Name: applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging
Uploaded: 2020-12-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging at JoVE.com

Il lavoro nel laboratorio Januschke è supportato da sovvenzioni wellcome trust 100031/Z/12/A e 1000032/Z/12/A. La struttura di imaging tissutale è supportata dalla sovvenzione WT101468 di Wellcome.

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ImageJ macros [software] Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020)</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'imaging dal vivo di cervelli larvali D. melanogaster a montaggio intero offre l'opportunità di osservare divisioni asimmetriche delle cellule staminali neurali in condizioni vicine a un contesto fisiologico. La prima parte del nostro protocollo introduce il nostro approccio sulla dissezione del cervello larvale. Come già affermato13, un aspetto critico della preparazione è evitare di danneggiare il cervello. L'aspetto più impegnativo di questo è separare il cervello dai dischi immaginari vicini senza tirare eccessivamente sul cervello. Il nostro approccio al "taglio senza trazione" è quello di eseguire un movimento di rettifica con le punte di una coppia di pini, o di far scorrere una punta di pin pin lungo altre due punte di pin che tengono la connessione tra i tessuti (Figura 1A) mentre Lerit et al. Consigliamo allo sperimentatore di provare tutti gli approcci e di adottare quello più adatto a se stesso. Suggeriamo inoltre di utilizzare punte di pipette rivestite in BSA o FCS piuttosto che strumenti di dissezione per trasferire cervelli isolati. Il rivestimento impedisce ai tessuti di attaccarsi alla plastica e consente il trasferimento sicuro dei tessuti mantenendoli sempre completamente immersi, senza sottometterli a una possibile deformazione transitoria mentre si attaccano allo strumento di dissezione durante il trasferimento. Le punte rivestite hanno altri vantaggi per consentire il trasferimento di più cervelli contemporaneamente, il che è particolarmente utile quando è fondamentale controllare il tempo di residenza dei campioni all'interno di un particolare mezzo; sono adatti per il trasferimento di altri tessuti, anche fragili come, ad esempio, corpi grassi; possono ospitare una vasta gamma di diverse dimensioni del campione utilizzando punte più grandi o tagliando l'estremità della punta.
Successivamente, questo protocollo descrive l'uso della coagulazione di Fibrinogen per immobilizzare il cervello larvale sul coverslip di un piatto di coltura. Un cervello è orientato all'interno di una goccia di mezzo di coltura + Fibrinogeno, dopo di che la coagulazione è indotta dall'aggiunta di Trombina. La formazione di fibrina è graduale, fornendo un'area di tempo durante la quale l'orientamento del campione può essere messo a punto, se necessario (Figura 2C). Se è necessaria una leggera compressione del campione - cosa che sconsigliamo nel caso di cervelli larvali - può anche essere regolata finemente premendo il coagulo più o meno vicino al campione durante i passaggi 3.4.4 e 3.5.2. Il principale vantaggio di questa coagulazione di Fibrinogen rispetto al protocollo descritto in Lerit et al., in cui i cervelli sono montati tra una membrana permeabile al gas e un coverslip, è la capacità di sostituire il mezzo di coltura durante l'imaging dal vivo. Un possibile vantaggio dell'uso di una membrana permeabile al gas rispetto al nostro protocollo potrebbe essere che fornisce un'ossigenazione ottimale dei campioni, che potrebbe essere più limitata con il nostro approccio poiché i cervelli sono separati dall'aria dal coagulo e da qualche mezzo. Per questo motivo, anche se non abbiamo valutato l'effetto della quantità di mezzo di coltura all'interno del piatto di coltura, suggeriamo di limitare la quantità di mezzo di coltura sopra i coaguli mantenendo i coaguli completamente immersi.
Poiché la manipolazione dei coaguli può essere sperimentalmente difficile e dispendiosa in termini di tempo, si consiglia allo sperimentatore di praticare prima la manipolazione dei coaguli senza campioni. Modulare il volume della goccia di mezzo di coltura + Fibrinogeno sul coverslip, la concentrazione di Fibrinogen o il volume e la concentrazione di Trombina potrebbero contribuire a facilitare la preparazione e potrebbero essere importanti quando si adatta il protocollo ad altri tipi di tessuti. Con abbastanza esperienza nella manipolazione dei coaguli, diversi cervelli possono essere immobilizzati in un unico coagulo se necessario, anche se complica la messa a punto dell'orientamento. Diversi coaguli possono essere formati sul coverslip, consentendo, ad esempio, di immagini campioni di diversi genotipi. È anche possibile esporre coaguli diversi sullo stesso copriscicolo a diversi mezzi di coltura, anche se occorre fare attenzione a non mescolare mai le gocce di mezzo di coltura che coprono i diversi coaguli. Una volta che i cervelli larvali sono immobilizzati e pronti per l'imaging dal vivo, si consiglia di seguire le raccomandazioni di Lerit etal. Aggiungiamo solo a queste raccomandazioni non solo per mantenere il cervello a 25 °C durante l'imaging dal vivo con un incubatore di stadio, ma anche per preriscaldare questa fase per almeno 30 minuti prima dell'inizio dell'imaging. Nelle nostre mani, non farlo sistematicamente si traduce in una forte deriva di attenzione.
