El trabajo en el laboratorio Januschke está respaldado por las subvenciones fiduciarios Wellcome 100031/Z/12/A y 1000032/Z/12/A. La instalación de imágenes tisulares está respaldada por la subvención WT101468 de Wellcome.

<ol>
	<li>Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs.">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).</li><li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+ex+vivo+culture+and+live+imaging+of+Drosophila+larval+imaginal+discs.">Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs.</a> PloS One. 11 (9), 0163744 (2016).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. 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M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).</li><li>Dai, W., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+border+cell+migration+in+Drosophila.">Live imaging of border cell migration in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).</li><li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte.">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168 (2017).</li><li>Martin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+of+the+Drosophila+adult+midgut+reveals+real-time+dynamics+of+division,+differentiation+and+loss.">Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss.</a> eLife. , (2018).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).</li><li>Sabado, V., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+fluorescence+live+imaging+of+Drosophila+circadian+clocks+in+larval+brain+culture.">Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).</li><li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li><li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li><li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+drosophila+neuroblast+lineages.">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages.</a> PloS One. 8 (11), 79588 (2013).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).</li><li>Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+recording+of+centrosomes+and+other+organelles+in+Drosophila+neuroblasts.">Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts.</a> Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).</li><li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA.">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li><li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+drosophila+neural+stem+cells.">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells.</a> Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).</li><li>Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKC-mediated+displacement+and+actomyosin-mediated+retention+polarize+Miranda+in+Drosophila+neuroblasts.">aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts.</a> eLife. 7, 166 (2018).</li><li>Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical-genetics+approach+to+study+the+role+of+atypical+Protein+Kinase+C+in+Drosophila.">A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila.</a> Development. 146 (2), (2019).</li><li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).</li><li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling.">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging.">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>. ImageJ macros [software] Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020)</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Las imágenes en vivo de cerebros larvarios enteros del monte D. melanogaster proporcionan la oportunidad de observar divisiones asimétricas de células madre neuronales en condiciones cercanas a un contexto fisiológico. La primera parte de nuestro protocolo introduce nuestro enfoque sobre la disección de cerebros larvarios. Como ya se ha dicho13,un aspecto crítico de la preparación es evitar dañar el cerebro. El aspecto más desafiante de esto es separar el cerebro de los discos imaginales vecinos sin tirar excesivamente sobre el cerebro. Nuestro enfoque para "cortar sin tirar" es realizar un movimiento de molienda con las puntas de un par de fórceps, o deslizar una punta de fórceps a lo largo de otras dos puntas de fórceps que sostienen la conexión entre los tejidos(Figura 1A),mientras que Lerit et al. describen los movimientos similares a las sierras con un pasador diseccionador. Aconsejamos al experimentador que pruebe todos los enfoques y adopte el más adecuado para sí mismos. También sugerimos el uso de puntas de pipeta recubiertas de BSA o FCS en lugar de herramientas de disección para transferir cerebros aislados. El revestimiento evita que los tejidos se peguen al plástico y permite la transferencia segura de los tejidos manteniendo siempre completamente sumergidos, sin someterlos a una posible deformación transitoria, ya que se adhieren a la herramienta de disección durante la transferencia. Las puntas recubiertas tienen otras ventajas para permitir la transferencia de varios cerebros a la vez, lo que es particularmente útil cuando es fundamental controlar el tiempo de residencia de las muestras dentro de un medio en particular; son adecuados para la transferencia de otros tejidos, incluso frágiles como, por ejemplo, cuerpos gordos; pueden acomodar una amplia gama de diferentes tamaños de muestra mediante el uso de puntas más grandes o el corte de la extremidad de la punta.
