העבודה במעבדת Januschke נתמכת על ידי מענקי נאמנות Wellcome 100031/Z/12/A ו- 1000032/Z/12/A. מתקן הדמיית הרקמות נתמך על ידי המענק WT101468 מ Wellcome.

<ol>
	<li>Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cultivation+and+live+imaging+of+Drosophila+imaginal+discs.">Cultivation and live imaging of Drosophila imaginal discs.</a> Methods in Molecular Biology. 11478, 203-213 (2016).</li><li>Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+term+ex+vivo+culture+and+live+imaging+of+Drosophila+larval+imaginal+discs.">Long term ex vivo culture and live imaging of Drosophila larval imaginal discs.</a> PloS One. 11 (9), 0163744 (2016).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apical/basal+spindle+orientation+is+required+for+neuroblast+homeostasis+and+neuronal+differentiation+in+Drosophila.">Apical/basal spindle orientation is required for neuroblast homeostasis and neuronal differentiation in Drosophila.</a> Developmental Cell. 17 (1), 134-141 (2009).</li><li>Basto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flies+without+centrioles.">Flies without centrioles.</a> Cell. 125 (7), 1375-1386 (2006).</li><li>Januschke, J., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interphase+microtubule+aster+is+a+determinant+of+asymmetric+division+orientation+in+Drosophila+neuroblasts.">The interphase microtubule aster is a determinant of asymmetric division orientation in Drosophila neuroblasts.</a> The Journal of Cell Biology. 188 (5), 693-706 (2010).</li><li>Rusan, N. M., Peifer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+a+novel+centrosome+cycle+in+asymmetric+cell+division.">A role for a novel centrosome cycle in asymmetric cell division.</a> Journal of Cell Biology. 177 (1), 13-20 (2007).</li><li>Dai, W., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+border+cell+migration+in+Drosophila.">Live imaging of border cell migration in Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 1407, 153-168 (2016).</li><li>Haigo, S. L., Bilder, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+tissue+revolutions+in+a+morphogenetic+movement+controlling+elongation.">Global tissue revolutions in a morphogenetic movement controlling elongation.</a> Science. 331 (6020), 1071-1074 (2011).</li><li>Tissot, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+molecular+cues+ensure+a+robust+microtubule-dependent+nuclear+positioning+in+the+Drosophila+oocyte.">Distinct molecular cues ensure a robust microtubule-dependent nuclear positioning in the Drosophila oocyte.</a> Nature Communications. 8, 15168 (2017).</li><li>Martin, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+imaging+of+the+Drosophila+adult+midgut+reveals+real-time+dynamics+of+division,+differentiation+and+loss.">Long-term live imaging of the Drosophila adult midgut reveals real-time dynamics of division, differentiation and loss.</a> eLife. , (2018).</li><li>Cabernard, C., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+neuroblast+lineages+within+intact+larval+brains+in+Drosophila.">Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).</li><li>Sabado, V., Nagoshi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+resolution+fluorescence+live+imaging+of+Drosophila+circadian+clocks+in+larval+brain+culture.">Single-cell resolution fluorescence live imaging of Drosophila circadian clocks in larval brain culture.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (131), (2018).</li><li>Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+imaging+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">Live imaging of Drosophila larval neuroblasts.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).</li><li>Egger, B., van Giesen, L., Moraru, M., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+imaging+of+primary+neural+cell+culture+from+Drosophila.">In vitro imaging of primary neural cell culture from Drosophila.</a> Nature Protocols. 8 (5), 958-965 (2013).</li><li>Homem, C. C., Reichardt, I., Berger, C., Lendl, T., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+live+cell+imaging+and+automated+4D+analysis+of+drosophila+neuroblast+lineages.">Long-term live cell imaging and automated 4D analysis of drosophila neuroblast lineages.</a> PloS One. 8 (11), 79588 (2013).</li><li>Forer, A., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochalasin+D+and+latrunculin+affect+chromosome+behaviour+during+meiosis+in+crane-fly+spermatocytes.">Cytochalasin D and latrunculin affect chromosome behaviour during meiosis in crane-fly spermatocytes.</a> Chromosome Research: An iIternational Journal On the Molecular, Supramolecular and Evolutionary Aspects of Chromosome Biology. 6 (7), 533-549 (1998).</li><li>Pampalona, J., Januschke, J., Sampaio, P., Gonzalez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-lapse+recording+of+centrosomes+and+other+organelles+in+Drosophila+neuroblasts.">Time-lapse recording of centrosomes and other organelles in Drosophila neuroblasts.</a> Methods in Cell Biology. 129, 301-315 (2015).</li><li>Ramat, A., Hannaford, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+of+miranda+localization+in+Drosophila+neuroblasts+involves+interaction+with+the+cognate+mRNA.">Maintenance of miranda localization in Drosophila neuroblasts involves interaction with the cognate mRNA.