrobuj tüplerini buza yerleştirin, mikroyapı tüpüne 150 μL soğuk TRIzol uygulayın. Sterilize edilmiş bir pestle ile homojenize edin. Doku homojenize olduktan sonra, kalan dokunun bozulmadığından emin olmak için çözeltiyi yukarı ve aşağı borulayın. Ayrıca küçük doku parçalarını birkaç kez insülin şırındına çekerek parçalayın.</li>
	<li>350 μL daha TRIzol ekleyin ve iyice karıştırmak için yukarı ve aşağı borulayın. Oda sıcaklığında 5 dakika bekletin.</li>
	<li>Tüpe 150 μL kloroform ekleyin ve kuvvetlice çalkalayın ve ardından 2-3 dakika dinlendirin. Kloroform homojenize doku çözeltisini fazlara (RNA, DNA ve protein) ayırır.</li>
	<li>12.000 x g'da, 15°C'de 10 dakika santrifüj. Tüm tüplerin aynı yönde olduğundan emin olun.</li>
	<li>Tüpleri dikkatlice çıkarın ve santrifüjün sıcaklığını 4 °C'ye ayarlayın. Sadece berrak sulu fazı yeni bir tüpe çıkarın (bu RNA'dır), opak ara fazı (DNA) bozmamaya dikkat edin.  En düşük faz kırmızı olacaktır ve protein içerir. Tüplerde kalan çözelti kaydedilebilir veya atılabilir.</li>
	<li>1:2 oranında% 100 izopropil alkol ekleyin (200 ul sulu faz çıkarılırsa, 100 μL izopropil alkol ekleyin). Yukarı ve aşağı pipetleme ile iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika dinlendirin. İzopropil alkol RNA'yı çözeltiden çıkarır.</li>
	<li>12.000 x g'da, 4°C'de 10 dakika santrifüj. Peletin görselleştirilmesini kolaylaştırmak için tüm tüpleri aynı yönde yerleştirebildiğinden emin olun. Elde edilen pelet çıkarılan RNA olacaktır.</li>
	<li>Tüpleri dikkatlice çıkarın, peletin bozulmamasına dikkat eden bir pipet ile üsttantı çıkarın. Pelet biraz jel benzeridir ve görülmesi zor olacaktır, ancak santrifüjdeki tüplerin yönüne göre nerede olduğunu tahmin edebilmelidir.</li>
	<li>Tüm süpernatantı çıkardıktan sonra, 5 dakika boyunca 5 dakika boyunca 7500 x g'da 500 μL% 75 etanol, girdap ve santrifüj ekleyin. Etanol peletin daha da yıkanır.</li>
	<li>Peletin bozulmasına neden olmadan süpernatantı dikkatlice çıkarın. Numuneyi kurutmak için kapakları açık bırakın. Bu genellikle 5-10 dakika sürer, ancak pelet üzerinde ne kadar etanol kaldığına bağlı olarak değişebilir. Fazla kurutma.</li>
	<li>Kurutuktan sonra peletin DNase serbest suyuna yeniden koyun. DCN için örneklere 20 μL ve diğerleri için 30 μL ekleyin.</li>
	<li>Yeniden depolandıktan sonra, numuneler -80 °C'de saklanabilir veya daha fazla teste devam edebilir.</li>
</ol>4. Gerçek Zamanlı Nicel Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RTqPCR)
<ol><li>Bu adımdan önce, herhangi bir genomik DNA'yı çıkarmak için RNA'yı tedavi etmek ve BioRad'dan iScript kullanarak cDNA oluşturmak gerekecektir. CDNA yapmadan önce RNA konsantrasyonunun normale döndürdürülmesini unutmayın. Ek olarak, qPCR için astarları optimize etmek önemlidir. Bu adım21'itamamlamak için burada açıklanan yöntemleri izleyin. Aşağıdaki qPCR'nin kısa açıklaması.</li>
	<li>Primer'ların tümü IDT'den satın alınmaktadır. İleri ve ters diziler aynı numune tüpündedir ve 20x konsantrasyonda depolanır. Rps18 (kontrol geni): İleri – 5'-CCTGAGAAGTTCCAGCACAT-3' Ters – 5'-ACACCACATGAGCATATCTCC-3' Parvalbumin (Kalsiyum bağlayıcı protein, inhibitör hücreler): İleri – '5-ATGAGGTGAAGAAGGTGTTCC-3' Ters – '5-AGCGTCTTTGTTTCTTTAGCAG-3' Kcng4 (Potasyum kanalı alt birliği): İleri – 5'-CTGTCTTTTCCTGGTCAGTGA-3' Ters – 5'-GCATTGCCTCAGACTGTCAG-3' Aldolaz C (Zebrin II, serebellar korteks boyunca farklı olarak ifade edilir): İleri – 5'-AGAGGACAAAGGGATAATGCTG-3' Ters – 5'-TCAGTAGGCATGGGGGGC-3'</li>
	<li>qPCR koşulları aşağıdaki gibidir. Ön kuluçka süresi, 5 dakika, 95°C'de. Amplifikasyon süresi, 50 döngü: 95°C'de 10 dakika, 62°C'de 10 dakika ve 72°C'de 10 dakika. Erime eğrisi süresi, 95°C'de 5 saniye, 65°C'de bir dakika ve rampa hızını 97°C hedef sıcaklığına kadar .07°C/saniye olarak ayarlayın. Daha sonra 10 dakika ila 40 °C arasında soğutma süresi.  Tüm qPCR reaksiyonları üç taraflı olarak gerçekleştirildi ve gen ekspresyonunun normalleştirilmesi için yükleme kontrolü olarak Rps18 ile 2- ΔΔCt kullanılarak gen ekspresyörü analiz edildi. Referans olarak dökme serebellar ekstre kullanılmıştır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Herculano-Houzel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glia/neuron+ratio:+How+it+varies+uniformly+across+brain+structures+and+species+and+what+that+means+for+brain+physiology+and+evolution.">The glia/neuron ratio: How it varies uniformly across brain structures and species and what that means for brain physiology and evolution.</a> Glia. 62 (9), 1377-1391 (2014).</li><li>Schmahmann, J. D., Caplan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognition,+enotion,+and+the+cerebellum.">Cognition, enotion, and the cerebellum.</a> Brain. 129 (2), 290-292 (2006).</li><li>Badura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+cognitive+and+social+development+require+posterior+cerebellar+activity.">Normal cognitive and social development require posterior cerebellar activity.</a> eLife. 7, 36401 (2018).</li><li>Diedrichsen, J., King, M., Hernandez-Castillo, C., Sereno, M., Ivry, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+Transform+or+Multiple+Functionality?+Understanding+the+Contribution+of+the+Human+Cerebellum+across+Task+Domains.">Universal Transform or Multiple Functionality? Understanding the Contribution of the Human Cerebellum across Task Domains.</a> Neuron. 102 (5), 918-928 (2019).</li><li>Strick, P. L., Dum, R. P., Fiez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum+and+Nonmotor+Function.">Cerebellum and Nonmotor Function.</a> Annual Review of Neuroscience. 32 (1), 413-434 (2009).</li><li>King, M., Hernandez-castillo, C. R., Poldrack, R. A., Ivry, R. B., Diedrichsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+boundaries+in+the+human+cerebellum+revealed+by+a+multi-domain+task+battery.">Functional boundaries in the human cerebellum revealed by a multi-domain task battery.