Die Arbeit im Januschke-Labor wird von Wellcome Trust Grants 100031/Z/12/A und 1000032/Z/12/A unterstützt. Die Gewebebildgebungseinrichtung wird durch das Stipendium WT101468 von Wellcome unterstützt.

<ol>
	<li>Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs.">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).</li><li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+ex+vivo+culture+and+live+imaging+of+Drosophila+larval+imaginal+discs.">Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs.</a> PloS One. 11 (9), 0163744 (2016).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+of+the+Drosophila+adult+midgut+reveals+real-time+dynamics+of+division,+differentiation+and+loss.">Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss.</a> eLife. , (2018).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li><li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li><li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. 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R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKC-mediated+displacement+and+actomyosin-mediated+retention+polarize+Miranda+in+Drosophila+neuroblasts.">aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts.</a> eLife. 7, 166 (2018).</li><li>Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical-genetics+approach+to+study+the+role+of+atypical+Protein+Kinase+C+in+Drosophila.">A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila.</a> Development. 146 (2), (2019).</li><li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).</li><li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling.">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging.">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>. ImageJ macros [software] Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020)</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Live-Bildgebung der gesamten Mount D. melanogaster Larvengehirne bietet die Möglichkeit, asymmetrische neuronale Stammzellteilungen in Bedingungen in der Nähe eines physiologischen Kontextes zu beobachten. Der erste Teil unseres Protokolls stellt unseren Ansatz zur Zerlegung von Larvenhirnen vor. Wie bereits erwähnt13, ist ein kritischer Aspekt der Vorbereitung zu vermeiden, das Gehirn zu beschädigen. Die schwierigste Aspekt dieser ist es, das Gehirn von den benachbarten imaginären Scheiben zu trennen, ohne übermäßig auf das Gehirn zu ziehen. Unser Ansatz zum "Schneiden ohne Ziehen" besteht darin, entweder eine Schleifbewegung mit den Spitzen eines Zangenpaares durchzuführen oder eine Zangenspitzen entlang zweier anderer Zangenspitzen zu schieben, die die Verbindung zwischen Geweben halten (Abbildung 1A), während Lerit et al. sägeartige Bewegungen mit einem Trennstift beschreiben. Wir raten dem Experimentator, alle Ansätze auszuprobieren und die am besten geeigneten für sich zu übernehmen. Wir empfehlen auch, BSA- oder FCS-beschichtete Pipettenspitzen anstelle von Sezierwerkzeugen zu verwenden, um isolierte Gehirne zu übertragen. Die Beschichtung verhindert, dass Gewebe am Kunststoff kleben und ermöglicht den sicheren Transfer von Geweben, während sie immer vollständig eingetaucht werden, ohne sie einer möglichen vorübergehenden Verformung zu unterwerfen, da sie während des Transfers am Sezierwerkzeug kleben. Beschichtete Spitzen haben andere Vorteile, um die Übertragung mehrerer Gehirne auf einmal zu ermöglichen, was besonders nützlich ist, wenn es wichtig ist, die Aufenthaltszeit der Proben innerhalb eines bestimmten Mediums zu kontrollieren; sie eignen sich für den Transfer anderer Gewebe, auch zerbrechlicher Gewebe wie z. B. Fettkörper; Sie können eine breite Palette von verschiedenen Probengrößen aufnehmen, indem sie größere Spitzen verwenden oder die Extremität der Spitze schneiden.
