Bu çalışma Çin Burs Konseyi (CSC, R. Xia'ya), Alman Kardiyovasküler Araştırma Merkezi (DZHK; 81X2600255'ten S. Clauss'a, 81Z0600206'dan S. Kääb'a), Corona Vakfı (S199/10079/2019'dan S. Clauss'a), SFB 914 (H. Ishikawa-Ankerhold ve S. Massberg'e Z01 projesi ve A10'dan C. Schulz'a), Kardiyovasküler Hastalıklar üzerine ERA-NET (ERA-CVD; 01KL1910'dan S. Clauss'a) ve Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (S. Clauss'a) tarafından desteklenmiştir. Fon verenlerin el yazması hazırlamada hiçbir rolü yoktu.

Hayvan bakımı ve tüm deneysel prosedürler, Münih Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Etik Komitesi'nin yönergelerine uygun olarak yürütülmüş ve fareler üzerinde yapılan tüm prosedürler Bavyera, Münih, Almanya Hükümeti tarafından onaylanmıştır (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). C57BL6/J fareleri Jackson Laboratuvarı'ndan satın alındı.
NOT: Şekil 1 , deney için gerekli aletleri göstermektedir. Şekil 2 , brüt kardiyak anatominin bir örneğini göstermektedir. Şekil 3 , SAN ve AVN'nin yetişkin bir fare kalbindeki konumunu göstermektedir. Şekil 4'te konfokal mikroskopiye yüklenen hazırlanmış örnek gösterilmektedir.
1. Hazırlıklar
<ol><li>30 mL PBS'de 10 mL% 16 formaldehit çözeltisini seyrelterek% 4'lük bir formaldehit çözeltisi (% 4 PFA) hazırlayın.</li>
	<li>Sırasıyla 15 g ve 30 g sakkaroz tozunu 100 mL PBS'ye çözerek% 15 sakkaroz çözeltisi ve% 30 sakkaroz çözeltisi hazırlayın. Sakkaroz tozu tamamen çözüldükten sonra, 4 ° C'de saklamadan önce çözeltiyi 0.2 μm şırınga filtresi kullanarak süzün.</li>
	<li>Bir beherin içine %3-%4'lük bir agaroz jeli hazırlayın, 3 g veya 4 g agaroz tozu ve 100 mL 1x TAE (50x TAE stok çözeltisinden seyreltilmiş) ekleyin. Beheri manyetik bir karıştırıcıya yerleştirin ve agaroz tamamen çözülene kadar kaynatın.</li>
	<li>Diseksiyon kabını, 100 mm çapında bir Petri kabına 30 mL agaroz jeli (% 3-4) hafifçe dökerek hazırlayın. Petri kabını soğuması ve sertleşmesi için oda sıcaklığında tezgahta bırakın.</li>
	<li>Tablo 1'de verilen tariflere göre blokaj çözeltisi ve yıkama çözeltisi hazırlayın. Kullanım gününde hazırlanan tüm çözümleri hazırlayın. Uzun süreli depolama önerilmez.</li>
	<li>Antikor çözeltilerini soğuk (4 ° C) 1x PBS'de seyrelterek hazırlayın, seyreltmeyi ışıktan koruyun (örneğin, alüminyum folyoyu etrafına sararak) ve seyreltmeleri kullanılana kadar buz üzerinde tutun. Kuluçkadan kısa bir süre önce antikorları seyreltin. Seyreltilmiş antikorları oda sıcaklığında bırakmaktan kaçının. NOT: Uygun antikor seyreltmesi, konvansiyonel immünofloresan boyama işlemi gerçekleştirilerek karşılaştırılabilir doku örnekleri ile test edilmelidir. Burada, antikorları 10 μm kalınlığında kesilmiş donmuş bölümleri boyayarak test ettik.</li>
</ol>2. Organ toplama ve doku hazırlama
<ol><li>Fareyi bir izofluran buharlaştırıcıya bağlı bir inkübasyon odasına yerleştirerek anestezi yapın. Buharlaştırıcıyı% 4-5 izofluran (sırasıyla% 96-95 oksijen) verecek şekilde ayarlayın. NOT: Tam anestezi, fare sırtına yerleştirilene kadar odayı hafifçe yuvarlayarak postüral reaksiyonun ve sağ refleksin kaybıyla doğrulanır.</li>
	<li>Fareyi ameliyat masasında sırtüstü pozisyona getirin. Fare burnunu, izofluran buharlaştırıcıya bağlı iç tüpü ile modifiye edilmiş bir Bain devresine bağlı bir anestezi maskesine yerleştirin. Anesteziyi sürdürmek için, 1 L / dak akış hızında oksijende% 1-2 izofluran kullanın. Fazla anestezik buharı maskenin dış tüpünden fareden temizleyin ve fazla anestezik gazı emen bir aktif kömür kutusundan çekin.</li>
	<li>Tam anestezi sağlandığında, analjezi için fentanil enjekte edin (0.1 μg / 25 g vücut ağırlığı i.p.).</li>
	<li>Ayak parmağını sıkıştırma refleksi tespit edilemediğinde, kürk ve cildi çıkarmak için iris makası kullanarak jugulumdan simfize kadar net bir kesim yapın. Karnı dikkatlice açmak için iris makası kullanarak kaburgaların altında soldan sağa doğru başka bir kesim yapın.</li>
	<li>Herhangi bir organa zarar vermeden diyaframın soldan sağa kesilmesine izin vermek için kavisli forseps kullanarak ksifoid biraz hayat verin. Göğüs kafesini her iki tarafta medial aksiller bir çizgide kesin, iris makası kullanarak kraniyal olarak çevirin ve kalbe erişime izin verin.</li>
	<li>İnferior vena kavayı ve inen torasik aortu iris makası kullanarak diyafram seviyesinde kesin. Kalbi tepe bölgesinde 27 G'lik bir iğne ile delin ve ardından iğneyi dikkatlice sol ventriküle (LV) itin. Kalbi delmek için LV'ye yavaşça 5-10 mL buz gibi soğuk PBS enjekte edin. NOT: Kalbin rengi, PBS ile başarılı perfüzyonu gösteren kırmızıdan griye dönmelidir.</li>
	<li>Büyük damarları kesmeye ve kalbi çıkarmaya izin veren bir cımbız kullanarak kalbin tepesini dikkatlice kaldırın.</li>
	<li>Superior vena kava'ya (SVC) zarar gelmesini önlemek için büyük arterleri ve damarları kalpten mümkün olduğunca uzağa keserek kalbi tüketin. Daha sonraki işlemler sırasında önemli bir dönüm noktası olarak hizmet edeceğinden SVC'yi koruyun.</li>