</a> Nature Neuroscience. 22, 1371-1378 (2019).</li><li>Buckner, R. L., Krienen, F. M., Castellanos, A., Diaz, J. C., Yeo, B. T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organization+of+the+human+cerebellum+estimated+by+intrinsic+functional+connectivity.">The organization of the human cerebellum estimated by intrinsic functional connectivity.</a> Journal of neurophysiology. 106 (5), 2322-2345 (2011).</li><li>Schmahmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+movement+to+thought:+Anatomic+substrates+of+the+cerebellar+contribution+to+cognitive+processing.">From movement to thought: Anatomic substrates of the cerebellar contribution to cognitive processing.</a> Human Brain Mapping. 4 (3), 174-198 (1996).</li><li>Kelly, R. M., Strick, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Loops+with+Motor+Cortex+and+Prefrontal+Cortex+of+a+Nonhuman+Primate.">Cerebellar Loops with Motor Cortex and Prefrontal Cortex of a Nonhuman Primate.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (23), 8432-8444 (2003).</li><li>Stoodley, C. J., Macmore, J. P., Makris, N., Sherman, J. C., Schmahmann, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Location+of+lesion+determines+motor+vs.+cognitive+consequences+in+patients+with+cerebellar+stroke.">Clinical Location of lesion determines motor vs. cognitive consequences in patients with cerebellar stroke.</a> NeuroImage: Clinical. 12, 765-775 (2016).</li><li>Guo, C. C., Tan, R., Hodges, J. R., Hu, X., Sami, S., Hornberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network-selective+vulnerability+of+the+human+cerebellum+to+Alzheimer's+disease+and+frontotemporal+dementia.">Network-selective vulnerability of the human cerebellum to Alzheimer's disease and frontotemporal dementia.</a> Brain. 139 (5), (2016).</li><li>Bocchetta, M., Cardoso, M. J., Cash, D. M., Ourselin, S., Warren, J. D., Rohrer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+regional+cerebellar+atrophy+in+genetic+frontotemporal+dementia.">Patterns of regional cerebellar atrophy in genetic frontotemporal dementia.</a> NeuroImage: Clinical. 11, 287-290 (2016).</li><li>Sillitoe, R. V., Fu, Y., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellum.">Cerebellum.</a> The Mouse Nervous System. , 360-397 (2012).</li><li>Nguyen-Minh, V. T., Tran-Anh, K., Luo, Y., Sugihara, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+Excitability+and+Parallel+Fiber+Synaptic+Properties+of+Zebrin-Positive+and+-Negative+Purkinje+Cells+in+Lobule+VIII+of+the+Mouse+Cerebellar+Slice.">Electrophysiological Excitability and Parallel Fiber Synaptic Properties of Zebrin-Positive and -Negative Purkinje Cells in Lobule VIII of the Mouse Cerebellar Slice.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 513 (2019).</li><li>Manto, M., Oulad Ben Taib, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+nuclei:+Key+Roles+for+Strategically+Located+Structures.">Cerebellar nuclei: Key Roles for Strategically Located Structures.</a> The Cerebellum. 9 (1), 17-21 (2010).</li><li>Driessen, T. M., Lee, P. J., Lim, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathway+analysis+towards+understanding+tissue+vulnerability+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Molecular pathway analysis towards understanding tissue vulnerability in spinocerebellar ataxia type 1.</a> eLife. , (2018).</li><li>Grabert, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+brain+region+-+dependent+diversity+and+selective+regional+sensitivities+to+aging.">Microglial brain region - dependent diversity and selective regional sensitivities to aging.</a> Nat Neurosci. 19 (3), 504 (2016).</li><li>Ingram, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebellar+Transcriptome+Profiles+of+ATXN1+Transgenic+Mice+Reveal+SCA1+Disease+Progression+and+Protection+Pathways.">Cerebellar Transcriptome Profiles of ATXN1 Transgenic Mice Reveal SCA1 Disease Progression and Protection Pathways.</a> Neuron. 89 (6), 1194-1207 (2016).</li><li>Cendelin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> From mice to men : lessons from mutant ataxic mice. , 1-21 (2014).</li><li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+RNA+Using+TRIzol+(TRI+Reagent).">Purification of RNA Using TRIzol (TRI Reagent).</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).</li><li>Kim, J. H., Lukowicz, A., Qu, W., Johnson, A., Cvetanovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astroglia+contribute+to+the+pathogenesis+of+spinocerebellar+ataxia+Type+1+(SCA1)+in+a+biphasic,+stage-of-disease+specific+manner.">Astroglia contribute to the pathogenesis of spinocerebellar ataxia Type 1 (SCA1) in a biphasic, stage-of-disease specific manner.</a> Glia. 66 (9), 1972-1987 (2018).</li><li>Chopra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Capicua+expression+drives+regional+Purkinje+neuron+vulnerability+through+ion+channel+gene+dysregulation+in+spinocerebellar+ataxia+type+1.">Altered Capicua expression drives regional Purkinje neuron vulnerability through ion channel gene dysregulation in spinocerebellar ataxia type 1.</a> Human Molecular Genetics. , (2020).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada açıklanan yöntem, dört ayrı serebellar bölgede altta kalan gen ekspresyonunu ve moleküler mekanizmaların değerlendirilmesini mümkün kılar - derin serebellar çekirdek (DCN), vermisin ön serebellar korteksi (CCaV), vermisin arka serebellar korteksi (CCpV) ve yarımkürelerin serebellar korteksi (CCH). Bu bölgeleri ayrı ayrı değerlendirme yeteneği, belirli serebellar bölgelerin heterojenliği hakkındaki bilgimizi genişletecek ve muhtemelen çeşitli davranışlara katkılarına ışık tutacakt?...

