Il lavoro nel laboratorio Januschke è supportato da sovvenzioni wellcome trust 100031/Z/12/A e 1000032/Z/12/A. La struttura di imaging tissutale è supportata dalla sovvenzione WT101468 di Wellcome.

<ol>
	<li>Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs.">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).</li><li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+ex+vivo+culture+and+live+imaging+of+Drosophila+larval+imaginal+discs.">Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs.</a> PloS One. 11 (9), 0163744 (2016).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. 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L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).</li><li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte.">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168 (2017).</li><li>Martin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+of+the+Drosophila+adult+midgut+reveals+real-time+dynamics+of+division,+differentiation+and+loss.">Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss.</a> eLife. , (2018).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li><li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li><li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. 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R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKC-mediated+displacement+and+actomyosin-mediated+retention+polarize+Miranda+in+Drosophila+neuroblasts.">aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts.</a> eLife. 7, 166 (2018).</li><li>Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical-genetics+approach+to+study+the+role+of+atypical+Protein+Kinase+C+in+Drosophila.">A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila.</a> Development. 146 (2), (2019).</li><li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).</li><li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling.">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging.">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>. ImageJ macros [software] Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020)</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L'imaging dal vivo di cervelli larvali D. melanogaster a montaggio intero offre l'opportunità di osservare divisioni asimmetriche delle cellule staminali neurali in condizioni vicine a un contesto fisiologico. La prima parte del nostro protocollo introduce il nostro approccio sulla dissezione del cervello larvale. Come già affermato13, un aspetto critico della preparazione è evitare di danneggiare il cervello. L'aspetto più impegnativo di questo è separare il cervello dai dischi immaginari vicini senza tirare eccessivamente sul cervello. Il nostro approccio al "taglio senza trazione" è quello di eseguire un movimento di rettifica con le punte di una coppia di pini, o di far scorrere una punta di pin pin lungo altre due punte di pin che tengono la connessione tra i tessuti (Figura 1A) mentre Lerit et al. Consigliamo allo sperimentatore di provare tutti gli approcci e di adottare quello più adatto a se stesso. Suggeriamo inoltre di utilizzare punte di pipette rivestite in BSA o FCS piuttosto che strumenti di dissezione per trasferire cervelli isolati. Il rivestimento impedisce ai tessuti di attaccarsi alla plastica e consente il trasferimento sicuro dei tessuti mantenendoli sempre completamente immersi, senza sottometterli a una possibile deformazione transitoria mentre si attaccano allo strumento di dissezione durante il trasferimento. Le punte rivestite hanno altri vantaggi per consentire il trasferimento di più cervelli contemporaneamente, il che è particolarmente utile quando è fondamentale controllare il tempo di residenza dei campioni all'interno di un particolare mezzo; sono adatti per il trasferimento di altri tessuti, anche fragili come, ad esempio, corpi grassi; possono ospitare una vasta gamma di diverse dimensioni del campione utilizzando punte più grandi o tagliando l'estremità della punta.
