This work was partially supported by National Institute of Deafness and Other Communications Disorders Awards R03-DC-012125 to D. A. Llano and F31-DC-013501 to B. J. Slater as well as the Carver Foundation.
The authors would like to thank Jason MacLean and Matthew Banks for technical advice with calcium imaging.

Tüm işlemler Illinois Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi. Bütün hayvanlar Laboratuar Hayvan Bakımı Akreditasyon Amerikan Derneği tarafından onaylanan hayvan bakım tesislerinde yerleştirildiler. Her girişimi kullanılan hayvanların sayısını en aza indirmek ve çalışmanın her aşamasında acıları azaltmak için yapıldı. Ve Dilimleme için Mouse Beyin çıkarılması 1. Hazırlık <ol><li> Perfüzyon ve dilim inkübasyon için hazırlayın. <ol><li> Yaklaşık 30 dakika dilimleme önce, kayıt veya görüntüleme öncesinde dilim kuluçka için yüksek sakaroz kesim çözümü ve düşük kalsiyum aCSF hazırlar. </li><li> Gerekli tüm araçları (büyük kör uç makas, küçük yaylı makas, anatomik forseps, büyük makas ya da giyotin, iris makas, kuyumcular forseps, 27G x 1/2 inç iğne ile 10 ml şırınga, 1 cm x 2 cm filtresi küçük bir parça dışarı Lay Kağıt ve sl için bir kırık uçlu Pasteur pipetiperfüzyon ve dilimleme ve perfüzyon tepsisini hazırlamak için buz transferi). </li><li> 32 o C su banyosunda ve çözüm kesim ile dolu bir kültür çanak oksijenli aCSF odasını kuluçka ayarlayın. </li></ol></li><li> Dilimleme için sahne kesme hazırlayın. <ol><li> Yaklaşık 1 cm 3 yumru bir beyin için Geri döndürmez ve 1,5 cm x 1,5 mm x 3 mm olarak kullanmak için% 3 agar küçük bir parça kesin IC desteklemek için kullanılacak. </li><li> Siyanoakrilat yapıştırıcı ile sahneye yanı sıra onlar 80 o açı oluşturacak şekilde döndürmez kilidin sağ tarafındaki yumru üzerine geri fren Tutkal. </li></ol></li><li> Beyin çıkarın. <ol><li> Derinden bir p12-P20 ketamin 100 mg / kg ve xylaxine 3 mg / kg (veya benzer etik kurul onaylı prosedür) ile (ideal p14-18) fare uyutmak. Not: ayak tutam yanıt eksikliği yoluyla uygun anestezi seviyesini kontrol edin. Hayvan anestezi kısaca altında olduğundan, göz merhem gereksizdir. </li><li> Künt kullanmamakas sona boyun kılıç şeklinde süreci göğüs kafesi maruz. <ol><li> Kılıç şeklinde sürecini bulun ve yaklaşık 1,5 cm yatay kesim yapmak. </li><li> Omuzlar önceki yatay kesilmiş uçlarından iki dikey keser, yaklaşık 1.5 cm Her olun. </li></ol></li><li> Diyafram ve kostokondral birleşme kesti kalbini ortaya çıkarmak. </li><li> Küçük yaylı makas ile, kalp tarafını dorsal ventral gelen, sağ atrium kesilmiş küçük, 2-5 mm yapın. </li><li> 27G x 1/2 inç iğne ile 10 ml şırınga kullanarak, sol ventrikül enjekte ve hızlı bir şekilde yüksek sakaroz kesim çözümü ile hayvan serpmek. </li><li> Kan net çalışır kez baş kaldırmak için büyük makas kullanın. Not: Biz sistematik perfüzyon yararını değerlendirildi değil. Ancak, bizim deneyim, bu genç farelerde transkardiyak perfüzyon neredeyse% 100 başarı ile yapılabilir ve kırmızı bl ortadan kaldırarak fayda varfloresan ve görüntüleme ile müdahale OOD hücreleri. </li><li> Kafatası açığa çıkarmak için orta hat cilt azaltın. </li><li> Bükülmüş iris makas kullanarak, daha sonra gözleri arasındaki kesim, dikkatle altına beyin zarar vermemeye orta hat dikiş alma bakımı boyunca posterior anterior kesilmiş başlayarak, gözler arasındaki kafatası kesti. Not: Dura genellikle kafatası ile kapalı geliyor. Gerekirse, dikkatlice beyni çıkarmadan önce dura kaldırın. </li><li> Kuyumcular forseps kullanarak, manivela kafatası açın ve dikkatlice beyin kaldırmak, sonra çözüm kesme beyin yerleştirin. Korteks zarar vermemek için özen gösterin. </li></ol></li></ol> 2. Dilimleme için Beyin hazırlanması <ol><li> Vibratome sahnede montaj için beyin hazırlamak. <ol><li> 90 o iki çizgi ile işaretlenmiş bir slayt ve alt soldan sağa doğru yukarıdan 17 o da diyagonal bir çizgi kullanarak, iki satır buluştuğu kullanarak, yukarı beyin dorsal yüzü koyun kesenBir jilet, düz bir yüzey oluşturarak rostral ucu beynin 2-4 mm kaldırın. </li><li> Yeni oluşturulan düz bir yüzeye beyin kaudal tarafı yukarı bakacak şekilde yerleştirin ve yatay ve dikey çizgi ile beynin orta hat ile beyin dorsal yüzeyini hizalayın. </li><li> 17 o hattı ile tıraş bıçağı hizalayın 30 o açıyla jilet yatırmak ve bir çift diyagonal kesim (koronal 17 yatay düzleme gelen o ve 60 o) sağ korteks yaklaşık 3 mm kaldırın. </li></ol></li><li> Vibratome sahnede beyin Montaj. <ol><li> Uzun boyut orta hatta dik olacak şekilde filtre