Als nächstes beschreibt dieses Protokoll die Verwendung von Fibrinogen-Gerinnung, um Larvengehirne auf dem Deckblatt einer Kulturschale zu immobilisieren. Ein Gehirn ist innerhalb eines Tropfens von Kulturmedium + Fibrinogen ausgerichtet, nach dem die Gerinnung durch die Zugabe von Thrombin induziert wird. Die Fibrin-Bildung erfolgt schrittweise und bietet ein Zeitfenster, in dem die Ausrichtung der Probe gegebenenfalls verfeinert werden kann(Abbildung 2C). Wenn eine leichte Kompression der Probe erforderlich ist - wovon wir bei Larvenhirnen raten -, kann sie auch fein eingestellt werden, indem das Gerinnsel in den Schritten 3.4.4 und 3.5.2 mehr oder weniger nahe an der Probe gedrückt wird. Der Hauptvorteil dieser Fibrinogen-Gerinnung gegenüber dem in Lerit et al. beschriebenen Protokoll, in dem Gehirne zwischen einer gasdurchlässigen Membran und einem Abdeckrutsch montiert sind, ist die Fähigkeit, das Kulturmedium während der Live-Bildgebung zu ersetzen. Ein möglicher Vorteil der Verwendung einer gasdurchlässigen Membran gegenüber unserem Protokoll könnte sein, dass sie eine optimale Sauerstoffversorgung der Proben bietet, die mit unserem Ansatz eingeschränkter sein könnte, da Gehirne durch das Gerinnsel und ein Medium von der Luft getrennt werden. Aus diesem Grund, obwohl wir nicht die Wirkung der Menge der Kulturmedium innerhalb der Kultur Gericht bewertet, schlagen wir vor, die Menge der Kultur Medium auf den Gerinnseln zu begrenzen, während die Gerinnsel vollständig eingetaucht.
Da die Manipulation der Gerinnsel experimentell schwierig und zeitaufwändig sein kann, empfehlen wir dem Experimentator, zunächst Gerinnsel ohne Proben zu manipulieren. Die Modulation des Volumens des Tropfens kulturmittel + Fibrinogen auf dem Deckel, die Konzentration von Fibrinogen oder das Volumen und die Konzentration von Thrombin könnte dazu beitragen, die Vorbereitung zu erleichtern und könnte wichtig sein, wenn das Protokoll an andere Arten von Geweben angepasst werden. Mit genügend Erfahrung bei der Manipulation der Gerinnsel können bei Bedarf mehrere Gehirne in einem Gerinnsel immobilisiert werden, obwohl dies die Feinabstimmung der Ausrichtung erschwert. Auf dem Deckblatt können mehrere Gerinnsel gebildet werden, so dass z.B. Proben verschiedener Genotypen abbilden können. Es ist auch möglich, verschiedene Gerinnsel auf dem gleichen Coverslip verschiedenen Kulturmedien auszusetzen, obwohl darauf geachtet werden muss, niemals die Tropfen des Kulturmediums zu mischen, das die verschiedenen Gerinnsel bedeckt. Sobald Larvengehirne immobilisiert sind und bereit für Live-Bildgebung, empfehlen wir, die Empfehlungen von Lerit et al.13 zu folgen, um übermäßige Photoschäden zu vermeiden. Wir fügen diesen Empfehlungen nur hinzu, um das Gehirn nicht nur bei 25 °C während der Live-Bildgebung mit einem Bühneninkubator zu halten, sondern auch, um dieses Stadium mindestens 30 min vor Beginn der Bildgebung vorzuheizen. Wenn wir dies nicht systematisch tun, führt dies zu einer starken Fokusdrift.
Es kann in einigen Kontexten vorteilhaft sein, korrelierte Mikroskopie durchzuführen und eine Probe nach Live-Bildgebung zu fixieren und zu immunstainieren. Eine Einschränkung der Verwendung von Fibrin-Gerinnseln ist jedoch, dass es fast unmöglich ist, ein Gehirn mechanisch von einem Gerinnsel zu isolieren, ohne es zu beschädigen. Ein möglicher Weg, diese Einschränkung zu überwinden, könnte darin bestehen, Methoden zu entwickeln, um Fibrin-Gerinnsel mit Plasmin zu abbauen oder die Gerinnseldemontage durch Zugabe eines Peptids zu induzieren, das die Knöpfe imitiert, was die Fibrin-Polymerisationermöglicht 28. Wir verwenden in der Regel Fibrin-Gerinnsel auf Proben von Einzelzellen bis zu 200 M langen Geweben, aber wir könnten auch erfolgreich in Gerinnseln und Bildgehirnen von erwachsenen Hummeln über 3 mm Breit immobilisieren. Die Obergrenze des Stichprobenumfangs, der in Gerinnsel immobilisiert werden kann, muss noch ermittelt werden. In ähnlicher Weise, obwohl wir in der Regel immobilisierte Proben für 4 bis 5 h abbilden, haben wir neuroblasten in der Primärkultur für bis zu 3 Tage erfolgreich ababgebildet, was darauf hindeutet, dass das Gerinnsel zumindest die längerfristige Lebensfähigkeit nicht beeinträchtigt. Im Gegenteil, Gerinnsel können den regelmäßigen Austausch des Mediums erleichtern, eine Voraussetzung für eine längerfristige Bildgebung, ohne dass geräte wie peristaltische Pumpen für diesen Zweck benötigt werden. Während wir die Permeabilitätsparameter von Fibringer nicht gemessen haben, scheint die faserige gelartige Natur der Gerinnsel durch zelldurchlässige Moleküle durchdrungen zu sein. Wir fanden heraus, dass Latrunculin A, Colcemid oder 1-NAPP1, HALO-Tag Liganden und andere Standardfarbstoffe, die in der Zellbiologie verwendet werden, die Zellen im Fibringer problemlos erreichen und bisher keine Moleküle gefunden haben, die durch das Gerinnsel zurückgehalten würden, was jedoch eine Möglichkeit ist, die empirisch getestet werden muss.