	<li>Kalbin çıkarılmasından sonra, izofluran buharlaştırıcısını kapatın.</li>
	<li>Kalbi, diseksiyon mikroskobu altında buz gibi soğuk PBS ile dolu bir diseksiyon kabına koyun. Kalbin solu/sağı ve önü/arkası belirlendikten sonra, kalbi kabın dibinde kalbin önü olacak şekilde çevirin (arkada bulunan büyük damarları ortaya çıkarmak için).</li>
	<li>Diseksiyon kabının altındaki agaroza tepeden ve sol atriyal apendikstan (LAA) küçük iğneler koyarak kalbi hareketsiz hale getirin (Şekil 2A). İnce cımbız ve makas kullanarak, kavaller arası bölgeyi açığa çıkarmak için SVC ve inferior vena kava (IVC) (örneğin akciğerler, yağ, perikard) etrafındaki kalp dışı dokuyu dikkatlice çıkarın (Şekil 3A).</li>
	<li>Ventriküller ve atriyum arasındaki oluğu mikro makasla paralel keserek ventriküllerin çoğunu çıkarın. Pleksiglas halkasına daha sonra yüklenmek üzere ventriküler dokunun küçük bir bölümünü koruyun.</li>
	<li>Fiksasyon ve dehidrasyon için, numuneyi (atriyum, SVC ve IVC içeren) 4 ° C'de gece boyunca% 4 PFA'ya koyun.</li>
	<li>Ertesi gün, kalbi 4 ° C'de 24 saat boyunca% 15 sakkaroz çözeltisine aktarın.</li>
	<li>Ertesi gün, kalbi 4 ° C'de 24 saat boyunca% 30 sakkaroz çözeltisine aktarın. NOT: Adım 2.13, 2.14 ve 2.15'teki sabitleme ve dehidrasyon için, numuneler daha fazla karışmadan veya sallanmadan 4 ° C'de bırakılır.</li>
</ol>3. Tam montajlı immünofloresan boyama
<ol><li>Kalbi PBS'de seyreltilmiş %1 Triton X-100 ile yıkayın ve 4 °C'de gece boyunca bloke edici çözeltiyi (Tablo 1) bloke edin ve geçirgenleştirin.</li>
	<li>Kalbi 1.5 mL'lik bir tüpe yerleştirin ve 4 ° C'de 7 gün boyunca bloke edici çözelti ile seyreltilmiş tavşan anti-fare konneksin-43 (1:200 seyreltme) ve sıçan anti-fare HCN4 (1:200 seyreltme) antikorları ile inkübe edin. NOT: Veri sayfalarını oryantasyon olarak kullanmadan önce optimal primer antikor konsantrasyonu test edilmelidir. İlgilenilen diğer antijenler de, birincil antijenin konakçı türleri diğerlerinden farklı olduğu sürece, bu adımda boyanabilir. Daha yüksek bir Triton X-100 konsantrasyonu,10'dan önce gösterildiği gibi daha etkili antikor boyaması elde edilmesine yardımcı olabilir, ancak konsantrasyon ayrı ayrı belirlenebilir.</li>
	<li>7 gün sonra, bir pipet kullanarak birincil antikorları içeren çözeltiyi çıkarın ve kalbi% 1 Triton X-100 çözeltisi ile 3 kez yıkayın (her seferinde orbital çalkalayıcıdaki oda sıcaklığında 1 saat boyunca).</li>
	<li>Yıkadıktan sonra, kalbi = Alexa Fluor 488 keçi anti-sıçan IgG (1:200 seyreltme) ve Alexa Fluor 647 keçi tavşan karşıtı IgG (1:200 seyreltme) ile 4 ° C'de 7 gün boyunca kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>7 gün sonra, ikincil antikorları içeren tüm çözeltiyi bir pipet kullanarak çıkarın. Daha sonra yıkama solüsyonunu kullanarak kalbi (Tablo 1) 3 kez yıkayın (yörüngesel çalkalayıcıdaki oda sıcaklığında her seferinde 1 saat boyunca).</li>
	<li>Çekirdekleri boyamak için, kalbi 4 ° C'de gece boyunca DAPI çözeltisinde (10 μg / mL) inkübe edin.</li>
	<li>Ertesi gün, kalbi 3 kez yıkama çözeltisiyle yıkayın (yörüngesel çalkalayıcıdaki oda sıcaklığında her seferinde 1 saat boyunca). NOT: Adım 3.1, 3.2, 3.4 ve 3.6'da blokaj, geçirgenlik, antikor inkübasyonu ve DAPI boyama için, numuneleri 4 ° C'de sabit durumda bırakın, karıştırmaya gerek yoktur. Lekeli doku, 4 ° C'de yıkama çözeltisi ile tamamen örtülmüş olarak korunabilir ve konfokal mikroskopta görüntülenene kadar birkaç gün boyunca ışıktan korunabilir.</li>
</ol>4. Konfokal mikroskopi
<ol><li>Pleksiglas halkaları hazırlayın ve hamuru ile doldurun (Şekil 1). Hamurun merkezinde, kalbin yüklenmesi için merkezde küçük bir oluk oluşur. Düz bir görüntüleme düzlemi elde etmek ve alanı ayarlamak ve 4.4. adımda numune ile kapak kaymaları arasındaki hava kabarcıklarını önlemek için sığ bir oluk açın.</li>
	<li>Hem SAN hem de AVN'nin sırayla görüntülenmesi için aynı kalp örneğini kullanın. SAN görüntüleme için doğrudan kalbe yüklenirken, AVN görüntüleme için daha önce mikrodiseksiyon yapın.<ol><li>SAN görüntüleme<ol><li>SAN'ı anatomik yer işaretleriyle tanımlayın: kalbin dorsal tarafında, kavaller arası bölgede (üst ve alt vena kava arasındaki bölge) bulunur. Crista terminalis (BT), SAN ve RAA arasındaki kas çizgisidir.</li>
			<li>Kalbi, kalbin arkası yukarı bakacak şekilde hamuru oluğuna yerleştirin. Kalp PBS ile tamamen kaplanana kadar boşluktaki tüm havayı yerinden etmek için kalbe PBS ekleyin (genellikle birkaç damla PBS yeterlidir).</li>
			<li>Diseksiyon mikroskobu altında, kalbi sabitlemek için RAA, LAA ve sol ventrikülün kalan kısımlarını hamuru içine hafifçe bastırın. Tüm kavaller arası bölgenin ve crista terminalinin açıkça görülebildiğinden emin olun (hamuru ile kaplı değildir). Görüntülenecek alan Şekil 3A'da gösterilmiştir.</li>
		</ol></li>
		<li>AVN görüntüleme<ol><li>SAN'ın görüntülenmesini bitirdikten sonra, aynı örneği hatırlayın ve ardından AVN görüntüleme için kullanın. AVN mikrodiseksiyonu için, kalbi = diseksiyon mikroskobunun altındaki bir diseksiyon kabına yerleştirin.</li>