Successivamente, questo protocollo descrive l'uso della coagulazione di Fibrinogen per immobilizzare il cervello larvale sul coverslip di un piatto di coltura. Un cervello è orientato all'interno di una goccia di mezzo di coltura + Fibrinogeno, dopo di che la coagulazione è indotta dall'aggiunta di Trombina. La formazione di fibrina è graduale, fornendo un'area di tempo durante la quale l'orientamento del campione può essere messo a punto, se necessario (Figura 2C). Se è necessaria una leggera compressione del campione - cosa che sconsigliamo nel caso di cervelli larvali - può anche essere regolata finemente premendo il coagulo più o meno vicino al campione durante i passaggi 3.4.4 e 3.5.2. Il principale vantaggio di questa coagulazione di Fibrinogen rispetto al protocollo descritto in Lerit et al., in cui i cervelli sono montati tra una membrana permeabile al gas e un coverslip, è la capacità di sostituire il mezzo di coltura durante l'imaging dal vivo. Un possibile vantaggio dell'uso di una membrana permeabile al gas rispetto al nostro protocollo potrebbe essere che fornisce un'ossigenazione ottimale dei campioni, che potrebbe essere più limitata con il nostro approccio poiché i cervelli sono separati dall'aria dal coagulo e da qualche mezzo. Per questo motivo, anche se non abbiamo valutato l'effetto della quantità di mezzo di coltura all'interno del piatto di coltura, suggeriamo di limitare la quantità di mezzo di coltura sopra i coaguli mantenendo i coaguli completamente immersi.
Poiché la manipolazione dei coaguli può essere sperimentalmente difficile e dispendiosa in termini di tempo, si consiglia allo sperimentatore di praticare prima la manipolazione dei coaguli senza campioni. Modulare il volume della goccia di mezzo di coltura + Fibrinogeno sul coverslip, la concentrazione di Fibrinogen o il volume e la concentrazione di Trombina potrebbero contribuire a facilitare la preparazione e potrebbero essere importanti quando si adatta il protocollo ad altri tipi di tessuti. Con abbastanza esperienza nella manipolazione dei coaguli, diversi cervelli possono essere immobilizzati in un unico coagulo se necessario, anche se complica la messa a punto dell'orientamento. Diversi coaguli possono essere formati sul coverslip, consentendo, ad esempio, di immagini campioni di diversi genotipi. È anche possibile esporre coaguli diversi sullo stesso copriscicolo a diversi mezzi di coltura, anche se occorre fare attenzione a non mescolare mai le gocce di mezzo di coltura che coprono i diversi coaguli. Una volta che i cervelli larvali sono immobilizzati e pronti per l'imaging dal vivo, si consiglia di seguire le raccomandazioni di Lerit etal. Aggiungiamo solo a queste raccomandazioni non solo per mantenere il cervello a 25 °C durante l'imaging dal vivo con un incubatore di stadio, ma anche per preriscaldare questa fase per almeno 30 minuti prima dell'inizio dell'imaging. Nelle nostre mani, non farlo sistematicamente si traduce in una forte deriva di attenzione.
Può essere vantaggioso in alcuni contesti essere in grado di eseguire microscopia correlata e fissare e immunosomodiare un campione dopo l'imaging dal vivo. Tuttavia, una limitazione dell'uso di coaguli di Fibrin è che è quasi impossibile isolare meccanicamente un cervello da un coagulo senza danneggiarlo. Un possibile modo per superare questa limitazione potrebbe essere quello di sviluppare metodi per degradare i coaguli di fibrina con plasmina o per indurre lo smontaggio del coagulo mediante l'aggiunta di un peptide che imita le manopole permettendo la polimerizzazione della Fibrina28. In genere usiamo coaguli di fibrina su campioni che vanno da singole cellule a tessuti lunghi 200 μM, ma potremmo anche immobilizzare con successo nei coaguli e nel cervello dell'immagine da bombi adulti larghi oltre 3 mm. Resta da determinare il limite superiore della dimensione del campione che può essere immobilizzato nei coaguli. Allo stesso modo, sebbene di solito immaginiamo campioni immobilizzati per 4-5 ore, abbiamo immaginato con successo i neuroblasti nella coltura primaria per un massimo di 3 giorni, indicando che il coagulo almeno non interferisce con la vitalità a lungo termine. Al contrario, i coaguli possono facilitare la sostituzione regolare del mezzo, un requisito per l'imaging a lungo termine, senza la necessità di dispositivi come pompe peristaltiche a questo scopo. Anche se non abbiamo misurato i parametri di permeabilità dei coaguli di fibrina, la natura fibrosa simile a un gel dei coaguli sembra essere penetrabile da molecole permeabili cellulari. Abbiamo scoperto che Latrunculin A, Colcemid o 1-NAPP1, ligandi a tag HALO e altri coloranti standard utilizzati in biologia cellulare raggiungono le cellule nel coagulo di fibrina senza problemi e finora non hanno incontrato molecole che sarebbero state trattenute dal coagulo, che, tuttavia, è una possibilità che deve essere testata empiricamente.