Può essere vantaggioso in alcuni contesti essere in grado di eseguire microscopia correlata e fissare e immunosomodiare un campione dopo l'imaging dal vivo. Tuttavia, una limitazione dell'uso di coaguli di Fibrin è che è quasi impossibile isolare meccanicamente un cervello da un coagulo senza danneggiarlo. Un possibile modo per superare questa limitazione potrebbe essere quello di sviluppare metodi per degradare i coaguli di fibrina con plasmina o per indurre lo smontaggio del coagulo mediante l'aggiunta di un peptide che imita le manopole permettendo la polimerizzazione della Fibrina28. In genere usiamo coaguli di fibrina su campioni che vanno da singole cellule a tessuti lunghi 200 μM, ma potremmo anche immobilizzare con successo nei coaguli e nel cervello dell'immagine da bombi adulti larghi oltre 3 mm. Resta da determinare il limite superiore della dimensione del campione che può essere immobilizzato nei coaguli. Allo stesso modo, sebbene di solito immaginiamo campioni immobilizzati per 4-5 ore, abbiamo immaginato con successo i neuroblasti nella coltura primaria per un massimo di 3 giorni, indicando che il coagulo almeno non interferisce con la vitalità a lungo termine. Al contrario, i coaguli possono facilitare la sostituzione regolare del mezzo, un requisito per l'imaging a lungo termine, senza la necessità di dispositivi come pompe peristaltiche a questo scopo. Anche se non abbiamo misurato i parametri di permeabilità dei coaguli di fibrina, la natura fibrosa simile a un gel dei coaguli sembra essere penetrabile da molecole permeabili cellulari. Abbiamo scoperto che Latrunculin A, Colcemid o 1-NAPP1, ligandi a tag HALO e altri coloranti standard utilizzati in biologia cellulare raggiungono le cellule nel coagulo di fibrina senza problemi e finora non hanno incontrato molecole che sarebbero state trattenute dal coagulo, che, tuttavia, è una possibilità che deve essere testata empiricamente.
In conclusione, l'utilizzo di coaguli di Fibrin fornisce un modo affidabile e relativamente facile da implementare per immobilizzare i tessuti viventi per l'imaging dal vivo. Al di là della sua utilità nel limitare la deriva laterale, la capacità di cambiare il mezzo di coltura durante l'imaging vivo si è dimostrata inestimabile per il nostro approccio di genetica chimica allo studio della divisione cellulare asimmetrica dei neuroblasti D. melanogaster 21. Prevediamo che questa tecnica sarà utile per gli studi su una vasta gamma di tessuti diversi, in particolare se coinvolgono genetica chimica o, ad esempio, autoeticazione proteica29.
La nostra macro MultiHyperStackReg si basa sul plug-in TurboReg ImageJ, che allinea frame o sezioni successive di uno stack, e sul plug-in MultiStackReg ImageJ, che consente di applicare le trasformazioni ad altri stack. MultiHyperStackReg consente semplicemente di applicare queste trasformazioni agli iperstack (stack con almeno quattro dimensioni). Poiché l'uso di MultiHyperStackReg, come lo descriviamo, richiede molte azioni e può richiedere molto tempo, abbiamo anche scritto la macro AutoHyperStackReg, che esegue automaticamente tutti i passaggi descritti nei passaggi 6.2 e 6.3. Tuttavia, contrariamente a MultiHyperStackReg, AutoHyperStackReg attualmente non ha la possibilità di calcolare l'allineamento di uno stack in base a una sottoregione di questo stack, un'opzione che abbiamo trovato a volte è cruciale per un allineamento soddisfacente. Un'altra limitazione di AutoHyperStackReg è che il suo utilizzo è limitato alle traduzioni e non alle altre trasformazioni proposte da TurboReg e MultiStackReg, mentre MultiHyperStackReg può essere applicato a un hyperstack qualsiasi tipo di trasformazione se l'utente ne ha bisogno. Le versioni future implementeranno queste funzioni e saranno disponibili su GitHub30. Infine, la nostra macro di linee rotanti può fornire un modo semplice per misurare rapidamente i segnali corticali in time lapses, anche se la corteccia cambia la sua posizione o orientamento nel tempo. Se la sua modalità di tracciamento o la sua modalità di non tracciamento è più adatta per l'analisi dipende dalla qualità e dalla coerenza del segnale corticale. La modalità di tracciamento è più facile da usare in quanto l'utente non ha bisogno di considerare dove sarà la corteccia per ogni punto di tempo e può adattarsi a grandi cambiamenti di posizione e orientamento nel tempo. Tuttavia, è adatto solo se il segnale corticale rimane abbastanza forte per il rilevamento durante l'intero filmato: la mancata rilevazione di nient'altro che la corteccia (ad esempio, un compartimento citoplasmatico luminoso vicino alla corteccia) può compromettere il rilevamento per ogni successivo punto di tempo (ad esempio, il compartimento citoplasmatico si allontana dalla corteccia e le linee corticalican lo seguono per il resto del tempo decadrà). La modalità di non tracciamento non ha questa insidia in quanto il rilevamento è limitato alla linea originariamente disegnata dall'utente (ad esempio, un compartimento citoplasmatico luminoso può causare il fallimento del rilevamento per alcuni punti di tempo, ma man mano che il compartimento citoplasmatico si allontana dalla zona di rilevamento, riprende il corretto rilevamento della corteccia), ma non si comporta bene se la posizione o l'orientamento della corteccia cambia molto nel tempo. La prossima funzione (che sarà disponibile su GitHub30) da sviluppare per la modalità di tracciamento sarà la possibilità di analizzare solo i punti di tempo specificati e di definire un punto di tempo di riferimento (anziché il primo punto di tempo) prima del quale e dopo di che verrà eseguito il rilevamento, che consentirà all'utente di evitare almeno punti di tempo problematici.

