Ce travail a été soutenu par le China Scholarship Council (CSC, à R. Xia), le Centre allemand de recherche cardiovasculaire (DZHK; 81X2600255 à S. Clauss, 81Z0600206 à S. Kääb), la Fondation Corona (S199/10079/2019 à S. Clauss), le SFB 914 (projet Z01 à H. Ishikawa-Ankerhold et S. Massberg et projet A10 à C. Schulz), l’ERA-NET sur les maladies cardiovasculaires (ERA-CVD; 01KL1910 à S. Clauss) et la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (à S. Clauss). Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la préparation des manuscrits.

Les soins aux animaux et toutes les procédures expérimentales ont été menés conformément aux directives du comité de protection et d’éthique des animaux de l’Université de Munich, et toutes les procédures entreprises sur les souris ont été approuvées par le gouvernement de Bavière, Munich, Allemagne (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). Les souris C57BL6/J ont été achetées au Jackson Laboratory.
NOTE: La figure 1 montre les instruments nécessaires à l’expérience. La figure 2 montre une illustration de l’anatomie cardiaque globale. La figure 3 montre l’emplacement du SAN et de l’AVN dans le cœur d’une souris adulte. La figure 4 montre l’échantillon préparé chargé sur la microscopie confocale.
1. Préparatifs
<ol><li>Préparer une solution de formaldéhyde à 4 % (PFA à 4 %) en diluant 10 mL de solution de formaldéhyde à 16 % dans 30 mL de PBS.</li>
	<li>Préparer une solution de saccharose à 15 % et une solution de saccharose à 30 % en dissolvant 15 g et 30 g de poudre de saccharose dans 100 ml de PBS, respectivement. Une fois la poudre de saccharose complètement dissoute, filtrer la solution à l’aide d’un filtre à seringue de 0,2 μm avant de la conserver à 4 °C.</li>
	<li>Préparez un gel d’agarose à 3%-4%, ajoutez 3 g ou 4 g de poudre d’agarose et 100 ml de 1x TAE (dilué dans 50x la solution mère TAE) dans un bécher. Placez le bécher sur un agitateur magnétique et faites-le bouillir jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissoute.</li>
	<li>Préparer la boîte de dissection en versant doucement 30 ml de gel d’agarose (3 % à 4 %) dans une boîte de Petri de 100 mm de diamètre. Laissez la boîte de Petri sur le banc à température ambiante pour refroidir et durcir.</li>
	<li>Préparer la solution de blocage et la solution de lavage selon les recettes fournies dans le tableau 1. Préparez toutes les solutions préparées le jour de l’utilisation. Le stockage à long terme n’est pas recommandé.</li>
	<li>Préparer les solutions d’anticorps en les diluant dans du froid (4 °C) 1x PBS, protéger la dilution de la lumière (p. ex., en enroulant du papier d’aluminium) et conserver les dilutions sur la glace jusqu’à utilisation. Diluer les anticorps peu de temps avant l’incubation. Évitez de laisser les anticorps dilués à température ambiante. REMARQUE : La dilution appropriée des anticorps doit être testée avec des échantillons de tissus comparables en effectuant une coloration immunofluorescente conventionnelle. Ici, nous avons testé les anticorps en colorant des sections congelées coupées sur une épaisseur de 10 μm.</li>
</ol>2. Prélèvement d’organes et préparation de tissus
<ol><li>Anesthésiez la souris en la plaçant dans une chambre d’incubation reliée à un vaporisateur d’isoflurane. Réglez le vaporisateur pour qu’il fournisse 4 à 5 % d’isoflurane (96 à 95 % d’oxygène, respectivement). REMARQUE: L’anesthésie complète est confirmée par la perte de la réaction posturale et du réflexe de redressement en roulant doucement la chambre jusqu’à ce que la souris soit placée sur le dos.</li>
	<li>Placez la souris en décubitus dorsal sur la table chirurgicale. Placez le nez de la souris dans un masque d’anesthésie relié à un circuit Bain modifié avec son tube intérieur connecté au vaporisateur d’isoflurane. Pour maintenir l’anesthésie, utilisez 1-2% d’isoflurane dans l’oxygène à un débit de 1 L / min. Récupérez l’excès de vapeur anesthésique de la souris via le tube extérieur du masque et aspirez à travers une cartouche de charbon actif, qui absorbe l’excès de gaz anesthésique.</li>