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Verwendung von Fibrin-Gerinnseln eine zuverlässige und relativ einfache Implementierung einer Möglichkeit bietet, lebende Gewebe für die Live-Bildgebung zu immobilisieren. Über seine Nützlichkeit bei der Begrenzung des seitlichen Driftens hinaus hat sich die Fähigkeit, das Kulturmedium während der Live-Bildgebung zu verändern, als von unschätzbarem Wert für unseren ansatzbereiten Ansatz der chemischen Genetik erwiesen, die asymmetrische Zellteilung von D. melanogaster Neuroblasten zu untersuchen21. Wir gehen davon aus, dass diese Technik für Studien in einer Vielzahl unterschiedlicher Gewebe von Vorteil sein wird, insbesondere wenn sie chemische Genetik oder beispielsweise die Protein-Selbstkennzeichnung29beinhalten.
Unser MultiHyperStackReg-Makro basiert auf dem TurboReg ImageJ-Plugin, das aufeinander folgende Frames oder Slices eines Stacks ausrichtet, und dem MultiStackReg ImageJ-Plugin, das es ermöglicht, die Transformationen auf andere Stacks anzuwenden. MultiHyperStackReg ermöglicht es einfach, diese Transformationen auf Hyperstacks anzuwenden (Stapel mit mindestens vier Dimensionen). Da die Verwendung von MultiHyperStackReg, wie wir es beschreiben, viele Aktionen erfordert und ziemlich zeitaufwändig werden kann, haben wir auch das AutoHyperStackReg-Makro geschrieben, das automatisch alle in den Schritten 6.2 und 6.3 beschriebenen Schritte ausführt. Im Gegensatz zu MultiHyperStackReg fehlt AutoHyperStackReg derzeit jedoch die Möglichkeit, die Ausrichtung eines Stacks basierend auf einer Subregion dieses Stacks zu berechnen, eine Option, die wir gefunden haben, ist manchmal entscheidend für eine befriedigende Ausrichtung. Eine weitere Einschränkung von AutoHyperStackReg besteht darin, dass seine Verwendung auf Übersetzungen beschränkt ist und nicht auf die anderen Transformationen, die von TurboReg und MultiStackReg vorgeschlagen werden, während MultiHyperStackReg auf einen Hyperstack jeden Transformationstyp anwenden kann, wenn der Benutzer ihn benötigt. Zukünftige Versionen werden diese Funktionen implementieren und auf GitHub30verfügbar sein. Schließlich bietet unser rotierendes Linecan-Makro eine einfache Möglichkeit, kortikale Signale im Zeitraffer schnell zu messen, auch wenn der Kortex seine Position oder Ausrichtung im Laufe der Zeit ändert. Ob der Tracking-Modus oder der Nicht-Tracking-Modus für die Analyse am besten geeignet ist, hängt von der Qualität und Konsistenz des kortikalen Signals ab. Der Tracking-Modus ist einfacher zu verwenden, da der Benutzer nicht berücksichtigen muss, wo sich der Kortex für jeden Zeitpunkt befindet und große Positions- und Orientierungsänderungen im Laufe der Zeit aufnehmen kann. Es ist jedoch nur dann geeignet, wenn das kortikale Signal während des gesamten Films stark genug bleibt, um es zu detektieren: Ein Versäumnis, etwas anderes als den Kortex zu erkennen (z. B. ein helles zytoplasmatisches Fach in der Nähe des Kortex), kann die Detektion für jeden folgenden Zeitpunkt beeinträchtigen (z. B. bewegt sich das zytoplasmatische Fach vom Kortex weg und die kortikalen Linien können ihm für den Rest des Zeitraffers folgen). Der Nicht-Tracking-Modus hat diese Falle nicht, da die Erkennung auf die ursprünglich vom Benutzer gezeichnete Linie beschränkt ist (z. B. kann ein helles zytoplasmatisches Fach dazu führen, dass die Erkennung für einige Zeitpunkte fehlschlägt, aber da sich das zytoplasmatische Fach von der Detektionszone entfernt, wird die korrekte Erkennung des Kortex fortgesetzt), verhält sich aber nicht gut, wenn sich die Kortexposition oder -ausrichtung im Laufe der Zeit stark ändert. Das nächste Feature (das auf GitHub30verfügbar sein wird), das für den Tracking-Modus entwickelt werden soll, ist die Option, nur bestimmte Zeitpunkte zu analysieren und einen Referenzzeitpunkt (anstelle des ersten Zeitpunkts) zu definieren, vor dem und nach dem die Erkennung durchgeführt wird, wodurch der Benutzer zumindest problematische Zeitpunkte vermeiden kann.