In conclusione, l'utilizzo di coaguli di Fibrin fornisce un modo affidabile e relativamente facile da implementare per immobilizzare i tessuti viventi per l'imaging dal vivo. Al di là della sua utilità nel limitare la deriva laterale, la capacità di cambiare il mezzo di coltura durante l'imaging vivo si è dimostrata inestimabile per il nostro approccio di genetica chimica allo studio della divisione cellulare asimmetrica dei neuroblasti D. melanogaster 21. Prevediamo che questa tecnica sarà utile per gli studi su una vasta gamma di tessuti diversi, in particolare se coinvolgono genetica chimica o, ad esempio, autoeticazione proteica29.
La nostra macro MultiHyperStackReg si basa sul plug-in TurboReg ImageJ, che allinea frame o sezioni successive di uno stack, e sul plug-in MultiStackReg ImageJ, che consente di applicare le trasformazioni ad altri stack. MultiHyperStackReg consente semplicemente di applicare queste trasformazioni agli iperstack (stack con almeno quattro dimensioni). Poiché l'uso di MultiHyperStackReg, come lo descriviamo, richiede molte azioni e può richiedere molto tempo, abbiamo anche scritto la macro AutoHyperStackReg, che esegue automaticamente tutti i passaggi descritti nei passaggi 6.2 e 6.3. Tuttavia, contrariamente a MultiHyperStackReg, AutoHyperStackReg attualmente non ha la possibilità di calcolare l'allineamento di uno stack in base a una sottoregione di questo stack, un'opzione che abbiamo trovato a volte è cruciale per un allineamento soddisfacente. Un'altra limitazione di AutoHyperStackReg è che il suo utilizzo è limitato alle traduzioni e non alle altre trasformazioni proposte da TurboReg e MultiStackReg, mentre MultiHyperStackReg può essere applicato a un hyperstack qualsiasi tipo di trasformazione se l'utente ne ha bisogno. Le versioni future implementeranno queste funzioni e saranno disponibili su GitHub30. Infine, la nostra macro di linee rotanti può fornire un modo semplice per misurare rapidamente i segnali corticali in time lapses, anche se la corteccia cambia la sua posizione o orientamento nel tempo. Se la sua modalità di tracciamento o la sua modalità di non tracciamento è più adatta per l'analisi dipende dalla qualità e dalla coerenza del segnale corticale. La modalità di tracciamento è più facile da usare in quanto l'utente non ha bisogno di considerare dove sarà la corteccia per ogni punto di tempo e può adattarsi a grandi cambiamenti di posizione e orientamento nel tempo. Tuttavia, è adatto solo se il segnale corticale rimane abbastanza forte per il rilevamento durante l'intero filmato: la mancata rilevazione di nient'altro che la corteccia (ad esempio, un compartimento citoplasmatico luminoso vicino alla corteccia) può compromettere il rilevamento per ogni successivo punto di tempo (ad esempio, il compartimento citoplasmatico si allontana dalla corteccia e le linee corticalican lo seguono per il resto del tempo decadrà). La modalità di non tracciamento non ha questa insidia in quanto il rilevamento è limitato alla linea originariamente disegnata dall'utente (ad esempio, un compartimento citoplasmatico luminoso può causare il fallimento del rilevamento per alcuni punti di tempo, ma man mano che il compartimento citoplasmatico si allontana dalla zona di rilevamento, riprende il corretto rilevamento della corteccia), ma non si comporta bene se la posizione o l'orientamento della corteccia cambia molto nel tempo. La prossima funzione (che sarà disponibile su GitHub30) da sviluppare per la modalità di tracciamento sarà la possibilità di analizzare solo i punti di tempo specificati e di definire un punto di tempo di riferimento (anziché il primo punto di tempo) prima del quale e dopo di che verrà eseguito il rilevamento, che consentirà all'utente di evitare almeno punti di tempo problematici.