kağıdı beynin ventral tarafta 1 cm x 2 cm küçük bir parça yerleştirin. </li><li> Dikkatlice geri dönme kilidi (ve yumru sol) önündeki alanda siyanoakrilat yapıştırıcı madde küçük bir miktar uygulanır. </li><li> Beyin ve Beyin kaudal parçası böylece pr tutkal çift çapraz kesilmiş beyin yüzünü yerleştirinyumru üzerine op ve beynin sağ tarafı Geri döndürmez aykırıdır. </li><li> Ince tüm yüzey dilimleme odası ile temas halinde olmasını sağlamak, beyinde bastırın. </li></ol></li></ol> 3. Colliculo-talamokortikal Dilim Edinme <ol><li> Çabuk, vibratome kesme sahne ve gerçekleşecek çözümü kesme sahne doldurun. </li><li> Beynin üst (ventral tarafı) ile bıçağını aynı hizaya getirin. </li><li> Beynin üst 1-1,5 mm çıkarın 300-500 mikron dilim çıkarın ve kaldırıldıktan sonra derinliğini değerlendirmek. Not: IC, MGB ve lateral genikulat nükleus (LGN) tüm görünür ve dentat girus bir &#39;C&#39; şeklinde iki 600 mikron dilim almak bir oluşturduğu zaman. Şekil 3A bakınız. </li><li> Holding (32 ° C) ısıtılmış odasında Yeri dilimleri. </li></ol> Dilim 4. Görüntüleme <ol><li> Flavoprotein otofloresans görüntüleme için hazırlık. <ol> &lt;li&gt; standart elektrofizyolojik kayıt odasındaki dilim perfüzyon için aCSF hazırlayın,% 95 O 2 /% 5 CO 2 ile kabarcık aCSF. </li><li> Uyarılması için cam elektrot çekin. O çok farklı uyarıcı elektrotlar ve yapılandırmaları (cam, tungsten, karbon fiber, monopoler, bipolar) flavoprotein otofloresans görüntüleme ile tüm iş çok iyi de birlikte unutmayın. </li><li> Bilgisayar, kamera, mikromanipülatör, ışık kaynağı, stimülasyon yazılımı, görüntü yakalama yazılımı açın. </li><li> Odasında dilim yükseltmek için özel köprü (Yan Malzeme kullanılabilir tasarım) yerleştirin oksijenli aCSF ile kayıt odasına serpmek. Not: Perfüzyon oranı kurmak herhangi bir birey ile değişebilir; 5-15 ml / dakika burada kullanılmıştır. </li><li> Inter yollar üzerinde arp dizeleri yerleştirerek önlemek için özen, dilim üzerinde özel olarak inşa harp yerleştirerek köprüden kaldırma gelen dilim önlemek için odasındaki sıvı seviyesini düşürmek, odasında dilim yerleştirinest (Şekil 1A). Dilim yukarıda ve aşağıda aCSF akışını korumak için dilim üzerinde yaklaşık 1-2 mm sıvı seviyesini artırın. Not: konumlandırma gerekiyorsa, kırık uç Pasteur pipet kullanın veya aCSF seviyesi yükselir ve çok dikkatli forseps kullanmanıza izin verir. </li><li> (Şekil 1A bakınız), aCSF ile dolu cam elektrot içine gümüş klorür elektrot yerleştirin mikromanipülatör içine cam elektrot yerleştirin ve izolatör uyarıcı bağlanmak ve dikkatle talamus giden IC / beyaz cevher cam elektrot yerleştirin. </li></ol></li><li> Otofloresans görüntü elde etme flavoprotein. <ol><li> (Sonsuzluk düzeltilmiş 2X makro objektif kullanılarak (NA 0.13)) 4 Hz görüntüleri ve 105 saniye boyunca bir kamera elektriksel uyarıcı olurken (her uyarım 0,05 Hz 40 Hz 2 msn bakliyat doku 1 sn beş kez oluşur) aydınlatırken toplayın mavi ışık 470-490 nm ve 515 nm üstünde yakalayan doku. Görüntü için ne olduğundan emin oluno karanlık, ne de dışarı üflenir bkz Şekil 3 başvuru için sütun bıraktı. Not: Toplama zamanı, toplama sıklığı ve stimülasyon frekansı deney gibi modifiye edilebilir ek materyalleri dahil özel bir program uyacak şekilde değiştirilebilir. </li><li> Matlab ve ek materyalleri mevcut özel yazılı programını kullanarak İhracat görüntüleri 0,05 Hz görüntülerin spektral güç analiz etmek. Ortaya çıkan görüntü Bağlı yollar gösterecektir. Not: Özel bir program görüntü üretmek için bir hızlı Fourier zaman serisinde piksel değerlerinin dönüşümü kullanır. </li></ol></li><li> Kalsiyum görüntüleme için hazırlık. <ol><li> ACSF yaklaşık 32 o C sıcaklığı korumak için bir ısıtma pedi üzerinde üst ve dilimin alt ve yeri hem de ulaşmasını sağlamak için bir 3 cm kültür çanak ve yükseltilmiş kültür membran kullanılarak küçük kuluçka odasına hazırlayın </li><li> % 95 O sıcak aCSF ve yavaş yavaş balonu ile küçük kuluçka odasına doldurun2 /% 5 CO 2. </li><li> 2 pluronik F-127 asit ul DMSO içinde 48 ul içinde çözülmüş, Fura-2AM 50 ug karıştırın. </li><li> Yükseltilmiş zarı ve dikkatli bir mikropipet kullanarak küçük kuluçka odasında Yeri dilim boyama doğrudan MGB yukarıdaki karışımı (veya diğer ilgi yapısını) ekleyin. </li><li> 1 saat - önce görüntüleme beyazlatma önlemek ve dilimler 45 dakika süre ile inkübe izin dilimleri örtün. </li><li> Fazla malzeme yıkayın 10-15 dakika ısıtılmış tutma odasına dilim çıkarın. </li><li> Uyarmak için hazırlık ve görüntü