Drosophila ist nach wie vor ein wichtiges Modellsystem, um eine Vielzahl biologischer Fragen zu untersuchen und hat sich seit Jahrzehnten in der Weiterentwicklung von Wissen in vielen Disziplinen hervorgetan. Ein Merkmal, das es besonders auszeichnet, ist, dass es besonders gut für Live-Bildgebung geeignet ist. Die Fähigkeit, subzelluläre Prozesse oder das Verhalten von Zellen und Geweben in Echtzeit zu überwachen, trägt weiterhin zur Generierung von Schlüsselkonzepten bei, die für die Zell- und Entwicklungsbiologie relevant sind. Viele erfolgreiche Protokolle wurden von verschiedenen Gruppen entwickelt, um solche Drosophila-Proben lebendig und gesund zu halten, um das Verhalten der Probe und der fluoreszierenden Moleküle zu studieren. Organe und Gewebe aus der Fliege wie imaginäre Scheiben1,2, das Larvenhirn3,4,5,6, oder Eikammern von erwachsenen Weibchen7,8,9, oder der adulte Darm10 zum Beispiel kann extrahiert und in Kultur für die Bildgebung mit Zeitraffermikroskopie gehalten werden. Eine zentrale Herausforderung für die Live-Bildgebung besteht darin, sicherzustellen, dass die Probe für eine optimale Auflösung und unbeweglich in der Nähe der Bildfläche gehalten wird, ohne die Probenintegrität zu beeinträchtigen, die empfindlich auf mechanische Stöße reagieren kann. Um neuronale Stammzellen, sogenannte Neuroblasten oder Neuronen im Drosophila Larvenhirn, zu untersuchen, kann beispielsweise die Aufbewahrung von Proben in der Nähe der bildgebenden Oberfläche erreicht werden, indem man sie mit Kulturmedien in versiegelten Bildkammern11,12,13bedeckt. Dieser Ansatz lässt den Medienaustausch jedoch nicht so einfach zu und schränkt so den versuchsfreudigen Handlungsspielraum ein. Alternativ können Proben vorbereitet und auf Abdeckungen platziert werden, die behandelt werden, um die Haftung von Zellen zu erhöhen und Multi-Point-Besuchsmikroskopie und erweiterte Live-Zell-Bildgebung in offenen Kulturgerichten zu ermöglichen, die potenziell einen Medienaustausch ermöglichen, aber keine einfachen Mittel bieten, um Probendrift oder Verlust während des Medienaustauschs zu verhindern14,15.
Die Fibrin-Gerinnselmethode, die ursprünglich entwickelt wurde, um Meiose in lebenden Kranich-Fliegen-Spermatozyten16 zu untersuchen, ist speziell geeignet, um diese Probleme zu überwinden. Fibrinogen wird in einem relevanten Kulturmedium gelöst, die Proben, die in einem Tropfen dieser Lösung auf einer geeigneten Glas-Oberflächen-Bildkammer platziert und ausgerichtet sind, bevor Thrombin hinzugefügt wird, was zur schnellen Bildung eines unlöslichen Fibrin-Gerinnsels führt, eines klebrigen faserigen Netzes, das an der Glasoberfläche und den Proben haftet und gleichzeitig den Zugang der Probe zum Kulturmedium gewährleistet. Das Medium kann dann ausgetauscht werden, ohne die Gerinnsel- oder Probenposition zu stören. Der Austausch von Kulturmedien während der Bildgebung ist beispielsweise wünschenswert, wenn Inhibitoren wie bei der ursprünglichen Methode oder zum Auswaschen oder Pulsjagdexperimenten zugesetzt werden sollen oder wenn fluoreszierende Farbstoffe während der Livezellbildgebung zugesetzt werden sollen, während Zellen und Gewebe an Ort und Stelle gehalten werden. Fibrin-Gerinnsel eignen sich zur Abbildung von Drosophila-Geweben sowie einzelnen Zellen13,17. Fibrin-Gerinnsel können weiter verwendet werden, um Proben zu orientieren, die aufgrund ihrer Form oder anderer Eigenschaften normalerweise nicht in der gewünschten Weise durch Modulation der Probenposition innerhalb des Fibrin-Gerinnsels und der Form des Gerinnsels selbst ausgerichtet würden.
Hier stellen wir ein Update zu unseren aktuellen Fibrin Gerinnsel-basierten Bildgebungsmethoden zur Verfügung und stellen Werkzeuge für die segmentierungsbasierte Bildanalyse zur Verfügung und konzentrieren uns auf den Einsatz dieser Methode zur Untersuchung von Neuroblastenteilungen im sich entwickelnden Fliegenhirn. Wir verwenden routinemäßig die Fibrin Gerinnsel-Methode, um mehrere Proben in verschiedenen Gerinnseln in der gleichen Kulturschale zu folgen. Dies ermöglicht i) Die Bildgebung subzellulärer Ereignisse wie Zentromomverhalten oder mRNA-Lokalisierung live18,19, ii) Überwachung des Verhaltens von Proben bei der pharmakologischen Behandlung verschiedener Genotypen unter den gleichen bildgebenden Einstellungen mit Multipunkt-Besuchsmikroskopie20, iii) Untersuchung der Auswirkungen der akuten Hemmung der Enzyme21 und iv) Minimierung von Driften zur Untersuchung von Veränderungen in der Ausrichtung der Zellteilung von Zellen in ihrer physiologischen Umgebung auf gezielte Laser-Abl2. Während unerwünschte Wirkungen von Thrombin und Fibrinogen und dem Fibrin-Gerinnsel empirisch für jede Probe getestet werden müssen, Diese Methode ist grundsätzlich geeignet, jede Art von Probe zu immobilisieren, die durch Live-Zell-Bildgebung analysiert werden soll und in Drosophila wurde erfolgreich verwendet, um mehrere Aspekte der Neuroblasten Biologie5,19,20, sondern auch die Dynamik der zytosensorischen Projektionen der weiblichen Keimbahn Stammzellen23 und Veränderungen der Polarität bei akuter aPKC Hemmung der Follikelzellen von Drosophila weiblichen Eikammern21zu studieren.
Zeitrafferfluoreszenz-Bildgebung führt zur Generierung komplexer zeitaufgelöster 3D-Datensätze, die Methoden zum Extrahieren dieser quantitativen Informationen erfordern. Hier beschreiben wir unsere Weiterentwicklung von ImageJ-basierten24 Makros, die verwendet werden können, um das Driften in Hyperstacks und maßgeschneiderten ImageJ-Makros zu korrigieren, die eine halbautomatische Quantifizierung der Mehrkanalfluoreszenz am Zellkortex ermöglichen, die zur Quantifizierung kortikaler Proteine in Neuroblasten von Drosophila-Larval-Gehirnen oder von individuellen Strahlneuronen in der primären Zellkultur entwickelt wurde.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin bovine serum, BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from human plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP1 Analog (1NA-PP1)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>529579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex spot plate with nine depressions</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS722085-18EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging

Drosophila ist ein wichtiges Modellsystem, um eine Breite von biologischen Fragen zu studieren. Verschiedene Organe und Gewebe aus verschiedenen Entwicklungsstadien der Fliege wie imaginäre Scheiben, das Larvenhirn oder Eikammern von erwachsenen Weibchen oder der adulte Darm können extrahiert und in Kultur zur Bildgebung mit Zeitraffermikroskopie gehalten werden, was wertvolle Einblicke in die Zell- und Entwicklungsbiologie bietet. Hier beschreiben wir detailliert unser aktuelles Protokoll zur Zerlegung von Drosophila Larvenhirnen und stellen dann unseren aktuellen Ansatz zur Immobilisierung und Orientierung von Larvenhirnen und anderen Geweben auf einem Glasdeckel mit Fibrin-Gerinnseln vor. Diese Immobilisierungsmethode erfordert nur die Zugabe von Fibrinogen und Thrombin zum Kulturmedium. Es eignet sich für hochauflösende Zeitraffer-Bildgebung an invertierten Mikroskopen mehrerer Proben in derselben Kulturschale, minimiert das seitliche Driften, das häufig durch Bewegungen der Mikroskopstufe in der Multipoint-Besuchsmikroskopie verursacht wird, und ermöglicht das Hinzufügen und Entfernen von Reagenzien während der Bildgebung. Wir präsentieren auch maßgeschneiderte Makros, die wir routinemäßig verwenden, um sie beim Driften zu korrigieren und spezifische quantitative Informationen aus der Zeitrafferanalyse zu extrahieren und zu verarbeiten.