A continuación, este protocolo describe el uso de la coagulación de Fibrinogen para inmovilizar cerebros larvarios en la portada de un plato de cultivo. Un cerebro está orientado dentro de una gota de medio de cultivo + Fibrinógeno, después de lo cual la coagulación es inducida por la adición de trombina. La formación de fibrina es gradual, proporcionando una ventana de tiempo durante la cual la orientación de la muestra se puede ajustar, si es necesario (Figura 2C). Si se requiere una ligera compresión de la muestra - que aconsejamos en el caso de los cerebros larvarios - también se puede ajustar finamente presionando el coágulo más o menos cerca de la muestra durante los pasos 3.4.4 y 3.5.2. La principal ventaja de esta coagulación de Fibrinogen sobre el protocolo descrito en Lerit et al., en el que los cerebros se montan entre una membrana permeable al gas y un tubo de cubierta, es la capacidad de reemplazar el medio de cultivo durante las imágenes en vivo. Una posible ventaja de utilizar una membrana permeable al gas sobre nuestro protocolo podría ser que proporciona una oxigenación óptima de las muestras, que podría ser más limitada con nuestro enfoque a medida que los cerebros están separados del aire por el coágulo y algún medio. Por esta razón, aunque no evaluamos el efecto de la cantidad de medio de cultivo dentro del plato de cultivo, sugerimos limitar la cantidad de medio de cultivo encima de los coágulos manteniendo los coágulos completamente sumergidos.
Como la manipulación de los coágulos puede ser experimentalmente difícil y lenta, recomendamos que el experimentador primero practica manipular coágulos sin muestras. Modular el volumen de la gota de medio de cultivo + Fibrinógeno en el deslizamiento de cubierta, la concentración de Fibrinógeno o el volumen y concentración de trombina podría ayudar a facilitar la preparación y podría ser importante a la hora de adaptar el protocolo a otros tipos de tejidos. Con suficiente experiencia manipulando los coágulos, varios cerebros pueden ser inmovilizados en un coágulo si es necesario, aunque complica el ajuste de la orientación. Se pueden formar varios coágulos en el deslizamiento de cubierta, lo que permite, por ejemplo, tomar muestras de imágenes de diferentes genotipos. También es posible exponer diferentes coágulos en las mismas portadas a diferentes medios de cultivo, aunque hay que tener cuidado de no mezclar nunca las gotas de medio de cultivo que cubren los diferentes coágulos. Una vez que los cerebros larvarios están inmovilizados y listos para la toma de imágenes en vivo, aconsejamos seguir las recomendaciones de Lerit et al.13 para evitar el fotodamage excesivo. Sólo a estas recomendaciones nos sumamos no sólo para mantener los cerebros a 25 °C durante las imágenes en vivo con una incubadora de etapas, sino también para precalentar esta etapa durante al menos 30 minutos antes del inicio de la toma de imágenes. En nuestras manos, no hacerlo sistemáticamente resulta en una fuerte deriva de enfoque.
Puede ser ventajoso en algunos contextos poder realizar microscopía correlacionada y fijar e inmunodeprimar una muestra después de la toma de imágenes en vivo. Sin embargo, una limitación del uso de coágulos de Fibrin es que es casi imposible aislar mecánicamente un cerebro de un coágulo sin dañarlo. Una posible manera de superar esta limitación podría ser desarrollar métodos para degradar coágulos de Fibrina con Plasmin o para inducir el desmontaje del coágulo mediante la adición de un péptido imitando las perillas permitiendo la polimerización fibrina28. Normalmente usamos coágulos de fibrina en muestras que van desde células individuales hasta tejidos largos de 200 μM, pero también podríamos inmovilizarnos con éxito en coágulos y cerebros de imágenes de abejorros adultos de más de 3 mm de ancho. Queda por determinar el límite superior del tamaño de la muestra que se puede inmovilizar en coágulos. Del mismo modo, aunque normalmente tomamos muestras inmovilizadas de imagen durante 4 a 5 h, realizamos imágenes exitosas de neuroblastos en cultivo primario durante un