Drosophila continua ad essere un importante sistema modello per studiare una vasta gamma di questioni biologiche ed è eccelleto nel far progredire le conoscenze in molte discipline per decenni. Una caratteristica che lo distingue particolarmente è che è particolarmente adatto per l'imaging dal vivo. La capacità di monitorare i processi subcellulari o il comportamento di cellule e tessuti in tempo reale continua a contribuire a generare concetti chiave rilevanti per la biologia cellulare e dello sviluppo. Molti protocolli di successo sono stati sviluppati da diversi gruppi per mantenere vivi e sani tali campioni di Drosophila per studiare il comportamento del campione e delle molecole fluorescenti vive. Organi e tessuti della mosca come idischi immaginari1,2,il cervello larvale3,4,5, 6o camere d'uovo di femmine adulte7,8,9o l'intestino adulto10 per esempio possono essere estratti e conservati in coltura per l'imaging con microscopia time-lapse. Una sfida fondamentale per l'imaging dal vivo consiste nel garantire che il campione sia tenuto vicino alla superficie di imaging per una risoluzione ottimale e immobile senza compromettere l'integrità del campione che può essere sensibile agli impatti meccanici. Per studiare le cellule staminali neurali, chiamate neuroblasti o neuroni nel cervello larvale della Drosophila, ad esempio, mantenere i campioni vicini alla superficie di imaging può essere ottenuto coprendoli con mezzi di coltura in camere di imaging sigillate11,12,13. Tuttavia, questo approccio non consente facilmente lo scambio di media limitando così lo spazio sperimentale di manovra. In alternativa, i campioni possono essere preparati e posizionati su coverlips trattati per aumentare l'adesione delle cellule e consentire la microscopia a visita multi-punto e l'imaging esteso a cellule vive in piatti a coltura aperta, che potenzialmente consentono lo scambio di media, ma non forniscono mezzi facili per prevenire la deriva o la perdita del campione durante lo scambiodi media 14,15.
Il metodo del coagulo di Fibrina originariamente sviluppato per studiare la meiosi negli spermatociti vita gru-mosca16 è specificamente adatto a superare questi problemi. Il fibrinogeno viene sciolto nel mezzo di coltura pertinente, i campioni posizionati e orientati in una goccia di questa soluzione su un'adeguata camera di imaging vetro-superficie prima dell'aggiunta di Trombina, con conseguente rapida formazione di un coagulo di Fibrina insolubile, una rete fibrosa appiccicosa che aderisce alla superficie del vetro e ai campioni garantendo al contempo l'accesso del campione al terreno di coltura. Il mezzo può quindi essere scambiato senza perturbo il coagulo o la posizione del campione. Lo scambio di mezzi di coltura durante l'imaging è, ad esempio, auspicabile quando gli inibitori devono essere aggiunti come nel metodo originale o per esperimenti di lavaggio o inseguimento di impulsi o quando i coloranti fluorescenti devono essere aggiunti durante l'imaging di cellule vive mantenendo cellule e tessuti in posizione. I coaguli di fibrina sono adatti per l'imaging di tessuti Drosophila e singolecellule 13,17. I coaguli di fibrina possono essere ulteriormente utilizzati per aiutare a orientare i campioni, che a causa della loro forma o altre proprietà normalmente non sarebbero orientati nel modo desiderato modulando la posizione del campione all'interno del coagulo di Fibrina e la forma del coagulo stesso.
Qui forniamo un aggiornamento sui nostri attuali metodi di imaging basati sul coagulo di Fibrin e forniamo strumenti per l'analisi delle immagini basata sulla segmentazione e ci concentriamo sull'uso di questo metodo per studiare le divisioni dei neuroblasti nel cervello della mosca in via di sviluppo. Usiamo regolarmente il metodo del coagulo di Fibrin per seguire più campioni in coaguli diversi nello stesso piatto di coltura. Ciò consente di i) l'imaging di eventi subcellulari come il comportamento centrosoma o la localizzazione dell'mRNAdal vivo 18,19, ii) il monitoraggio del comportamento dei campioni durante il trattamento farmacologico di diversi genotipi sotto le stesse impostazioni di imaging utilizzando visite multi-punto microscopia20, iii) studio degli effetti dell'inibizione acutadegli enzimi 21 e iv) minimizzazione della deriva per studiare i cambiamenti nell'orientamento della divisione cellulare delle cellule all'interno del loro ambiente fisiologico su laser-ablazionemirata 22. Mentre gli effetti indesiderati di Trombina e Fibrinogeno e del coagulo di Fibrina devono essere testati empiricamente per ogni campione, questo metodo è in linea di principio adatto a immobilizzare qualsiasi tipo di campione che deve essere analizzato mediante imaging a cellule vive e in Drosophila è stato utilizzato con successo per studiare molteplici aspetti della biologia dei neuroblasti5,19,20, ma anche la dinamica delle proiezioni citosensoriali delle cellule staminali della linea germinalefemminile 23 e i cambiamenti di polarità sull'inibizione acuta dell'aPKC delle cellule follicolari delle camere uovo femminili drosophila 21.
L'imaging fluorescente time-lapse si traduce nella generazione di complessi set di dati 3D risolti nel tempo che richiedono metodi per estrarre queste informazioni quantitative. Qui descriviamo il nostro ulteriore sviluppo dimacro 24 basate su ImageJ che possono essere utilizzate per correggere la deriva negli iperstack e macro ImageJ su misura che consentono la quantificazione semi-automatizzata della fluorescenza multicanale presso la corteccia cellulare sviluppata per quantificare le proteine corticali nei neuroblasti dei cervelli larvali di Drosophila o dei singoli neuroblasti nella coltura cellulare primaria.