Drosophila continua ad essere un importante sistema modello per studiare una vasta gamma di questioni biologiche ed è eccelleto nel far progredire le conoscenze in molte discipline per decenni. Una caratteristica che lo distingue particolarmente è che è particolarmente adatto per l'imaging dal vivo. La capacità di monitorare i processi subcellulari o il comportamento di cellule e tessuti in tempo reale continua a contribuire a generare concetti chiave rilevanti per la biologia cellulare e dello sviluppo. Molti protocolli di successo sono stati sviluppati da diversi gruppi per mantenere vivi e sani tali campioni di Drosophila per studiare il comportamento del campione e delle molecole fluorescenti vive. Organi e tessuti della mosca come idischi immaginari1,2,il cervello larvale3,4,5, 6o camere d'uovo di femmine adulte7,8,9o l'intestino adulto10 per esempio possono essere estratti e conservati in coltura per l'imaging con microscopia time-lapse. Una sfida fondamentale per l'imaging dal vivo consiste nel garantire che il campione sia tenuto vicino alla superficie di imaging per una risoluzione ottimale e immobile senza compromettere l'integrità del campione che può essere sensibile agli impatti meccanici. Per studiare le cellule staminali neurali, chiamate neuroblasti o neuroni nel cervello larvale della Drosophila, ad esempio, mantenere i campioni vicini alla superficie di imaging può essere ottenuto coprendoli con mezzi di coltura in camere di imaging sigillate11,12,13. Tuttavia, questo approccio non consente facilmente lo scambio di media limitando così lo spazio sperimentale di manovra. In alternativa, i campioni possono essere preparati e posizionati su coverlips trattati per aumentare l'adesione delle cellule e consentire la microscopia a visita multi-punto e l'imaging esteso a cellule vive in piatti a coltura aperta, che potenzialmente consentono lo scambio di media, ma non forniscono mezzi facili per prevenire la deriva o la perdita del campione durante lo scambiodi media 14,15.
Il metodo del coagulo di Fibrina originariamente sviluppato per studiare la meiosi negli spermatociti vita gru-mosca16 è specificamente adatto a superare questi problemi. Il fibrinogeno viene sciolto nel mezzo di coltura pertinente, i campioni posizionati e orientati in una goccia di questa soluzione su un'adeguata camera di imaging vetro-superficie prima dell'aggiunta di Trombina, con conseguente rapida formazione di un coagulo di Fibrina insolubile, una rete fibrosa appiccicosa che aderisce alla superficie del vetro e ai campioni garantendo al contempo l'accesso del campione al terreno di coltura. Il mezzo può quindi essere scambiato senza perturbo il coagulo o la posizione del campione. Lo scambio di mezzi di coltura durante l'imaging è, ad esempio, auspicabile quando gli inibitori devono essere aggiunti come nel metodo originale o per esperimenti di lavaggio o inseguimento di impulsi o quando i coloranti fluorescenti devono essere aggiunti durante l'imaging di cellule vive mantenendo cellule e tessuti in posizione. I coaguli di fibrina sono adatti per l'imaging di tessuti Drosophila e singolecellule 13,17. I coaguli di fibrina possono essere ulteriormente utilizzati per aiutare a orientare i campioni, che a causa della loro forma o altre proprietà normalmente non sarebbero orientati nel modo desiderato modulando la posizione del campione all'interno del coagulo di Fibrina e la forma del coagulo stesso.
Qui forniamo un aggiornamento sui nostri attuali metodi di imaging basati sul coagulo di Fibrin e forniamo strumenti per l'analisi delle immagini basata sulla segmentazione e ci concentriamo sull'uso di questo metodo per studiare le divisioni dei neuroblasti nel cervello della mosca in via di sviluppo. Usiamo regolarmente il metodo del coagulo di Fibrin per seguire più campioni in coaguli diversi nello stesso piatto di coltura. Ciò consente di i) l'imaging di eventi subcellulari come il comportamento centrosoma o la localizzazione dell'mRNAdal vivo 18,19, ii) il monitoraggio del comportamento dei campioni durante il trattamento farmacologico di diversi genotipi sotto le stesse impostazioni di imaging utilizzando visite multi-punto microscopia20, iii) studio degli effetti dell'inibizione acutadegli enzimi 21 e iv) minimizzazione della deriva per studiare i cambiamenti nell'orientamento della divisione cellulare delle cellule all'interno del loro ambiente fisiologico su laser-ablazionemirata 22. Mentre gli effetti indesiderati di Trombina e Fibrinogeno e del coagulo di Fibrina devono essere testati empiricamente per ogni campione, questo metodo è in linea di principio adatto a immobilizzare qualsiasi tipo di campione che deve essere analizzato mediante imaging a cellule vive e in Drosophila è stato utilizzato con successo per studiare molteplici aspetti della biologia dei neuroblasti5,19,20, ma anche la dinamica delle proiezioni citosensoriali delle cellule staminali della linea germinalefemminile 23 e i cambiamenti di polarità sull'inibizione acuta dell'aPKC delle cellule follicolari delle camere uovo femminili drosophila 21.
L'imaging fluorescente time-lapse si traduce nella generazione di complessi set di dati 3D risolti nel tempo che richiedono metodi per estrarre queste informazioni quantitative. Qui descriviamo il nostro ulteriore sviluppo dimacro 24 basate su ImageJ che possono essere utilizzate per correggere la deriva negli iperstack e macro ImageJ su misura che consentono la quantificazione semi-automatizzata della fluorescenza multicanale presso la corteccia cellulare sviluppata per quantificare le proteine corticali nei neuroblasti dei cervelli larvali di Drosophila o dei singoli neuroblasti nella coltura cellulare primaria.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin bovine serum, BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from human plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP1 Analog (1NA-PP1)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>529579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex spot plate with nine depressions</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS722085-18EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging

Drosophila è un importante sistema modello per studiare una vasta gamma di questioni biologiche. Vari organi e tessuti di diversi stadi di sviluppo della mosca come i dischi immaginari, le camere larvali del cervello o delle uova delle femmine adulte o dell'intestino adulto possono essere estratti e tenuti in coltura per l'imaging con microscopia time-lapse, fornendo preziose informazioni sulla biologia cellulare e dello sviluppo. Qui, descriviamo in dettaglio il nostro attuale protocollo per la dissezione dei cervelli larvali di Drosophila, e poi presentiamo il nostro attuale approccio per immobilizzare e orientare cervelli larvali e altri tessuti su una coverlip di vetro usando coaguli di fibrina. Questo metodo di immobilizzazione richiede solo l'aggiunta di Fibrinogen e Thrombin al mezzo di coltura. È adatto per l'imaging time lapse ad alta risoluzione su microscopi rovesciati di più campioni nello stesso piatto di coltura, riduce al minimo la deriva laterale frequentemente causata dai movimenti della fase del microscopio in microscopia da visita multi-punto e consente l'aggiunta e la rimozione di reagenti durante il corso di imaging. Presentiamo anche macro su misura che utilizziamo regolarmente per correggere per la deriva e per estrarre ed elaborare informazioni quantitative specifiche dall'analisi time-lapse.