	<li>Lorsque l’anesthésie complète est obtenue, injecter du fentanyl pour l’analgésie (0,1 μg/25 g de poids corporel i.p.).</li>
	<li>Lorsque le réflexe de pincement des orteils est indétectable, faites une coupe claire du jugulaire à la symphyse en utilisant des ciseaux d’iris pour enlever la fourrure et la peau. Faites une autre coupe de gauche à droite sous les côtes en utilisant des ciseaux d’iris pour ouvrir soigneusement l’abdomen.</li>
	<li>Vivez un peu le xiphoïde en utilisant des pinces incurvées pour permettre de couper le diaphragme de gauche à droite sans blesser aucun organe. Coupez la cage thoracique en une ligne axillaire médiale des deux côtés à l’aide de ciseaux à iris pour la retourner crânienne et permettre l’accès au cœur.</li>
	<li>Couper la veine cave inférieure et l’aorte thoracique descendante au niveau du diaphragme à l’aide de ciseaux d’iris. Percez le cœur avec une aiguille de 27 G dans la région de l’apex, puis poussez soigneusement l’aiguille dans le ventricule gauche (LV). Injectez doucement 5 à 10 ml de PBS glacé dans le VG pour perfuser le cœur. REMARQUE: La couleur du cœur doit passer du rouge au gris indiquant une perfusion réussie avec PBS.</li>
	<li>Soulevez délicatement l’apex du cœur à l’aide d’une pince à épiler permettant de couper les gros vaisseaux et d’enlever le cœur.</li>
	<li>Extrayez le cœur en coupant les grosses artères et les veines aussi loin que possible du cœur pour éviter tout dommage à la veine cave supérieure (SVC). Conservez le SVC car il servira de point de repère important lors du traitement ultérieur.</li>
	<li>Après le retrait du cœur, éteignez le vaporisateur d’isoflurane.</li>
	<li>Mettez le cœur dans une boîte de dissection remplie de PBS glacé sous le microscope à dissection. Après détermination de la gauche / droite et de l’avant / arrière du cœur, tournez le cœur avec l’avant du cœur au fond du plat (pour exposer les gros vaisseaux situés à l’arrière).</li>
	<li>Immobiliser le cœur en plaçant de petites épingles à travers l’apex et l’appendice auriculaire gauche (AAL) dans l’agarose au fond de la boîte de dissection (Figure 2A). À l’aide d’une pince à épiler fine et de ciseaux, retirez délicatement le tissu non cardiaque autour du CVS et de la veine cave inférieure (IVC) (p. ex. poumons, graisse, péricarde) pour exposer la région intercavale (figure 3A).</li>
	<li>Retirez la majorité des ventricules en coupant parallèlement la rainure entre les ventricules et les oreillettes avec le micro ciseau. Conservez une petite partie du tissu ventriculaire pour la charge ultérieure sur l’anneau en plexiglas.</li>
	<li>Pour la fixation et la déshydratation, mettre l’échantillon (contenant les oreillettes, le SVC et l’IVC) dans 4% PFA pendant une nuit à 4 °C.</li>
	<li>Le lendemain, transférer le cœur dans une solution de saccharose à 15% pendant 24 heures à 4 °C.</li>
	<li>Le lendemain, transférer le cœur dans une solution de saccharose à 30% pendant 24 heures à 4 °C. NOTE: Pour la fixation et la déshydratation aux étapes 2.13, 2.14 et 2.15, les échantillons sont laissés à 4 °C sans autre agitation ni balancement.</li>
</ol>3. Coloration par immunofluorescence à montage entier
<ol><li>Laver le cœur dans du Triton X-100 à 1 % dilué dans du PBS et bloquer et perméabiliser dans une solution de blocage (tableau 1) pendant une nuit à 4 °C.</li>
	<li>Placer le cœur dans un tube de 1,5 mL et incuber avec des anticorps anti-souris de lapin connexin-43 (dilution de 1:200) et de rats anti-souris HCN4 (dilution de 1:200) dilués avec une solution bloquante pendant 7 jours à 4 °C. REMARQUE : La concentration optimale d’anticorps primaires doit être testée avant d’utiliser les fiches techniques comme orientation. D’autres antigènes d’intérêt pourraient également être colorés à cette étape, à condition que l’espèce hôte de l’antigène primaire soit différente des autres. Une concentration plus élevée de Triton X-100 peut aider à obtenir une coloration plus efficace des anticorps, comme démontré avant10, mais la concentration peut être déterminée individuellement.</li>