			<li>Kalbi sağ taraf yukarı bakacak şekilde yönlendirin (sağ ventrikülün kalan kısımları dahil). Dokuyu hareketsiz hale getirmek için AG serbest duvarının kalan kısmından (şimdi altta olan) pimler yerleştirin (Şekil 2B).</li>
			<li>Kalan RV serbest duvarını triküspid valf ve superior vena kava boyunca yukarı doğru kesin. Daha sonra interventriküler ve interatriyal septumu ortaya çıkarmak için RV ve RA'yı çevirin. (Şekil 3B) NOT: Koroner sinüse (CS) zarar vermemeye dikkat edin, çünkü daha sonra AVN'yi lokalize etmeye izin veren Koch üçgenini bulmak önemli bir anatomik dönüm noktasıdır. CS, kalbin arka tarafındaki sol atriyoventriküler olukta enine olarak çalışır ve CS deliği açıklığı, interatriyal septumun alt kısmındaki IVC ile triküspid kapak arasında bulunur (Şekil 3A ve B).</li>
			<li>Sağ atriyumun endokardiyal yüzeyinde bulunabilen, triküspid kapağın (TV) septal broşürünün menteşe çizgisi ile ön tarafta ve arkada Todaro tendonu ile sınırlanmış Koch üçgenini tanımlayın. Taban, koroner sinüsün deliğinden oluşur (Şekil 3B). AVN görüntüleme için hedef bölge burası olduğundan, açıkça görülebilmesi gerekir.</li>
			<li>Kalbi, Pleksiglas halkası içindeki hamuru oluğuna, Koch üçgeni açıkça açığa çıkarılarak (yani hamuru ile kaplanmamış) aktarın. Numuneyi sabitlemek için Koch üçgeninin etrafındaki dokuyu hamuru yavaşça bastırın. Kalp PBS ile tamamen kaplanana kadar boşluktaki tüm havayı yerinden etmek için kalbe PBS ekleyin (genellikle birkaç damla PBS yeterlidir).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Pleksiglas halkaların kenarlarına, hamuru dolgulu Pleksiglas halkaların içine yüklenen kalplerin kapak kaymalarıyla kaplanmasını sağlamak için silikon uygulayın.</li>
	<li>PBS'nin parçalarını sıkmak ve görüntüleme alanında herhangi bir hava kabarcığından kaçınırken kalbi kapak kaymasına takmak için hamurunun arka tarafına hafifçe bastırın. NOT: Hamurunun arka tarafına bastırılırken ilgilenilen bölgelerin katlanmadığından ve örtülmediğinden emin olun. Anatominin korunması ve örneklerin uygun konfokal görüntülenmesi için numune aşırı kompresyonu olmayan düz bir görüntüleme düzlemi gereklidir. SAN için, kavaller arası bölgenin açıkça açığa çıktığından emin olmak önemlidir. AVN için, Koch üçgeni tamamen açığa çıkarılmalıdır.</li>
	<li>Tüm montajlı boyama örneklerini konfokal mikroskop platformuna baş aşağı yerleştirin. Kapak kaymasına takılı açıkta kalan SAN/AVN artık mikroskop platformunun dibindedir (Şekil 4). NOT: Görüntü çekmek için Airyscan Ünitesine sahip Carl Zeiss LSM800 ve ZEN 2.3 SP1 siyah yazılımını kullanıyoruz.</li>
	<li>Alexa Fluor 420 konjuge anti-HCN4'ün uyarılması için "BP420-480 + LP605" plakasını seçin. Ana kazancı 650-750 arasında değiştirin.</li>
	<li>Döşeme Tarama işlevini kullanarak tüm SAN ve AVN bölgesinin genel bir görüntüsünü alın. Ardından, taranacak ilgi alanının etrafındaki genel bakış görüntüsüne tıklayıp bir kare ekleyerek HCN4 pozitif bölgesini seçin.</li>
	<li>Konfokal mikroskobun kalan kanalları (Alexa Fluor 488 ve DAPI) için plakalar ve ana kazanç dahil olmak üzere parametreleri kontrol edin ve adım 4.6'da açıklandığı gibi ayarlayın.</li>
	<li>Tüm numuneyi önizlemek ve Z-stack aralığı için İlk ve Son'u ayarlamak üzere odağı numunenin yukarıdan aşağıya doğru yavaşça ayarlayın. Optik numunenin kalınlığına bağlı olarak Z-yığını için en uygun aralığı ayarlayın. Z-yığını için aralık olarak 20x hedefi ve 0,8-1 μm kullanıyoruz.</li>
	<li>Tüm parametreler düzgün bir şekilde ayarlandıktan sonra, SAN ve AVN'nin tüm alanını tarayın.</li>
	<li>Yazılım kullanarak görüntülerin 3B rekonstrüksiyonunu gerçekleştirin (örneğin, Imaris sürüm 8.4.2).<ol><li>Görüntü İşleme'yi seçin | Arka plan lekelemesini kaldırmak için Temel Çıkarma Özelliği.</li>
		<li>Seçilen kanal ve işlenecek ilgili bölge için ayara yüzey oluşturmayı seçin.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+porcine+model+of+atrial+arrhythmogenicity+in+the+context+of+ischaemic+heart+failure.">Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure.</a> PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).</li><li>Schuttler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Atrial+Fibrillation.">Animal Models of Atrial Fibrillation.</a> Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).</li><li>van Weerd, J. H., Christoffels, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+formation+and+function+of+the+cardiac+conduction+system.">The formation and function of the cardiac conduction system.</a> Development. 143 (2), 197-210 (2016).</li><li>Vogler, J., Breithardt, G., Eckardt, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bradyarrhythmias+and+Conduction+Blocks.">Bradyarrhythmias and Conduction Blocks.</a> Revista Espa&#241;ola de Cardiolog&#237;a (English Edition. 65 (7), 656-667 (2012).