Immobilizzazione dei tessuti Drosophila con coaguli di Fibrina e scambio di mezzi di coltura durante l'imaging dal vivo. Dopo essere stati sezionati seguendo la procedura presentata nella fase 2 (Figura 1) e immobilizzati nei coaguli di Fibrina sullo stesso coverslip seguendo la procedura presentata al passaggio 3 (Figura 2), i cervelli larvali che esprimono Bazooka taggato dalla GFP (Baz::GFP), l'ortologo a mosca della proteina polarità Par-3, sono stati imageizzati per 30 minuti in imaging confocale multi-posizione time-lapse. Baz::GFP è combinato con apkcas4, un allele che consente l'inibizione acuta della proteina atipica chinasi C (aPKC) attraverso l'aggiunta del piccolo atp analogico 1-NAPP120. 1-NAPP1 è stato quindi aggiunto al mezzo di coltura seguendo la procedura presentata nella fase 4 e l'imaging dal vivo è stato ripreso per 2,5 ore. I cervelli di controllo che trasportavano una versione di tipo selvaggio dell'aPKC della chinasi non hanno reagito all'analogo ATP, mentre i cervelli che trasportavano inoltre una mutazione analoga sensibile dell'aPKC (apkcas4) hanno mostrato una contrazione del neuroepitelio e dei gruppi luminosi di Baz nei neuroblasti e nella loro progenie(Figura 6, Video 1). I neuroblasti continuano a dividersi per tutto il time-lapse, indicando che il tessuto rimane sano, e il cervello mostra poca deriva nonostante il cambiamento del mezzo di coltura, indicando che sono ben immobilizzati. Allo stesso modo, dopo essere stati sezionati seguendo la procedura presentata in27, gli ovariole che esprimono Baz::GFP sono stati immobilizzati nei coaguli di Fibrina sullo stesso coverslip e con immagini per 8 minuti, dopo di che l'applicazione di 1-NAPP1 ha indotto la contrazione di cellule follicolari mutanti apkcas4 ma non di controlli(Figura 7, Video 2).
Correzione della deriva laterale e dello stato attivo mediante MultiHyperstackReg. Un hyperstack che mostra sia la deriva laterale che quella di messa a fuoco(Video 3,pannello sinistro) è stato prima corretto per la deriva laterale (passaggio 6.2, Figura 3, Video 3, pannello centrale), quindi la deriva di messa a fuoco (passaggio 6.3, Figura 4, Video 3, pannello destro) utilizzando il plugin MultiStackReg e la macro MultiHyperstackReg, con conseguente sostanziale riduzione dei movimenti osservati nell'iperstack originale.
Misurazione corticale del segnale utilizzando lattine di linea rotanti Un neuroblasto che esprime Baz::GFP (verde) e la proteina transmembrana CD4 taggata con una proteina fluorescente infrarossa (CD4::mIFP, rosso) è stato immaginato durante una mitosi. Il segnale CD4::mIFP è stato utilizzato come riferimento per rilevare la corteccia in varie parti del neuroblasto con lattine di linee (passo 7, Figura 5, Figura 8A-C) e il segnale Baz::GFP è stato misurato nelle posizioni rilevate Figura 8D). Durante la loro divisione, i neuroblasti si polarizzarono transitoriamente stabilendo domini corticali distinti e opposti: il polo apicale e il polo basale. Baz definisce il polo apicale e, coerentemente, il segnale Baz::GFP aumentato al polo apicale del neuroblasto e diminuito al polo basale durante la divisione (Figura 8C,D). La posizione della corteccia è stata tracciata in modo soddisfacente per tutto il time-lapse(Figura 8C, Video 4). Le linee e i genotipi drosophila sono referenziati nella tabella supplementare 1-2.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> Figura 6: Applicazione di un analogo ATP sul cervello larvale immobilizzato durante l'imaging dal vivo. (A) Imaging dal vivo di due cervelli larvali che esprimono Baz::GFP immobilizzato sullo stesso coverslip. Il mezzo di coltura viene cambiato in una concentrazione di 10 μM dell'ATP analogico 1-NAPP1 a 0 min. I cervelli di controllo non reagiscono visibilmente all'analogo ATP, mentre i cervelli che portano una mutazione sensibile analogica diaPKC ( aPKCAS4) mostrano una contrazione del neuroepitelio (punte di freccia) e dei gruppi luminosi di Baz nei neuroblasti e nella loro progenie. Proiezione