</a> Current Biology: CB. 27 (14), 2101-2111 (2017).</li><li>Rebollo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+unequal+centrosomes+drive+spindle+orientation+in+asymmetrically+dividing+drosophila+neural+stem+cells.">Functionally unequal centrosomes drive spindle orientation in asymmetrically dividing drosophila neural stem cells.</a> Developmental Cell. 12 (3), 467-474 (2007).</li><li>Hannaford, M. R., Ramat, A., Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=aPKC-mediated+displacement+and+actomyosin-mediated+retention+polarize+Miranda+in+Drosophila+neuroblasts.">aPKC-mediated displacement and actomyosin-mediated retention polarize Miranda in Drosophila neuroblasts.</a> eLife. 7, 166 (2018).</li><li>Hannaford, M., Loyer, N., Tonelli, F., Zoltner, M., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical-genetics+approach+to+study+the+role+of+atypical+Protein+Kinase+C+in+Drosophila.">A chemical-genetics approach to study the role of atypical Protein Kinase C in Drosophila.</a> Development. 146 (2), (2019).</li><li>Loyer, N., Januschke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+last-born+daughter+cell+contributes+to+division+orientation+of+Drosophila+larval+neuroblasts.">The last-born daughter cell contributes to division orientation of Drosophila larval neuroblasts.</a> Nature Communications. 9 (1), 3745 (2018).</li><li>Wilcockson, S. G., Ashe, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+ovarian+germline+stem+cell+cytocensor+projections+dynamically+receive+and+attenuate+BMP+signaling.">Drosophila ovarian germline stem cell cytocensor projections dynamically receive and attenuate BMP signaling.</a> Developmental Cell. 50 (3), 296-312 (2019).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nature methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).</li><li>Prasad, M., Montell, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+mechanisms+of+border+cell+migration+analyzed+using+time-lapse+live-cell+imaging.">Cellular and molecular mechanisms of border cell migration analyzed using time-lapse live-cell imaging.</a> Developmental Cell. 12 (6), 997-1005 (2007).</li><li>Chernysh, I. N., Nagaswami, C., Purohit, P. K., Weisel, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+clots+are+equilibrium+polymers+that+can+be+remodeled+without+proteolytic+digestion.">Fibrin clots are equilibrium polymers that can be remodeled without proteolytic digestion.</a> Scientific Reports. 2, 879 (2012).</li><li>Liss, V., Barlag, B., Nietschke, M., Hensel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-labelling+enzymes+as+universal+tags+for+fluorescence+microscopy,+super-resolution+microscopy+and+electron+microscopy.">Self-labelling enzymes as universal tags for fluorescence microscopy, super-resolution microscopy and electron microscopy.</a> Scientific Reports. 5, 17740 (2015).</li><li>. ImageJ macros [software] Available from: <a target="_blank" href="https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories">https://github.com/nicolasloyer?tab=repositories</a> (2020)</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הדמיה חיה של מוח זחל הר D. melanogaster כולו מספק את ההזדמנות להתבונן חלוקות תאי גזע עצביים אסימטריים בתנאים קרובים להקשר פיזיולוגי. החלק הראשון של הפרוטוקול שלנו מציג את הגישה שלנו על ניתוח של מוחות זחל. כאמור13, היבט קריטי של ההכנה היא למנוע פגיעה במוח. ההיבט המאתגר ביותר של זה הוא להפריד את המוח מהדיסקים הדמיוני השכן מבלי למשוך יתר על המידה על המוח. הגישה שלנו ל"חיתוך ללא משיכה" היא לבצע תנועת שחיקה עם קצות זוג מלקחיים אחד, או להחליק מלקחיים לאורך שני קצות מלקחיים אחרים המחזיקים את הקשרבין רקמות ( איור 1A)ואילו לירית ואח 'מתארים תנועות דמויות מסור עם סיכה מנתחת. אנו מייעצים לנסיין לנסות את כל הגישות ולאמץ את המתאימה ביותר עבור עצמם. אנו מציעים גם להשתמש בטיפים לפיפט מצופה BSA או FCS במקום בכלי ניתוח להעברת מוחות מבודדים. הציפוי מונע מרקמות להידבק לפלסטיק ומאפשר העברה בטוחה של רקמות תוך שמירה עליהם שקועים לחלוטין, מבלי לחשוף אותם לעיוות חולף אפשרי כשהם נדבקים לכלי הניתוח במהלך ההעברה. טיפים מצופים יש יתרונות אחרים כדי לאפשר העברה של מספר מוחות בבת אחת, וזה שימושי במיוחד כאשר זה קריטי כדי לשלוט על זמן ההתמחות של הדגימות בתוך מדיום מסוים; הם מתאימים להעברת רקמות אחרות, אפילו שבריריות כמו, למשל, גופי שומן; הם יכולים להכיל מגוון רחב של גדלי מדגם שונים באמצעות טיפים גדולים יותר או חיתוך הקיצוניות של הקצה.
לאחר מכן, פרוטוקול זה מתאר את השימוש בקרישת פיברינוגן כדי לשתק מוחות זחל על העטיפה של צלחת תרבות. המוח הוא מכוון בתוך טיפה של מדיום תרבות + פיברינוגן, ולאחר מכן קרישה נגרמת על ידי תוספת של תרומבין. היווצרות פיברין היא הדרגתית, ומספקת חלון זמן שבמהלכו ניתן לכוונן את כיוון הדגימה, במידת הצורך (איור 2C). אם נדרשת דחיסה קלה של המדגם - אשר אנו ממליצים נגד במקרה של מוח הזחל - זה יכול גם להיות מותאם דק על ידי לחיצה על הקריש פחות או יותר קרוב למדגם במהלך שלבים 3.4.4 ו 3.5.2. היתרון העיקרי של קרישת פיברינוגן זו על פני הפרוטוקול המתואר ב Lerit et al., שבו המוחות רכובים בין קרום חדיר גז ו coverslip, היא היכולת להחליף את מדיום התרבות במהלך הדמיה חיה. יתרון אפשרי של שימוש בקרום חדיר גז על הפרוטוקול שלנו יכול להיות שהוא מספק חמצון אופטימלי של הדגימות, אשר יכול להיות מוגבל יותר עם הגישה שלנו כמו המוח מופרדים מהאוויר על ידי קריש וכמה בינוני. מסיבה זו, למרות שלא הערכנו את ההשפעה של כמות המדיום התרבותי בתוך צלחת התרבות, אנו ממליצים להגביל את כמות המדיום התרבותי על גבי הקרישים תוך שמירה על קרישי דם שקועים לחלוטין.