	<li>Après 7 jours, retirer la solution contenant les anticorps primaires à l’aide d’une pipette et laver le cœur avec la solution 1% Triton X-100 3 fois (chaque fois pendant 1 h à température ambiante sur le vibreur orbital).</li>
	<li>Après lavage, incuber le cœur = avec Alexa Fluor 488 chèvre anti-rat IgG (dilution de 1:200) et Alexa Fluor 647 chèvre anti-lapin IgG (dilution de 1:200) pendant 7 jours à 4 °C.</li>
	<li>Après 7 jours, retirer toute la solution contenant les anticorps secondaires à l’aide d’une pipette. Ensuite, laver le cœur avec une solution de lavage (tableau 1) 3 fois (chaque fois pendant 1 h à température ambiante sur le shaker orbital).</li>
	<li>Pour colorer les noyaux, incuber le cœur dans une solution DAPI (10 μg/mL) pendant une nuit à 4 °C.</li>
	<li>Le lendemain, laver le cœur avec une solution de lavage 3 fois (chaque fois pendant 1 h à température ambiante sur le shaker orbital). NOTE: Pour le blocage, la perméabilisation, l’incubation d’anticorps et la coloration DAPI aux étapes 3.1, 3.2, 3.4 et 3.6, laisser les échantillons à l’état d’équilibre à 4 °C, aucune agitation n’est nécessaire. Le tissu coloré a pu être conservé entièrement recouvert d’une solution de lavage à 4 °C et protégé de la lumière pendant quelques jours jusqu’à l’imagerie au microscope confocal.</li>
</ol>4. Microscopie confocale
<ol><li>Préparez des bagues en plexiglas et remplissez-les de pâte à modeler (Figure 1). Au centre de la pâte à modeler, une petite rainure se forme au centre pour charger le cœur. Faire une rainure peu profonde, car il serait plus facile d’acquérir un plan d’imagerie plat, et d’ajuster l’espace et d’éviter les bulles d’air entre l’échantillon et les lamelles de couverture à l’étape 4.4.</li>
	<li>Utilisez le même échantillon cardiaque pour l’imagerie séquentielle du SAN et de l’AVN. Pour l’imagerie SAN, chargez directement le cœur tandis que pour l’imagerie AVN, effectuez la microdissection avant.<ol><li>Imagerie SAN<ol><li>Identifier le SAN par des repères anatomiques : il est situé sur la face dorsale du cœur dans la région inter-cavale (la région entre la veine cave supérieure et inférieure). La crista terminalis (CT) est la strie musculaire entre le SAN et le RAA.</li>
			<li>Placez le cœur dans la rainure de pâte à modeler avec l’arrière du cœur tourné vers le haut. Ajoutez du PBS sur le cœur pour déplacer tout l’air dans la cavité jusqu’à ce que le cœur soit complètement recouvert de PBS (généralement quelques gouttes de PBS suffisent).</li>
			<li>Sous le microscope à dissection, presser doucement le RAA, le LAA et les parties restantes du ventricule gauche dans la pâte à modeler pour fixer le cœur. Assurez-vous que toute la région inter-cavale et la crista terminalis sont clairement visibles (non recouvertes de pâte à modeler). La zone qui sera imagée est illustrée à la figure 3A.</li>
		</ol></li>
		<li>Imagerie AVN<ol><li>Une fois l’imagerie du SAN terminée, prélevez le même échantillon et utilisez-le ensuite pour l’imagerie AVN. Pour la microdissection AVN, placer le cœur = sur une boîte de dissection au microscope à dissection.</li>
			<li>Orientez le cœur avec le côté droit tourné vers le haut (y compris les parties restantes du ventricule droit). Placez des broches à travers la partie restante de la paroi libre BT (qui se trouve maintenant en bas) pour immobiliser le tissu (Figure 2B).</li>
			<li>Coupez le mur libre de VR restant vers le haut à travers la valve tricuspide et la veine cave supérieure. Ensuite, retournez le VR et la PR pour exposer le septum interventriculaire et interauriculaire. (Figure 3B) REMARQUE: Faites attention à ne pas endommager le sinus coronaire (CS), car c’est un repère anatomique important pour trouver le triangle de Koch qui permet ensuite de localiser l’AVN. Le CS passe transversalement dans la rainure auriculo-ventriculaire gauche du côté postérieur du cœur, et l’ouverture de l’orifice CS est située entre IVC et la valve tricuspide à la partie inférieure du septum interauriculaire (Figure 3A et B).</li>