<table><tbody><tr><td>Albumin bovine serum, BSA</td><td>Merck</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11255-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture</td><td>Sigma</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen from human plasma</td><td>Sigma</td><td>F3879</td><td></td></tr><tr><td>FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td></td></tr><tr><td>PP1 Analog (1NA-PP1)</td><td>Merck Millipore</td><td>529579</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex spot plate with nine depressions</td><td>Sigma</td><td>CLS722085-18EA</td><td></td></tr><tr><td>Schneider&#039;s Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Merck</td><td>T4648</td><td></td></tr></tbody></table>

applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging

Drosophila è un importante sistema modello per studiare una vasta gamma di questioni biologiche. Vari organi e tessuti di diversi stadi di sviluppo della mosca come i dischi immaginari, le camere larvali del cervello o delle uova delle femmine adulte o dell'intestino adulto possono essere estratti e tenuti in coltura per l'imaging con microscopia time-lapse, fornendo preziose informazioni sulla biologia cellulare e dello sviluppo. Qui, descriviamo in dettaglio il nostro attuale protocollo per la dissezione dei cervelli larvali di Drosophila, e poi presentiamo il nostro attuale approccio per immobilizzare e orientare cervelli larvali e altri tessuti su una coverlip di vetro usando coaguli di fibrina. Questo metodo di immobilizzazione richiede solo l'aggiunta di Fibrinogen e Thrombin al mezzo di coltura. È adatto per l'imaging time lapse ad alta risoluzione su microscopi rovesciati di più campioni nello stesso piatto di coltura, riduce al minimo la deriva laterale frequentemente causata dai movimenti della fase del microscopio in microscopia da visita multi-punto e consente l'aggiunta e la rimozione di reagenti durante il corso di imaging. Presentiamo anche macro su misura che utilizziamo regolarmente per correggere per la deriva e per estrarre ed elaborare informazioni quantitative specifiche dall'analisi time-lapse.