מכיוון שהמניפולציה של הקרישים יכולה להיות קשה מבחינה ניסיונית ולגזול זמן רב, אנו ממליצים לנסיין לתרגל תחילה מניפולציה של קרישי דם ללא דגימות. לווסת את נפח הירידה של מדיום תרבות + פיברינוגן על כריכה, את הריכוז של פיברינוגן או את נפח וריכוז של תרומבין יכול לעזור להפוך את ההכנה קלה יותר יכול להיות חשוב בעת התאמת הפרוטוקול לסוגים אחרים של רקמות. עם מספיק ניסיון במניפולציה של הקרישים, מספר מוחות יכולים להיות משותקים בקריש אחד במידת הצורך, אם כי זה מסבך את הכוונון העדין של האוריינטציה. ניתן ליצור מספר קרישי דם על ה-coverslip, מה שמאפשר, למשל, לדגימות תמונה של גנוטיפים שונים. אפשר גם לחשוף קרישי דם שונים על אותו כיסוי למדיה תרבותית שונה, אם כי יש להקפיד לא לערבב את טיפות המדיום התרבותי המכסה את הקרישים השונים. ברגע שמוחות הזחל משותקים ומוכנים להדמיה חיה, אנו ממליצים לפעול בהתאם להמלצות של Lerit et al.13 כדי למנוע פוטו-סאונד מוגזם. אנו מוסיפים להמלצות אלה רק כדי לשמור על המוח ב 25 מעלות צלזיוס במהלך הדמיה חיה עם חממת במה, אלא גם כדי לחמם שלב זה לפחות 30 דקות לפני תחילת ההדמיה. בידיים שלנו, כישלון לעשות זאת באופן שיטתי גורם לסחף מיקוד חזק.
זה יכול להיות יתרון בהקשרים מסוימים כדי להיות מסוגל לבצע מיקרוסקופיה מתואמת לתקן ולדכא מדגם לאחר הדמיה חיה. עם זאת, מגבלה של שימוש בקרישי פיברין היא שכמעט בלתי אפשרי לבודד באופן מכני מוח מקריש דם מבלי לפגוע בו. דרך אפשרית להתגבר על מגבלה זו יכולה להיות לפתח שיטות להשפיל קרישי פיברין עם פלסמין או לגרום לפירוק קריש על ידי תוספת של פפטיד מחקה את הידיות המאפשרות פילמריזציה פיברין28. בדרך כלל אנו משתמשים בקרישי פיברין על דגימות הנעות בין תאים בודדים לרקמות באורך 200 מיקרומטר, אך אנו יכולים גם לשתק בהצלחה קרישי דם ומוחות תמונה מדבורים בוגרות ברוחב של מעל 3 מ"מ. הגבול העליון של גודל המדגם שניתן לשתק בקרישי דם נותר לקבוע. באופן דומה, למרות שאנחנו בדרך כלל תמונה דגימות משותקות במשך 4 עד 5 שעות, אנחנו בהצלחה הדמיה neuroblasts בתרבות העיקרית עד 3 ימים, המציין כי קריש לפחות לא מפריע הכדאיות לטווח ארוך יותר. להיפך, קרישי דם יכולים להקל על החלפה קבועה של המדיום, דרישה להדמיה לטווח ארוך יותר, ללא צורך במכשירים כגון משאבות פריסטלטיות למטרה זו. אמנם לא מדדנו את הפרמטרים החודרים של קרישי פיברין, אבל האופי הסיבי דמוי הג'ל של הקרישים נראה חדיר על ידי מולקולות חדירות לתאים. מצאנו כי Latrunculin A, Colcemid או 1-NAPP1, HALO-תג ligands וצבעים סטנדרטיים אחרים המשמשים בביולוגיה של התא להגיע לתאים בקריש פיברין ללא בעיות, עד כה לא נתקלו מולקולות כי יישמרו על ידי הקריש, אשר, עם זאת, היא אפשרות שיש לבדוק באופן אמפירי.
לסיכום, שימוש בקרישי פיברין מספק דרך אמינה וקלה יחסית ליישום דרך לשיתוק רקמות חיות להדמיה חיה. מעבר לתועלתה בהגבלת הסחף לרוחב, היכולת לשנות את מדיום התרבות במהלך הדמיה חיה הוכיחה את עצמה כבעלת ערך רב בגישת הגנטיקה הכימית שלנו לחקר חלוקת התאים האסימטריים של D. melanogaster neuroblasts21. אנו צופים כי טכניקה זו תהיה מועילה למחקרים במגוון רחב של רקמות שונות, במיוחד אם הם כרוכים גנטיקה כימית או, למשל, חלבון עצמיתתיוג 29.
המאקרו MultiHyperStackReg שלנו מסתמך על תוסף TurboReg ImageJ, אשר מיישר מסגרות רצופות או פרוסות של מחסנית, ואת תוסף MultiStackReg ImageJ, המאפשר להחיל את המרות על ערימות אחרות. MultiHyperStackReg פשוט מאפשר להחיל טרנספורמציות אלה על hyperstacks (ערימות עם לפחות ארבעה ממדים). כמו השימוש MultiHyperStackReg, כפי שאנו מתארים את זה, דורש הרבה פעולות יכול לקבל די זמן רב, כתבנו גם את המאקרו AutoHyperStackReg, אשר מבצע באופן אוטומטי את כל השלבים המתוארים בשלבים 6.2 ו 6.3. עם זאת, בניגוד MultiHyperStackReg, AutoHyperStackReg כרגע חסר את האפשרות לחשב את היישור של מחסנית המבוססת על subregion של מחסנית זו, אפשרות שמצאנו הוא לפעמים חיוני עבור יישור מספק. מגבלה נוספת של AutoHyperStackReg היא כי השימוש בו מוגבל תרגומים ולא המרות אחרות המוצעות על ידי TurboReg ו MultiStackReg, ואילו MultiHyperStackReg יכול לחול על hyperstack כל סוג המרה אם המשתמש צריך את זה. מהדורות עתידיות ייישמו פונקציות אלה ויהיו זמינות ב- GitHub30. לבסוף, מאקרו הקווים המסתובב שלנו מספק דרך קלה למדוד במהירות אותות קליפת המוח בזמן פג, גם אם קליפת המוח משנה את מיקומה או את כיוונה לאורך זמן. בין אם מצב המעקב שלו או מצב אי המעקב שלו מתאים ביותר לניתוח תלוי באיכות ובעקביות של האות הקליפתי. מצב המעקב קל יותר לשימוש מכיוון שהמשתמש אינו צריך לשקול היכן תהיה קליפת המוח עבור כל נקודת זמן ויכול להכיל שינויים גדולים במיקום ובכיוון לאורך זמן. עם זאת, זה מתאים רק אם האות הקליפתי נשאר חזק מספיק לגילוי במהלך הסרט כולו: כישלון לזהות שום דבר אחר מאשר קליפת המוח (למשל, תא ציטופלזמי בהיר קרוב לקליפת המוח) יכול לסכן את הגילוי עבור כל נקודת זמן הבאה (למשל, התא הציטופלסמי מתרחק מקליפת המוח ואת הקווים קליפת המוח יכול לעקוב אחריו לשארית הזמן לשגות). למצב ללא מעקב אין את המלכודת הזו מכיוון שהזיהוי מוגבל לקו שצויר במקור על ידי המשתמש (למשל, תא ציטופלסמי בהיר עלול לגרום לגילוי להיכשל במשך כמה נקודות זמן, אך ככל שהתא הציטופלסמי מתרחק מאזור הגילוי, זיהוי נכון של קליפת המוח מתחדש), אך אינו מתנהג היטב אם מיקום קליפת המוח או הכיוון משתנים הרבה עם הזמן. התכונה הבאה (שתהיה זמינה ב- GitHub30) שתפותח עבור מצב המעקב תהיה האפשרות לנתח נקודות זמן שצוינו בלבד ולהגדיר נקודת זמן של הפניה (ולא את נקודת הזמן הראשונה) שלפניה ולאחריה יבוצע הזיהוי, מה שיאפשר למשתמש לפחות להימנע מנקודות זמן בעייתיות.