Beyincik beyindeki nöronların yarısından fazlasını içerir ve tarihsel olarak beyinde motor kontrol ve denge merkezi olarak adlandırılır1. Daha yakın zamanlarda, çalışmalar serebellumun biliş, ödül işleme dahil olmak üzere diğer çeşitli işlevlerde kilit bir rol oynadığını ve 2 , 3,4,5'i etkilediğinigöstermiştir.
Beyincik iyi tanımlanmış anatomiye sahiptir: korteks bölgesi granül, Purkinje ve moleküler katmanlardan oluşur. Granül hücreler granül hücre tabakasını oluşturur ve paralel lifler aracılığıyla moleküler tabakanın Purkinje hücre dendritlerine giriş gönderir ve bu da alt zeytinden kaynaklanan tırmanma liflerinden giriş alır. Purkinje hücreleri, beyincikten ana çıktı görevi gören derin serebellar çekirdekteki (DCN) hücrelere inhibitör projeksiyonlar gönderir. Bu serebellar devrenin çıkışı, Golgi, stellat ve sepet hücreleri de dahil olmak üzere serebellar korteksteki inhibitör internöronların aktivitesi ile daha da modüle edilir4. Bu serebellar fonksiyonel ünite serebellar korteksin tüm lobüllerine dağılmıştır. Beyincik boyunca bu nispeten düzgün devreye rağmen, insan nörogörüntüleme literatüründen ve hasta çalışmalarından elde edilen kanıtlar beyincik6,7'ninfonksiyonel heterojenliğini göstermektedir.
Serebellar korteks iki ana bölgeye ayrılabilir: orta çizgi tanımlı vermis ve lateral yarımküreler. Vermis daha da ön ve arka lobüllere ayrılabilir. Beyinciklerin bu farklı bölgeleri farklı davranışlara katkıda bulunmakla suçlanmıştır. Görev çağrışan veya görevsiz aktivite kalıpları, vermis'in ön bölgelerinin motor fonksiyona daha fazla katkıda bulunduğunu, posterior vermis'in ise biliş6,7'yedaha fazla katkıda bulunduğunu ortaya çıkardı. Vermis ayrıca etki ve duygularla bağlantılıdır, serebellar yarımküreler yürütme, görsel-mekansal, dil ve diğer anımsatıcı işlevlere katkıda bulunur8. Ek olarak, anatomik çalışmalar fonksiyonel olarak farklı serebellar bölgelerin farklı kortikal bölgelerle bağlantılı olduğuna dair kanıtlar sağlamıştır9. Lezyon semptom haritalaması, ön lobları etkileyen inmeleri olan hastaların (lob VI'ya kadar uzanan) ince motor görevlerde daha düşük performansa sahip olduğunu, arka lob bölgelerinde ve yarımkürelerde hasarı olan hastaların serebellar motor sendromunun yokluğunda bilişsel eksiklikler sergilediğini ortaya koydu10. Son olarak, hastalıkta bölgesel serebellar patoloji, fonksiyonel olarak farklı serebellar bölgelerin de hastalığa farklı şekilde duyarlı olduğunu gösterir11,12.
Çok daha az araştırılsa da, ön kanıtlar serebellar kortikal bölgelerde belirgin gen ekspresyon imzaları göstermektedir. Zebrin II'nin Purkinje hücre ifadesi, vermiste bölgeye özgü desenleme gösterir, böylece arka lobüllerde daha fazla Zebrin II pozitif hücre ve ön lobüllerde dahaazdır 13. Bu aynı zamanda Zebrin II negatif Purkinje hücreleri Zebrin II pozitif14olan Purkinje hücrelerinden daha yüksek tonik ateşleme sıklığı gösterdiğinden bölgesel olarak farklı fizyolojik işlevle de ilişkilidir.
Serebellar kortekse ek olarak, serebellum, beyincik için birincil çıktı görevi gören derin serebellar çekirdeği (DCN) içerir. Çekirdekler medial (MN), interposed (IN) ve lateral çekirdeklerden (LN) oluşur. Fonksiyonel görüntüleme ve hasta çalışmaları, DCN'nin çeşitli davranışlara da katıldığını göstermiştir15, ancak çok az çalışma DCN'deki gen ekspresyon değişimini inceler.
Moleküler tekniklerdeki gelişmeler beyindeki bölgesel gen ekspresyonun değerlendirilmesini mümkün kıldı ve hem fizyolojik hem de hastalık durumlarında farklı beyin bölgelerinde ve içinde heterojenliği ortaya çıkardı16. Bu tür çalışmalar, beyinciğerinin diğer beyin bölgelerinden farklı olduğunu ima eder. Örneğin, nöronların glial hücrelere oranı beyincikte diğer beyin bölgelerine göre ters çevrilmiş1. Normal fizyolojik koşullarda bile, proinflamatuar genlerin ekspresyonu beyincikte diğer beyin bölgelerine göre artmaktadır17. Moleküler teknikler, serebellar hastalıkların patogenezine katkıda bulunan yolların tanımlanmasında da çok yararlı olmuştur. Örneğin, tüm serebellar özlerin RNA dizilimi, vahşi tip kontrollerine kıyasla spinocerebellar ataksi tip 1'in (SCA1) Purkinje hücresine özgü transgenik fare modelinde değiştirilen genleri tanımladı. Bu tür kanıtlar, serebellar Purkinje hücrelerinde patogenezin altında kalan temel moleküler yolları ortaya çıkarmıştır ve potansiyel terapötik hedeflerin belirlenmesine yardımcı olmuştur18. Bununla birlikte, son çalışmalar serebellar bölgelerde hastalıklara karşı savunmasızlıkta farklılıklar olduğunu göstermektedir11,12,19. Bu, tüm serebellar özlerle maskelenmiş veya tespit edilmemiş olabilecek farklı serebellar bölgelerde meydana gelen önemli değişiklikler olduğunu gösterebilir. Bu nedenle, araştırmacıların farklı serebellar bölgelerdeki moleküler profilleri incelemelerini sağlayan teknikler geliştirmeye ihtiyaç vardır.