Immobilizzazione dei tessuti Drosophila con coaguli di Fibrina e scambio di mezzi di coltura durante l'imaging dal vivo. Dopo essere stati sezionati seguendo la procedura presentata nella fase 2 (Figura 1) e immobilizzati nei coaguli di Fibrina sullo stesso coverslip seguendo la procedura presentata al passaggio 3 (Figura 2), i cervelli larvali che esprimono Bazooka taggato dalla GFP (Baz::GFP), l'ortologo a mosca della proteina polarità Par-3, sono stati imageizzati per 30 minuti in imaging confocale multi-posizione time-lapse. Baz::GFP è combinato con apkcas4, un allele che consente l'inibizione acuta della proteina atipica chinasi C (aPKC) attraverso l'aggiunta del piccolo atp analogico 1-NAPP120. 1-NAPP1 è stato quindi aggiunto al mezzo di coltura seguendo la procedura presentata nella fase 4 e l'imaging dal vivo è stato ripreso per 2,5 ore. I cervelli di controllo che trasportavano una versione di tipo selvaggio dell'aPKC della chinasi non hanno reagito all'analogo ATP, mentre i cervelli che trasportavano inoltre una mutazione analoga sensibile dell'aPKC (apkcas4) hanno mostrato una contrazione del neuroepitelio e dei gruppi luminosi di Baz nei neuroblasti e nella loro progenie(Figura 6, Video 1). I neuroblasti continuano a dividersi per tutto il time-lapse, indicando che il tessuto rimane sano, e il cervello mostra poca deriva nonostante il cambiamento del mezzo di coltura, indicando che sono ben immobilizzati. Allo stesso modo, dopo essere stati sezionati seguendo la procedura presentata in27, gli ovariole che esprimono Baz::GFP sono stati immobilizzati nei coaguli di Fibrina sullo stesso coverslip e con immagini per 8 minuti, dopo di che l'applicazione di 1-NAPP1 ha indotto la contrazione di cellule follicolari mutanti apkcas4 ma non di controlli(Figura 7, Video 2).
Correzione della deriva laterale e dello stato attivo mediante MultiHyperstackReg. Un hyperstack che mostra sia la deriva laterale che quella di messa a fuoco(Video 3,pannello sinistro) è stato prima corretto per la deriva laterale (passaggio 6.2, Figura 3, Video 3, pannello centrale), quindi la deriva di messa a fuoco (passaggio 6.3, Figura 4, Video 3, pannello destro) utilizzando il plugin MultiStackReg e la macro MultiHyperstackReg, con conseguente sostanziale riduzione dei movimenti osservati nell'iperstack originale.
Misurazione corticale del segnale utilizzando lattine di linea rotanti Un neuroblasto che esprime Baz::GFP (verde) e la proteina transmembrana CD4 taggata con una proteina fluorescente infrarossa (CD4::mIFP, rosso) è stato immaginato durante una mitosi. Il segnale CD4::mIFP è stato utilizzato come riferimento per rilevare la corteccia in varie parti del neuroblasto con lattine di linee (passo 7, Figura 5, Figura 8A-C) e il segnale Baz::GFP è stato misurato nelle posizioni rilevate Figura 8D). Durante la loro divisione, i neuroblasti si polarizzarono transitoriamente stabilendo domini corticali distinti e opposti: il polo apicale e il polo basale. Baz definisce il polo apicale e, coerentemente, il segnale Baz::GFP aumentato al polo apicale del neuroblasto e diminuito al polo basale durante la divisione (Figura 8C,D). La posizione della corteccia è stata tracciata in modo soddisfacente per tutto il time-lapse(Figura 8C, Video 4). Le linee e i genotipi drosophila sono referenziati nella tabella supplementare 1-2.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> Figura 6: Applicazione di un analogo ATP sul cervello larvale immobilizzato durante l'imaging dal vivo. (A) Imaging dal vivo di due cervelli larvali che esprimono Baz::GFP immobilizzato sullo stesso coverslip. Il mezzo di coltura viene cambiato in una concentrazione di 10 μM dell'ATP analogico 1-NAPP1 a 0 min. I cervelli di controllo non reagiscono visibilmente all'analogo ATP, mentre i cervelli che portano una mutazione sensibile analogica diaPKC ( aPKCAS4) mostrano una contrazione del neuroepitelio (punte di freccia) e dei gruppi luminosi di Baz nei neuroblasti e nella loro progenie. Proiezione di intensità massima di 33 fette per una profondità di 23 μM. Barra di scala: 20 μM. (B) Ingrandimento del neuroepitelio. Barra di scala: 10 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> Figura 7: Applicazione di un analogo ATP sulle camere delle uova immobilizzate durante l'imaging dal vivo. Imaging dal vivo di due ovariole che esprimono Baz::GFP immobilizzato sullo stesso coverslip. Il mezzo di coltura viene cambiato in una concentrazione di 10 μM dell'ATP analogico 1-NAPP1 a 0 min. Le camere delle uova di controllo non reagiscono visibilmente all'analogo ATP, mentre le camere delle uova che portano una mutazione sensibile analogica diaPKC (aPKCAS4) mostrano una contrazione dell'epitelio (punte di freccia) che alla fine porta all'apparente rottura delle giunzioni aderenti. Proiezione di intensità massima di 33 fette per una profondità di 27 μM. Barra di scala: 20 μM. Fare clic <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> Figura 8: Misurazione del segnale corticale mediante lacanne rotanti. (A) Neuroblasto D. melanogaster vivo che esprime Baz::GFP (verde) e CD4::mIFP (rosso). Linee ciano: linee di scansione iniziali tracciate perpendicolarmente a varie zone corticali da misurare. Barra di scala: 5 μM. (B) Identificazione della corteccia (linea blu scuro) usando lattine di linee corticali e CD4::mIFP (rosso) come canale di riferimento. Linea ciano: area definita dal parametro "Misura intorno" (qui, 2 pixel), dove il segnale viene misurato dopo il rilevamento della corteccia. Barra di scala: 2 μm. (C) Ciano: aree corticali identificate durante una divisione di neuroblasti dal metodo delle reti a linee rotanti dalle linee di scansione iniziali visualizzate in (A), usando CD4::mIFP (rosso) come canale di riferimento. Barra di scala: 5 μM. Freccia: polo apicale. Punta di freccia: palo basale. (D) Misurazione dell'intensità del segnale Baz::GFP nel tempo nelle due zone corrispondenti identificate dalle lattine rotanti visualizzate in (C). Durante la mitosi, Baz::GFP si arricchisce transitoriamente al polo apicale del neuroblasto e si esaurisce dal polo basale opposto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Video 1: Applicazione dello scambio di media sul cervello larvale immobilizzato durante l'imaging dal vivo per aggiungere un inibitore, presentato nella Figura 6, barra di scala: 20 μm. Fare <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">clic qui per scaricare questo video.</a>
Video 2: Applicazione dello scambio di supporti su camere di uova immobilizzate durante l'imaging dal vivo per aggiungere un inibitore, presentato nella figura 7, barra di scala: 20 μm. Fare <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">clic qui per scaricare questo video.</a>
Video 3: Correzione della deriva laterale e di messa a fuoco con MultiHyperStackReg. Imaging dal vivo di un neuroblasto che esprime la sonda di membrana PH::GFP. Xy: piano focale singolo. Xz: reslice ortogonale. A sinistra: prima della correzione della deriva. Al centro: dopo la correzione della deriva laterale. A destra: dopo aver corretto la deriva laterale e di messa a fuoco, barra di scala: 10 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo video.</a>
Video 4: Rilevamento della corteccia utilizzando lattine rotanti, presentato nella figura 8, barra di scala: 5 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo video.</a>
Tabella supplementare 1: Genotipi di tessuti Drosophila con immagini. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella supplementare 2: Origine dei transgeni utilizzati. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
File di codifica supplementare 1: Origine dei transgeni utilizzati. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File di codifica supplementare 2: Origine dei transgeni utilizzati. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File di codifica supplementare 3: Origine dei transgeni utilizzati. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Questo protocollo descrive le applicazioni dell'immobilizzazione dei campioni utilizzando coaguli di Fibrin, limitando la deriva e consentendo l'aggiunta e il lavaggio di reagenti durante l'imaging dal vivo. I campioni vengono trasferiti in una goccia di Fibrinogen contenente terreno di coltura sulla superficie di un coverslip, dopo di che la polimerizzazione è indotta dall'aggiunta di trombina.