colliculo-talamokortikal dilim için 4.1.6 adımlar 4.1.1 izleyin. </li></ol></li><li> Kalsiyum görüntü elde etme. <ol><li> 365 nm ışık ile doku aydınlatıcı ve 510 nm üstünde floresan çekerken elektriksel 0.2 Hz&#39;de (her uyarım biri 2 msn darbe oluşur) beş kez dokusunu uyarma sırasında 25 saniye boyunca (bir 20X suya daldırma hedefi kullanarak) 10 Hz&#39;de görüntüleri toplayın. </li&gt; <li> Matlab ve yardımcı malzeme mevcut özel yazılı programını kullanarak İhracat görüntüleri 0.2 Hz görüntülerin spektral güç analiz etmek. Ortaya çıkan görüntü, aktif hücrelerin gösterecektir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Llano, D. A., Slater, B. J., Lesicko, A. M., Stebbings, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+auditory+colliculothalamocortical+brain+slice+preparation+in+mouse.">An auditory colliculothalamocortical brain slice preparation in mouse.</a> J. Neurosci. 111, 197-207 (2014).</li><li>Agmon, A., Connors, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thalamocortical+responses+of+mouse+somatosensory+(barrel)+cortex+in+vitro.">Thalamocortical responses of mouse somatosensory (barrel) cortex in vitro.</a> Neuro. 41, 365-379 (1991).</li><li>Cruikshank, S. J., Rose, H. J., Metherate, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+Thalamocortical+Synaptic+Transmission+In+Vitro.">Auditory Thalamocortical Synaptic Transmission In Vitro.</a> J Neurophysiol. 87, 361-384 (2002).</li><li>Lee, C. C., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topography+and+physiology+of+ascending+streams+in+the+auditory+tectothalamic+pathway.">Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway.</a> PNAS. 107, 372-377 (2010).</li><li>MacLean, J. N., Fenstermaker, V., Watson, B. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+thalamocortical+slice.">A visual thalamocortical slice.</a> Nat meth. 3, 129-134 (2006).</li><li>Crabtree, J. W., Isaac, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+intrathalamic+pathways+allowing+modality-related+and+cross-modality+switching+in+the+dorsal+thalamus.">New intrathalamic pathways allowing modality-related and cross-modality switching in the dorsal thalamus.</a> J. Neurosci. 22, 8754-8761 (2002).</li><li>McAlonan, K., Cavanaugh, J., Wurtz, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attentional+Modulation+of+Thalamic+Reticular+Neurons.">Attentional Modulation of Thalamic Reticular Neurons.</a> J. Neurosci. 26, 4444-4450 (2006).</li><li>Weese, G. D., Phillips, J. M., Brown, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Attentional+Orienting+Is+Impaired+by+Unilateral+Lesions+of+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+in+the+Rat.">Attentional Orienting Is Impaired by Unilateral Lesions of the Thalamic Reticular Nucleus in the Rat.</a> J. Neurosci. 19, 10135-10139 (1999).</li><li>Zikopoulos, B., Barbas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+Projections+to+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+form+a+Unique+Circuit+for+Attentional+Mechanisms.">Prefrontal Projections to the Thalamic Reticular Nucleus form a Unique Circuit for Attentional Mechanisms.</a> J. Neurosci. 26, 7348-7361 (2006).</li><li>Kalatsky, V. A., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Paradigm+for+Optical+Imaging:+Temporally+Encoded+Maps+of+Intrinsic+Signal.">New Paradigm for Optical Imaging: Temporally Encoded Maps of Intrinsic Signal.</a> Neuron. 38, 529-545 (2003).</li><li>Llano, D. A., Turner, J., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diminished+cortical+inhibition+in+an+aging+mouse+model+of+chronic+tinnitus.">Diminished cortical inhibition in an aging mouse model of chronic tinnitus.</a> J. Neurosci. 32, 16141-16148 (2012).</li><li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioural+studies+on+auditory+development+in+mammals+in+relation+to+higher+nervous+system+functioning.">Behavioural studies on auditory development in mammals in relation to higher nervous system functioning.</a> Acta otolaryngol. 99, 31-40 (1985).</li><li>Mikaelian, D., Ruben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+hearing+in+the+normal+CBA-J+mouse:+correlation+of+physiological+observations+with+behavioral+responses+and+with+cochlear+anatomy.">Development of hearing in the normal CBA-J mouse: correlation of physiological observations with behavioral responses and with cochlear anatomy.</a> Acta. 59, 451-461 (1965).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