período de hasta 3 días, lo que indica que el coágulo al menos no interfiere con la viabilidad a largo plazo. Por el contrario, los coágulos pueden facilitar la sustitución regular del medio, un requisito para la toma de imágenes a largo plazo, sin necesidad de dispositivos como bombas peristálticas para este fin. Si bien no hemos medido los parámetros de permeabilidad de los coágulos de fibrina, la naturaleza fibrosa similar al gel de los coágulos parece ser penetrable por moléculas permeables celulares. Encontramos que latrunculina A, Colcemid o 1-NAPP1, ligandos de etiqueta HALO y otros tintes estándar utilizados en la biología celular llegan a las células en el coágulo de fibrina sin ningún problema y hasta ahora no han encontrado moléculas que serían retenidas por el coágulo, que, sin embargo, es una posibilidad que necesita ser probada empíricamente.
En conclusión, el uso de coágulos de Fibrin proporciona una forma fiable y relativamente fácil de implementar una forma de inmovilizar los tejidos vivos para obtener imágenes en vivo. Más allá de su utilidad para limitar la deriva lateral, la capacidad de cambiar el medio de cultivo durante las imágenes en vivo ha demostrado ser invaluable para nuestro enfoque de genética química para estudiar la división celular asimétrica de los neuroblastos D. melanogaster 21. Anticipamos que esta técnica será beneficiosa para los estudios en una amplia gama de tejidos diferentes, particularmente si implican genética química o, por ejemplo, autoetiquetamiento de proteínas29.
Nuestra macro MultiHyperStackReg se basa en el plugin TurboReg ImageJ, que alinea fotogramas o sectores sucesivos de una pila, y el plugin MultiStackReg ImageJ, que permite aplicar las transformaciones a otras pilas. MultiHyperStackReg simplemente permite aplicar estas transformaciones a hiperstacks (pilas con al menos cuatro dimensiones). Como el uso de MultiHyperStackReg, como lo describimos, requiere muchas acciones y puede llevar bastante tiempo, también escribimos la macro AutoHyperStackReg, que realiza automáticamente todos los pasos descritos en los pasos 6.2 y 6.3. Sin embargo, contrariamente a MultiHyperStackReg, AutoHyperStackReg actualmente carece de la posibilidad de calcular la alineación de una pila basada en una subregión de esta pila, una opción que encontramos a veces es crucial para una alineación satisfactoria. Otra limitación de AutoHyperStackReg es que su uso está restringido a traducciones y no a las otras transformaciones propuestas por TurboReg y MultiStackReg, mientras que MultiHyperStackReg puede aplicar a un hiperstack cualquier tipo de transformación en caso de que el usuario lo necesite. Las versiones futuras implementarán estas funciones y estarán disponibles en GitHub30. Por último, nuestra macro de líneas giratorias puede ser una forma fácil de medir rápidamente las señales corticales en lapsos de tiempo, incluso si la corteza cambia su posición u orientación con el tiempo. Si su modo de seguimiento o su modo de no seguimiento es el más adecuado para el análisis depende de la calidad y consistencia de la señal cortical. El modo de seguimiento es más fácil de usar, ya que el usuario no necesita considerar dónde estará la corteza para cada punto de tiempo y puede acomodar grandes cambios de posición y orientación con el tiempo. Sin embargo, sólo es adecuado si la señal cortical sigue siendo lo suficientemente fuerte para su detección durante toda la película: una falla en la detección de cualquier otra cosa que no sea la corteza (por ejemplo, un compartimento citoplasmático brillante cerca de la corteza) puede comprometer la detección para cada punto de tiempo siguiente (por ejemplo, el compartimento citoplasmático se aleja de la corteza y las líneas corticales pueden seguirlo durante el resto del lapso de tiempo). El modo de no seguimiento no tiene este escollo, ya que la detección se limita a la línea dibujada originalmente por el usuario (por ejemplo, un compartimento citoplasmático brillante puede hacer que la detección falle durante unos pocos puntos de tiempo, pero a medida que el compartimento citoplasmático se aleja de la zona de detección, se reanuda la detección adecuada de la corteza), pero no se comporta bien si la posición o orientación de la corteza cambia mucho con el tiempo. La siguiente característica (que estará disponible en GitHub30)que se desarrollará para el modo de seguimiento será la opción de analizar solo los puntos de tiempo especificados y definir un punto de tiempo de referencia (en lugar del primer punto de tiempo) antes del cual y después de lo cual se realizará la detección, lo que permitirá al usuario al menos evitar puntos de tiempo problemáticos.

