This work was partially supported by National Institute of Deafness and Other Communications Disorders Awards R03-DC-012125 to D. A. Llano and F31-DC-013501 to B. J. Slater as well as the Carver Foundation.
The authors would like to thank Jason MacLean and Matthew Banks for technical advice with calcium imaging.

Tüm işlemler Illinois Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Bütün hayvanlar Laboratuar Hayvan Bakımı Akreditasyon Amerikan Derneği tarafından onaylanan hayvan bakım tesislerinde yerleştirildiler. Her girişimi kullanılan hayvanların sayısını en aza indirmek ve çalışmanın her aşamasında acıları azaltmak için yapıldı. Ve Dilimleme için Mouse Beyin çıkarılması 1. Hazırlık <ol><li> Perfüzyon ve dilim inkübasyon için hazırlayın. <ol><li> Yaklaşık 30 dakika dilimleme önce, kayıt veya görüntüleme öncesinde dilim kuluçka için yüksek sakaroz kesim çözümü ve düşük kalsiyum aCSF hazırlar. </li><li> Gerekli tüm araçları (büyük kör uç makas, küçük yaylı makas, anatomik forseps, büyük makas ya da giyotin, iris makas, kuyumcular forseps, 27G x 1/2 inç iğne ile 10 ml şırınga, 1 cm x 2 cm filtresi küçük bir parça dışarı Lay Kağıt ve sl için bir kırık uçlu Pasteur pipetiperfüzyon ve dilimleme ve perfüzyon tepsisini hazırlamak için buz transferi). </li><li> 32 o C su banyosunda ve çözüm kesim ile dolu bir kültür çanak oksijenli aCSF odasını kuluçka ayarlayın. </li></ol></li><li> Dilimleme için sahne kesme hazırlayın. <ol><li> Yaklaşık 1 cm 3 yumru bir beyin için Geri döndürmez ve 1,5 cm x 1,5 mm x 3 mm olarak kullanmak için% 3 agar küçük bir parça kesin IC desteklemek için kullanılacak. </li><li> Siyanoakrilat yapıştırıcı ile sahneye yanı sıra onlar 80 o açı oluşturacak şekilde döndürmez kilidin sağ tarafındaki yumru üzerine geri fren Tutkal. </li></ol></li><li> Beyin çıkarın. <ol><li> Derinden bir p12-P20 ketamin 100 mg / kg ve xylaxine 3 mg / kg (veya benzer etik kurul onaylı prosedür) ile (ideal p14-18) fare uyutmak. Not: ayak tutam yanıt eksikliği yoluyla uygun anestezi seviyesini kontrol edin. Hayvan anestezi kısaca altında olduğundan, göz merhem gereksizdir. </li><li> Künt kullanmamakas sona boyun kılıç şeklinde süreci göğüs kafesi maruz. <ol><li> Kılıç şeklinde sürecini bulun ve yaklaşık 1,5 cm yatay kesim yapmak. </li><li> Omuzlar önceki yatay kesilmiş uçlarından iki dikey keser, yaklaşık 1.5 cm Her olun. </li></ol></li><li> Diyafram ve kostokondral birleşme kesti kalbini ortaya çıkarmak. </li><li> Küçük yaylı makas ile, kalp tarafını dorsal ventral gelen, sağ atrium kesilmiş küçük, 2-5 mm yapın. </li><li> 27G x 1/2 inç iğne ile 10 ml şırınga kullanarak, sol ventrikül enjekte ve hızlı bir şekilde yüksek sakaroz kesim çözümü ile hayvan serpmek. </li><li> Kan net çalışır kez baş kaldırmak için büyük makas kullanın. Not: Biz sistematik perfüzyon yararını değerlendirildi değil. Ancak, bizim deneyim, bu genç farelerde transkardiyak perfüzyon neredeyse% 100 başarı ile yapılabilir ve kırmızı bl ortadan kaldırarak fayda varfloresan ve görüntüleme ile müdahale OOD hücreleri. </li><li> Kafatası açığa çıkarmak için orta hat cilt azaltın. </li><li> Bükülmüş iris makas kullanarak, daha sonra gözleri arasındaki kesim, dikkatle altına beyin zarar vermemeye orta hat dikiş alma bakımı boyunca posterior anterior kesilmiş başlayarak, gözler arasındaki kafatası kesti. Not: Dura genellikle kafatası ile kapalı geliyor. Gerekirse, dikkatlice beyni çıkarmadan önce dura kaldırın. </li><li> Kuyumcular forseps kullanarak, manivela