This protocol describes improvements upon a previously described colliculo-thalamocortical brain slice in p12-20 mouse to study information flow in the auditory system1. This method has a number of advantages over other, similar, brain slice preparations by retaining connections between more brain areas in a single slice, which gives investigators new tools to understand the interaction and interplay between auditory nuclei in the forebrain. There have been a few key modifications in this protocol, compared to...

Duyusal çevresi ve alt colliculus arasında bilgi ehemmiyetli işlem olmasına rağmen, bu işitsel korteks ulaşmadan önce işitsel sistemde, önemli ölçüde ek bir işlem vardır. Biz işlem yapılması ve bu dönüşüm beyin gelen duyusal bilgileri yorumlamak için izin verir nasıl bu nedenle çok az nasıl hakkında çok az şey biliyoruz. Olfaction hariç, duyuların her biri başlangıçta sinyal korteks yükselir olarak düşmektedir yüksek sadakat ile yönlendirilen periferik sinyaller ile çok benzer bir organizasyona sahiptir. Korteks daha sonra gelen bilgiyi modüle alt yapılarına projeksiyonlar gönderir. Bu karmaşık sistem in vivo hem de in vitro olarak preparatlar bir dizi çeşitli yollarla çalışılmıştır. Eski, tüm bağlantıların duyusal girdileri kontrol ve ölçüm yaparken, bağlantıların herhangi bir set incelemek için araştırmacı sağlayan bozulmamışherhangi bir alanda çıktı. Bu yaklaşımla, yoğun karmaşık çıkış sebebiyet veren, diğer duyusal girdilerin, uyarılma ve dikkat gibi diğer girdilerin, çok çeşitli hiçbir kontrole çok az var. In vitro beyin dilimleri tek bir set ya yakalamak için kesilmiş Araştırmacılar uyarmak ve afferentler veya beyin bölgelerinin çeşitli değerlendirmek için izin projeksiyonlar, ya da iki bağlı beyin alanları,. Bunlar genellikle talamus giriş veya talamus ve korteks onun çıkış ya 2-5 korunur talamokortikal veya tectothalamic ya dilimleri vardır. Bu preparatlar, farmakolojik, elektrik ve Optogenetic manipülasyon geniş bir çeşitliliği için izin verir. Bununla birlikte, sadece iki beyin bölgeleri, esas olarak bilgi aktarımı değerlendirmek ve talamus geçerken bilgi dönüşümünü değerlendirmek için kabiliyetinden yoksundur. Ayrıca dikkat modülasyonunda rol oynayabilir retikülo-talamik projeksiyon, 6-9 prBu dilim ESENT. Burada nasıl talamus kapıları ve filtreler bilgi benzersiz bir perspektif vermek için talamus çeşitli girdilerin araştırmacı kontrolü sağlar önceki hazırlık 1, üzerine iyileştirmeler göstermektedir. Biz çift tek hücre düzeyinde çeşitli girdilerin etkisini ölçmek için dilim bağlantısı ve büyük ölçekli aktivasyon analizi, nöronal nüfus analizi için talamus kalsiyum görüntüleme ve tek bir hücre kayıt değerlendirmek için flavoprotein otofloresans görüntüleme ile bu yeni dilim hazırlanması. Bu yaygın bağlantıları sürdürmek yardımcı olmak için biz de gelişmiş perfüzyon için dilim yükseltmek için yerinde beyin dilim ve bir köprü tutmak için, normal dilim çapa (aka &quot;harp&quot;) olarak değişiklikler bir dizi geliştirdik. Arp dilim çevreleyen ve arp dizeleri için özelleştirilebilir bağlantı noktaları için izin vermek için modifiye edilmiş at nalı şeklinde dizayn edilmiştir. Üç dizeleriEkli i) bir ii) bir AC kaudal kenarına IC kaudal kenarından uzanır ve iii) bir bir alana dilimin iç kenarına gelen diyagonal bir biçimde uzanır, dilim medial kenarı boyunca yatay olarak yer alacağı şekilde AC rostralinde (Şekil 1A bakınız). Dizeleri dilim bütünlüğünü korumaya yardımcı olmak için dilim bir basınç azalması miktarı izin arp (siyanoakrilat yapıştırıcı) ile yapıştırma çerçevede Küçük çentikler (Şekil 1B bakınız). Üç boyutlu baskı kullanarak, dokusu üstünde ve altında yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) ideal akışı için izin benzersiz özellikler, yanı sıra köprülere özel tasarım arp edebiliyoruz. Bu aynı zamanda yama kelepçe elektrofizyoloji için doku nüfuz ışık geniş alanları korur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>High sucrose cutting solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in mM: 206 sucrose, 10.0 MgCl2, 11.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 0.5 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low calcium aCSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in mM: 126 NaCl, 3.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>aCSF</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>in mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucose, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulus Isolator</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>A360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>D12345</td>
			<td>Lot: 1572C502</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fura-2AM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>F1201</td>
			<td>Lot: 144912</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>Lot: 1499369</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large culture dish</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>08-757-13</td>
			<td>100x15mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small culture dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td align="right">353001</td>
			<td>35x10mm culture dish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Raised culture membrane</td>
			<td>Millicell</td>
			<td>PICMORG50</td>
			<td>Used to maintain oxygenated fluid perfusion on both sides of slice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flavoprotein imaging fluorescence cube</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>UMNIB</td>
			<td>470&#8211;490 nm excitation, 505 nm dichroic, 515 nm emission long pass.&#160; We have found that virtually any green fluorescence protein filter cube will work here.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium imaging fluorescence cube</td>
			<td>Omega Optical</td>
			<td>BX-18</td>
			<td>XF1005 365nm exitation, XF2001 400nm dichroic, XF3080 510nm emission</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar for blocking brain</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>3% by weight in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Viper si Stereo Lithography Apparatus</td>
			<td>3D Systems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