דרוזופילה ממשיכה להיות מערכת מודלים חשובה לחקר מגוון רחב של שאלות ביולוגיות והצטיינה בקידום ידע בדיסציפלינות רבות במשך עשרות שנים. תכונה אחת שגורמת לו להתבלט במיוחד היא שהוא מתאים במיוחד להדמיה חיה. היכולת לנטר תהליכים תת-תאיים או התנהגות תאים ורקמות בזמן אמת ממשיכה לתרום ליצירת מושגי מפתח הרלוונטיים לביולוגיה התאית וההתפתחותית. פרוטוקולים מוצלחים רבים פותחו על ידי קבוצות שונות כדי לשמור על דגימות Drosophila כאלה חיים ובריאים כדי ללמוד את ההתנהגות של הדגימה ומולקולות פלואורסצנטיות לחיות. איברים ורקמות מהזבוב כגון דיסקים דמיוניים1,2, מוח הזחל 3,4,5,6, או תאי ביצה של נקבות בוגרות7,8,9, או המעי הבוגר10 למשל ניתן לחלץ ושמור בתרבות להדמיה עם מיקרוסקופ זמן לשגות. אתגר מרכזי להדמיה חיה הוא להבטיח שהדגימה תישמר קרוב למשטח ההדמיה לרזולוציה אופטימלית ושיתוק מבלי להתפשר על שלמות הדגימה שיכולה להיות רגישה להשפעות מכניות. כדי לחקור תאי גזע עצביים, הנקראים נוירובלסטים או נוירונים במוח הזחל Drosophila, למשל, שמירה על דגימות קרוב לפני השטח הדמיה יכול להיות מושגת על ידי כיסוי אותם עם מדיה תרבותית בתאי הדמיה אטומים11,12,13. עם זאת, גישה זו אינה מאפשרת בקלות חילופי מדיה ובכך מגבילה את מרחב התמרון הניסיוני. לחלופין, ניתן להכין ולהניח דגימות על כריכות שטופלו כדי להגביר את ההידבקות בתאים ולאפשר מיקרוסקופיה ביקור רב-נקודתית והדמיה ממושכת של תאים חיים במנות תרבות פתוחות, המאפשרות חילופי מדיה, אך אינן מספקות אמצעים קלים למניעת סחף או אובדן מדגם במהלך חילופי מדיה14,15.
שיטת קריש פיברין שפותחה במקור כדי ללמוד מיוזיס בזרעון עגורן חי16 מתאים במיוחד כדי להתגבר על בעיות אלה. פיברינוגן מומס במדיום תרבות רלוונטי, הדגימות ממוקמות ומכוונות בטיפה של פתרון זה על תא הדמיה זכוכית-משטח נאות לפני Thrombin מתווסף, וכתוצאה מכך היווצרות מהירה של קריש פיברין מסיס, רשת סיבית דביקה כי דבק משטח הזכוכית ואת הדגימות תוך הבטחת גישה של המדגם למדיום התרבות. לאחר מכן ניתן להחליף את המדיום מבלי להטריד את מיקום הקריש או המדגם. חילופי תרבות בינוניים במהלך ההדמיה, למשל, רצויים כאשר יש להוסיף מעכבים כמו בשיטה המקורית או לניסויי שטיפה או מרדף דופק או כאשר יש להוסיף צבעים פלואורסצנטיים במהלך הדמיית תאים חיים תוך שמירה על תאים ורקמות במקום. קרישי פיברין מתאימים להדמיה של רקמות Drosophila, כמו גם תאים בודדים13,17. קרישי פיברין ניתן להשתמש עוד יותר כדי לעזור דגימות אוריינטציה, כי בשל צורתם או מאפיינים אחרים בדרך כלל לא יהיה מכוון בדרך הרצויה על ידי אפנון מיקום המדגם בתוך קריש פיברין ואת הצורה של הקריש עצמו.
כאן אנו מספקים עדכון על שיטות ההדמיה הנוכחיות שלנו המבוססות על קריש פיברין ומספקים כלים לניתוח תמונה מבוסס פילוח ומתמקדים בשימוש בשיטה זו כדי לחקור חטיבות נוירובלסט במוח הזבוב המתפתח. אנו משתמשים באופן שגרתי בשיטת קריש פיברין כדי לעקוב אחר דגימות מרובות בקרישי דם שונים באותה צלחת תרבות. זה מאפשר i) הדמיה של אירועים תת תאיים כגון התנהגות centrosome או לוקליזציה mRNA לחיות18,19, ii) ניטור ההתנהגות של דגימות על טיפול תרופתי של גנוטיפים שונים תחת אותן הגדרות הדמיה באמצעות מיקרו ביקור רב נקודתיוסקופיה20, iii) לחקור את ההשפעות של עיכוב חריף שלאנזימים 21 ו iv) מזעור נסחף לחקור שינויים בכיוון של חלוקת התא של תאים בתוך הסביבה הפיזיולוגית שלהם על ממוקד לייזר אבלציה22. בעוד השפעות לא רצויות של תרומבין ופיברינוגן וקריש פיברין צריך להיבדק באופן אמפירי עבור כל מדגם, שיטה זו מתאימה עקרונית לשיתוק כל סוג של מדגם שיש לנתח על ידי הדמיית תאים חיים ובדרוסופילה שימש בהצלחה לחקר היבטים מרובים של ביולוגיה נוירובלסטים5,19,20אבל גם את הדינמיקה של תחזיות cytosensor של תאי גזע קו נבט נקבה23 ושינויים בקוטביות על עיכוב aPKC חריפה של תאי זקיק של תאי ביצה נקבה Drosophila 21.
הדמיה פלואורסצנטית של זמן לשגות גורמת ליצירת ערכות נתונים תלת-ממדיות מורכבות שנפתרו בזמן הדורשות שיטות לחילוץ מידע כמותי זה. כאן אנו מתארים את ההתפתחות הנוספת שלנו של24 פקודות מאקרו מבוססות ImageJ שניתן להשתמש בהן כדי לתקן להיסחף בהיפרסטקים ופקודות מאקרו מותאמות אישית של ImageJ המאפשרות כימות אוטומטי למחצה של פלואורסצנטיות רב-ערוצית בקליפת המוח התאית שפותחה לכימות חלבונים קליפת המוח בנוירובלסטים של מוחות זחל דרוזופילה או של נוירובלסטים בודדים בתרבית התאים העיקרית.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Albumin bovine serum, BSA</td>
			<td>Merck</td>
			<td>5470</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)-Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #55 Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11255-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovie Serum, suitable for cell culture</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F7524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen from human plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3879</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroDish Cell Culture Dish - 35mm, 23 mm well</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>FD35-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP1 Analog (1NA-PP1)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>529579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pyrex spot plate with nine depressions</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS722085-18EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Schneider&#39;s Insect Medium</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Merck</td>
			<td>T4648</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