Burada önerilen teknik, RNA'yı bu bölgelerden izole etmek ve gen ifadesindeki bölgesel farklılıkları araştırmak için fare beyinciğinin dört farklı bölgesini parçalamak için tekrarlanabilir bir yöntemi açıklar. Şekil 1A'daki fare beyinciliğinin şeması, vermis'i mavi ve yarımküreleri sarı renkle vurgular. Özellikle, Bu teknik dört bölgenin izole olmasını mümkün kılar: derin serebellar çekirdek (DCN) (Şekil 1A'dakikırmızı noktalı kutular), ön vermis (CCaV) serebellar korteksi (koyu mavi inç) Şekil 1A), arka vermis (CCpV) serebellar korteksi (Şekil 1A'daaçık mavi) ve yarımkürelerin serebeller korteksi (CCH) (Şekil 1A'dasarı). Bu bölgelerin gen ekspresyonunun ayrı ayrı değerlendirilmesi ile bu farklı bölgelerin ayrık fonksiyonlarının altında kalan moleküler mekanizmaların yanı sıra hastalıktaki kırılganlıklarındaki potansiyel farklılıkların araştırılması mümkün olacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr >
			<td >1.5 Microcentrifuge tubes</td>
			<td >ThermoScietific</td>
			<td >3456</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >100% Isopropyl Alcohol</td>
			<td >VWR Life sciences</td>
			<td >1106C361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >200 ul Pipet tips</td>
			<td >GeneMate</td>
			<td >P-1237-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Adult Mouse Brain Matrix Sagittal</td>
			<td >Kent Scientific Corporation</td>
			<td >RBMA-200S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Blunt forceps</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Chloroform</td>
			<td >Macron</td>
			<td >220905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Decapitation Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dissecting Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ethyl Alcohol</td>
			<td >Pharmco</td>
			<td >111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Glass Slide (for electrophoresis)</td>
			<td >BIORAD</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Homogenizer</td>
			<td >Kimble</td>
			<td >6HAZ6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ice Bucket</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Insulin Syringe (.5ml)</td>
			<td >BD</td>
			<td >329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >iScript Adv cDNA kit for RT-qPCR</td>
			<td >BIORAD</td>
			<td >1725037</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Micro Spatula</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Needle Nose forceps</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Petri Dish</td>
			<td >Pyrex</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Aldolase C</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58&#62;43415246</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Kcng4</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.56a.9448518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer for Parvalbumin</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58.7596729</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Primetime Primer Rps18&#160;</td>
			<td >IDT</td>
			<td >Mm.PT.58.12109666</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Single Edge Rzor Blades</td>
			<td >Personna GEM</td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sterile, sigle-use pestles</td>
			<td >FisherScientific</td>
			<td >12141364</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >TRIzol Reagent</td>
			<td >Ambion by Life technologies</td>
			<td >15596018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vascular Scissors</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cerebellar regional dissection for molecular analysis