kafatası açın ve dikkatlice beyin kaldırmak, sonra çözüm kesme beyin yerleştirin. Korteks zarar vermemek için özen gösterin. </li></ol></li></ol> 2. Dilimleme için Beyin hazırlanması <ol><li> Vibratome sahnede montaj için beyin hazırlamak. <ol><li> 90 o iki çizgi ile işaretlenmiş bir slayt ve alt soldan sağa doğru yukarıdan 17 o da diyagonal bir çizgi kullanarak, iki satır buluştuğu kullanarak, yukarı beyin dorsal yüzü koyun kesenBir jilet, düz bir yüzey oluşturarak rostral ucu beynin 2-4 mm kaldırın. </li><li> Yeni oluşturulan düz bir yüzeye beyin kaudal tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve yatay ve dikey çizgi ile beynin orta hat ile beyin dorsal yüzeyini hizalayın. </li><li> 17 o hattı ile tıraş bıçağı hizalayın 30 o açıyla jilet yatırmak ve bir çift diyagonal kesim (koronal 17 yatay düzleme gelen o ve 60 o) sağ korteks yaklaşık 3 mm kaldırın. </li></ol></li><li> Vibratome sahnede beyin Montaj. <ol><li> Uzun boyut orta hatta dik olacak şekilde filtre kağıdı beynin ventral tarafta 1 cm x 2 cm küçük bir parça yerleştirin. </li><li> Dikkatlice geri dönme kilidi (ve yumru sol) önündeki alanda siyanoakrilat yapıştırıcı madde küçük bir miktar uygulanır. </li><li> Beyin ve Beyin kaudal parçası böylece pr tutkal çift çapraz kesilmiş beyin yüzünü yerleştirinyumru üzerine op ve beynin sağ tarafı Geri döndürmez aykırıdır. </li><li> Ince tüm yüzey dilimleme odası ile temas halinde olmasını sağlamak, beyinde bastırın. </li></ol></li></ol> 3. Colliculo-talamokortikal Dilim Edinme <ol><li> Çabuk, vibratome kesme sahne ve gerçekleşecek çözümü kesme sahne doldurun. </li><li> Beynin üst (ventral tarafı) ile bıçağını aynı hizaya getirin. </li><li> Beynin üst 1-1,5 mm çıkarın 300-500 mikron dilim çıkarın ve kaldırıldıktan sonra derinliğini değerlendirmek. Not: IC, MGB ve lateral genikulat nükleus (LGN) tüm görünür ve dentat girus bir &#39;C&#39; şeklinde iki 600 mikron dilim almak bir oluşturduğu zaman. Şekil 3A bakınız. </li><li> Holding (32 ° C) ısıtılmış odasında Yeri dilimleri. </li></ol> Dilim 4. Görüntüleme <ol><li> Flavoprotein otofloresans görüntüleme için hazırlık. <ol> &lt;li&gt; standart elektrofizyolojik kayıt odasındaki dilim perfüzyon için aCSF hazırlayın,% 95 O 2 /% 5 CO 2 ile kabarcık aCSF. </li><li> Uyarılması için cam elektrot çekin. O çok farklı uyarıcı elektrotlar ve yapılandırmaları (cam, tungsten, karbon fiber, monopoler, bipolar) flavoprotein otofloresans görüntüleme ile tüm iş çok iyi de birlikte unutmayın. </li><li> Bilgisayar, kamera, mikromanipülatör, ışık kaynağı, stimülasyon yazılımı, görüntü yakalama yazılımı açın. </li><li> Odasında dilim yükseltmek için özel köprü (Yan Malzeme kullanılabilir tasarım) yerleştirin oksijenli aCSF ile kayıt odasına serpmek. Not: Perfüzyon oranı kurmak herhangi bir birey ile değişebilir; 5-15 ml / dakika burada kullanılmıştır. </li><li> Inter yollar üzerinde arp dizeleri yerleştirerek önlemek için özen, dilim üzerinde özel olarak inşa harp yerleştirerek köprüden kaldırma gelen dilim önlemek için odasındaki sıvı seviyesini düşürmek, odasında dilim yerleştirinest (Şekil 1A). Dilim yukarıda ve aşağıda aCSF akışını korumak için dilim üzerinde yaklaşık 1-2 mm sıvı seviyesini artırın. Not: konumlandırma gerekiyorsa, kırık uç Pasteur pipet kullanın veya aCSF seviyesi yükselir ve çok dikkatli forseps kullanmanıza izin verir. </li><li> (Şekil 1A bakınız), aCSF ile dolu cam elektrot içine gümüş klorür elektrot yerleştirin mikromanipülatör içine cam elektrot