</li><li>Wen, Y., Li, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphology+of+mouse+sinoatrial+node+and+its+expression+of+NF-160+and+HCN4.">Morphology of mouse sinoatrial node and its expression of NF-160 and HCN4.</a> International Journal of Clinical and Experimental Medicine. 8 (8), 13383-13387 (2015).</li><li>Verheijck, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+features+of+the+mouse+sinoatrial+node+in+relation+to+connexin+distribution.">Electrophysiological features of the mouse sinoatrial node in relation to connexin distribution.</a> Cardiovascular Research. 52 (1), 40-50 (2001).</li><li>Glukhov, A. V., Fedorov, V. V., Anderson, M. E., Mohler, P. J., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+anatomy+of+the+murine+sinus+node:+high-resolution+optical+mapping+of+ankyrin-B+heterozygous+mice.">Functional anatomy of the murine sinus node: high-resolution optical mapping of ankyrin-B heterozygous mice.</a> American Journal of Physiology Heart and Circulatory Physiology. 299 (2), H482-H491 (2010).</li><li>Sillitoe, R. V., Hawkes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-mount+immunohistochemistry:+a+high-throughput+screen+for+patterning+defects+in+the+mouse+cerebellum.">Whole-mount immunohistochemistry: a high-throughput screen for patterning defects in the mouse cerebellum.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 50 (2), 235-244 (2002).</li><li>Hulsmans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+Facilitate+Electrical+Conduction+in+the+Heart.">Macrophages Facilitate Electrical Conduction in the Heart.</a> Cell. 169 (3), 510-522 (2017).</li><li>Liu, J., Dobrzynski, H., Yanni, J., Boyett, M. R., Lei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organisation+of+the+mouse+sinoatrial+node:+structure+and+expression+of+HCN+channels.">Organisation of the mouse sinoatrial node: structure and expression of HCN channels.</a> Cardiovascular Research. 73 (4), 729-738 (2007).</li><li>Muller-Taubenberger, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescent+protein+tags+as+reporters+in+live-cell+imaging+studies.">Application of fluorescent protein tags as reporters in live-cell imaging studies.</a> Methods Mol Biol. 346, 229-246 (2006).</li><li>Müller-Taubenberger, A., Ishikawa-Ankerhold, H. C., Eichinger, L., Rivero, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Dictyostelium discoideum Protocol. , 93-112 (2013).</li><li>Shaw, P. J., Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook Of Biological Confocal Microscopy. , 453-467 (2006).</li><li>Huff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Airyscan+detector+from+ZEISS:+confocal+imaging+with+improved+signal-to-noise+ratio+and+super-resolution.">The Airyscan detector from ZEISS: confocal imaging with improved signal-to-noise ratio and super-resolution.</a> Nature Methods. 12 (12), (2015).</li><li>Rysevaite, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+characterization+of+the+intrinsic+cardiac+neural+plexus+in+whole-mount+mouse+heart+preparations.">Immunohistochemical characterization of the intrinsic cardiac neural plexus in whole-mount mouse heart preparations.</a> Heart Rhythm. 8 (5), 731-738 (2011).</li><li>Acar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+imaging+of+bone+marrow+shows+non-dividing+stem+cells+are+mainly+perisinusoidal.">Deep imaging of bone marrow shows non-dividing stem cells are mainly perisinusoidal.</a> Nature. 526 (7571), 126-130 (2015).</li><li>Brahmajothi, M. V., Morales, M. J., Campbell, D. L., Steenbergen, C., Strauss, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+distribution+of+voltage-gated+ion+channels+in+ferret+sinoatrial+node.">Expression and distribution of voltage-gated ion channels in ferret sinoatrial node.</a> Physiological Genomics. 42 (2), 131-140 (2010).</li><li>Mesirca, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+arrhythmia+induced+by+genetic+silencing+of+'funny'+(f)+channels+is+rescued+by+GIRK4+inactivation.">Cardiac arrhythmia induced by genetic silencing of 'funny' (f) channels is rescued by GIRK4 inactivation.</a> Nature Communication. 5, 4664 (2014).</li><li>Liang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HCN4+dynamically+marks+the+first+heart+field+and+conduction+system+precursors.">HCN4 dynamically marks the first heart field and conduction system precursors.</a> Circulation Research. 113 (4), 399-407 (2013).</li><li>Verheule, S., Kaese, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Connexin+diversity+in+the+heart:+insights+from+transgenic+mouse+models.">Connexin diversity in the heart: insights from transgenic mouse models.</a> Frontiers in Pharmacology. 4, 81 (2013).</li><li>van der Velden, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+gap+junctions+and+connexins:+their+role+in+atrial+fibrillation+and+potential+as+therapeutic+targets.">Cardiac gap junctions and connexins: their role in atrial fibrillation and potential as therapeutic targets.</a> Cardiovascular Research. 54 (2), 270-279 (2002).</li></ol>