Serebellum, hareket kontrolü, denge, biliş, ödül ve etki dahil olmak üzere çeşitli temel işlevlerde önemli bir rol oynar. Görüntüleme çalışmaları farklı serebellar bölgelerin bu farklı fonksiyonlara katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bölgesel serebellar farklılıkları inceleyen moleküler çalışmalar, çoğunlukla serebellar özlerin tamamında yapıldığı için geride kalmaktadır ve böylece belirli serebellar bölgelerdeki ayrımları maskelemektedir. Burada dört farklı serebellar bölgeyi tekrar ve hızlı bir şekilde parçalama tekniğini açıklıyoruz: derin serebellar çekirdek (DCN), ön ve arka vermal serebellar korteks ve yarımkürelerin serebellar korteksi. Bu farklı bölgelerin diseksiyonunun, denge, hareket, etki ve bilişe benzersiz katkılarının altında yatan moleküler mekanizmaların araştırılmasına izin verir. Bu teknik, çeşitli fare hastalığı modellerinde bu belirli bölgelerin patolojik duyarlılığındaki farklılıkları araştırmak için de kullanılabilir.

Bu deneyler için dört on bir haftalık dişi vahşi tip C57/Black6 fare kullanıldı. Bir fare, 'dökme beyincik' olarak adlandırılan ve kesilen bölgelerdeki RNA seviyelerinin tam bir diseksiyonla karşılaştırılmasına izin verilen tam bir serebellar diseksiyon yapmak için kullanıldı. Diğer üç fare, bu protokolde açıklanan serebellar diseksiyonu yapmak için kullanılmıştır. Üç fare kullanmak, RNA seviyelerinde tespit edilen eğilimlerin fareler arasında tekrarlanab...