modification of a colliculo-thalamocortical mouse brain slice, incorporating 3-d printing of chamber components and multi-scale optical imaging

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study these two systems and how they interact has been with the use of in vivo preparations. Major advances have been made with acute brain slices containing the thalamocortical and cortico-thalamic pathways in the somatosensory, visual, and auditory systems. With key refinements to our recent modification of the auditory thalamocortical slice1, we are able to more reliably capture the projections between most of the major auditory midbrain and forebrain structures: the inferior colliculus (IC), medial geniculate body (MGB), thalamic reticular nucleus (TRN), and the auditory cortex (AC). With portions of all these connections retained, we are able to answer detailed questions that complement the questions that can be answered with in vivo preparations. The use of flavoprotein autofluorescence imaging enables us to rapidly assess connectivity in any given slice and guide the ensuing experiment. Using this slice in conjunction with recording and imaging techniques, we are now better equipped to understand how information processing occurs at each point in the auditory forebrain as information ascends to the cortex, and the impact of descending cortical modulation. 3-D printing to build slice chamber components permits double-sided perfusion and broad access to networks within the slice and maintains the widespread connections key to fully utilizing this preparation.

P15 fare elde colliculo talamokortikal fare beyin dilim bir örneği, Şekil 2&#39;de gösterilmiştir. İdeal bir dilim IC uyarıldığında etkinleştirilmiş tüm dört ana orta beyin ve ön beyin işitsel yapılar IC MGB, TRN ve AC içerecektir (Şekil 2A). Fourier analizi kullanarak, spektral güç periyodik ve stimülasyon frekansı 10 sürüklenen olan aktiviteyi gösteren bağlı beyin bölgeleri, elektrik stimülasyonu frekansında ölçülür. Bu protokol, özellikl...

Watch this Scientific Journal Video about Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging at JoVE.com

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

Farklı açılardan kullanarak fare yavru beyin kesmek için, biz büyük işitme orta beyin ve ön beyin yapılarının çoğu arasındaki bağlantıları yakalar önceden açıklanan akut beyin dilim üzerine geliştirmek.