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Kardiyak anatomi geleneksel olarak ince histolojik kesitler11 kullanılarak incelenmiştir. Bununla birlikte, bu yöntemler iletim sisteminin üç boyutlu yapısını korumaz ve bu nedenle sadece 2D bilgi sağlar. Burada açıklanan tam montajlı immünofloresan boyama protokolü bu sınırlamaların üstesinden gelmeye izin verir ve SAN ve AVN görüntüleme için rutin olarak kullanılabilir.
Parafin gömme, kesitleme ve antijen alımı gerektiren geleneksel immünohi...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62058">Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3 
Julia Vlcek1,2 
Julia Bauer1,2,3 
Stefan K&#228;&#228;b1,3 
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2 
Dominic Adam van den Heuvel1,2 
Christian Schulz1,2,3 
Steffen Massberg1,2,3 
Sebastian Clauss1,2,3 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3 
Julia Vlcek1,2 
Julia Bauer1,2,3 
Stefan K&#228;&#228;b1,3 
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2 
Dominic Adam van den Heuvel1,2 
Christian Schulz1,2,3 
Steffen Massberg1,2,3 
Sebastian Clauss1,2,3 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich 
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62058">Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

Aritmiler milyonlarca insanı etkileyen yaygın hastalıklardır ve dünya çapında önemli morbidite ve mortalite nedenidir. Kardiyak kalp pillerinin geliştirilmesi gibi tedavi ve önlemedeki muazzam ilerlemelere rağmen, aritmilerin tedavisi, esas olarak altta yatan hastalık mekanizmaları hakkındaki çok sınırlı bilgi birikimi nedeniyle zor olmaya devam etmektedir 1,2,3. Aritmilerin hem normal elektrofizyolojisinin hem de patofizyolojisinin daha iyi anlaşılması, gelecekte yeni, yenilikçi ve nedensel tedavi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olabilir. Ek olarak, aritmogenezi kapsamlı bir şekilde incelemek için, fareler elektrofizyoloji araştırmalarında yaygın olarak kullanıldığından, fare gibi hayvan modellerinde spesifik kardiyak iletim sistemini lokalize etmek ve görselleştirmek önemlidir.
Kardiyak iletim sisteminin ana parçaları, elektriksel impulsun özel kalp pili hücrelerinde üretildiği sinoatriyal düğüm (SAN) ve atriyum ile ventriküller arasındaki tek elektriksel bağlantı olan atriyoventriküler düğümdür (AVN)4. SAN ve AVN'nin elektrofizyolojik özellikleri her değiştiğinde, hemodinamik bozulmaya, senkopa ve hatta ölüme yol açabilecek hasta sinüs sendromu veya atriyoventriküler blok gibi aritmiler ortaya çıkabilir ve böylece hem SAN hem de AVN'nin elektrofizyoloji ve aritmiyogenezdeki temel rolünün altını çizer5.
SAN veya AVN ile ilgili kapsamlı çalışmalar, her iki yapının da ideal olarak fizyolojik ortamlarında hassas bir lokalizasyonunu ve görselleştirilmesini gerektirir. Bununla birlikte, çalışan miyokard içindeki küçük boyutları ve konumları nedeniyle, makroskopik olarak görülebilen net bir yapı oluşturmadan, SAN ve AVN'nin anatomisini ve elektrofizyolojisini incelemek zordur. Anatomik yer işaretleri, SAN ve AVN 6,7,8'i içeren bölgeyi kabaca tanımlamak için kullanılabilir. Kısaca SAN, sağ atriyumun kas krista terminalisine (BT) bitişik kaval bölgesinde, AVN, triküspid kapak, koroner sinüsün ostiumu ve Todaro tendonu tarafından kurulan Koch üçgeni içinde yer almaktadır. Şimdiye kadar, bu anatomik işaretler esas olarak SAN ve AVN'yi bireysel yapılar olarak lokalize etmek, kaldırmak ve daha sonra incelemek için kullanıldı (örneğin, geleneksel histoloji ile). Bununla birlikte, SAN ve AVN'nin karmaşık elektrofizyolojisini (örneğin, çalışan miyokardın bitişik hücrelerinin düzenleyici etkileri) daha iyi anlamak için, fizyolojik 3D ortamdaki iletim sistemlerini incelemek gereklidir.
Tam montajlı immünofloresan boyama, çevreleyen dokunun bütünlüğünü korurken anatomik yapıları in situ olarak incelemek için kullanılan bir yöntemdir9. Konfokal mikroskopi ve görüntü analiz yazılımından yararlanan SAN ve AVN, özellikle bu bölgelerde ifade edilen iyon kanallarını hedefleyen floresan etiketli antikorlarla görselleştirilebilir.
Aşağıdaki protokol, SAN ve AVN mikroskop lokalizasyonu ve görselleştirmesi için iyi kurulmuş bir bütüne monte boyama yöntemi gerçekleştirmek için gerekli adımları açıklamaktadır. Spesifik olarak, bu protokol (1) SAN ve AVN'nin anatomik işaretlerle anatomik işaretlerle nasıl lokalize edileceğini ve bu numunelerin boyama ve mikroskopi analizi için nasıl lokalize edileceğini (2) HCN4 ve Cx43 (3) referans belirteçlerinin tam montajlı immünofloresan boyamasını gerçekleştirmek için SAN ve AVN örneklerini konfokal mikroskopi için hazırlamak (4) SAN ve AVN'nin konfokal görüntülemesini gerçekleştirmek için açıklamaktadır. Ayrıca, bu protokolün, çevredeki çalışan miyokard veya otonom sinir lifleri gibi miyosit olmayan hücrelerin ilave boyanmasını içerecek şekilde nasıl değiştirilebileceğini de açıklıyoruz, bu da kalp içindeki kardiyak iletim sisteminin kapsamlı bir şekilde araştırılmasını sağlıyor.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer system&#160;</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td>
			<td>Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Bain circuit</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4860</td>
			<td>Includes an anesthesia mask for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Platform</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SURGI-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">In vivo instrumentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-01</td>
			<td>Could use 27G needles as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General lab instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Sunlab</td>
			<td>D-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA&#160;</td>
			<td>RH basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette,volume 10 &#181;L, 100 &#181;L, 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereo- zoom microscope&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10836-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 8.4.2</td>
			<td>Oxford instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN 2.3 SP1 black</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General Lab Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>17597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>7632160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-158</td>
			<td>Components of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Formaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>28908</td>
			<td>use as a 4% solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>Components of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X) Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NS02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1888-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td>Components of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ml</td>
			<td>Diluted to 1% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0.5&#160;mg/10&#160;mL</td>
			<td>Braun Melsungen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1 mL/mL</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>31303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen 5 L</td>
			<td>Linde</td>
			<td>2020175</td>
			<td>Includes a pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor&#160;488&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#4412</td>
			<td>diluted to 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#A-21247</td>
			<td>diluted to 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>diluted to 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Connexin-43</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6219</td>
			<td>diluted to 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-HCN4 (SHG 1E5)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA3-903</td>
			<td>diluted to 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Other</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-designed and 3D printed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticine</td>
			<td>Cernit</td>
			<td>49655005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silikonpasten, Baysilone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>291-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse, C57BL/6</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3d reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse

Sinoatriyal düğümdeki (SAN) kalp pili hücreleri tarafından fizyolojik olarak üretilen elektrik sinyali, tüm kalbin uyarılmasına ve kasılmasına izin vermek için atriyoventriküler düğümü (AVN) içeren iletim sistemi aracılığıyla iletilir. SAN veya AVN'nin herhangi bir disfonksiyonu, elektrofizyoloji ve aritmogenezdeki temel rollerini gösteren aritmilere neden olur. Fare modelleri aritmi araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır, ancak SAN ve AVN'nin spesifik araştırması zor olmaya devam etmektedir.
SAN, crista terminalinin superior vena kava ile birleştiği noktada bulunur ve AVN, koroner sinüs, triküspid annulus ve Todaro tendonunun deliğinden oluşan Koch üçgeninin tepesinde bulunur. Bununla birlikte, küçük boyut nedeniyle, geleneksel histoloji ile görselleştirme zor olmaya devam etmektedir ve SAN ve AVN'nin 3D ortamlarında incelenmesine izin vermemektedir.
Burada, etiketli fare SAN ve AVN'nin yerel olarak görselleştirilmesine izin veren tam montajlı bir immünofloresan yaklaşımını açıklıyoruz. Bu amaçla, fare kalbi disseke edilir, istenmeyen doku çıkarılır, ardından fiksasyon, geçirgenlik ve bloke edilir. SAN ve AVN içindeki iletim sisteminin hücreleri daha sonra bir anti-HCN4 antikoru ile boyanır. Konfokal lazer tarama mikroskobu ve görüntü işleme, düğüm hücreleri ve çalışan kardiyomiyositler arasında ayrım yapılmasına ve SAN ve AVN'nin net bir şekilde lokalize edilmesine izin verir. Ayrıca, sinir lifleri gibi diğer hücre tiplerini de etiketlemek için ek antikorlar birleştirilebilir.
Konvansiyonel immünohistoloji ile karşılaştırıldığında, tam montajlı immünofloresan boyama, kardiyak iletim sisteminin anatomik bütünlüğünü korur, böylece AVN'nin araştırılmasına izin verir; özellikle anatomilerine ve çevredeki çalışan miyokard ve miyosit olmayan hücrelerle etkileşimlerine girer.