yerleştirin ve izolatör uyarıcı bağlanmak ve dikkatle talamus giden IC / beyaz cevher cam elektrot yerleştirin. </li></ol></li><li> Otofloresans görüntü elde etme flavoprotein. <ol><li> (Sonsuzluk düzeltilmiş 2X makro objektif kullanılarak (NA 0.13)) 4 Hz görüntüleri ve 105 saniye boyunca bir kamera elektriksel uyarıcı olurken (her uyarım 0,05 Hz 40 Hz 2 msn bakliyat doku 1 sn beş kez oluşur) aydınlatırken toplayın mavi ışık 470-490 nm ve 515 nm üstünde yakalayan doku. Görüntü için ne olduğundan emin oluno karanlık, ne de dışarı üflenir bkz Şekil 3 başvuru için sütun bıraktı. Not: Toplama zamanı, toplama sıklığı ve stimülasyon frekansı deney gibi modifiye edilebilir ek materyalleri dahil özel bir program uyacak şekilde değiştirilebilir. </li><li> Matlab ve ek materyalleri mevcut özel yazılı programını kullanarak İhracat görüntüleri 0,05 Hz görüntülerin spektral güç analiz etmek. Ortaya çıkan görüntü Bağlı yollar gösterecektir. Not: Özel bir program görüntü üretmek için bir hızlı Fourier zaman serisinde piksel değerlerinin dönüşümü kullanır. </li></ol></li><li> Kalsiyum görüntüleme için hazırlık. <ol><li> ACSF yaklaşık 32 o C sıcaklığı korumak için bir ısıtma pedi üzerinde üst ve dilimin alt ve yeri hem de ulaşmasını sağlamak için bir 3 cm kültür çanak ve yükseltilmiş kültür membran kullanılarak küçük kuluçka odasına hazırlayın </li><li> % 95 O sıcak aCSF ve yavaş yavaş balonu ile küçük kuluçka odasına doldurun2 /% 5 CO 2. </li><li> 2 pluronik F-127 asit ul DMSO içinde 48 ul içinde çözülmüş, Fura-2AM 50 ug karıştırın. </li><li> Yükseltilmiş zarı ve dikkatli bir mikropipet kullanarak küçük kuluçka odasında Yeri dilim boyama doğrudan MGB yukarıdaki karışımı (veya diğer ilgi yapısını) ekleyin. </li><li> 1 saat - önce görüntüleme beyazlatma önlemek ve dilimler 45 dakika süre ile inkübe izin dilimleri örtün. </li><li> Fazla malzeme yıkayın 10-15 dakika ısıtılmış tutma odasına dilim çıkarın. </li><li> Uyarmak için hazırlık ve görüntü colliculo-talamokortikal dilim için 4.1.6 adımlar 4.1.1 izleyin. </li></ol></li><li> Kalsiyum görüntü elde etme. <ol><li> 365 nm ışık ile doku aydınlatıcı ve 510 nm üstünde floresan çekerken elektriksel 0.2 Hz&#39;de (her uyarım biri 2 msn darbe oluşur) beş kez dokusunu uyarma sırasında 25 saniye boyunca (bir 20X suya daldırma hedefi kullanarak) 10 Hz&#39;de görüntüleri toplayın. </li&gt; <li> Matlab ve yardımcı malzeme mevcut özel yazılı programını kullanarak İhracat görüntüleri 0.2 Hz görüntülerin spektral güç analiz etmek. Ortaya çıkan görüntü, aktif hücrelerin gösterecektir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Llano, D. A., Slater, B. J., Lesicko, A. M., Stebbings, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+auditory+colliculothalamocortical+brain+slice+preparation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An auditory colliculothalamocortical brain slice preparation in mouse.</a> J. Neurosci. 111, 197-207 (2014).</li>
<li>Agmon, A., Connors, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamocortical+responses+of+mouse+somatosensory+%28barrel%29+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro%22%5BJournal%5D)">Thalamocortical responses of mouse somatosensory (barrel) cortex in vitro.</a> Neuro. 41, 365-379 (1991).</li>
<li>Cruikshank, S. J., Rose, H. J., Metherate, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+Thalamocortical+Synaptic+Transmission+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Auditory Thalamocortical Synaptic Transmission In Vitro.</a> J Neurophysiol. 87, 361-384 (2002).</li>