			<li>Identifier le triangle de Koch qui se trouve sur la surface endocardique de l’oreillette droite, bordé antérieurement par la ligne charnière du feuillet septal de la valve tricuspide (TV) et postérieurement par le tendon de Todaro. La base est formée par l’orifice du sinus coronaire (Figure 3B). Comme il s’agit de la région cible pour l’imagerie AVN, elle doit être clairement visible.</li>
			<li>Transférez le cœur dans la rainure de pâte à modeler à l’intérieur de l’anneau en plexiglas avec le triangle de Koch clairement exposé (c’est-à-dire non recouvert de pâte à modeler). Pressez doucement le tissu autour du triangle de Koch dans la pâte à modeler pour fixer l’échantillon. Ajoutez du PBS sur le cœur pour déplacer tout l’air dans la cavité jusqu’à ce que le cœur soit complètement recouvert de PBS (généralement quelques gouttes de PBS suffisent).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Appliquez du silicone sur les bords des anneaux en plexiglas pour permettre de couvrir les cœurs chargés dans les anneaux en plexiglas remplis de pâte à modeler avec des lamelles de couverture.</li>
	<li>Appuyez doucement sur la face arrière de la pâte à modeler pour extraire des parties du PBS et attacher le cœur à la lamelle de couverture tout en évitant toute bulle d’air dans la zone d’imagerie. REMARQUE: Assurez-vous que les régions d’intérêt ne sont pas pliées et couvertes lors de la pression sur la face arrière de la pâte à modeler. Un plan d’imagerie plat sans surcompression de l’échantillon est nécessaire pour conserver l’anatomie et pour une imagerie confocale correcte des échantillons. Pour le SAN, il est important de s’assurer que la région inter-cavale est clairement exposée. Pour AVN, le triangle de Koch doit être entièrement exposé.</li>
	<li>Placez les échantillons de coloration à montage entier à l’envers sur la plate-forme du microscope confocal. Le SAN/AVN exposé fixé à la glissière de couvercle se trouve maintenant au bas de la plate-forme du microscope (Figure 4). REMARQUE: Pour prendre des images, nous utilisons le Carl Zeiss LSM800 avec l’unité Airyscan et le logiciel ZEN 2.3 SP1 noir.</li>
	<li>Choisissez la plaque « BP420-480 + LP605 » pour l’excitation de l’anti-HCN4 conjugué Alexa Fluor 647. Variez le gain principal de 650-750.</li>
	<li>Prenez une image globale de l’ensemble de la région SAN et AVN à l’aide de la fonction Tile Scan . Sélectionnez ensuite la région HCN4 positive en cliquant et en ajoutant un carré sur l’image de vue d’ensemble autour de la zone d’intérêt qui sera analysée.</li>
	<li>Vérifiez les paramètres, y compris les plaques et le gain principal pour les canaux restants (Alexa Fluor 488 et DAPI) du microscope confocal et réglez-les comme décrit à l’étape 4.6.</li>
	<li>Ajustez lentement la mise au point de haut en bas de l’échantillon pour prévisualiser l’échantillon entier et définir le premier et le dernier pour la plage Z-stack. Définissez un intervalle optimal pour la pile Z en fonction de l’épaisseur de l’échantillon optique. Nous utilisons un objectif 20x, et 0,8-1 μm comme intervalle pour Z-stack.</li>
	<li>Une fois tous les paramètres correctement définis, analysez toute la zone du SAN et de l’AVN.</li>
	<li>Effectuer une reconstruction 3D des images à l’aide d’un logiciel (par exemple, Imaris version 8.4.2).<ol><li>Sélectionner le traitement des images | Soustraction de base pour éliminer les taches de fond.</li>
		<li>Sélectionnez la création de surface sur le paramètre du canal et de la région d’intérêt sélectionnés pour le traitement.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+porcine+model+of+atrial+arrhythmogenicity+in+the+context+of+ischaemic+heart+failure.">Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure.</a> PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).</li><li>Schuttler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Atrial+Fibrillation.">Animal Models of Atrial Fibrillation.</a> Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).</li><li>van Weerd, J. 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Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêts.