Watch this Scientific Journal Video about Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis at JoVE.com

Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

Farklı serebellar bölgelerin farklı davranışsal çıktılarda rol oynadığı belirtilmiştir, ancak alttaki moleküler mekanizmalar bilinmemektedir. Bu çalışma, RNA'yı izole ederek ve gen ifadesindeki farklılıkları test ederek moleküler farklılıkları araştırmak için yarımkürelerin serebellar korteksini, vermisin ön ve arka bölgelerini ve derin serebellar çekirdekleri tekrar ve hızlı bir şekilde parçalama yöntemini açıklar.

Moleküler Analiz için Serebellar Bölgesel Diseksiyon

Cerebellum plays an important role in several key functions including control of movement, balance, cognition, reward, and affect. Imaging studies ...

cerebellar-regional-dissection-for-molecular-analysis

Research

JoVE Journal

Neuroscience

3.8K Görüntüleme.  University of Minnesota. Farklı serebellar bölgelerin farklı davranışsal çıktılarda rol oynadığı belirtilmiştir, ancak alttaki moleküler mekanizmalar bilinmemektedir. Bu çalışma, RNA'yı izole ederek ve gen ifadesindeki farklılıkları test ederek moleküler farklılıkları araştırmak için yarımkürelerin serebellar korteksini, vermisin ön ve arka bölgelerini ve derin serebellar çekirdekleri tekrar ve hızlı bir şekilde parçalama yöntemini açıklar.