Drosophila sigue siendo un importante sistema modelo para estudiar una amplia gama de cuestiones biológicas y ha destacado en el avance del conocimiento en muchas disciplinas durante décadas. Una característica que lo hace particularmente destacado es que es especialmente adecuado para imágenes en vivo. La capacidad de monitorear los procesos subcelulares o el comportamiento de las células y los tejidos en tiempo real sigue contribuyendo a generar conceptos clave relevantes para la biología celular y del desarrollo. Muchos protocolos exitosos han sido desarrollados por diferentes grupos para mantener vivas y saludables estas muestras de Drosophila para estudiar el comportamiento de la muestra y las moléculas fluorescentes. Órganos y tejidos de la mosca como discos imaginales1,2,el cerebro larvario3,4,5,6,o cámaras de huevos de hembras adultas7,8,9,o el intestino adulto10 por ejemplo pueden ser extraídos y mantenidos en cultivo para imágenes con microscopía de lapso de tiempo. Un desafío clave para la toma de imágenes en vivo es asegurar que la muestra se mantenga cerca de la superficie de imágenes para una resolución óptima e inmóvil sin comprometer la integridad de la muestra que puede ser sensible a los impactos mecánicos. Para estudiar las células madre neuronales, llamadas neuroblastos o neuronas en el cerebro larvario de Drosophila, por ejemplo, mantener muestras cerca de la superficie de imágenes se puede lograr cubriéndolas con medios de cultivo en cámaras de imágenes selladas11,12,13. Sin embargo, este enfoque no permite fácilmente el intercambio de medios, lo que limita el margen de maniobra experimental. Alternativamente, las muestras se pueden preparar y colocar en coverslips tratados para aumentar la adherencia de las células y permitir la microscopía de visita multipunto y imágenes extendidas de células vivas en platos de cultivo abierto, que potencialmente permiten el intercambio de medios, pero no proporcionan medios fáciles para prevenir la deriva o pérdida de la muestra durante el intercambio de medios14,15.
El método de coágulo de Fibrin desarrollado originalmente para estudiar la meiosis en espermatozoides vivos de mosca de la grulla16 es específicamente adecuado para superar estos problemas. Fibringen se disuelve en un medio de cultivo relevante, las muestras colocadas y orientadas en una gota de esta solución en una cámara de imágenes de superficie de vidrio adecuada antes de que se agregue trombina, lo que resulta en la rápida formación de un coágulo de fibrina insoluble, una malla fibrosa pegajosa que se adhiere a la superficie de vidrio y las muestras al tiempo que garantiza el acceso de la muestra al medio de cultivo. A continuación, el medio se puede intercambiar sin perturbar el coágulo o la posición de la muestra. El intercambio medio de cultivo durante la toma de imágenes es, por ejemplo, deseable cuando se deben agregar inhibidores como en el método original o para experimentos de lavado o persecución de pulsos o cuando se añadirán colorantes fluorescentes durante las imágenes celulares vivas mientras se mantienen las células y los tejidos en su lugar. Los coágulos de fibrina son adecuados para la toma de imágenes de tejidos de Drosophila, así como células individuales13,17. Los coágulos de fibrina se pueden utilizar aún más para ayudar a orientar las muestras, que debido a su forma u otras propiedades normalmente no estarían orientados de la manera deseada mediante la modulación de la posición de la muestra dentro del coágulo de Fibrin y la forma del coágulo en sí.
Aquí proporcionamos una actualización sobre nuestros métodos actuales de imágenes basadas en coágulos de Fibrin y proporcionamos herramientas para el análisis de imágenes basado en segmentación y nos centramos en el uso de este método para estudiar las divisiones de neuroblastos en el cerebro mosca en desarrollo. Utilizamos rutinariamente el método de coágulo de Fibrin para seguir múltiples muestras en diferentes coágulos en el mismo plato de cultivo. Esto permite i) imágenes de eventos subcelulares como el comportamiento centroscósmico o la localización de ARNm en vivo18,19, ii) monitoreando el comportamiento de las muestras tras el tratamiento farmacológico de diferentes genotipos bajo la misma configuración de imágenes utilizando visitas multipunto microscopía20, iii) estudiar los efectos de la inhibición aguda de las enzimas21 y iv) minimizando la deriva para estudiar los cambios en la orientación de la división celular de las células dentro de su entorno fisiológico sobre la ablación láser dirigida22. Mientras que los efectos no deseados de trombina y fibrinógeno y el coágulo de Fibrin necesitan ser probados empíricamente para cada muestra, este método es en principio adecuado para inmovilizar cualquier tipo de muestra que deba ser analizada por imágenes de células vivas y en Drosophila se ha utilizado con éxito para estudiar múltiples aspectos de la biología de neuroblastos5,19,20,pero también la dinámica de las proyecciones de citosensores de las células madre de la línea germinal femenina23 y los cambios en la polaridad tras la inhibición aguda de las células folículos de las cámaras de huevos femeninos Drosophila 21.
Las imágenes fluorescentes de lapso de tiempo se traducen en la generación de conjuntos de datos 3D resueltos en el tiempo complejos que requieren métodos para extraer esta información cuantitativa. Aquí describimos nuestro desarrollo adicional de24 macros basadas en ImageJ que se pueden utilizar para corregir la deriva en hiperstacks y macros ImageJ hechas a medida que permiten la cuantificación semiautomática de fluorescencia multicanal en la corteza celular desarrollada para cuantificar proteínas corticales en neuroblastos de cerebros larvarios de Drosophila o de neuroblastos individuales en el cultivo celular primario.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin bovine serum, BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from human plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP1 Analog (1NA-PP1)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>529579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex spot plate with nine depressions</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS722085-18EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging

Drosophila es un sistema modelo importante para estudiar una amplia gama de cuestiones biológicas. Varios órganos y tejidos de diferentes etapas de desarrollo de la mosca como discos imaginales, las cámaras larvarias del cerebro o del óvulo de las hembras adultas o el intestino adulto se pueden extraer y mantener en cultivo para la toma de imágenes con microscopía de lapso de tiempo, proporcionando información valiosa sobre la biología celular y del desarrollo. Aquí, describimos en detalle nuestro protocolo actual para la disección de los cerebros larvarios de Drosophila, y luego presentamos nuestro enfoque actual para inmovilizar y orientar cerebros larvarios y otros tejidos en un tubo de cubierta de vidrio usando coágulos de Fibrin. Este método de inmovilización sólo requiere la adición de Fibrinógeno y Trombina al medio de cultivo. Es adecuado para imágenes de lapso de tiempo de alta resolución en microscopios invertidos de múltiples muestras en el mismo plato de cultivo, minimiza la deriva lateral con frecuencia causada por los movimientos de la etapa del microscopio en microscopía visitante multipuntos y permite la adición y eliminación de reactivos durante el transcurso de la toma de imágenes. También presentamos macros hechas a medida que usamos rutinariamente para corregir la deriva y extraer y procesar información cuantitativa específica del análisis de lapso de tiempo.