L’anatomie cardiaque a traditionnellement été étudiée à l’aide de coupes histologiques minces11. Cependant, ces méthodes ne préservent pas la structure tridimensionnelle du système de conduction et ne fournissent donc que des informations 2D. Le protocole de coloration par immunofluorescence à montage complet décrit ici permet de surmonter ces limitations et peut être utilisé en routine pour l’imagerie SAN et AVN.
Par rapport aux méthodes standard tel...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62058">Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3 
Julia Vlcek1,2 
Julia Bauer1,2,3 
Stefan K&#228;&#228;b1,3 
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2 
Dominic Adam van den Heuvel1,2 
Christian Schulz1,2,3 
Steffen Massberg1,2,3 
Sebastian Clauss1,2,3 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3 
Julia Vlcek1,2 
Julia Bauer1,2,3 
Stefan K&#228;&#228;b1,3 
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2 
Dominic Adam van den Heuvel1,2 
Christian Schulz1,2,3 
Steffen Massberg1,2,3 
Sebastian Clauss1,2,3 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich 
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62058">Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

Les arythmies sont des maladies courantes qui touchent des millions de personnes et sont la cause d’une morbidité et d’une mortalité importantes dans le monde entier. Malgré d’énormes progrès dans le traitement et la prévention, tels que le développement de stimulateurs cardiaques, le traitement des arythmies reste difficile, principalement en raison des connaissances très limitées sur les mécanismes sous-jacents de la maladie 1,2,3. Une meilleure compréhension de l’électrophysiologie normale et de la physiopathologie des arythmies peut aider à développer des stratégies de traitement nouvelles, innovantes et causales à l’avenir. De plus, pour étudier de manière exhaustive l’arythmagénèse, il est important de localiser et de visualiser le système de conduction cardiaque spécifique dans des modèles animaux tels que la souris, car les souris sont largement utilisées dans la recherche en électrophysiologie.
Les principales parties du système de conduction cardiaque sont le nœud sino-auriculaire (SAN), où l’impulsion électrique est générée dans des cellules de stimulateur cardiaque spécialisées, et le nœud auriculo-ventriculaire (AVN), qui est la seule connexion électrique entre les oreillettes et les ventricules4. Chaque fois que les propriétés électrophysiologiques du SAN et de l’AVN sont altérées, des arythmies telles que le syndrome du sinus malade ou le bloc auriculo-ventriculaire peuvent survenir, ce qui peut entraîner une détérioration hémodynamique, une syncope et même la mort, soulignant ainsi le rôle essentiel du SAN et de l’AVN dans l’électrophysiologie et l’arythmogenèse5.
Des études approfondies sur SAN ou AVN nécessitent une localisation et une visualisation précises des deux structures, idéalement dans leur environnement physiologique. Cependant, en raison de leur petite taille et de leur emplacement dans le myocarde de travail, sans établir une structure macroscopiquement visible clairement, l’étude de l’anatomie et de l’électrophysiologie du SAN et de l’AVN est difficile. Les repères anatomiques peuvent être utilisés pour identifier approximativement la région qui contient SAN et AVN 6,7,8. En bref, SAN est situé dans la région inter-cavale de l’oreillette droite adjacente à la crista terminalis musculaire (CT), AVN est situé dans le triangle de Koch établi par la valve tricuspide, l’ostium du sinus coronaire et le tendon de Todaro. Jusqu’à présent, ces repères anatomiques ont été principalement utilisés pour localiser, supprimer puis étudier SAN et AVN en tant que structures individuelles (par exemple, par histologie conventionnelle). Pour mieux comprendre l’électrophysiologie complexe du SAN et de l’AVN (par exemple, les effets régulateurs des cellules adjacentes du myocarde de travail), il est toutefois nécessaire d’étudier les systèmes de conduction dans l’environnement physiologique 3D.
La coloration par immunofluorescence à montage entier est une méthode utilisée pour étudier les structures anatomiques in situ tout en préservant l’intégrité des tissus environnants9. Tirant parti des logiciels de microscopie confocale et d’analyse d’images, SAN et AVN peuvent être visualisés avec des anticorps marqués par fluorescence ciblant les canaux ioniques spécifiquement exprimés dans ces régions.
Le protocole suivant explique les étapes nécessaires pour effectuer une méthode de coloration à monture entière bien établie pour la localisation et la visualisation des microscopes SAN et AVN. Plus précisément, ce protocole décrit comment (1) localiser le SAN et l’AVN par repères anatomiques pour préparer ces échantillons pour la coloration et l’analyse microscopique (2) effectuer une coloration par immunofluorescence à montage entier des marqueurs de référence HCN4 et Cx43 (3) préparer les échantillons SAN et AVN pour la microscopie confocale (4) effectuer l’imagerie confocale du SAN et de l’AVN. Nous décrivons également comment ce protocole peut être modifié pour inclure une coloration supplémentaire du myocarde de travail environnant ou des cellules non myocytaires telles que les fibres nerveuses autonomes, ce qui permet une étude approfondie du système de conduction cardiaque dans le cœur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer system&#160;</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td>
			<td>Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Bain circuit</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4860</td>
			<td>Includes an anesthesia mask for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Platform</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SURGI-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">In vivo instrumentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-01</td>
			<td>Could use 27G needles as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General lab instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Sunlab</td>
			<td>D-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA&#160;</td>
			<td>RH basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette,volume 10 &#181;L, 100 &#181;L, 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereo- zoom microscope&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10836-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 8.4.2</td>
			<td>Oxford instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN 2.3 SP1 black</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General Lab Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>17597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>7632160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-158</td>
			<td>Components of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Formaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>28908</td>
			<td>use as a 4% solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>Components of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X) Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NS02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1888-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td>Components of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ml</td>
			<td>Diluted to 1% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0.5&#160;mg/10&#160;mL</td>
			<td>Braun Melsungen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1 mL/mL</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>31303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen 5 L</td>
			<td>Linde</td>
			<td>2020175</td>
			<td>Includes a pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor&#160;488&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#4412</td>
			<td>diluted to 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#A-21247</td>
			<td>diluted to 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>diluted to 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Connexin-43</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6219</td>
			<td>diluted to 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-HCN4 (SHG 1E5)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA3-903</td>
			<td>diluted to 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Other</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-designed and 3D printed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticine</td>
			<td>Cernit</td>
			<td>49655005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silikonpasten, Baysilone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>291-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse, C57BL/6</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3d reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse

Le signal électrique physiologiquement généré par les cellules du stimulateur cardiaque dans le nœud sino-auriculaire (SAN) est conduit à travers le système de conduction, qui comprend le nœud auriculo-ventriculaire (AVN), pour permettre l’excitation et la contraction de tout le cœur. Tout dysfonctionnement du SAN ou de l’AVN entraîne des arythmies, indiquant leur rôle fondamental dans l’électrophysiologie et l’arythmogenèse. Les modèles murins sont largement utilisés dans la recherche sur l’arythmie, mais l’étude spécifique du SAN et de l’AVN reste difficile.
Le SAN est situé à la jonction de la crista terminalis avec la veine cave supérieure et AVN est situé au sommet du triangle de Koch, formé par l’orifice du sinus coronaire, l’anneau tricuspide et le tendon de Todaro. Cependant, en raison de la petite taille, la visualisation par histologie conventionnelle reste difficile et ne permet pas l’étude du SAN et de l’AVN dans leur environnement 3D.
Nous décrivons ici une approche d’immunofluorescence à montage entier qui permet la visualisation locale du SAN et de l’AVN marqués chez la souris. La coloration par immunofluorescence à montage entier est destinée à de plus petites sections de tissu sans nécessiter de section manuelle. À cette fin, le cœur de souris est disséqué, avec le tissu indésirable enlevé, suivi de la fixation, de la perméabilisation et du blocage. Les cellules du système de conduction dans le SAN et l’AVN sont ensuite colorées avec un anticorps anti-HCN4. La microscopie confocale à balayage laser et le traitement d’image permettent de différencier les cellules nodales et les cardiomyocytes fonctionnels, et de localiser clairement le SAN et l’AVN. En outre, des anticorps supplémentaires peuvent également être combinés pour marquer d’autres types de cellules, telles que les fibres nerveuses.
Par rapport à l’immunohistologie conventionnelle, la coloration par immunofluorescence à montage entier préserve l’intégrité anatomique du système de conduction cardiaque, permettant ainsi l’investigation de l’AVN; en particulier dans leur anatomie et leurs interactions avec le myocarde de travail environnant et les cellules non myocytaires.