Immobilisierung von Drosophila Gewebe mit Fibrin Gerinnseln und Kultur Medium Austausch während der Live-Bildgebung. Nach der Zerlegung nach dem in Schritt 2 (Abbildung 1) vorgestellten Verfahren und immobilisierten Fibrin-Gerinnsel auf demselben Deckzettel nach dem in Schritt 3 (Abbildung 2) vorgestellten Verfahren wurden Larvenhirne, die GFP-markierte Bazooka (Baz::GFP) exdrücken, der Fliegenortholog des Polaritätsproteins Par-3 3 30 min in zeitrafferiger multilinker konfokaler Bildgebung abgebildet. Baz::GFP wird mit apkcas4kombiniert, einem Allel, das eine akute Hemmung der atypischen Proteinkinase C (aPKC) durch Zugabe des kleinen ATP-Analogs 1-NAPP120ermöglicht. 1-NAPP1 wurde daher nach dem in Schritt 4 vorgestellten Verfahren dem Kulturmedium hinzugefügt und die Live-Bildgebung für 2,5 h wieder aufgenommen. Kontrollgehirne, die eine wilde Version der Kinase aPKC trugen, reagierten nicht auf das ATP-Analog, während Gehirne, die zusätzlich eine analog-empfindliche Mutation von aPKC (apkcas4) trugen, eine Kontraktion des Neuroepithels und helle Cluster von Baz in Neuroblasten und deren Nachkommen zeigten ( Abbildung6, Video 1). Neuroblasten teilen sich während des Zeitraffers weiter, was darauf hindeutet, dass das Gewebe gesund bleibt, und das Gehirn zeigt trotz des Kulturmediumwechsels wenig Drift, was darauf hindeutet, dass sie gut immobilisiert sind. In ähnlicher Weise wurden nach der Seziertheit nach dem in27vorgestellten Verfahren Ovariole, die Baz::GFP ausdrückend in Fibrin-Gerinnseln auf demselben Deckzettel immobilisiert und für 8 min abgebildet wurden, woraufdurch die Anwendung von 1-NAPP1 die Kontraktion von apkcas4 mutierten Follikelzellen, aber nicht von Kontrollen induzierte (Abbildung 7, Video 2).
Korrektur der Seiten- und Fokusdrift mit MultiHyperstackReg. Ein Hyperstack, der sowohl die Seiten- als auch die Fokusdrift(Video 3, linkes Panel) anzeigt, wurde zuerst für die seitliche Drift korrigiert (Schritt 6.2, Abbildung 3, MittleresPanel), dann Fokusdrift (Schritt 6.3, Abbildung 4, Video 3, rechtes Panel) mit dem MultiStackReg-Plugin und dem MultiHyperstackReg-Makro, was zu einer erheblichen Reduzierung der im ursprünglichen Hyperstack beobachteten Bewegungen führt.
Kortikale Signalmessung mit rotierenden Linecans Ein Neuroblast, der Baz ausdrückt::GFP (grün) und das Transmembranprotein CD4, das mit einem Infrarotfluoreszenzprotein (CD4::mIFP, rot) markiert ist, wurde während einer Mitose abgebildet. Das CD4::mIFP-Signal wurde als Referenz verwendet, um den Kortex an verschiedenen Teilen des Neuroblasts mit Linescans zu erkennen (Schritt 7, Abbildung 5, Abbildung 8A–C) und das Baz::GFP-Signal wurde an den erkannten Positionen gemessen Abbildung 8D). Während ihrer Teilung polarisierten Neuroblasten vorübergehend, indem sie unterschiedliche und entgegengesetzte kortikale Domänen aufstellen: den apikalen Pol und den Basalpol. Baz definiert den apikalen Pol und konsequent das Baz::GFP-Signal am apikalen Pol des Neuroblasten und verringerte sich während der Teilung am Basalpol (Abbildung 8C,D). Die Position des Kortex wurde während des gesamten Zeitraffers zufriedenstellend nachverfolgt (Abbildung 8C, Video 4). Die Drosophila-Linien und Genotypen werden in der Zusatztabelle 1–2referenziert.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> Abbildung 6: Anwendung eines ATP-Analogs auf immobilisierte Larvengehirne während der Live-Bildgebung. (A) Live-Bildgebung von zwei Larvengehirnen, die Baz exexzessiver exallert::GFP auf demselben Deckzettel immobilisiert. Das Kulturmedium wird bei 0 min auf eine Konzentration von 10 m des ATP-Analogs 1-NAPP1 umgestellt. Kontrollgehirne reagieren nicht sichtbar auf das ATP-Analog, während Gehirne, die eine analogempfindliche Mutation von aPKC (aPKCAS4) tragen, eine Kontraktion des Neuroepithels (Pfeilspitzen) und helle Ballhaufen von Baz in Neuroblasten und ihrer Nachkommen zeigen. Maximale Intensitätsprojektion von 33 Scheiben für eine Tiefe von 23 m. Skalenbalken: 20 M. (B) Vergrößerung des Neuroepithels. Maßstabsleiste: 10 M. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> Abbildung 7: Anwendung eines ATP-Analogs auf immobilisierten Eikammern während der Live-Bildgebung. Live-Bildgebung von zwei Ovariolen, die Baz exzessiieren::GFP auf dem gleichen Deckschein immobilisiert. Das Kulturmedium wird bei 0 min auf eine Konzentration von 10 m des ATP-Analogs 1-NAPP1 umgestellt. Kontrolleierkammern reagieren nicht sichtbar auf das ATP-Analog, während Eikammern, die eine analogempfindliche Mutation von aPKC (aPKCAS4) tragen, eine Kontraktion des Epithels (Pfeilspitzen) zeigen, was schließlich zum scheinbaren Abbau von Haftknotenführt führt. Maximale Intensitätsprojektion von 33 Scheiben für eine Tiefe von 27 m. Maßstabsleiste: 20 m. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> Abbildung 8: Messung des kortikalen Signals mit rotierenden Linecans. (A) Live D. melanogaster neuroblast expressing Baz::GFP (grün) und CD4::mIFP (rot). Cyan-Linien: anfängliche Scanlinien, die senkrecht zu verschiedenen kortikalen Zonen verfolgt werden, um sie zu messen. Maßstabsleiste: 5 m. (B) Identifikation des Kortex (dunkelblaue Linie) mit kortikalen Linien und CD4::mIFP (rot) als Referenzkanal. Cyan-Linie: Fläche, die durch den Parameter "Ummessen" definiert wird (hier 2 Pixel), wobei das Signal nach der Kortexerkennung gemessen wird. Skala bar: 2 m. (C) Cyan: kortikale Bereiche, die während einer Neuroblastenteilung durch die rotierende Linecans-Methode aus den anfänglichen Scanlinien identifiziert werden, die in (A) angezeigt werden, mit CD4::mIFP (rot) als Referenzkanal. Maßstabsleiste: 5 m. Pfeil: apikaler Pol. Pfeilspitze: Basalpol. (D) Messung der Baz::GFP-Signalintensität im Zeitverlauf in den beiden entsprechenden Zonen, die durch rotierende Linien in (C )identifiziert werden. Während der Mitose, Baz::GFP wird vorübergehend an der apikalen Pol des Neuroblasten angereichert und wird vom gegenüberliegenden Basalpol erschöpft. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Video 1: Anwendung des Medienaustauschs auf immobilisierte Larvengehirne während der Live-Bildgebung, um einen Inhibitor hinzuzufügen, dargestellt in Abbildung 6,Maßstabsleiste: 20 m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Video 2: Anwendung des Medienaustauschs auf immobilisierten Eikammern während der Live-Bildgebung, um einen Inhibitor hinzuzufügen, dargestellt in Abbildung 7,Maßstabsleiste: 20 m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Video 3: Korrektur von Seiten- und Fokusdrift mit MultiHyperStackReg. Live-Bildgebung eines Neuroblasten, der die Membransonde PH::GFP exzessither ausdrückt. Xy: einzelne Fokusebene. Xz: orthogonales Reslice. Links: vor Korrektur der Drift. Mitte: nach Korrektur der seitenseitigen Drift. Rechts: nach Korrektur die Seiten- und Fokusdrift, Skalenleiste: 10 m. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Video 4: Erkennung des Kortex mit rotierenden Linien, dargestellt in Abbildung 8, Maßstabsleiste: 5 m. Bitte klicken Sie <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">hier, um dieses Video herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Genotypen von abgebildeten Drosophila Gewebe. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Tabelle 2: Ursprung der verwendeten Transgene. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.</a>
Ergänzende Codierungsdatei 1: Ursprung der verwendeten Transgene. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Codierungsdatei 2: Ursprung der verwendeten Transgene. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Codierungsdatei 3: Ursprung der verwendeten Transgene. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