Inmovilización de los tejidos de Drosophila con coágulos de fibrina e intercambio medio de cultivo durante las imágenes en vivo. Después de ser diseccionados siguiendo el procedimiento presentado en el paso 2(Figura 1)e inmovilizados en coágulos de Fibrin en el mismo control de cubiertas después del procedimiento presentado en el paso 3(Figura 2),cerebros larvarios que expresan Bazooka etiquetado por GFP (Baz::GFP), el ortolog mosca de la proteína de polaridad Par-3, fueron imaginados durante 30 minutos en imágenes confocales de lapso de tiempo. Baz::GFP se combina con apkcas4,un alelo que permite la inhibición aguda de la proteína atípica quinasa C (aPKC) a través de la adición del pequeño analógico ATP 1-NAPP120. 1-NAPP1 se añadió al medio de cultivo después del procedimiento presentado en el paso 4 y se reanudaron las imágenes en vivo para las 2,5 h. Los cerebros de control que llevaban una versión de tipo salvaje de la quinasa aPKC no reaccionaron al análogo ATP, mientras que los cerebros portadores además de una mutación analógica sensible de aPKC(apkcas4) mostraron una contracción del neuroepithelium y grupos brillantes de Baz en neuroblastos y su progenie(Figura 6, Video 1). Los neuroblastos siguen dividiéndose a lo largo del lapso de tiempo, lo que indica que el tejido permanece sano, y los cerebros muestran poca deriva a pesar del cambio medio del cultivo, lo que indica que están bien inmovilizados. Del mismo modo, tras ser diseccionados tras el procedimiento presentado enel año 27,se inmovilizaron los coágulos de Fibrin en el mismo control de portadas e imágenes durante 8 minutos, tras lo cual la aplicación de 1-NAPP1 indujo la contracción de apkccomo4 células foliculares mutantes pero no de controles(Figura 7, Vídeo 2).
Corrección de deriva lateral y de enfoque mediante MultiHyperstackReg. Un hiperstack que muestra la deriva lateral y de enfoque(Video 3,panel izquierdo) se corrigió primero para la deriva lateral (paso 6.2, Figura 3, Video 3,panel central), luego deriva de enfoque (paso 6.3, Figura 4, Video 3,panel derecho) utilizando el plugin MultiStackReg y la macro MultiHyperstackReg, lo que resulta en una reducción sustancial de los movimientos observados en el hiperstack original.
Medición de señal cortical utilizando líneas giratorias Un neuroblasto que expresa Baz::GFP (verde) y la proteína transmembrana CD4 etiquetada con una proteína fluorescente infrarroja (CD4::mIFP, rojo) se imaginaron durante una mitosis. La señal CD4::mIFP se utilizó como referencia para detectar la corteza en varias partes del neuroblasto con linescans (paso 7, Figura 5, Figura 8A-C)y la señal Baz::GFP se midió en las posiciones detectadas Figura 8D). Durante su división, los neuroblastos se polarizaron transitoriamente estableciendo dominios corticales distintos y opuestos: el polo apical y el polo basal. Baz define el polo apical y, consistentemente, la señal Baz::GFP aumentó en el polo apical del neuroblasto y disminuyó en el polo basal durante la división(Figura 8C,D). La posición de la corteza fue rastreada satisfactoriamente durante todo el lapso de tiempo (Figura 8C, Video 4). Se hace referencia a las líneas y genotipos de Drosophila en la Tabla suplementaria 1–2.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> Figura 6: Aplicación de un análogo ATP en cerebros larvarios inmovilizados durante imágenes en vivo. (A) Imágenes en vivo de dos cerebros larvarios que expresan Baz::GFP inmovilizado en la misma portada. El medio de cultivo se cambia a una concentración de 10 μM del analógico ATP 1-NAPP1 a 0 min. Los cerebros de control no reaccionan visiblemente al análogo ATP, mientras que los cerebros portadores de una mutación sensible analógica de aPKC(aPKCAS4)muestran una contracción del neuroepithelium (puntas de flecha) y grupos brillantes de Baz en neuroblastos y su progenie. Proyección de intensidad máxima de 33 rebanadas para una profundidad de 23 