<li>Lee, C. C., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+and+physiology+of+ascending+streams+in+the+auditory+tectothalamic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway.</a> PNAS. 107, 372-377 (2010).</li>
<li>MacLean, J. N., Fenstermaker, V., Watson, B. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+visual+thalamocortical+slice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+meth%22%5BJournal%5D)">A visual thalamocortical slice.</a> Nat meth. 3, 129-134 (2006).</li>
<li>Crabtree, J. W., Isaac, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+intrathalamic+pathways+allowing+modality-related+and+cross-modality+switching+in+the+dorsal+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">New intrathalamic pathways allowing modality-related and cross-modality switching in the dorsal thalamus.</a> J. Neurosci. 22, 8754-8761 (2002).</li>
<li>McAlonan, K., Cavanaugh, J., Wurtz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attentional+Modulation+of+Thalamic+Reticular+Neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Attentional Modulation of Thalamic Reticular Neurons.</a> J. Neurosci. 26, 4444-4450 (2006).</li>
<li>Weese, G. D., Phillips, J. M., Brown, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attentional+Orienting+Is+Impaired+by+Unilateral+Lesions+of+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+in+the+Rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Attentional Orienting Is Impaired by Unilateral Lesions of the Thalamic Reticular Nucleus in the Rat.</a> J. Neurosci. 19, 10135-10139 (1999).</li>
<li>Zikopoulos, B., Barbas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+Projections+to+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+form+a+Unique+Circuit+for+Attentional+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal Projections to the Thalamic Reticular Nucleus form a Unique Circuit for Attentional Mechanisms.</a> J. Neurosci. 26, 7348-7361 (2006).</li>
<li>Kalatsky, V. A., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Paradigm+for+Optical+Imaging%3A+Temporally+Encoded+Maps+of+Intrinsic+Signal%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New Paradigm for Optical Imaging: Temporally Encoded Maps of Intrinsic Signal.</a> Neuron. 38, 529-545 (2003).</li>
<li>Llano, D. A., Turner, J., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+cortical+inhibition+in+an+aging+mouse+model+of+chronic+tinnitus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Diminished cortical inhibition in an aging mouse model of chronic tinnitus.</a> J. Neurosci. 32, 16141-16148 (2012).</li>
<li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+studies+on+auditory+development+in+mammals+in+relation+to+higher+nervous+system+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Behavioural studies on auditory development in mammals in relation to higher nervous system functioning.</a> Acta otolaryngol. 99, 31-40 (1985).</li>
<li>Mikaelian, D., Ruben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+hearing+in+the+normal+CBA-J+mouse%3A+correlation+of+physiological+observations+with+behavioral+responses+and+with+cochlear+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta%22%5BJournal%5D)">Development of hearing in the normal CBA-J mouse: correlation of physiological observations with behavioral responses and with cochlear anatomy.</a> Acta. 59, 451-461 (1965).</li>
</ol>