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Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Dieses Protokoll beschreibt Anwendungen der Probenimmobilisierung mit Fibrin-Gerinnseln, die Begrenzung des Driftens und das Hinzufügen und Auswaschen von Reagenzien während der Live-Bildgebung. Die Proben werden auf einen Tropfen Fibrinogen übertragen, der das Kulturmedium auf der Oberfläche eines Deckslips enthält, nach dem die Polymerisation durch Zugabe von Thrombin induziert wird.

Anwendungen der Immobilisierung von Drosophila-Geweben mit Fibrin-Clots für Live Imaging

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

applications-immobilization-drosophila-tissues-with-fibrin-clots-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

3.0K Aufrufe.  University of Dundee. Dieses Protokoll beschreibt Anwendungen der Probenimmobilisierung mit Fibrin-Gerinnseln, die Begrenzung des Driftens und das Hinzufügen und Auswaschen von Reagenzien während der Live-Bildgebung. Die Proben werden auf einen Tropfen Fibrinogen übertragen, der das Kulturmedium auf der Oberfläche eines Deckslips enthält, nach dem die Polymerisation durch Zugabe von Thrombin induziert wird.

Serie: Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-Bilder aus dem<em&gt; Drosophila</em&gt; Pupal Augen

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

Langfristige Live-Imaging von<em&gt; Drosophila</em&gt; Augen Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Live Imaging der Maus Sekundärer Gaumen Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

Methoden für Imaging intrazellulären pH der Follikel Stem Cell Linie in Live Drosophila Eierstockgewebe

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

Live Cell Imaging der Segregation der Chromosomen während der Mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

Live Imaging und Analyse von Muskelkontraktionen im Drosophila-Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin rods are a hallmark of a conserved, inducible Actin Stress Response (ASR) that accompanies human pathologies, including neurodegenerative disease. Previously, we showed that the ASR contributes to morphogenesis failures and reduced viability of developing embryos. This protocol allows the continued study of mechanisms underlying actin rod assembly and the ASR in a model system that is highly amenable to imaging, genetics and biochemistry. Embryos are collected and mounted on a coverslip to prepare them for injection. Rhodamine-conjugated globular actin (G-actinRed) is diluted and loaded into a microneedle. A single injection is made into the center of each embryo. After injection, embryos are incubated at elevated temperature and intranuclear actin rods are then visualized by confocal microscopy. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments may be performed on the actin rods; and other actin-rich structures in the cytoplasm can also be imaged. We find that G-actinRed polymerizes like endogenous G-actin and does not, on its own, interfere with normal embryo development. One limitation of this protocol is that care must be taken during injection to avoid serious injury to the embryo. However, with practice, injecting G-actinRed into Drosophila embryos is a fast and reliable way to visualize actin rods and can easily be used with flies of any genotype or with the introduction of other cellular stresses, including hypoxia and oxidative stress.

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The goal of this protocol is to inject Rhodamine-conjugated globular actin into Drosophila embryos and image intranuclear actin rod assembly following heat stress.

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

Dissektion und Live-Imaging der späten embryonalen Drosophila-Gonade

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ribonucleoprotein particle movement, mRNA localization, organelle movement, and cytoskeletal dynamics. There are several methods for live imaging that have been developed. Due to the fact that each method involves dissecting individual ovarioles placed in media or halocarbon oil, cellular damage due to hypoxia and/or physical manipulation will inevitably occur over time. One downstream effect of hypoxia is to increase oxidative damage in the cells. The purpose of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries after induction of controlled cellular damage. Here, we use hydrogen peroxide to induce cellular oxidative damage and give examples of the effects of such damage on two subcellular structures, mitochondria and Clu bliss particles. However, this method is applicable to any subcellular structure. The limitations are that hydrogen peroxide can only be added to aqueous media and would not work for imaging that uses halocarbon oil. The advantages are that hydrogen peroxide is readily available and inexpensive, acts quickly, its concentrations can be modulated, and oxidative damage is a good approximation of damage caused by hypoxia as well as general tissue damage due to manipulation.

The objective of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries.

Visualisierung der Auswirkungen oxidativer Schäden auf Drosophila-Eierkammern mit Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...