μM. Barra de escala: 20 μM. (B) Ampliación del neuroepithelium. Barra de escala: 10 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> Figura 7: Aplicación de un análogo ATP en cámaras de huevos inmovilizadas durante imágenes en vivo. Imagen en vivo de dos ovarioles que expresan Baz::GFP inmovilizado en el mismo coverslip. El medio de cultivo se cambia a una concentración de 10 μM del analógico ATP 1-NAPP1 a 0 min. Las cámaras de huevos de control no reaccionan visiblemente al análogo ATP, mientras que las cámaras de huevos que llevan una mutación sensible analógica de aPKC(aPKCAS4)muestran una contracción del epitelio (puntas de flecha) que eventualmente conduce a la aparente descomposición de las uniones de adherentes. Proyección de intensidad máxima de 33 rebanadas para una profundidad de 27 μM. Escala bar: 20 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> Figura 8: Medición de la señal cortical utilizando linescans giratorios. (A) Neuroblast D. melanogaster en vivo que expresa Baz::GFP (verde) y CD4::mIFP (rojo). Líneas de cian: líneas de escaneo inicial trazadas perpendicularmente a varias zonas corticales a medir. Barra de escala: 5 μM. (B) Identificación de la corteza (línea azul oscuro) utilizando linescans corticales y CD4::mIFP (rojo) como canal de referencia. Línea de cian: área definida por el parámetro "Medir alrededor" (aquí, 2 píxeles), donde la señal se mide después de la detección de la corteza. Barra de escala: 2 μm. (C) Cian: áreas corticales identificadas durante una división de neuroblasto por el método de linescans giratorios a partir de las líneas de escaneo iniciales mostradas en (A), utilizando CD4::mIFP (rojo) como canal de referencia. Barra de escala: 5 μM. Flecha: polo apical. Punta de flecha: polo basal. (D) Medición de la intensidad de la señal Baz::GFP a lo largo del tiempo en las dos zonas correspondientes identificadas por las líneas giratorias en las que se muestran (C). Durante la mitosis, Baz::GFP se enriquece transitoriamente en el polo apical del neuroblasto y se agota desde el polo basal opuesto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Vídeo 1: Aplicación del intercambio de medios en cerebros larvarios inmovilizados durante imágenes en vivo para añadir un inhibidor, presentado en la Figura 6,barra de escala: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video 2: Aplicación del intercambio de medios en cámaras de huevos inmovilizadas durante imágenes en vivo para añadir un inhibidor, presentado en la Figura 7,barra de escala: 20 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Por favor haga clic aquí para descargar este video.</a>
Vídeo 3: Corrección de la deriva lateral y de enfoque mediante MultiHyperStackReg. Imágenes en vivo de un neuroblasto que expresa la sonda de membrana PH::GFP. Xy: plano focal único. Xz: reslice ortogonal. Izquierda: antes de la corrección de la deriva. Medio: después de la corrección de la deriva lateral. Derecha: después de la corrección de la deriva lateral y de enfoque, barra de escala: 10 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este video.</a>
Video 4: Detección de la corteza utilizando linescans giratorios, presentados en la Figura 8,escala de barra: 5 μm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este video.</a>
Tabla suplementaria 1: Genotipos de tejidos Drosophila en imágenes. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Tabla suplementaria 2: Origen de los transgéneos utilizados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar esta tabla.</a>
Archivo de codificación suplementario 1: Origen de los transgéneos utilizados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo de codificación suplementario 2: Origen de los transgéneos utilizados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Archivo de codificación suplementario 3: Origen de los transgéneos utilizados. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