di intensità massima di 33 fette per una profondità di 23 μM. Barra di scala: 20 μM. (B) Ingrandimento del neuroepitelio. Barra di scala: 10 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> Figura 7: Applicazione di un analogo ATP sulle camere delle uova immobilizzate durante l'imaging dal vivo. Imaging dal vivo di due ovariole che esprimono Baz::GFP immobilizzato sullo stesso coverslip. Il mezzo di coltura viene cambiato in una concentrazione di 10 μM dell'ATP analogico 1-NAPP1 a 0 min. Le camere delle uova di controllo non reagiscono visibilmente all'analogo ATP, mentre le camere delle uova che portano una mutazione sensibile analogica diaPKC (aPKCAS4) mostrano una contrazione dell'epitelio (punte di freccia) che alla fine porta all'apparente rottura delle giunzioni aderenti. Proiezione di intensità massima di 33 fette per una profondità di 27 μM. Barra di scala: 20 μM. Fare clic <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> Figura 8: Misurazione del segnale corticale mediante lacanne rotanti. (A) Neuroblasto D. melanogaster vivo che esprime Baz::GFP (verde) e CD4::mIFP (rosso). Linee ciano: linee di scansione iniziali tracciate perpendicolarmente a varie zone corticali da misurare. Barra di scala: 5 μM. (B) Identificazione della corteccia (linea blu scuro) usando lattine di linee corticali e CD4::mIFP (rosso) come canale di riferimento. Linea ciano: area definita dal parametro "Misura intorno" (qui, 2 pixel), dove il segnale viene misurato dopo il rilevamento della corteccia. Barra di scala: 2 μm. (C) Ciano: aree corticali identificate durante una divisione di neuroblasti dal metodo delle reti a linee rotanti dalle linee di scansione iniziali visualizzate in (A), usando CD4::mIFP (rosso) come canale di riferimento. Barra di scala: 5 μM. Freccia: polo apicale. Punta di freccia: palo basale. (D) Misurazione dell'intensità del segnale Baz::GFP nel tempo nelle due zone corrispondenti identificate dalle lattine rotanti visualizzate in (C). Durante la mitosi, Baz::GFP si arricchisce transitoriamente al polo apicale del neuroblasto e si esaurisce dal polo basale opposto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Video 1: Applicazione dello scambio di media sul cervello larvale immobilizzato durante l'imaging dal vivo per aggiungere un inibitore, presentato nella Figura 6, barra di scala: 20 μm. Fare <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">clic qui per scaricare questo video.</a>
Video 2: Applicazione dello scambio di supporti su camere di uova immobilizzate durante l'imaging dal vivo per aggiungere un inibitore, presentato nella figura 7, barra di scala: 20 μm. Fare <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">clic qui per scaricare questo video.</a>
Video 3: Correzione della deriva laterale e di messa a fuoco con MultiHyperStackReg. Imaging dal vivo di un neuroblasto che esprime la sonda di membrana PH::GFP. Xy: piano focale singolo. Xz: reslice ortogonale. A sinistra: prima della correzione della deriva. Al centro: dopo la correzione della deriva laterale. A destra: dopo aver corretto la deriva laterale e di messa a fuoco, barra di scala: 10 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo video.</a>
Video 4: Rilevamento della corteccia utilizzando lattine rotanti, presentato nella figura 8, barra di scala: 5 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo video.</a>
Tabella supplementare 1: Genotipi di tessuti Drosophila con immagini. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
Tabella supplementare 2: Origine dei transgeni utilizzati. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questa tabella.</a>
File di codifica supplementare 1: Origine dei transgeni utilizzati. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File di codifica supplementare 2: Origine dei transgeni utilizzati. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>
File di codifica supplementare 3: Origine dei transgeni utilizzati. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file.</a>