Yukarıda özetlenen protokolü kullanarak, hem SAN hem de AVN'nin konfokal mikroskopi görüntülemesi güvenilir bir şekilde gerçekleştirilebilir. HCN4'ü hedef alan floresan antikorları kullanarak iletim sisteminin spesifik boyanması ve Cx43'ü hedefleyen floresan antikorları kullanarak çalışan miyokardın boyanması, sağlam anatomi içinde SAN (Şekil 5, Video 1) ve AVN'nin (Şekil 6, Video 2) net b...

Watch this Scientific Journal Video about Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse at JoVE.com

Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

Murin kalplerde sinoatriyal nod (SAN) ve atriyoventriküler nodun (AVN) tam montajlı immünofloresan boyaması için adım adım bir protokol sağlıyoruz.

Faredeki Sinoatriyal ve Atriyoventriküler Düğümün Tam Montajlı İmmünofloresan Boyama, Konfokal Görüntüleme ve 3D Rekonstrüksiyonu

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

whole-mount-immunofluorescence-staining-confocal-imaging-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

5.1K Görüntüleme.  Ludwig Maximilians University (LMU) Munich. Murin kalplerde sinoatriyal nod (SAN) ve atriyoventriküler nodun (AVN) tam montajlı immünofloresan boyaması için adım adım bir protokol sağlıyoruz.

Video: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

Multispectral Real-time Fluorescence Imaging for Intraoperative Detection of the Sentinel Lymph Node in Gynecologic Oncology

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical excision of the tumor with a full lymphadenectomy in the drainage area of the tumor. However, removal of lymph nodes is associated with increased morbidity due to infection, wound breakdown and lymphedema.4,5 As an alternative, the sentinel lymph node procedure (SLN) was developed several decades ago to detect the first draining lymph node from the tumor.6 In case of lymphogenic dissemination, the SLN is the first lymph node that is affected (Figure 1). Hence, if the SLN does not contain metastases, downstream lymph nodes will also be free from tumor metastases and need not to be removed. The SLN procedure is part of the treatment for many tumor types, like breast cancer and melanoma, but also for cancer of the vulva and cervix.7 The current standard methodology for SLN-detection is by peritumoral injection of radiocolloid one day prior to surgery, and a colored dye intraoperatively. Disadvantages of the procedure in cervical and vulvar cancer are multiple injections in the genital area, leading to increased psychological distress for the patient, and the use of radioactive colloid.
Multispectral fluorescence imaging is an emerging imaging modality that can be applied intraoperatively without the need for injection of radiocolloid. For intraoperative fluorescence imaging, two components are needed: a fluorescent agent and a quantitative optical system for intraoperative imaging. As a fluorophore we have used indocyanine green (ICG). ICG has been used for many decades to assess cardiac function, cerebral perfusion and liver perfusion.8 It is an inert drug with a safe pharmaco-biological profile. When excited at around 750 nm, it emits light in the near-infrared spectrum around 800 nm. A custom-made multispectral fluorescence imaging camera system was used.9.
The aim of this video article is to demonstrate the detection of the SLN using intraoperative fluorescence imaging in patients with cervical and vulvar cancer. Fluorescence imaging is used in conjunction with the standard procedure, consisting of radiocolloid and a blue dye. In the future, intraoperative fluorescence imaging might replace the current method and is also easily transferable to other indications like breast cancer and melanoma.

Fluorescence imaging is a promising innovative modality for image-guided surgery in surgical oncology. In this video we describe the technical procedure for detection of the sentinel lymph node using fluorescence imaging as showcased in gynecologic oncologicy. A multispectral fluorescence camera system, together with the fluorescent agent indocyanine green, is applied.

Jinekolojik Onkoloji Sentinel lenf nodu intraoperatif Algılama için Multispektral Gerçek zamanlı Floresans Görüntüleme

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical ...

Tıp

Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta and inferior vena cava (IVC) are exposed. The proximal infrarenal aorta and the distal aorta are dissected for clamp placement and needle puncture, respectively. Special attention is paid to avoid dissection between the aorta and the IVC. After clamping the aorta, a 25 G needle is used to puncture both walls of the aorta into the IVC. The surrounding connective tissue is used for hemostatic compression. Successful creation of the AVF will show pulsatile arterial blood flow in the IVC. Further confirmation of successful AVF can be achieved by post-operative Doppler ultrasound.

The goal is to produce an arteriovenous fistula that is simple and reproducible. This method does not use sutures or glue adhesive. Therefore the samples can be used with the least amount of foreign materials for analysis.