Video: Cerebellar Regional Dissection for Molecular Analysis

A Simple Composite Phenotype Scoring System for Evaluating Mouse Models of Cerebellar Ataxia

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously published phenotype assessments in several disease models, including spinocerebellar ataxias, Huntington s disease and spinobulbar muscular atrophy. Measures include hind limb clasping, ledge test, gait and kyphosis. Each measure is recorded on a scale of 0-3, with a combined total of 0-12 for all four measures. The results effectively discriminate between affected and non-affected individuals, while also quantifying the temporal progression of neurodegenerative disease phenotypes. Measures may be analyzed individually or combined into a composite phenotype score for greater statistical power. The ideal combination of the four described measures will depend upon the disorder in question. We present an example of the protocol used to assess disease severity in a transgenic mouse model of spinocerebellar ataxia type 7 (SCA7).
Albert R. La Spada and Gwenn A. Garden contributed to this manuscript equally.

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebellar ataxia. Measures include hind limb clasping, ledge test, gait and kyphosis. This protocol effectively discriminates between affected and non-affected individuals, and detects the progression of affected individuals over time.

Serebellar Ataksi Fare Modelleri Değerlendirme Basit Kompozit Fenotip Puanlama Sistemi

We describe a protocol for the rapid and sensitive quantification of disease severity in mouse models of cerebella ataxia. It is derived from previously ...

Nörobilim

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. Since then, the technique was developed further and currently there are many different ways to prepare organotypic cultures. The method presented here was adapted from the one described by Stoppini et al. for the preparation of the slices and from Gogolla et al. for the staining procedure 3,4.
A unique feature of this technique is that it allows you to study different parts of the brain such as hippocampus or cerebellum in their original structure, providing a big advantage over dissociated cultures in which all the cellular organization and neuronal networks are disrupted. In the case of the cerebellum it is even more advantageous because it allows the study of Purkinje cells, extremely difficult to obtain as dissociated primary culture. This method can be used to study certain developmental features of the cerebellum in vitro, as well as for electrophysiological and pharmacological experiments in both wild type and mutant mice.
The method described here was designed to study the effect of apoptotic stimuli such as Fas ligand in the developing cerebellum, using TUNEL staining to measure apoptotic cell death. If TUNEL staining is combined with cell type specific markers, such as Calbindin for Purkinje cells, it is possible to evaluate cell death in a cell population specific manner. The Calbindin staining also serves the purpose of evaluating the quality of the cerebellar cultures.

This method describes the generation of organotypic cerebellar cultures and the effect of certain apoptotic stimuli on the viability of different cerebellar cell types.

Organotipik Serebellar Kültürler: Apoptotik Zorluklar ve Tayin

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative diseases because of its powerful genetics1. The fly eye in particular has been the organ of choice for neurodegeneration research, being the most accessible and life-dispensable part of the Drosophila nervous system. However the major caveat of intact eyes is the difficulty, because of the intense autofluorescence of the pigment, in imaging intracellular events, such as autophagy dynamics2, which are paramount to understanding of neurodegeneration.
We have recently used the dissection and culture of single ommatidia3 that has been essential for our understanding of autophagic dysfunctions in a fly model of Dentatorubro-Pallidoluysian Atrophy (DRPLA)3, 4.
We now report a comprehensive description of this technique (Fig. 1), adapted from electrophysiological studies5, which is likely to expand dramatically the possibility of fly models for neurodegeneration. This method can be adapted to image live subcellular events and to monitor effective drug administration onto photoreceptor cells (Fig. 2). If used in combination with mosaic techniques6-8, the responses of genetically different cells can be assayed in parallel (Fig. 2).

Single Drosophila Ommatidium Dissection and Imaging

The limiting factor in the use of the adult Drosophila eye to study neurodegeneration and cell biology is the difficult imaging of intracellular processes. We describe the dissection of single ommatidia to generate a bona-fide primary neuronal cell culture, which can be subject to drug treatment and advanced imaging.

Tek Drosophila Ommatidium Diseksiyon ve Görüntüleme

The fruit fly Drosophila melanogaster has made invaluable contributions to neuroscience research and has been used widely as a model for neurodegenerative ...

Quantitative Analysis of Synaptic Vesicle Pool Replenishment in Cultured Cerebellar Granule Neurons using FM Dyes

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools - the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.

A live fluorescence imaging technique to quantify the replenishment and mobilisation of specific synaptic vesicle (SV) pools in central nerve terminals is described. Two rounds of SV recycling are monitored in the same nerve terminals providing an internal control.