Bir Colliculo-talamokortikal Fare Beyin Dilim modifikasyonu, 3-D Odası Bileşenleri baskı ve Multi-ölçekli Optik Görüntüleme birleştirilerek

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

modification-colliculo-thalamocortical-mouse-brain-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.2K Görüntüleme.  University of Illinois Urbana-Champaign.  Farklı açılardan kullanarak fare yavru beyin kesmek için, biz büyük işitme orta beyin ve ön beyin yapılarının çoğu arasındaki bağlantıları yakalar önceden açıklanan akut beyin dilim üzerine geliştirmek. 

Video: Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

Bozulmamış 3-D Beyin Devrelerin Hedefleme Viral için Ölçeklenebilir akışkan Enjektör Diziler

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Nörobilim

Multiple-mouse Neuroanatomical Magnetic Resonance Imaging

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and evaluating mouse models of human disease. MRI is an excellent modality for investigating genetically altered animals. It is capable of whole brain coverage, can be used in vivo, and provides multiple contrast mechanisms for investigating different aspects of neuranatomy and physiology. The advent of high-field scanners along with the ability to scan multiple mice simultaneously allows for rapid phenotyping of novel mutations.
Effective mouse MRI studies require attention to many aspects of experiment design. In this article, we will describe general methods to acquire quality images for mouse phenotyping using a system that images mice concurrently in shielded transmit/receive radio frequency (RF) coils in a common magnet (Bock et al., 2003). We focus particularly on anatomical phenotyping, an important and accessible application that has shown a high potential for impact in many mouse models at our imaging centre. Before we can provide the detailed steps to acquire such images, there are important practical considerations for both in vivo brain imaging (Dazai et al., 2004) and ex vivo brain imaging (Spring et al., 2007) that should be noted. These are discussed below.

Magnetic resonance imaging (MRI) has become an increasingly popular tool for examining the phenotype of genetically altered mice. This article illustrates the methods necessary to achieve high-throughput phenotyping of genetically altered mice using multiple-mouse MRI.

Çoklu-fare nöroanatomik Manyetik Rezonans Görüntüleme

The field of mouse phenotyping with magnetic resonance imaging (MRI) is rapidly growing, motivated by the need for improved tools for characterizing and ...

Imaging Pheromone Sensing in a Mouse Vomeronasal Acute Tissue Slice Preparation

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. Pheromones are volatile or non-volatile short-lived molecules2 secreted and/or contained in biological fluids3,4, such as urine, a liquid known to be a main source of pheromones3. Pheromonal communication is implicated in a variety of key animal modalities such as kin interactions5,6, hierarchical organisations3 and sexual interactions7,8 and are consequently directly correlated with the survival of a given species9,10,11. In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO)10,12, a paired structure located at the base of the nasal cavity, and enclosed in a cartilaginous capsule. Each VNO has a tubular shape with a lumen13,14 allowing the contact with the external chemical world. The sensory neuroepithelium is principally composed of vomeronasal bipolar sensory neurons (VSNs)15. Each VSN extends a single dendrite to the lumen ending in a large dendritic knob bearing up to 100 microvilli implicated in chemical detection16. Numerous subpopulations of VSNs are present. They are differentiated by the chemoreceptor they express and thus possibly by the ligand(s) they recognize17,18. Two main vomeronasal receptor families, V1Rs and V2Rs19,20,21,22, are composed respectively by 24023 and 12024 members and are expressed in separate layers of the neuroepithelium. Olfactory receptors (ORs)25 and formyl peptide receptors (FPRs)26,27 are also expressed in VSNs.
Whether or not these neuronal subpopulations use the same downstream signalling pathway for sensing pheromones is unknown. Despite a major role played by a calcium-permeable channel (TRPC2) present in the microvilli of mature neurons28 TRPC2 independent transduction channels have been suggested6,29. Due to the high number of neuronal subpopulations and the peculiar morphology of the organ, pharmacological and physiological investigations of the signalling elements present in the VNO are complex.
Here, we present an acute tissue slice preparation of the mouse VNO for performing calcium imaging investigations. This physiological approach allows observations, in the natural environment of a living tissue, of general or individual subpopulations of VSNs previously loaded with Fura-2AM, a calcium dye. This method is also convenient for studying any GFP-tagged pheromone receptor and is adaptable for the use of other fluorescent calcium probes. As an example, we use here a VG mouse line30, in which the translation of the pheromone V1rb2 receptor is linked to the expression of GFP by a polycistronic strategy.

In mice, the ability to detect pheromones is principally mediated by the vomeronasal organ (VNO). Here, an acute tissue slice preparation of VNO for performing calcium imaging is described. This physiological approach allows observations of subpopulations and/or individual neurons in a living tissue and is convenient for receptor-ligand identification.