En utilisant le protocole décrit ci-dessus, l’imagerie par microscopie confocale du SAN et de l’AVN peut être réalisée de manière fiable. La coloration spécifique du système de conduction à l’aide d’anticorps fluorescents ciblant HCN4 et la coloration du myocarde de travail à l’aide d’anticorps fluorescents ciblant Cx43 permettent l’identification claire du SAN (Figure 5, Vidéo 1) et de l’AVN (Figure 6<s...

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Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

Nous fournissons un protocole étape par étape pour la coloration par immunofluorescence complète du nœud sino-auriculaire (SAN) et du nœud auriculo-ventriculaire (AVN) dans les cœurs murins.

Coloration par immunofluorescence à monture entière, imagerie confocale et reconstruction 3D du nœud sino-auriculaire et auriculo-ventriculaire chez la souris

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

whole-mount-immunofluorescence-staining-confocal-imaging-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

5.1K vues.  Ludwig Maximilians University (LMU) Munich. Nous fournissons un protocole étape par étape pour la coloration par immunofluorescence complète du nœud sino-auriculaire (SAN) et du nœud auriculo-ventriculaire (AVN) dans les cœurs murins.

Vidéo: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

Multispectral Real-time Fluorescence Imaging for Intraoperative Detection of the Sentinel Lymph Node in Gynecologic Oncology

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical excision of the tumor with a full lymphadenectomy in the drainage area of the tumor. However, removal of lymph nodes is associated with increased morbidity due to infection, wound breakdown and lymphedema.4,5 As an alternative, the sentinel lymph node procedure (SLN) was developed several decades ago to detect the first draining lymph node from the tumor.6 In case of lymphogenic dissemination, the SLN is the first lymph node that is affected (Figure 1). Hence, if the SLN does not contain metastases, downstream lymph nodes will also be free from tumor metastases and need not to be removed. The SLN procedure is part of the treatment for many tumor types, like breast cancer and melanoma, but also for cancer of the vulva and cervix.7 The current standard methodology for SLN-detection is by peritumoral injection of radiocolloid one day prior to surgery, and a colored dye intraoperatively. Disadvantages of the procedure in cervical and vulvar cancer are multiple injections in the genital area, leading to increased psychological distress for the patient, and the use of radioactive colloid.
Multispectral fluorescence imaging is an emerging imaging modality that can be applied intraoperatively without the need for injection of radiocolloid. For intraoperative fluorescence imaging, two components are needed: a fluorescent agent and a quantitative optical system for intraoperative imaging. As a fluorophore we have used indocyanine green (ICG). ICG has been used for many decades to assess cardiac function, cerebral perfusion and liver perfusion.8 It is an inert drug with a safe pharmaco-biological profile. When excited at around 750 nm, it emits light in the near-infrared spectrum around 800 nm. A custom-made multispectral fluorescence imaging camera system was used.9.
The aim of this video article is to demonstrate the detection of the SLN using intraoperative fluorescence imaging in patients with cervical and vulvar cancer. Fluorescence imaging is used in conjunction with the standard procedure, consisting of radiocolloid and a blue dye. In the future, intraoperative fluorescence imaging might replace the current method and is also easily transferable to other indications like breast cancer and melanoma.

Fluorescence imaging is a promising innovative modality for image-guided surgery in surgical oncology. In this video we describe the technical procedure for detection of the sentinel lymph node using fluorescence imaging as showcased in gynecologic oncologicy. A multispectral fluorescence camera system, together with the fluorescent agent indocyanine green, is applied.

Multispectrale en temps réel d&#39;imagerie par fluorescence pour la détection peropératoire du ganglion sentinelle en oncologie gynécologique

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Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta and inferior vena cava (IVC) are exposed. The proximal infrarenal aorta and the distal aorta are dissected for clamp placement and needle puncture, respectively. Special attention is paid to avoid dissection between the aorta and the IVC. After clamping the aorta, a 25 G needle is used to puncture both walls of the aorta into the IVC. The surrounding connective tissue is used for hemostatic compression. Successful creation of the AVF will show pulsatile arterial blood flow in the IVC. Further confirmation of successful AVF can be achieved by post-operative Doppler ultrasound.

The goal is to produce an arteriovenous fistula that is simple and reproducible. This method does not use sutures or glue adhesive. Therefore the samples can be used with the least amount of foreign materials for analysis.

Aspects techniques de la fistule aorto-cave de la souris

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The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rose Bengale Photothrombosis par imagerie optique confocal<em&gt; In Vivo</em&gt;: Un modèle de l&#39;unité des maladies du navire

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Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Analyse fondée cytométrie Imaging- et circulation de la position de cellule et le cycle cellulaire en 3D mélanome Sphéroïdes

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Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glaucomes induisant une procédure dans un<em&gt; In Vivo</em&gt; Modèle de rat et Whole-mount Retina Préparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

A Postoperative Evaluation Guideline for Computer-Assisted Reconstruction of the Mandible

Valid comparisons of postoperative accuracy results in computer-assisted reconstruction of the mandible are difficult due to heterogeneity in imaging modalities, mandibular defect classification, and evaluation methodologies between studies. This guideline uses a step-by-step approach guiding the process of imaging, classification of mandibular defects and volume assessment of three-dimensional (3D) models, after which a legitimized quantitative accuracy evaluation method can be performed between the postoperative clinical situation and the preoperative virtual plan. The condyles and the vertical and horizontal corners of the mandible are used as bony landmarks to define virtual lines in the computer-assisted surgery (CAS) software. Between these lines the axial, coronal, and both sagittal mandibular angles are calculated on both pre- and postoperative 3D models of the (neo)mandible and subsequently the deviations are calculated. By superimposing the postoperative 3D model to the preoperative virtually planned 3D model, which is fixed to the XYZ axis, the deviation between pre- and postoperative virtually planned dental implant positions can be calculated. This protocol continues and specifies an earlier publication of this evaluation guideline.