FM Boyalar Kültür Serebellar Granül Nöronlar Synaptic veziküllü Havuzu Yenileme Kantitatif Analiz

After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis.  Retrieved SVs are then refilled with ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

The process by which the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina continues to be a major focus of both clinical and basic research. In addition to the obvious medical relevance for understanding and treating retinal disease, the development of the vertebrate retina continues to serve as an important and elegant model system for understanding neuronal cell type determination and differentiation1-16. The neural retina consists of six discrete cell types (ganglion, amacrine, horizontal, photoreceptors, bipolar cells, and M&uuml;ller glial cells) arranged in stereotypical layers, a pattern that is largely conserved among all vertebrates 12,14-18.
While studying the retina in the intact developing embryo is clearly required for understanding how this complex organ develops from a protrusion of the forebrain into a layered structure, there are many questions that benefit from employing approaches using primary cell culture of presumptive retinal cells 7,19-23. For example, analyzing cells from tissues removed and dissociated at different stages allows one to discern the state of specification of individual cells at different developmental stages, that is, the fate of the cells in the absence of interactions with neighboring tissues 8,19-22,24-33. Primary cell culture also allows the investigator to treat the culture with specific reagents and analyze the results on a single cell level 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, a classic model system for the study of early neural development 19,27,29,31-32,40-42, serves as a particularly suitable system for retinal primary cell culture 10,38,43-45.
Presumptive retinal tissue is accessible from the earliest stages of development, immediately following neural induction 25,38,43. In addition, given that each cell in the embryo contains a supply of yolk, retinal cells can be cultured in a very simple defined media consisting of a buffered salt solution, thus removing the confounding effects of incubation or other sera-based products 10,24,44-45.
However, the isolation of the retinal tissue from surrounding tissues and the subsequent processing is challenging. Here, we present a method for the dissection and dissociation of retinal cells in Xenopus laevis that will be used to prepare primary cell cultures that will, in turn, be analyzed for calcium activity and gene expression at the resolution of single cells. While the topic presented in this paper is the analysis of spontaneous calcium transients, the technique is broadly applicable to a wide array of research questions and approaches (Figure 1).

Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue

Xenopus laevis provides an ideal model system for studying cell fate specification and physiological function of individual retinal cells in primary cell culture. Here we present a technique for dissecting retinal tissues and generating primary cell cultures that are imaged for calcium activity and analyzed by in situ hybridization.

Diseksiyon, Kültür ve Analizi<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Embriyonik Retina Doku

The process by which  the anterior region of the neural plate gives rise to the vertebrate retina  continues to be a major focus of both clinical and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

Tüm Montajlı Nöromüsküler Kavşak Analizi için Enine Abdominis Kasının Diseksiyonu

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to understand the mechanism that promotes neuronal regeneration, an in-depth analysis of the neuronal types that can remodel after injury is needed. Several studies showed that damaged climbing fibers are capable of regrowing also in adult animals1,2. The investigation of the time-lapse dynamics of degeneration and regeneration of these axons within their complex environment can be performed by time-lapse two-photon fluorescence (TPF) imaging in vivo3,4. This technique is here combined with laser surgery, which proved to be a highly selective tool to disrupt fluorescent structures in the intact mouse cortex5-9.
This protocol describes how to perform TPF time-lapse imaging and laser nanosurgery of single axonal branches in the cerebellum in vivo. Olivocerebellar neurons are labeled by anterograde tracing with a dextran-conjugated dye and then monitored by TPF imaging through a cranial window. The terminal portion of their axons are then dissected by irradiation with a Ti:Sapphire laser at high power. The degeneration and potential regrowth of the damaged neuron are monitored by TPF in vivo imaging during the days following the injury.

Laser Nanosurgery of Cerebellar Axons In Vivo

Two-photon imaging, coupled to laser nanodissection, are useful tools to study degenerative and regenerative processes in the central nervous system with subcellular resolution. This protocol shows how to label, image, and dissect single climbing fibers in the cerebellar cortex in vivo.

Serebellar Aksonlar Lazer Nanosurgery<em&gt; In Vivo</em

Only a few neuronal populations in the central nervous system (CNS) of adult mammals show local regrowth upon dissection of their axon. In order to ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Basit Bir adım Yetişkin Tüm montaj Hazırlama Diseksiyon Protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Brain

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...