Görüntüleme Feromon Fare Vomeronasal Akut Doku Dilim Hazırlama içinde Algılama

Peter Karlson and Martin L&uuml;scher used the term pheromone for the first time in 19591 to describe chemicals used for intra-species communication. ...

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by repeated, time-lapse in vivo imaging in live rodents. These studies were made possible by straightforward surgical procedures, which enabled optical access for a prolonged period of time without repeat surgical procedures. In contrast, analogous studies of the spinal cord have been previously limited to only a few imaging sessions, each of which required an invasive surgery. As previously described, we have developed a spinal chamber that enables continuous optical access for upwards of 8 weeks, preserves mechanical stability of the spinal column, is easily stabilized externally during imaging, and requires only a single surgery. Here, the design of the spinal chamber with its associated surgical implements is reviewed and the surgical procedure is demonstrated in detail. Briefly, this video will demonstrate the preparation of the surgical area and mouse for surgery, exposure of the spinal vertebra and appropriate tissue debridement, the delivery of the implant and vertebral clamping, the completion of the chamber, the removal of the delivery system, sealing of the skin, and finally, post-operative care. The procedure for chronic in vivo imaging using nonlinear microscopy will also be demonstrated. Finally, outcomes, limitations, typical variability, and a guide for troubleshooting are discussed.

A Procedure for Implanting a Spinal Chamber for Longitudinal In Vivo Imaging of the Mouse Spinal Cord

In this video, we describe a procedure for implanting a chronic optical imaging chamber over the dorsal spinal cord of a live mouse. The chamber, surgical procedure, and chronic imaging are reviewed and demonstrated.

Boyuna için bir Spinal Odası implantasyon için bir Prosedürü<em&gt; İn Vivo</em&gt; Fare Omurilik Görüntüleme

Studies in the mammalian neocortex have enabled unprecedented resolution of cortical structure, activity, and response to neurodegenerative insults by ...

Whole-mount Imaging of Mouse Embryo Sensory Axon Projections

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we describe a method to label in situ a subset of dorsal root ganglion (DRG) axon projections to assess their phenotypic characteristics using several genetically manipulated mouse lines. The TrkA-positive neurons are nociceptor neurons, dedicated to the transmission of pain signals. We utilize a TrkAtaulacZ mouse line to label the trajectories of all TrkA-positive peripheral axons in the intact mouse embryo. We further breed the TrkAtaulacZ line onto a Bax null background, which essentially abolishes neuronal apoptosis, in order to assess growth-related questions independently of possible effects of genetic manipulations on neuronal survival. Subsequently, genetically modified mice of interest are bred with the TrkAtaulacZ/Bax null line and are then ready for study using the techniques described herein. This presentation includes detailed information on mouse breeding plans, genotyping at the time of dissection, tissue preparation, staining and clearing to allow for visualization of full-length axonal trajectories in whole-mount preparation.

We present here an optimized protocol to genotype, stain and prepare fetal mice for the imaging of peripheral nociceptor axon projections in the whole animal, as an effective method to assess sensory axon growth phenotypes in developing genetically engineered mice.

Fare Embriyo Duyu Akson Projeksiyonlar tüm montaj Görüntüleme

The visualization of full-length neuronal projections in embryos is essential to gain an understanding of how mammalian neuronal networks develop. Here we ...

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma establishes a lifelong persistent infection in the brain. While this brain infection is asymptomatic in most immunocompetent people, in the developing fetus or immunocompromised individuals such as acquired immune deficiency syndrome (AIDS) patients, this predilection for and persistence in the brain can lead to devastating neurologic disease. Thus, it is clear that the brain-Toxoplasma interaction is critical to the symptomatic disease produced by Toxoplasma, yet we have little understanding of the cellular or molecular interaction between cells of the central nervous system (CNS) and the parasite. In the mouse model of CNS toxoplasmosis it has been known for over 30 years that neurons are the cells in which the parasite persists, but little information is available about which part of the neuron is generally infected (soma, dendrite, axon) and if this cellular relationship changes between strains. In part, this lack is secondary to the difficulty of imaging and visualizing whole infected neurons from an animal. Such images would typically require serial sectioning and stitching of tissue imaged by electron microscopy or confocal microscopy after immunostaining. By combining several techniques, the method described here enables the use of thick sections (160 &#181;m) to identify and image whole cells that contain cysts, allowing three-dimensional visualization and analysis of individual, chronically infected neurons without the need for immunostaining, electron microscopy, or serial sectioning and stitching. Using this technique, we can begin to understand the cellular relationship between the parasite and the infected neuron.

3-D Imaging and Analysis of Neurons Infected In Vivo with Toxoplasma gondii

Using this protocol, we were able to image 160 &#181;m thick brain sections from mice infected with the parasite Toxoplasma gondii, which enables visualization and analysis of the spatial relationship between the encysting parasite and the infected neuron.