Applicazioni di immobilizzazione dei tessuti Drosophila con coaguli di fibrina per l'imaging dal vivo

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

applications-immobilization-drosophila-tissues-with-fibrin-clots-for

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

3.0K Views.  University of Dundee. Questo protocollo descrive le applicazioni dell'immobilizzazione dei campioni utilizzando coaguli di Fibrin, limitando la deriva e consentendo l'aggiunta e il lavaggio di reagenti durante l'imaging dal vivo. I campioni vengono trasferiti in una goccia di Fibrinogen contenente terreno di coltura sulla superficie di un coverslip, dopo di che la polimerizzazione è indotta dall'aggiunta di trombina.

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Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

Utilizzando Chips microfluidica per l&#39;imaging dal vivo e studio delle risposte lesioni in<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Ricerca

Bioingegneria

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle synapses, we developed a larval tissue preparation that had features of live intact larvae, but also had good optical properties.  This new preparation also allowed for access of perfusates to the synapse.  We used fly larvae, immersed them in artificial hemolymph, and relaxed their normal rhythmic body contractions by chilling them. Next we dissected off the posterior segments of each animal and with a blunt insect pin pushed the mouth parts backward through the body cavity.  This everted the larval body wall, like turning a sock inside-out.  We completed the dissection with ultra-fine dissection scissors and thus exposed the visceral side of the body wall muscles. The glial structures at the NMJ expressed membrane targeted GFP under the control of glial specific promoters. The post-synaptic membrane, the SSR (Subsynaptic Reticula) in muscle expressed synaptically targeted dsRed. We needed to acutely label the motor neuron terminals, the third part of the synapse. To do this we applied primary antibodies to HRP, conjugated to a far-red emitting flurophore.  To test for dye diffusion properties into the perisynaptic space between the motor neuron terminals and the SSR, we applied a solution of large Dextran molecules conjugated to far-red emitting flurophore and collected images.