The authors have nothing to disclose.

This protocol describes improvements upon a previously described colliculo-thalamocortical brain slice in p12-20 mouse to study information flow in the auditory system1. This method has a number of advantages over other, similar, brain slice preparations by retaining connections between more brain areas in a single slice, which gives investigators new tools to understand the interaction and interplay between auditory nuclei in the forebrain. There have been a few key modifications in this protocol, compared to...

Duyusal çevresi ve alt colliculus arasında bilgi ehemmiyetli işlem olmasına rağmen, bu işitsel korteks ulaşmadan önce işitsel sistemde, önemli ölçüde ek bir işlem vardır. Biz işlem yapılması ve bu dönüşüm beyin gelen duyusal bilgileri yorumlamak için izin verir nasıl bu nedenle çok az nasıl hakkında çok az şey biliyoruz. Olfaction hariç, duyuların her biri başlangıçta sinyal korteks yükselir olarak düşmektedir yüksek sadakat ile yönlendirilen periferik sinyaller ile çok benzer bir organizasyona sahiptir. Korteks daha sonra gelen bilgiyi modüle alt yapılarına projeksiyonlar gönderir. Bu karmaşık sistem in vivo hem de in vitro olarak preparatlar bir dizi çeşitli yollarla çalışılmıştır. Eski, tüm bağlantıların duyusal girdileri kontrol ve ölçüm yaparken, bağlantıların herhangi bir set incelemek için araştırmacı sağlayan bozulmamışherhangi bir alanda çıktı. Bu yaklaşımla, yoğun karmaşık çıkış sebebiyet veren, diğer duyusal girdilerin, uyarılma ve dikkat gibi diğer girdilerin, çok çeşitli hiçbir kontrole çok az var. In vitro beyin dilimleri tek bir set ya yakalamak için kesilmiş Araştırmacılar uyarmak ve afferentler veya beyin bölgelerinin çeşitli değerlendirmek için izin projeksiyonlar, ya da iki bağlı beyin alanları,. Bunlar genellikle talamus giriş veya talamus ve korteks onun çıkış ya 2-5 korunur talamokortikal veya tectothalamic ya dilimleri vardır. Bu preparatlar, farmakolojik, elektrik ve Optogenetic manipülasyon geniş bir çeşitliliği için izin verir. Bununla birlikte, sadece iki beyin bölgeleri, esas olarak bilgi aktarımı değerlendirmek ve talamus geçerken bilgi dönüşümünü değerlendirmek için kabiliyetinden yoksundur. Ayrıca dikkat modülasyonunda rol oynayabilir retikülo-talamik projeksiyon, 6-9 prBu dilim ESENT. Burada nasıl talamus kapıları ve filtreler bilgi benzersiz bir perspektif vermek için talamus çeşitli girdilerin araştırmacı kontrolü sağlar önceki hazırlık 1, üzerine iyileştirmeler göstermektedir. Biz çift tek hücre düzeyinde çeşitli girdilerin etkisini ölçmek için dilim bağlantısı ve büyük ölçekli aktivasyon analizi, nöronal nüfus analizi için talamus kalsiyum görüntüleme ve tek bir hücre kayıt değerlendirmek için flavoprotein otofloresans görüntüleme ile bu yeni dilim hazırlanması. Bu yaygın bağlantıları sürdürmek yardımcı olmak için biz de gelişmiş perfüzyon için dilim yükseltmek için yerinde beyin dilim ve bir köprü tutmak için, normal dilim çapa (aka &quot;harp&quot;) olarak değişiklikler bir dizi geliştirdik. Arp dilim çevreleyen ve arp dizeleri için özelleştirilebilir bağlantı noktaları için izin vermek için modifiye edilmiş at nalı şeklinde dizayn edilmiştir. Üç dizeleriEkli i) bir ii) bir AC kaudal kenarına IC kaudal kenarından uzanır ve iii) bir bir alana dilimin iç kenarına gelen diyagonal bir biçimde uzanır, dilim medial kenarı boyunca yatay olarak yer alacağı şekilde AC rostralinde (Şekil 1A bakınız). Dizeleri dilim bütünlüğünü korumaya yardımcı olmak için dilim bir basınç azalması miktarı izin arp (siyanoakrilat yapıştırıcı) ile yapıştırma çerçevede Küçük çentikler (Şekil 1B bakınız). Üç boyutlu baskı kullanarak, dokusu üstünde ve altında yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) ideal akışı için izin benzersiz özellikler, yanı sıra köprülere özel tasarım arp edebiliyoruz. Bu aynı zamanda yama kelepçe elektrofizyoloji için doku nüfuz ışık geniş alanları korur.

<table><tbody><tr><td>High sucrose cutting solution</td><td></td><td></td><td>in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 11.0 glucose, 1.25 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 26 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 0.5 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2.5 KCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>Low calcium aCSF</td><td></td><td></td><td>in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 10.0 glucose, 1.25 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 26 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 1.0 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2.5 KCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>aCSF</td><td></td><td></td><td>in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 10.0 glucose, 1.25 NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 26 NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;, 2.0 CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;, 2.5 KCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>Stimulus Isolator</td><td>World Precision Instruments</td><td>A360</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td>Lot: 1572C502</td></tr><tr><td>Fura-2AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1201</td><td>Lot: 144912</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Life Technologies</td><td>P3000MP</td><td>Lot: 1499369</td></tr><tr><td>Large culture dish</td><td>Fisherbrand</td><td>08-757-13</td><td>100 x 15 mm culture dish</td></tr><tr><td>Small culture dish</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>35 x10 mm culture dish</td></tr><tr><td>Raised culture membrane</td><td>Millicell</td><td>PICMORG50</td><td>Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice.</td></tr><tr><td>Flavoprotein imaging fluorescence cube</td><td>Olympus</td><td>UMNIB</td><td>470&amp;ndash;490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass.&amp;nbsp; We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here.</td></tr><tr><td>Calcium imaging fluorescence cube</td><td>Omega Optical</td><td>BX-18</td><td>XF1005 365 nm exitation, XF2001 400 nm dichroic, XF3080 510 nm emission</td></tr><tr><td>Agar for blocking brain</td><td></td><td></td><td>3% by weight in water</td></tr><tr><td>Viper si Stereo Lithography Apparatus</td><td>3D Systems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modification of a colliculo-thalamocortical mouse brain slice, incorporating 3-d printing of chamber components and multi-scale optical imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