Fare Aortocaval Fistül Teknik Yönleri

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Konfokal Optik Görüntüleme ile Rose Bengal Fototromboz<em&gt; In Vivo</em&gt;: Tek Gemi İnme Bir Model

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Imaging- ve Sitometrisi tabanlı Hücre Pozisyonu Analizi ve 3D Melanom küresellerde Hücre Döngüsü

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glokom uyaran bir de Prosedürü<em&gt; İn Vivo</em&gt; Rat Modeli ve Tüm montaj Retina Hazırlık

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

A Postoperative Evaluation Guideline for Computer-Assisted Reconstruction of the Mandible

Valid comparisons of postoperative accuracy results in computer-assisted reconstruction of the mandible are difficult due to heterogeneity in imaging modalities, mandibular defect classification, and evaluation methodologies between studies. This guideline uses a step-by-step approach guiding the process of imaging, classification of mandibular defects and volume assessment of three-dimensional (3D) models, after which a legitimized quantitative accuracy evaluation method can be performed between the postoperative clinical situation and the preoperative virtual plan. The condyles and the vertical and horizontal corners of the mandible are used as bony landmarks to define virtual lines in the computer-assisted surgery (CAS) software. Between these lines the axial, coronal, and both sagittal mandibular angles are calculated on both pre- and postoperative 3D models of the (neo)mandible and subsequently the deviations are calculated. By superimposing the postoperative 3D model to the preoperative virtually planned 3D model, which is fixed to the XYZ axis, the deviation between pre- and postoperative virtually planned dental implant positions can be calculated. This protocol continues and specifies an earlier publication of this evaluation guideline.

Here, we propose a practical, feasible and reproducible evaluation guideline for computer-assisted reconstruction of the mandible in order to create uniformity between studies regarding postoperative accuracy evaluation. This protocol continues and specifies an earlier publication of this evaluation guideline.

Mandibulanın Bilgisayar Destekli Rekonstrüksiyonu Için Ameliyat Sonrası Değerlendirme Yönergesi

Valid comparisons of postoperative accuracy results in computer-assisted reconstruction of the mandible are difficult due to heterogeneity in imaging ...

Blood Circuit Reconstruction in an Abdominal Mouse Heart Transplantation Model

The surgical technique of heterotopic abdominal heart transplantation in mice is a standard model for research in transplantation immunology. Here, the established technique for a modified blood circuit reconstruction in a heterotopic abdominal heart transplantation model is presented. This method uses the intrathoracic inferior vena cava (IIVC) instead of the pulmonary artery of the donor heart for the anastomosis to the inferior vena cava of the recipient. It is facilitating and improving success rates for abdominal heart transplantation in mice.

A novel technique for blood circuit reconstruction in a heterotopic abdominal mouse heart transplantation model is demonstrated.

Abdominal Fare Kalp Nakli Modelinde Kan Devresi Rekonstrüksiyonu

The surgical technique of heterotopic abdominal heart transplantation in mice is a standard model for research in transplantation immunology. Here, the ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ventricular stiffness with altered cardiac function. This increase in cardiac ventricular fibrosis is due to activation of resident fibroblasts, although how these cells operate within the 3-dimensional (3-D) heart, at baseline or after activation, is not well understood. To examine how fibroblasts contribute to heart disease and their dynamics in the 3-D heart, a refined CLARITY-based tissue clearing and imaging method was developed that shows fluorescently labeled cardiac fibroblasts within the entire mouse heart. Tissue resident fibroblasts were genetically labeled using Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter mice crossed with the cardiac fibroblast expressing Tcf21-MerCreMer knock-in line. This technique was used to observe fibroblast localization dynamics throughout the entire adult left ventricle in healthy mice and in fibrotic mouse models of heart disease. Interestingly, in one injury model, unique patterns of cardiac fibroblasts were observed in the injured mouse heart that followed bands of wrapped fibers in the contractile direction. In ischemic injury models, fibroblast death occurred, followed by repopulation from the infarct border zone. Collectively, this refined cardiac tissue clarifying technique and digitized imaging system allows for 3-D visualization of cardiac fibroblasts in the heart without the limitations of antibody penetration failure or previous issues surrounding lost fluorescence due to tissue processing.

A refined method of tissue clearing was developed and applied to the adult mouse heart. This method was designed to clear dense, autofluorescent cardiac tissue, while maintaining labeled fibroblast fluorescence attributed to a genetic reporter strategy.

Sağlıklı ve Yaralı Fare Kalplerinde Üç Boyutlu Fibroblast Organizasyonu için Rafine CLARITY Tabanlı Doku Temizleme

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

Murine Sinoatriyal ve Atriyoventriküler Düğümden Yerleşik Kardiyak Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or bradycardia. Reliable identification of cardiac pacemaking defects requires the measurement of intrinsic heart rates by largely preventing the influence of the autonomic nervous system, which can mask rate deficits. Traditional methods to analyze intrinsic cardiac pacemaker function include drug-induced autonomic blockade to measure in vivo heart rates, isolated heart recordings to measure intrinsic heart rates, and sinoatrial strip or single-cell patch-clamp recordings of sinoatrial pacemaker cells to measure spontaneous action potential firing rates. However, these more traditional techniques can be technically challenging and difficult to perform. Here, we present a new methodology to measure intrinsic cardiac firing rate by performing microelectrode array (MEA) recordings of whole-mount sinoatrial node preparations from mice. MEAs are composed of multiple microelectrodes arranged in a grid-like pattern for recording in vitro extracellular field potentials. The method described herein has the combined advantage of being relatively faster, simpler, and more precise than previous approaches for recording intrinsic heart rates, while also allowing easy pharmacological interrogation.

This protocol aims to describe a new methodology to measure intrinsic cardiac firing rate using microelectrode array recording of the whole sinoatrial node tissue to identify pacemaking defects in mice. Pharmacological agents can also be introduced in this method to study their effects on intrinsic pacemaking.

Farelerde İçSel Kardiyak Pacemaking Kusurlarını Belirlemek için Sinoatrial Düğüm Ateşleme Hızının Mikroelekrod Dizisi Kaydı

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or ...