applications of immobilization of drosophila tissues with fibrin clots for live imaging

דרוזופילה היא מערכת מודל חשובה לחקר מגוון רחב של שאלות ביולוגיות. איברים ורקמות שונים מהשלבים ההתפתחותיים השונים של הזבוב כגון דיסקים דמיוניים, מוח הזחל או תאי הביציות של נקבות בוגרות או המעי הבוגר יכולים להיות מופקים ונשמרים בתרבות להדמיה עם מיקרוסקופיה לשגות בזמן, מתן תובנות חשובות על ביולוגיה תאית התפתחותית. כאן, אנו מתארים בפירוט את הפרוטוקול הנוכחי שלנו לניתוח מוחות הזחל של דרוזופילה, ולאחר מכן מציגים את הגישה הנוכחית שלנו לשיתוק וכוונת מוחות זחל ורקמות אחרות על מכסה זכוכית באמצעות קרישי פיברין. שיטת קיבוע זו דורשת רק תוספת של פיברינוגן ותרומבין למדיום התרבותי. היא מתאימה להדמיית זמן ברזולוציה גבוהה על מיקרוסקופים הפוכים של דגימות מרובות באותה מנה תרבותית, ממזערת את הסחף הלרוחב הנגרם לעתים קרובות על ידי תנועות של שלב המיקרוסקופ במיקרוסקופיה ביקור רב-נקודתית ומאפשרת הוספה והסרה של ריאגנטים במהלך ההדמיה. כמו כן, אנו מציגים פקודות מאקרו מותאמות אישית שבהן אנו משתמשים באופן שגרתי כדי לתקן להיסחף ולחלץ ולעבד מידע כמותי ספציפי מניתוח זמן לשגות.