P15 fare elde colliculo talamokortikal fare beyin dilim bir örneği, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. İdeal bir dilim IC uyarıldığında etkinleştirilmiş tüm dört ana orta beyin ve ön beyin işitsel yapılar IC MGB, TRN ve AC içerecektir (Şekil 2A). Fourier analizi kullanarak, spektral güç periyodik ve stimülasyon frekansı 10 sürüklenen olan aktiviteyi gösteren bağlı beyin bölgeleri, elektrik stimülasyonu frekansında ölçülür. Bu protokol, özellikl...

Watch this Scientific Journal Video about Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging at JoVE.com

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

Farklı açılardan kullanarak fare yavru beyin kesmek için, biz büyük işitme orta beyin ve ön beyin yapılarının çoğu arasındaki bağlantıları yakalar önceden açıklanan akut beyin dilim üzerine geliştirmek.

Bir Colliculo-talamokortikal Fare Beyin Dilim modifikasyonu, 3-D Odası Bileşenleri baskı ve Multi-ölçekli Optik Görüntüleme birleştirilerek

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

modification-colliculo-thalamocortical-mouse-brain-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.3K Görüntüleme.  University of Illinois Urbana-Champaign.  Farklı açılardan kullanarak fare yavru beyin kesmek için, biz büyük işitme orta beyin ve ön beyin yapılarının çoğu arasındaki bağlantıları yakalar önceden açıklanan akut beyin dilim üzerine geliştirmek. 

Video: Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The technique presented here allows the imaging of the same area of the brain at several time points (chronic imaging) with microscopic resolution allowing the tracking of dendritic spines which are the small structures that represent the majority of postsynaptic excitatory sites in the CNS. The ability to clearly resolve fine cortical structures over several time points has many advantages, specifically in the study of brain plasticity in which morphological changes at synapses and circuit remodeling may help explain underlying mechanisms. In this video and supplementary material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation. The thinned-skull preparation is a minimally invasive approach, which avoids potential damage to the dura and/or cortex, thus reducing the onset of an inflammatory response. When this protocol is performed correctly, it is possible to clearly monitor changes in dendritic spine characteristics in the intact brain over a prolonged period of time.

In this video and supplemental material, we show a protocol for chronic in vivo imaging of the intact brain using a thinned-skull preparation.

Fare Visual Cortex İnceltilen kafatası Hazırlık Kronik Görüntüleme

In vivo imaging using two-photon laser scanning microscopy (2PLSM) allows the study of living cells and neuronal processes in the intact brain. The ...

Nörobilim

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical neurons with two-photon microscopy has provided unique insights into cortical structure, function and plasticity. However, these studies are limited to head fixed animals, greatly reducing the behavioral complexity available for study. In this paper, we describe a procedure for performing chronic fluorescence microscopy with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely behaving mice. We used an integrated miniaturized fluorescence microscope paired with an implanted prism probe to simultaneously visualize and record the calcium dynamics of hundreds of neurons across multiple layers of the somatosensory cortex as the mouse engaged in a novel object exploration task, over several days. This technique can be adapted to other brain regions in different animal species for other behavioral paradigms.

Multi-layer Cortical Ca2+ Imaging in Freely Moving Mice with Prism Probes and Miniaturized Fluorescence Microscopy

Here, we present a procedure for performing large-scale Ca2+ imaging with cellular-resolution across multiple cortical layers in freely moving mice. Hundreds of active cells can be observed simultaneously using a miniature, head-mounted microscope coupled with an implanted prism probe.