Visualizing the Live Drosophila Glial-neuromuscular Junction with Fluorescent Dyes

We described structural features of the Glia-neuromuscular synapses in a novel Inside-out tissue preparation of live fly larvae using fluorescent dyes with confocal microscopy. We labeled live neuron terminals with fluorescent primary antibodies to HRP, and also visualized the perisynaptic space with fluorescent Dextrans.

Visualizzazione di Live Drosophila Gliali-giunzione neuromuscolare con tinture fluorescenti

Our project identified GFP labeled glial structures at the developing larval fly neuromuscular synapse. To look at development of live glial-nerve-muscle ...

Biologia

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

La preparazione di Drosophila Gli embrioni per Live-Imaging Utilizzando il protocollo goccia

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we present a protocol for the mounting of Drosophila melanogaster embryos and subsequent live imaging of fluorescently labeled hemocytes, the embryonic macrophages of this organism. Using the Gal4-uas system1 we drive the expression of a variety of genetically encoded, fluorescently tagged markers in hemocytes to follow their developmental dispersal throughout the embryo. Following collection of embryos at the desired stage of development, the outer chorion is removed and the embryos are then mounted in halocarbon oil between a hydrophobic, gas-permeable membrane and a glass coverslip for live imaging. In addition to gross migratory parameters such as speed and directionality, higher resolution imaging coupled with the use of fluorescent reporters of F-actin and microtubules can provide more detailed information concerning the dynamics of these cytoskeletal components.

Live Imaging Of Drosophila melanogaster Embryonic Hemocyte Migrations

Drosophila hemocytes disperse over the entirety of the developing embryo. This protocol demonstrates how to mount and image these migrations using embryos with fluorescently labelled hemocytes.

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Many studies address cell migration using in vitro methods, whereas the physiologically relevant environment is that of the organism itself. Here we ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

Preparazione di Sviluppo e degli adulti Drosophila Brains e retina per l&#39;imaging dal vivo

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal lines have enabled biological processes to be studied in the context of a living, and in some instances even behaving, organism. In this protocol we will describe how to anesthetize intact Drosophila larvae, using the volatile anesthetic desflurane, to follow the development and plasticity of synaptic populations at sub-cellular resolution1-3. While other useful methods to anesthetize Drosophila melanogaster larvae have been previously described4,5,6,7,8, the protocol presented herein demonstrates significant improvements due to the following combined key features: (1) A very high degree of anesthetization; even the heart beat is arrested allowing for lateral resolution of up to 150 nm1, (2) a high survival rate of &gt; 90% per anesthetization cycle, permitting the recording of more than five time-points over a period of hours to days2 and (3) a high sensitivity enabling us in 2 instances to study the dynamics of proteins expressed at physiological levels. In detail, we were able to visualize the postsynaptic glutamate receptor subunit GluR-IIA expressed via the endogenous promoter1 in stable transgenic lines and the exon trap line FasII-GFP1. (4) In contrast to other methods4,7 the larvae can be imaged not only alive, but also intact (i.e. non-dissected) allowing observation to occur over a number of days1. The accompanying video details the function of individual parts of the in vivo imaging chamber2,3, the correct mounting of the larvae, the anesthetization procedure, how to re-identify specific positions within a larva and the safe removal of the larvae from the imaging chamber.

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

This protocol describes a reliable method for anesthetization and imaging of intact Drosophila melanogaster larvae. We have utilized the volatile anesthetic desflurane to allow for repetitive imaging at sub-cellular resolution and re-identification of structures for up to a few days1.

Imaging in vivo di intatto Larve di Drosophila a livello sub-cellulare Risoluzione

Recent improvements in optical imaging, genetically encoded fluorophores and genetic tools allowing efficient establishment of desired transgenic animal ...

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. Single-molecule imaging is gaining momentum as it provides exceptional access to the visualization of individual molecules in living cells. Here, we describe a technique that we developed to perform single-particle tracking photo-activated localization microscopy (sptPALM) in Drosophila larvae. Synaptic communication relies on key presynaptic proteins that act by docking, priming, and promoting the fusion of neurotransmitter-containing vesicles with the plasma membrane. A range of protein-protein and protein-lipid interactions tightly regulates these processes and the presynaptic proteins therefore exhibit changes in mobility associated with each of these key events. Investigating how mobility of these proteins correlates with their physiological function in an intact live animal is essential to understanding their precise mechanism of action. Extracting protein mobility with high resolution in vivo requires overcoming limitations such as optical transparency, accessibility, and penetration depth. We describe how photoconvertible fluorescent proteins tagged to the presynaptic protein Syntaxin-1A can be visualized via slight oblique illumination and tracked at the motor nerve terminal or along the motor neuron axon of the third instar Drosophila larva.