קיבוע של רקמות Drosophila עם קרישי פיברין וחילופי תרבות בינוניים במהלך הדמיה חיה. לאחר שניתחו בעקבות ההליך שהוצג בשלב 2 (איור 1) ושיתוק בקרישי פיברין על אותו כיסוי בעקבות ההליך שהוצג בשלב 3 (איור 2), מוחות זחל המבטאים בזוקה מתויגת GFP (Baz::GFP), אורתולוגיית הזבובים של חלבון הקוטביות Par-3, צולמו במשך 30 דקות במיקום רב-תכליתי. באז::GFP משולב עם apkcas4, אלל המאפשר עיכוב חריף של חלבון לא טיפוסי קינאז C (aPKC) באמצעות תוספת של אנלוגי ATP קטן 1-NAPP120. 1-NAPP1 נוסף אפוא למדיום התרבות בעקבות ההליך שהוצג בשלב 4 וההדמיה החיה חודשה למשך 2.5 שעות. מוחות בקרה הנושאים גרסה פראית של ה- aPKC קינאז לא הגיבו לאנלוגי ATP, ואילו מוחות הנושאים בנוסף מוטציה אנלוגית רגישה של aPKC (apkcas4) הציגו התכווצות של הנוירופיתליום ואשכולות בהירים של באז בנוירובלסטים וצאצאיהם ( איור6, וידאו 1). נוירובלסטים ממשיכים להתחלק לאורך כל הזמן, מה שמצביע על כך שהרקמה נשארת בריאה, ומוחות מראים מעט דריפט למרות השינוי הבינוני בתרבות, מה שמצביע על כך שהם משותקים היטב. באופן דומה, לאחר שנותחו בעקבות ההליך שהוצג ב27, ovarioles המבטא באז::GFP היו משותקים קרישי פיברין על אותו כיסוי ותמונה במשך 8 דקות, לאחר מכן יישום של 1-NAPP1 גרם התכווצות של APKCas4 תאים זקיקים מוטציה אבל לא של פקדים (איור 7, וידאו 2).
תיקון של להיסחף לרוחב ומיקוד באמצעות MultiHyperstackReg. היפרסטאק המציג הן סחף רוחבי והן סחף מיקוד(וידאו 3,פאנל שמאלי) תוקן תחילה לסחף לרוחב (שלב 6.2, איור 3, וידאו 3, הפאנל האמצעי), ולאחר מכן התמקד בסחף (שלב 6.3, איור 4, וידאו 3, לוח ימני) באמצעות התוסף MultiStackReg והמאקרו MultiHyperstackReg, וכתוצאה מכך הפחתה משמעותית של התנועות שנצפו ב-
מדידת אותות קליפת המוח באמצעות סריקות קווים מסתובבות נוירובלסט המבטא את באז::GFP (ירוק) ואת חלבון transmembrane CD4 מתויג עם חלבון פלואורסצנטי אינפרא אדום (CD4::mIFP, אדום) צולם במהלך מיטוזה אחת. אות ה-CD4::mIFP שימש כהפניה לגילוי קליפת המוח בחלקים שונים של הנוירובלסט עם קווים (שלב 7, איור 5, איור 8A-C)ואות ה-GFP נמדד בעמדות שזוהו איור 8D). במהלך החלוקה שלהם, נוירובלסטים מקוטבים באופן ארעי על ידי הקמת תחומים קליפתיים נפרדים ומנוגדים: הקוטב האפסי וקוטב הבסיס. באז מגדיר את הקוטב האפור, ובאופן עקבי, אות ה-GFP עלה בקוטב הנוירובלסט וירד בקוטב הבסיס במהלך החלוקה (איור 8C,D). המיקום של קליפת המוח היה במעקב מספק לאורך כל הזמן לשגות (איור 8C, וידאו 4). הקווים והגנוטיפים של דרוזופילה מוזכרים בטבלה משלימה 1-2.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig06.jpg"> איור 6: יישום של אנלוגי ATP במוח זחל משותק במהלך הדמיה חיה. (A) הדמיה חיה של שני מוחות זחל המבטאים את באז::GFP משותק על אותו כיסוי. מדיום התרבות משתנה לריכוז של 10 מיקרומטר של האנלוגי ATP 1-NAPP1 ב 0 דקות. מוחות בקרה אינם מגיבים באופן ניכר לאנלוגי ATP ואילו מוחות הנושאים מוטציה אנלוגית רגישה של aPKC (aPKCAS4) מציגים התכווצות של הנוירופיתליום (ראשי חץ) ואשכולות בהירים של באז בנוירובלסטים וצאצאיהם. הקרנת אינטנסיביות מקסימלית של 33 פרוסות לעומק של 23 מיקרומטר. סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. (B) הגדלה של הנוירופיתליום. סרגל קנה מידה: 10 μM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig07.jpg"> איור 7: יישום של אנלוגי ATP בתאי ביצים משותקים במהלך הדמיה חיה. הדמיה חיה של שני אובריולים המבטאים את באז::GFP משותק על אותו כיסוי. מדיום התרבות משתנה לריכוז של 10 מיקרומטר של האנלוגי ATP 1-NAPP1 ב 0 דקות. תאי ביצה בקרה אינם מגיבים באופן ניכר לאנלוגי ATP ואילו תאי ביצה הנושאים מוטציה אנלוגית רגישה של aPKC (aPKCAS4) מציגים התכווצות של האפיתל (ראשי חץ) שבסופו של דבר מובילים לפירוק לכאורה של צמתים דבקים. הקרנת עוצמה מקסימלית של 33 פרוסות לעומק של 27 מיקרומטר. סרגל <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig07large.jpg" target="_blank"></a> קנה מידה: 20 מיקרומטר.
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61954/61954fig08.jpg"> איור 8: מדידת האות הקליפתי באמצעות קווים מסתובבים. (A) לחיות D. מלנוגאסטר נוירובלסט מבטא באז::GFP (ירוק) ו CD4::mIFP (אדום). קווי ציאן: קווי סריקה ראשוניים נעוצים בניצב לאזורים קליפתיים שונים למדידה. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר (B) זיהוי של קליפת המוח (קו כחול כהה) באמצעות אוניות קליפת המוח ו- CD4::mIFP (אדום) כערוץ הייחוס. קו תכלת: אזור המוגדר על ידי הפרמטר "מדוד מסביב" (כאן, 2 פיקסלים), שבו האות נמדד לאחר זיהוי קליפת המוח. סרגל קנה מידה: 2 מיקרומטר (C) ציאן: אזורים קליפתיים שזוהו במהלך חלוקה נוירובלסט על ידי שיטת הקווים המסתובבים מקווי הסריקה הראשוניים המוצגים ב- (A), באמצעות CD4::mIFP (אדום) כערוץ הייחוס. סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. חץ: מוט apical. ראש חץ: מוט בסיס. (D) מדידה של באז::עוצמת אות GFP לאורך זמן בשני האזורים המתאימים המזוהים על ידי קווים מסתובבים המוצגים ב- (C). במהלך המיטוזיס, באז::GFP מקבל מועשר באופן ארעי בקוטב apical של neuroblast והוא מרוקן מקוטב הבסיס הנגדי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61954/61954fig08large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.</a>
וידאו 1: יישום של חילופי מדיה על מוח זחל משותק במהלך הדמיה חיה כדי להוסיף מעכב, המוצג באיור 6, סרגל קנה מידה: 20 <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_1_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">מיקרומטר.</a>
וידאו 2: יישום של חילופי מדיה על תאי ביצה משותקים במהלך הדמיה חיה כדי להוסיף מעכב, המוצג באיור 7, סרגל קנה מידה: 20 מיקרומטר. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_2_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank"></a>
וידאו 3: תיקון של להיסחף לרוחב ומיקוד באמצעות MultiHyperStackReg. הדמיה חיה של נוירובלסט המבטא את בדיקת הממברנה PH::GFP. מישור מוקד יחיד. Xz: שריד אורתוגונלי. משמאל: לפני תיקון הסחף. אמצע: לאחר תיקון הסחף לרוחב. מימין: לאחר תיקון הסחף לרוחב המיקוד, סרגל קנה המידה: 10 מיקרומטר. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_3_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד את הווידאו הזה.</a>
וידאו 4: זיהוי קליפת המוח באמצעות קווים מסתובבים, המוצג באיור 8, סרגל קנה מידה: 5 מיקרומטר. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/MOV_4_Loyer_Januschke.mp4" target="_blank"></a>
טבלה משלימה 1: גנוטיפים של רקמות דרוזופילה דימוי. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_1_genotypes.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה משלימה 2: מקורם של טרנסג'נים בשימוש. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Supplemental_Table_2_origine_of_transgenes.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
קובץ קידוד משלים 1: מקורם של טרנסג'נים בשימוש. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code1_MultiHyperstackReg.ijm" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ קידוד משלים 2: מקורם של טרנסג'נים בשימוש. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code2_AutoHyperstackReg.ijm" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ קידוד משלים 3: מקורם של טרנסג'נים בשימוש. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61954/Code3_RotatingLineScan.ijm" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging at JoVE.com