Çok Katlı Kortikal Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Prizmatik Problar ve Minyatür Floresan Mikroskopi ile Serbestçe Hareketli Fare Görüntüleme

In vivo circuit and cellular level functional imaging is a critical tool for understanding the brain in action. High resolution imaging of mouse cortical ...

Davranış

A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse Brain

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form a polished and reinforced thinned skull (PoRTS) window in the mouse skull that spans several millimeters in diameter and is stable for months. The skull is thinned to 10 to 15 &mu;m in thickness with a hand held drill to achieve optical clarity, and is then overlaid with cyanoacrylate glue and a cover glass to: 1) provide rigidity, 2) inhibit bone regrowth and 3) reduce light scattering from irregularities on the bone surface. Since the skull is not breached, any inflammation that could affect the process being studied is greatly reduced. Imaging depths of up to 250 &mu;m below the cortical surface can be achieved using two-photon laser scanning microscopy. This window is well suited to study cerebral blood flow and cellular function in both anesthetized and awake preparations. It further offers the opportunity to manipulate cell activity using optogenetics or to disrupt blood flow in targeted vessels by irradiation of circulating photosensitizers.

We present a method to form an imaging window in the mouse skull that spans millimeters and is stable for months without inflammation of the brain. This method is well suited for longitudinal studies of blood flow, cellular dynamics, and cell/vascular structure using two-photon microscopy.

Fare Beyin Uzun vadeli Görüntüleme için Parlak ve Takviyeli inceltilmiş-kafatası Pencere

In vivo imaging of cortical function requires optical access to the brain without disruption of the intracranial environment. We present a method to form ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Eşodaklı Işık Sac Mikroskobu ile Tüm Fare Brain mikron çaplı Çözünürlük Optik Tomografi

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Large-scale Three-dimensional Imaging of Cellular Organization in the Mouse Neocortex

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical properties, synaptic connections, and in vivo functions, but their basic functional and anatomical organization from cellular to network scale is poorly understood. Here we describe a method for the three-dimensional imaging of fluorescently-labeled neurons across large areas of the brain for the investigation of the cortical cellular organization. Specific types of neurons are labeled by the injection of fluorescent retrograde neuronal tracers or expression of fluorescent proteins in transgenic mice. Block brain samples, e.g., a hemisphere, are prepared after fixation, made transparent with tissue clearing methods, and subjected to fluorescent immunolabeling of the specific cell types. Large areas are scanned using confocal or two-photon microscopes equipped with large working distance objectives and motorized stages. This method can resolve the periodic organization of the cell type-specific microcolumn functional modules in the mouse neocortex. The procedure can be useful for the study of three-dimensional cellular architecture in the diverse brain areas and other complex tissues.

Here we describe a procedure for tissue clearing, fluorescent labeling, and large-scale imaging of mouse brain tissue which, thereby, enables visualization of the three-dimensional organization of cell types in the neocortex.

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

The mammalian neocortex is composed of many types of excitatory and inhibitory neurons, each with specific electrophysiological and biochemical ...

Wide-field Single-photon Optical Recording in Brain Slices Using Voltage-sensitive Dye

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural circuits. Due to the fractional change in the light signal, it has been difficult to use this method as a quantitative assay. This article describes special optics and slice handling systems, which render this technique stable and reliable. The present article demonstrates the slice handling, staining, and recording of the VSD-stained hippocampal slices in detail. The system maintains physiological conditions for a long time, with good staining, and prevents mechanical movements of the slice during the recordings. Moreover, it enables staining of slices with a small amount of the dye. The optics achieve high numerical aperture at low magnification, which allows recording of the VSD signal at the maximum frame rate of 10 kHz, with 100 pixel x 100-pixel spatial resolution. Due to the high frame rate and spatial resolution, this technique allows application of the post-recording filters that provide sufficient signal-to-noise ratio to assess the changes in neural circuits.

We introduce a reproducible and stable optical recording method for brain slices using voltage-sensitive dye. The article describes voltage-sensitive dye staining and recording of optical signals using conventional hippocampal slice preparations.

Gerilim duyarlı boya kullanarak beyin dilimleri geniş alan tek foton optik kayıt

Wide-field single photon voltage-sensitive dye (VSD) imaging of brain slice preparations is a useful tool to assess the functional connectivity in neural ...