In Vivo Single-Molecule Tracking at the Drosophila Presynaptic Motor Nerve Terminal

Here we illustrate how single molecule photo-activated localization microscopy can be carried out on the motor nerve terminal of a live Drosophila melanogaster third instar larva.

In Vivo Singola molecola Tracking al terminale presinaptico nervo motore Drosophila

An increasing number of super-resolution microscopy techniques are helping to uncover the mechanisms that govern the nanoscale cellular world. ...

Neuroscienze

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. The molecular clock within each pacemaker neuron generates circadian rhythms in gene expression, which underlie the rhythmic neuronal functions essential to the operation of the circuit. Investigation of the properties of the individual molecular oscillators in different subclasses of pacemaker neurons and their interaction with neuronal signaling yields a better understanding of the circadian pacemaker circuit. Here, we present a time-lapse fluorescent microscopy approach developed to monitor the molecular clockwork in clock neurons of cultured Drosophila larval brain. This method allows the multi-day recording of the rhythms of genetically encoded fluorescent circadian reporters at single-cell resolution. This setup can be combined with pharmacological manipulations to closely analyze real-time response of the molecular clock to various compounds. Beyond circadian rhythms, this multipurpose method in combination with powerful Drosophila genetic techniques offers the possibility to study diverse neuronal or molecular processes in live brain tissue.

Single-cell Resolution Fluorescence Live Imaging of Drosophila Circadian Clocks in Larval Brain Culture

The goal of this protocol is to establish ex vivo Drosophila larval brain culture optimized to monitor circadian molecular rhythms with long-term fluorescence time-lapse imaging. The application of this method to pharmacological assays is also discussed.

Cella singola risoluzione fluorescenza Live Imaging di Drosophila orologi circadiani nel cervello larvale cultura

The circadian pacemaker circuit orchestrates rhythmic behavioral and physiological outputs coordinated with environmental cues, such as day/night cycles. ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

Vivo Imaging delle proteine ​​GFP-etichettati in<em&gt; Drosophila</em&gt; Gli oociti

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because the larval body wall and most internal organs are transparent. However, continuous live imaging of intact Drosophila larvae for longer than 30 min has been challenging because it is difficult to noninvasively immobilizeimmobilizing larvae for a long time. Here we present a larval mounting method called LarvaSPA that allows for continuous imaging of live Drosophila larvae with high temporal and spatial resolution for longer than 10 hours. This method involves partially attaching larvae to the coverslip using a UV-reactive glue and additionally restraining larval movement using a polydimethylsiloxane (PDMS) block. This method is compatible with larvae at developmental stages from second instar to wandering third instar. We demonstrate applications of this method in studying dynamic processes of Drosophila somatosensory neurons, including dendrite growth and injury-induced dendrite degeneration. This method can also be applied to study many other cellular processes that happen near the larval body wall.

LarvaSPA, A Method for Mounting Drosophila Larva for Long-Term Time-Lapse Imaging

This protocol describes a method for mounting Drosophila larvae to achieve longer than 10 h of uninterrupted time-lapse imaging in intact live animals. This method can be used to image many biological processes close to the larval body wall.

LarvaSPA, un metodo per montare la larva della Drosophila per l'imaging time-Lapse a lungo termine

Live imaging is a valuable approach for investigating cell biology questions. The Drosophila larva is particularly suited for in vivo live imaging because ...

Applicazioni di immobilizzazione dei tessuti Drosophila con coaguli di fibrina per l'imaging dal vivo

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Utilizzando Chips microfluidica per l'imaging dal vivo e studio delle risposte lesioni in

Visualizzazione di Live Drosophila Gliali-giunzione neuromuscolare con tinture fluorescenti

La preparazione di Drosophila Gli embrioni per Live-Imaging Utilizzando il protocollo goccia

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Preparazione di Sviluppo e degli adulti Drosophila Brains e retina per l'imaging dal vivo

Imaging in vivo di intatto Larve di Drosophila a livello sub-cellulare Risoluzione

In Vivo Singola molecola Tracking al terminale presinaptico nervo motore Drosophila

Cella singola risoluzione fluorescenza Live Imaging di Drosophila orologi circadiani nel cervello larvale cultura

Vivo Imaging delle proteine GFP-etichettati in

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Applicazioni di immobilizzazione dei tessuti Drosophila con coaguli di fibrina per l'imaging dal vivo

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Utilizzando Chips microfluidica per l'imaging dal vivo e studio delle risposte lesioni in

Visualizzazione di Live Drosophila Gliali-giunzione neuromuscolare con tinture fluorescenti

La preparazione di Drosophila Gli embrioni per Live-Imaging Utilizzando il protocollo goccia

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Preparazione di Sviluppo e degli adulti Drosophila Brains e retina per l'imaging dal vivo

Imaging in vivo di intatto Larve di Drosophila a livello sub-cellulare Risoluzione

In Vivo Singola molecola Tracking al terminale presinaptico nervo motore Drosophila

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