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

פרוטוקול זה מתאר יישומים של קיבוע מדגם באמצעות קרישי פיברין, הגבלת הסחף, ומאפשר הוספה ושטיפה של ריאגנטים במהלך הדמיה חיה. דגימות מועברות טיפה של פיברינוגן המכיל מדיום תרבות על פני השטח של כריכה, ולאחר מכן פילמור הוא המושרה על ידי הוספת תרומבין.

יישומים של קיבוע של רקמות Drosophila עם קרישי פיברין להדמיה חיה

Drosophila is an important model system to study a vast range of biological questions. Various organs and tissues from different developmental stages of ...

applications-immobilization-drosophila-tissues-with-fibrin-clots-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

3.0K Views.  University of Dundee. פרוטוקול זה מתאר יישומים של קיבוע מדגם באמצעות קרישי פיברין, הגבלת הסחף, ומאפשר הוספה ושטיפה של ריאגנטים במהלך הדמיה חיה. דגימות מועברות טיפה של פיברינוגן המכיל מדיום תרבות על פני השטח של כריכה, ולאחר מכן פילמור הוא המושרה על ידי הוספת תרומבין.

Video: Applications of Immobilization of Drosophila Tissues with Fibrin Clots for Live Imaging

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; for example, how the zygote polarizes to establish the body axis and how the embryo specifies various cell fates during organ formation. This manuscript describes an in vitro ovule culture method to perform live-cell imaging of developing zygotes and embryos of Arabidopsis thaliana. The optimized cultivation medium allows zygotes or early embryos to grow into fertile plants. By combining it with a poly(dimethylsiloxane) (PDMS) micropillar array device, the ovule is held in the liquid medium in the same position. This fixation is crucial to observe the same ovule under a microscope for several days from the zygotic division to the late embryo stage. The resulting live-cell imaging can be used to monitor the real-time dynamics of zygote polarization, such as nuclear migration and cytoskeleton rearrangement, and also the cell division timing and cell fate specification during embryo patterning. Furthermore, this ovule cultivation system can be combined with inhibitor treatments to analyze the effects of various factors on embryo development, and with optical manipulations such as laser disruption to examine the role of cell-cell communication.

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

This manuscript describes an in vitro ovule cultivation method that enables live-cell imaging of Arabidopsis zygotes and embryos. This method is utilized to visualize the intracellular dynamics during zygote polarization and the cell fate specification in developing embryos.

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and differentiation. Typically, pHi dynamics are determined in cultured cells, which are amenable to measuring and experimentally manipulating pHi. However, the recent development of new tools and methodologies has made it possible to study pHi dynamics within intact, live tissue. For Drosophila research, one important development was the generation of a transgenic line carrying a pHi biosensor, mCherry::pHluorin. Here, we describe a protocol that we routinely use for imaging live Drosophila ovarioles to measure pHi in the epithelial follicle stem cell (FSC) lineage in mCherry::pHluorin transgenic wild type lines; however, the methods described here can be easily adapted for other tissues, including the wing discs and eye epithelium. We describe techniques for expressing mCherry::pHluorin in the FSC lineage, maintaining ovarian tissue during live imaging, and acquiring and analyzing images to obtain pHi values.

Methods for Imaging Intracellular pH of the Follicle Stem Cell Lineage in Live Drosophila Ovarian Tissue

We provide a protocol for imaging intracellular pH of an epithelial stem cell lineage in live Drosophila ovarian tissue. We describe methods to generate transgenic flies expressing a pH biosensor, mCherry::pHluorin, image the biosensor using quantitative fluorescence imaging, generate standard curves, and convert fluorescence intensity values to pH values.

שיטות הדמיה תאיים pH של השושלת תאי זקיק ברקמת השחלה דרוזופילה בשידור חי

Changes in intracellular pH (pHi) play important roles in the regulation of many cellular functions, including metabolism, proliferation, and ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled by multiple mechanisms that include the Spindle Assembly Checkpoint (SAC). The SAC is part of a complex feedback system that is responsible for prevention of a cell progress through mitosis unless all chromosomal kinetochores have attached to spindle microtubules. Chromosomal lagging and abnormal chromosome segregation is an indicator of dysfunctional cell cycle control checkpoints and can be used to measure the genomic stability of dividing cells. Deregulation of the SAC can result in the transformation of a normal cell into a malignant cell through the accumulation of errors during chromosomal segregation. Implementation of the SAC and the formation of the kinetochore complex are tightly regulated by interactions between kinases and phosphatase such as Protein Phosphatase 2A (PP2A). This protocol describes live cell imaging of lagging chromosomes in mouse embryonic fibroblasts isolated from mice that had a knockout of the PP2A-B56&#947; regulatory subunit. This method overcomes the shortcomings of other cell cycle control imaging techniques such as flow cytometry or immunocytochemistry that only provide a snapshot of a cell cytokinesis status, instead of a dynamic spatiotemporal visualization of chromosomes during mitosis.