Here, we propose a practical, feasible and reproducible evaluation guideline for computer-assisted reconstruction of the mandible in order to create uniformity between studies regarding postoperative accuracy evaluation. This protocol continues and specifies an earlier publication of this evaluation guideline.

Une ligne directrice d'évaluation postopératoire pour la reconstruction assistée par ordinateur de la mandibule

Valid comparisons of postoperative accuracy results in computer-assisted reconstruction of the mandible are difficult due to heterogeneity in imaging ...

Blood Circuit Reconstruction in an Abdominal Mouse Heart Transplantation Model

The surgical technique of heterotopic abdominal heart transplantation in mice is a standard model for research in transplantation immunology. Here, the established technique for a modified blood circuit reconstruction in a heterotopic abdominal heart transplantation model is presented. This method uses the intrathoracic inferior vena cava (IIVC) instead of the pulmonary artery of the donor heart for the anastomosis to the inferior vena cava of the recipient. It is facilitating and improving success rates for abdominal heart transplantation in mice.

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Reconstruction de circuit sanguin dans un modèle de transplantation de cœur de souris abdominale

The surgical technique of heterotopic abdominal heart transplantation in mice is a standard model for research in transplantation immunology. Here, the ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ventricular stiffness with altered cardiac function. This increase in cardiac ventricular fibrosis is due to activation of resident fibroblasts, although how these cells operate within the 3-dimensional (3-D) heart, at baseline or after activation, is not well understood. To examine how fibroblasts contribute to heart disease and their dynamics in the 3-D heart, a refined CLARITY-based tissue clearing and imaging method was developed that shows fluorescently labeled cardiac fibroblasts within the entire mouse heart. Tissue resident fibroblasts were genetically labeled using Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter mice crossed with the cardiac fibroblast expressing Tcf21-MerCreMer knock-in line. This technique was used to observe fibroblast localization dynamics throughout the entire adult left ventricle in healthy mice and in fibrotic mouse models of heart disease. Interestingly, in one injury model, unique patterns of cardiac fibroblasts were observed in the injured mouse heart that followed bands of wrapped fibers in the contractile direction. In ischemic injury models, fibroblast death occurred, followed by repopulation from the infarct border zone. Collectively, this refined cardiac tissue clarifying technique and digitized imaging system allows for 3-D visualization of cardiac fibroblasts in the heart without the limitations of antibody penetration failure or previous issues surrounding lost fluorescence due to tissue processing.

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Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

Isolement et culture de macrophages cardiaques résidents du nœud sino-auriculaire murin et auriculo-ventriculaire

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or bradycardia. Reliable identification of cardiac pacemaking defects requires the measurement of intrinsic heart rates by largely preventing the influence of the autonomic nervous system, which can mask rate deficits. Traditional methods to analyze intrinsic cardiac pacemaker function include drug-induced autonomic blockade to measure in vivo heart rates, isolated heart recordings to measure intrinsic heart rates, and sinoatrial strip or single-cell patch-clamp recordings of sinoatrial pacemaker cells to measure spontaneous action potential firing rates. However, these more traditional techniques can be technically challenging and difficult to perform. Here, we present a new methodology to measure intrinsic cardiac firing rate by performing microelectrode array (MEA) recordings of whole-mount sinoatrial node preparations from mice. MEAs are composed of multiple microelectrodes arranged in a grid-like pattern for recording in vitro extracellular field potentials. The method described herein has the combined advantage of being relatively faster, simpler, and more precise than previous approaches for recording intrinsic heart rates, while also allowing easy pharmacological interrogation.

This protocol aims to describe a new methodology to measure intrinsic cardiac firing rate using microelectrode array recording of the whole sinoatrial node tissue to identify pacemaking defects in mice. Pharmacological agents can also be introduced in this method to study their effects on intrinsic pacemaking.

Enregistrement par réseau de microélectrodes de la vitesse de tir du nœud sino-auriculaire pour identifier les défauts cardiaques intrinsèques de la fabrication du rythme chez la souris

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or ...