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Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Este protocolo describe las aplicaciones de la inmovilización de muestras utilizando coágulos de Fibrin, limitando la deriva y permitiendo la adición y lavado de reactivos durante las imágenes en vivo. Las muestras se transfieren a una gota de Fibrinógeno que contiene medio de cultivo en la superficie de un deslizamiento de cubierta, después de lo cual la polimerización se induce añadiendo trombina.

Aplicaciones de inmovilización de tejidos de Drosophila con coágulos de fibrina para imágenes vivas

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

3.0K vistas.  University of Dundee. Este protocolo describe las aplicaciones de la inmovilización de muestras utilizando coágulos de Fibrin, limitando la deriva y permitiendo la adición y lavado de reactivos durante las imágenes en vivo. Las muestras se transfieren a una gota de Fibrinógeno que contiene medio de cultivo en la superficie de un deslizamiento de cubierta, después de lo cual la polimerización se induce añadiendo trombina.

Video: Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-proyección de imagen de la<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Ojo

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

A largo plazo de imágenes en vivo<em&gt; Drosophila</em&gt; Disco de ojos

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In Vitro Cultivo de óvulos para la proyección de imagen de cigoto polarización de Live-celular y patrones del embrión en Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Imágenes en vivo de la fusión secundaria del paladar del ratón

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

Métodos para el pH intracelular de la proyección de imagen del linaje de la célula de vástago del folículo en vivo tejido ovárico de Drosophila

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Imágenes de células vivas de la segregación de cromosomas durante la Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Imagen en vivo y análisis de contracciones musculares en Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin rods are a hallmark of a conserved, inducible Actin Stress Response (ASR) that accompanies human pathologies, including neurodegenerative disease. Previously, we showed that the ASR contributes to morphogenesis failures and reduced viability of developing embryos. This protocol allows the continued study of mechanisms underlying actin rod assembly and the ASR in a model system that is highly amenable to imaging, genetics and biochemistry. Embryos are collected and mounted on a coverslip to prepare them for injection. Rhodamine-conjugated globular actin (G-actinRed) is diluted and loaded into a microneedle. A single injection is made into the center of each embryo. After injection, embryos are incubated at elevated temperature and intranuclear actin rods are then visualized by confocal microscopy. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments may be performed on the actin rods; and other actin-rich structures in the cytoplasm can also be imaged. We find that G-actinRed polymerizes like endogenous G-actin and does not, on its own, interfere with normal embryo development. One limitation of this protocol is that care must be taken during injection to avoid serious injury to the embryo. However, with practice, injecting G-actinRed into Drosophila embryos is a fast and reliable way to visualize actin rods and can easily be used with flies of any genotype or with the introduction of other cellular stresses, including hypoxia and oxidative stress.

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The goal of this protocol is to inject Rhodamine-conjugated globular actin into Drosophila embryos and image intranuclear actin rod assembly following heat stress.

Imágenes Intranuclear Actin Rods en vivo calor estresado Drosophila Embriones

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

Disección e imágenes en vivo de la Drosophila gonad embrionaria tardía

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ribonucleoprotein particle movement, mRNA localization, organelle movement, and cytoskeletal dynamics. There are several methods for live imaging that have been developed. Due to the fact that each method involves dissecting individual ovarioles placed in media or halocarbon oil, cellular damage due to hypoxia and/or physical manipulation will inevitably occur over time. One downstream effect of hypoxia is to increase oxidative damage in the cells. The purpose of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries after induction of controlled cellular damage. Here, we use hydrogen peroxide to induce cellular oxidative damage and give examples of the effects of such damage on two subcellular structures, mitochondria and Clu bliss particles. However, this method is applicable to any subcellular structure. The limitations are that hydrogen peroxide can only be added to aqueous media and would not work for imaging that uses halocarbon oil. The advantages are that hydrogen peroxide is readily available and inexpensive, acts quickly, its concentrations can be modulated, and oxidative damage is a good approximation of damage caused by hypoxia as well as general tissue damage due to manipulation.

The objective of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries.

Visualización de los efectos del daño oxidativo en las cámaras de huevos de Drosophila usando imágenes en vivo

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...