This protocol describes an easy and convenient method to label and visualize live chromosomes in mitotic cells using Histone2B-GFP BacMam 2.0 label and a spinning disc confocal microscopy system.

תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits are required to control this behavior. Failure to produce the rhythmic pattern of contractions can be indicative of neurological abnormalities. We previously found that defects in protein O-mannosylation, a posttranslational protein modification, affect the axon morphology of sensory neurons and result in abnormal coordinated muscle contractions in embryos. Here, we present a relatively simple method for recording and analyzing the pattern of peristaltic muscle contractions by live imaging of late stage embryos up to the point of hatching, which we used to characterize the muscle contraction phenotype of protein O-mannosyltransferase mutants. Data obtained from these recordings can be used to analyze muscle contraction waves, including frequency, direction of propagation and relative amplitude of muscle contractions at different body segments. We have also examined body posture and taken advantage of a fluorescent marker expressed specifically in muscles to accurately determine the position of the embryo midline. A similar approach can also be utilized to study various other behaviors during development, such as embryo rolling and hatching.

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Here, we present a method to record embryonic muscle contractions in Drosophila embryos in a non-invasive and detail-oriented manner.

הדמיה חיה וניתוח של התכווצויות שרירים בתוך העובר דרוזופילה

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin rods are a hallmark of a conserved, inducible Actin Stress Response (ASR) that accompanies human pathologies, including neurodegenerative disease. Previously, we showed that the ASR contributes to morphogenesis failures and reduced viability of developing embryos. This protocol allows the continued study of mechanisms underlying actin rod assembly and the ASR in a model system that is highly amenable to imaging, genetics and biochemistry. Embryos are collected and mounted on a coverslip to prepare them for injection. Rhodamine-conjugated globular actin (G-actinRed) is diluted and loaded into a microneedle. A single injection is made into the center of each embryo. After injection, embryos are incubated at elevated temperature and intranuclear actin rods are then visualized by confocal microscopy. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) experiments may be performed on the actin rods; and other actin-rich structures in the cytoplasm can also be imaged. We find that G-actinRed polymerizes like endogenous G-actin and does not, on its own, interfere with normal embryo development. One limitation of this protocol is that care must be taken during injection to avoid serious injury to the embryo. However, with practice, injecting G-actinRed into Drosophila embryos is a fast and reliable way to visualize actin rods and can easily be used with flies of any genotype or with the introduction of other cellular stresses, including hypoxia and oxidative stress.

Imaging Intranuclear Actin Rods in Live Heat Stressed Drosophila Embryos

The goal of this protocol is to inject Rhodamine-conjugated globular actin into Drosophila embryos and image intranuclear actin rod assembly following heat stress.

הדמיה מוטות Actin תוך-גרעיניים בחום חי הדגישו עוברי דרוזופילה

The purpose of this protocol is to visualize intranuclear actin rods that assemble in live Drosophila melanogaster embryos following heat stress. Actin ...

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, germ cell development, piRNA biology, and niche formation. Here, we present a dissection technique to live-image the gonad ex vivo during a period when in vivo live-imaging is highly ineffective. This protocol outlines how to transfer embryos to an imaging dish, choose appropriately-staged male embryos, and dissect the gonad from its surrounding tissue while still maintaining its structural integrity. Following dissection, gonads can be imaged using a confocal microscope to visualize dynamic cellular processes. The dissection procedure requires precise timing and dexterity, but we provide insight on how to prevent common mistakes and how to overcome these challenges. To our knowledge this is the first dissection protocol for the Drosophila embryonic gonad, and will permit live-imaging during an otherwise inaccessible window of time. This technique can be combined with pharmacological or cell-type specific transgenic manipulations to study any dynamic processes occurring within or between the&#160;cells in their natural gonadal environment.

Dissection and Live-Imaging of the Late Embryonic Drosophila Gonad

Here, we provide a dissection protocol required to live-image the late embryonic Drosophila male gonad. This protocol will permit observation of dynamic cellular processes under normal conditions or after transgenic or pharmacological manipulation.

דיסקציה והדמיה חיה של דרוזופילה גונד העוברית המאוחרת

The Drosophila melanogaster male embryonic gonad is an advantageous model to study various aspects of developmental biology including, but not limited to, ...

Visualizing the Effects of Oxidative Damage on Drosophila Egg Chambers using Live Imaging

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ribonucleoprotein particle movement, mRNA localization, organelle movement, and cytoskeletal dynamics. There are several methods for live imaging that have been developed. Due to the fact that each method involves dissecting individual ovarioles placed in media or halocarbon oil, cellular damage due to hypoxia and/or physical manipulation will inevitably occur over time. One downstream effect of hypoxia is to increase oxidative damage in the cells. The purpose of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries after induction of controlled cellular damage. Here, we use hydrogen peroxide to induce cellular oxidative damage and give examples of the effects of such damage on two subcellular structures, mitochondria and Clu bliss particles. However, this method is applicable to any subcellular structure. The limitations are that hydrogen peroxide can only be added to aqueous media and would not work for imaging that uses halocarbon oil. The advantages are that hydrogen peroxide is readily available and inexpensive, acts quickly, its concentrations can be modulated, and oxidative damage is a good approximation of damage caused by hypoxia as well as general tissue damage due to manipulation.

The objective of this protocol is to use live imaging to visualize the effects of oxidative damage on the localization and dynamics of subcellular structures in Drosophila ovaries.

הדמיה של ההשפעות של נזק חמצוני על תאי ביצה Drosophila באמצעות הדמיה חיה

Live imaging of Drosophila melanogaster ovaries has been instrumental in understanding a variety of basic cellular processes during development, including ...