Nöronlar 3-D Görüntüleme ve Analiz Enfekte<em&gt; İn Vivo</em&gt; Ile<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Toxoplasma gondii is an obligate, intracellular parasite with a broad host range, including humans and rodents. In both humans and rodents, Toxoplasma ...

A Large Lateral Craniotomy Procedure for Mesoscale Wide-field Optical Imaging of Brain Activity

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, typically 3 mm x 3 mm. This protocol introduces a method for creating a substantially larger 7 mm x 6 mm cranial window exposing most of a cerebral hemisphere over the mouse temporal and parietal cortices (e.g., bregma 2.5 - 4.5 mm, lateral 0 - 6 mm). To perform this surgery, the head must be tilted approximately 30&#176; and much of the temporal muscle must be retracted. Due to the large amount of bone removal, this procedure is intended only for acute experiments with the animal anesthetized throughout the surgery and experiment.
The main advantage of this innovative large lateral cranial window is to provide simultaneous access to both medial and lateral areas of the cortex. This large unilateral cranial window can be used to study the neural dynamics between cells, as well as between different cortical areas by combining multi-electrode electrophysiological recordings, imaging of neuronal activity (e.g., intrinsic or extrinsic imaging), and optogenetic stimulation. Additionally, this large craniotomy also exposes a large area of cortical blood vessels, allowing for direct manipulation of the lateral cortical vasculature.

This protocol presents a method for creating a large unilateral craniotomy over the temporal and parietal regions of the mouse cerebral cortex. This is especially useful for real time imaging over an expansive area of a cortical hemisphere.

Beyin Faaliyet Mesoscale Geniş alan Optik Görüntüleme için Büyük Yanal Kraniotomi Prosedürü

The craniotomy is a commonly performed procedure to expose the brain for in vivo experiments. In mouse research, most labs utilize a small craniotomy, ...

Live Imaging of the Ependymal Cilia in the Lateral Ventricles of the Mouse Brain

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various neurological deficits. The current ex vivo live imaging of motile ependymal cilia technique allows for a detailed study of ciliary dynamics following several steps. These steps include: mice euthanasia with carbon dioxide according to protocols of The University of Toledo&#8217;s Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC); craniectomy followed by brain removal and sagittal brain dissection with a vibratome or sharp blade to obtain very thin sections through the brain lateral ventricles, where the ependymal cilia can be visualized. Incubation of the brain&#8217;s slices in a customized glass-bottom plate containing Dulbecco&#8217;s Modified Eagle&#8217;s Medium (DMEM)/High-Glucose at 37 &#176;C in the presence of 95%/5% O2/CO2 mixture is essential to keep the tissue alive during the experiment. A video of the cilia beating is then recorded using a high-resolution differential interference contrast microscope. The video is then analyzed frame by frame to calculate the ciliary beating frequency. This allows distinct classification of the ependymal cells into three categories or types based on their ciliary beating frequency and angle. Furthermore, this technique allows the use of high-speed fluorescence imaging analysis to characterize the unique intracellular calcium oscillation properties of ependymal cells as well as the effect of pharmacological agents on the calcium oscillations and the ciliary beating frequency. In addition, this technique is suitable for immunofluorescence imaging for ciliary structure and ciliary protein localization studies. This is particularly important in disease diagnosis and phenotype studies. The main limitation of the technique is attributed to the decrease in live motile cilia movement as the brain tissue starts to die.

Using high-resolution differential interference contrast (DIC) microscopy, an ex vivo observation of the beating of motile ependymal cilia located within the mouse brain ventricles is demonstrated by live-imaging. The technique allows a recording of the unique ciliary beating frequency and beating angle as well as their intracellular calcium oscillation pacing properties.

Fare Beyin lateral ventrikül Ependimal Cilia Canlı Görüntüleme

Multiciliated ependymal cells line the ventricles in the adult brain. Abnormal function or structure of ependymal cilia is associated with various ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful analysis of synaptic transmission modulation when performing field potential or intracellular recordings. This manuscript describes methodological aspects that might be helpful in improving experimental conditions for the maintenance of acute brain slices and for recording field excitatory postsynaptic potentials in a commercially available submersion chamber with an outflow-carbogenation unit. The outflow-carbogenation helps to stabilize the oxygen level in experiments that rely on the recycling of a small buffer reservoir to enhance the cost-efficiency of drug experiments. In addition, the manuscript presents representative experiments that examine the effects of different carbogenation modes and stimulation paradigms on the activity-dependent synaptic plasticity of synaptic transmission.

This protocol describes the stabilization of the oxygen level in a small volume of recycled buffer and methodological aspects of recording activity-dependent synaptic plasticity in submerged acute hippocampal slices.

Sinaptik plastisite akut Hipokampal dilimleri bir küçük hacimli geri dönüşüm-, perfüzyon- ve batma-tipi oda sistemi içinde tutulan kayıt

Even though experiments on brain slices have been in use since 1951, problems remain that reduce the probability of achieving a stable and successful ...