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Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Questo protocollo descrive le applicazioni dell'immobilizzazione dei campioni utilizzando coaguli di Fibrin, limitando la deriva e consentendo l'aggiunta e il lavaggio di reagenti durante l'imaging dal vivo. I campioni vengono trasferiti in una goccia di Fibrinogen contenente terreno di coltura sulla superficie di un coverslip, dopo di che la polimerizzazione è indotta dall'aggiunta di trombina.

Applicazioni di immobilizzazione dei tessuti Drosophila con coaguli di fibrina per l'imaging dal vivo

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

3.0K Views.  University of Dundee. Questo protocollo descrive le applicazioni dell'immobilizzazione dei campioni utilizzando coaguli di Fibrin, limitando la deriva e consentendo l'aggiunta e il lavaggio di reagenti durante l'imaging dal vivo. I campioni vengono trasferiti in una goccia di Fibrinogen contenente terreno di coltura sulla superficie di un coverslip, dopo di che la polimerizzazione è indotta dall'aggiunta di trombina.

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Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-imaging del<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupa Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily conserved structures that compose it are assembled remains under investigation. Their size and physiological features often constrain manipulation and imaging applications. The culture of immortalized cell lines is widely used, but it can only replicate the early steps of differentiation.
Here, we describe a protocol that enables easy genetic manipulation of myofibers originating from primary mouse myoblasts. After one week of differentiation, the myofibers display contractility, aligned sarcomeres and triads, as well as peripheral nuclei. The entire differentiation process can be followed by live imaging or immunofluorescence. This system combines the advantages of the existing ex vivo and in vitro protocols. The possibility of easy and efficient transfection as well as the ease of access to all differentiation stages broadens the potential applications. Myofibers can subsequently be used not only to address relevant developmental and cell biology questions, but also to reproduce muscle disease phenotypes for clinical applications.

In Vitro Differentiation of Mature Myofibers for Live Imaging

Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.

La differenziazione in vitro di miofibre mature per Live Imaging

Skeletal muscles are composed of myofibers, the biggest cells in the mammalian body and one of the few syncytia. How the complex and evolutionarily ...

Live Confocal Imaging of Developing Arabidopsis Flowers

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. Recent advances in confocal microscopy, combined with the development of numerous fluorophores, have overcome these issues and opened the possibility to study the expression of several genes simultaneously, with a good cellular resolution, in live samples. Live confocal imaging provides plant biologists with a powerful tool to study development, and has been extensively used to study root growth and the formation of lateral organs on the flanks of the shoot apical meristem. However, it has not been widely applied to the study of flower development, in part due to challenges that are specific to imaging flowers, such as the sepals that grow over the flower meristem, and filter out the fluorescence from underlying tissues. Here, we present a detailed protocol to perform live confocal imaging on live, developing Arabidopsis flower buds, using either an upright or an inverted microscope.

Live confocal imaging provides biologists with a powerful tool to study development. Here, we present a detailed protocol for the live confocal imaging of developing Arabidopsis flowers.

Vivere Confocale Imaging di sviluppare Arabidopsis Fiori

The study of plant growth and development has long relied on experimental techniques using dead, fixed tissues and lacking proper cellular resolution. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

A lungo termine Imaging in diretta di<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco Eye

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Coltivazione dell'ovulo per Live cell Imaging di zigote polarizzazione e Patterning di embrione in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imaging Live di Mouse Seconda Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

Metodi per pH intracellulare Imaging del lignaggio di cellule staminali del follicolo in Live tessuto ovarico di Drosophila

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Live Cell Imaging della segregazione cromosomica durante la mitosi

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Live Imaging e analisi delle contrazioni muscolari nell'embrione di Drosophila

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin rods are a hallmark of a conserved, inducible Actin Stress Response (ASR) that accompanies human pathologies, including neurodegenerative disease. Previously, we showed that the ASR contributes to morphogenesis failures and reduced viability of developing embryos. This protocol allows the continued study of mechanisms underlying actin rod assembly and the ASR in a model system that is highly amenable to imaging, genetics and biochemistry. Embryos are collected and mounted on a coverslip to prepare them for injection. Rhodamine-conjugated globular actin (G-actinRed) is diluted and loaded into a microneedle. A single injection is made into the center of each embryo. After injection, embryos are incubated at elevated temperature and intranuclear actin rods are then visualized by confocal microscopy. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments may be performed on the actin rods; and other actin-rich structures in the cytoplasm can also be imaged. We find that G-actinRed polymerizes like endogenous G-actin and does not, on its own, interfere with normal embryo development. One limitation of this protocol is that care must be taken during injection to avoid serious injury to the embryo. However, with practice, injecting G-actinRed into Drosophila embryos is a fast and reliable way to visualize actin rods and can easily be used with flies of any genotype or with the introduction of other cellular stresses, including hypoxia and oxidative stress.

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The goal of this protocol is to inject Rhodamine-conjugated globular actin into Drosophila embryos and image intranuclear actin rod assembly following heat stress.

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...