A Tissue Clearing Method for Neuronal Imaging from Mesoscopic to Microscopic Scales

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging from neural circuits to subcellular neuronal structures are visualized in mouse brain slices optically cleared with ScaleSF. This clearing method is a modified version of ScaleS and is a hydrophilic tissue clearing method for tissue slices that achieves potent clearing capability as well as a high-level of preservation of fluorescence signals and structural integrity. A customizable three dimensional (3D)-printed imaging chamber is designed for reliable mounting of cleared brain tissues. Mouse brains injected with an adeno-associated virus vector carrying enhanced green fluorescent protein gene were fixed with 4% paraformaldehyde and cut into slices of 1-mm thickness with a vibrating tissue slicer. The brain slices were cleared by following the clearing protocol, which include sequential incubations in three solutions, namely, ScaleS0 solution, phosphate buffer saline (&#8211;), and ScaleS4 solution, for a total of 10.5&#8211;14.5 h. The cleared brain slices were mounted on the imaging chamber and embedded in 1.5% agarose gel dissolved in ScaleS4D25(0) solution. The 3D image acquisition of the slices was carried out using a confocal laser scanning microscope equipped with a multi-immersion objective lens of a long working distance. Beginning with mesoscopic neuronal imaging, we succeeded in visualizing fine subcellular neuronal structures, such as dendritic spines and axonal boutons, in the optically cleared brain slices. This protocol would facilitate understanding of neuronal structures from circuit to subcellular component scales.

The protocol provides a detailed method of neuronal imaging in brain slice using a tissue clearing method, ScaleSF. The protocol includes brain tissue preparation, tissue clarification, handling of cleared slices and confocal laser scanning microscopy imaging of neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels.

Mezoskopikten Mikroskobik Ölçeklere Nöronal Görüntüleme için Bir Doku Temizleme Yöntemi

A detailed protocol is provided here to visualize neuronal structures from mesoscopic to microscopic levels in brain tissues. Neuronal structures ranging ...

Superior Colliculus'ta İki Foton ve Geniş Alan Kalsiyum Görüntüleme

Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the emergence of the cerebral cortex. It receives direct inputs from ~30 types of retinal ganglion cells (RGCs), with each encoding a specific visual feature. It remains elusive whether the SC simply inherits retinal features or if additional and potentially de novo processing occurs in the SC. To reveal the neural coding of visual information in the SC, we provide here a detailed protocol to optically record visual responses with two complementary methods in awake mice. One method uses two-photon microscopy to image calcium activity at single-cell resolution without ablating the overlaying cortex, while the other uses wide-field microscopy to image the whole SC of a mutant mouse whose cortex is largely undeveloped. This protocol details these two methods, including animal preparation, viral injection, headplate implantation, plug implantation, data acquisition, and data analysis. The representative results show that the two-photon calcium imaging reveals visually evoked neuronal responses at single-cell resolution, and the wide-field calcium imaging reveals&#160;neural activity across the entire SC. By combining these two methods, one can reveal the neural coding in the SC at different scales, and such combination can also be applied to other brain regions.

Yazar Gündemi: Superior Colliculus'ta Nöral Kodlamanın ve Görsel İşleme Mekanizmalarının Ortaya Çıkarılması 

This protocol details the procedure for imaging calcium responses in the superior colliculus (SC) of awake mice, including imaging single-neuron activity with two-photon microscopy while leaving the cortex intact in wild-type mice, and imaging the entire SC with wide-field microscopy in partial-cortex mutant mice.

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

The superior colliculus (SC), an evolutionarily conserved midbrain structure in all vertebrates, is the most sophisticated visual center before the ...

Bir Colliculo-talamokortikal Fare Beyin Dilim modifikasyonu, 3-D Odası Bileşenleri baskı ve Multi-ölçekli Optik Görüntüleme birleştirilerek

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Fare Visual Cortex İnceltilen kafatası Hazırlık Kronik Görüntüleme

Çok Katlı Kortikal Ca

Fare Beyin Uzun vadeli Görüntüleme için Parlak ve Takviyeli inceltilmiş-kafatası Pencere

Eşodaklı Işık Sac Mikroskobu ile Tüm Fare Brain mikron çaplı Çözünürlük Optik Tomografi

Hücresel Örgütü fare yeni korteksimiz yılında büyük ölçekli üç boyutlu görüntüleme

Gerilim duyarlı boya kullanarak beyin dilimleri geniş alan tek foton optik kayıt

Mezoskopikten Mikroskobik Ölçeklere Nöronal Görüntüleme için Bir Doku Temizleme Yöntemi

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme

Fare Superior Colliculus'ta Kalsiyum Görüntüleme