Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Becas de China (CSC, a R. Xia), el Centro Alemán de Investigación Cardiovascular (DZHK; 81X2600255 a S. Clauss, 81Z0600206 a S. Kääb), la Fundación Corona (S199/10079/2019 a S. Clauss), el SFB 914 (proyecto Z01 a H. Ishikawa-Ankerhold y S. Massberg y proyecto A10 a C. Schulz), el ERA-NET sobre Enfermedades Cardiovasculares (ERA-CVD; 01KL1910 a S. Clauss) y la Heinrich-and-Lotte-Mühlfenzl Stiftung (a S. Clauss). Los financiadores no tuvieron ningún papel en la preparación del manuscrito.

El cuidado de los animales y todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del Comité de Cuidado y Ética Animal de la Universidad de Munich, y todos los procedimientos realizados en ratones fueron aprobados por el Gobierno de Baviera, Munich, Alemania (ROB-55.2-2532.Vet_02-16-106, ROB-55.2-2532.Vet_02-19-86). Los ratones C57BL6/J fueron comprados en el Laboratorio Jackson.
NOTA: La figura 1 muestra los instrumentos necesarios para el experimento. La figura 2 muestra una ilustración de la anatomía cardíaca macroscópica. La Figura 3 muestra la ubicación de SAN y AVN en un corazón de ratón adulto. La figura 4 muestra la muestra preparada cargada en la microscopía confocal.
1. Preparativos
<ol><li>Prepare una solución de formaldehído al 4% (PFA al 4%) diluyendo 10 ml de solución de formaldehído al 16% en 30 ml de PBS.</li>
	<li>Prepare una solución de sacarosa al 15% y una solución de sacarosa al 30% disolviendo 15 g y 30 g de sacarosa en polvo en 100 ml de PBS, respectivamente. Una vez disuelto completamente el polvo de sacarosa, filtrar la solución con un filtro de jeringa de 0,2 μm antes de conservarla a 4 °C.</li>
	<li>Prepare un gel de agarosa al 3% -4%, agregue 3 g o 4 g de polvo de agarosa y 100 ml de 1x TAE (diluido de una solución madre de 50x TAE) en un vaso de precipitados. Coloque el vaso de precipitados en un agitador magnético y hiérvalo hasta que la agarosa se disuelva por completo.</li>
	<li>Prepare el plato de disección vertiendo suavemente 30 ml de gel de agarosa (3% -4%) en una placa de Petri de 100 mm de diámetro. Deje la placa de Petri en el banco a temperatura ambiente para que se enfríe y se endurezca.</li>
	<li>Prepare la solución de bloqueo y la solución de lavado de acuerdo con las recetas proporcionadas en la Tabla 1. Prepare todas las soluciones preparadas el día de su uso. No se recomienda el almacenamiento a largo plazo.</li>
	<li>Preparar las soluciones de anticuerpos diluyéndolas en frío (4 °C) 1x PBS, proteger la dilución de la luz (por ejemplo, envolviendo papel de aluminio alrededor) y mantener las diluciones en hielo hasta que se utilicen. Diluir los anticuerpos poco antes de la incubación. Evite dejar los anticuerpos diluidos a temperatura ambiente. NOTA: La dilución de anticuerpos apropiada debe probarse con muestras de tejido comparables mediante la realización de una tinción inmunofluorescente convencional. Aquí, probamos los anticuerpos teñiendo secciones congeladas cortadas a un espesor de 10 μm.</li>
</ol>2. Sustracción de órganos y preparación de tejidos
<ol><li>Anestesia al ratón colocándolo en una cámara de incubación conectada a un vaporizador de isoflurano. Ajuste el vaporizador para que entregue 4-5% de isoflurano (96-95% de oxígeno, respectivamente). NOTA: La anestesia completa se confirma por la pérdida de la reacción postural y el reflejo de enderezamiento al hacer rodar suavemente la cámara hasta que el ratón se coloca sobre su espalda.</li>
	<li>Coloque el ratón en posición supina sobre la mesa quirúrgica. Coloque la nariz del ratón en una máscara de anestesia conectada a un circuito Bain modificado con su tubo interior conectado al vaporizador de isoflurano. Para mantener la anestesia, use isoflurano al 1-2% en oxígeno a una velocidad de flujo de 1 L / min. Elimine el exceso de vapor anestésico del ratón a través del tubo exterior de la máscara y extraiga a través de un recipiente de carbón activado, que absorbe el exceso de gas anestésico.</li>
	<li>Cuando se logre la anestesia completa, inyecte fentanilo para analgesia (0,1 μg/25 g de peso corporal i.p.).</li>
	<li>Cuando el reflejo de pellizco del dedo del pie es indetectable, haga un corte claro desde la yugula hasta la sínfisis usando tijeras de iris para eliminar el pelaje y la piel. Haga otro corte de izquierda a derecha debajo de las costillas usando tijeras de iris para abrir cuidadosamente el abdomen.</li>
	<li>Vive un poco el xifoide usando pinzas curvas para permitir cortar el diafragma de izquierda a derecha sin lesionar ningún órgano. Corte la caja torácica en una línea axilar medial en ambos lados usando tijeras de iris para voltearla cranealmente y permitir el acceso al corazón.</li>
	<li>Cortar la vena cava inferior y la aorta torácica descendente a nivel del diafragma con tijeras de iris. Perfore el corazón con una aguja de 27 G en el área del ápice y luego empuje cuidadosamente la aguja hacia el ventrículo izquierdo (VI). Inyecte suavemente 5-10 ml de PBS helado en el VI para perfundir el corazón. NOTA: El color del corazón debe cambiar de rojo a gris, lo que indica una perfusión exitosa con PBS.</li>
	<li>Levante con cuidado el ápice del corazón con una pinza que permita cortar los vasos grandes y extraer el corazón.</li>
	<li>Extirpe el corazón cortando las arterias y venas grandes lo más lejos posible del corazón para evitar cualquier daño a la vena cava superior (SVC). Conserve el SVC, ya que servirá como hito importante durante el procesamiento posterior.</li>
	<li>Después de la extracción del corazón, apague el vaporizador de isoflurano.</li>
	<li>Coloque el corazón en un plato de disección lleno de PBS helado bajo el microscopio de disección. Después de determinar la izquierda / derecha y la parte frontal / posterior del corazón, gire el corazón con la parte frontal del corazón en la parte inferior del plato (para exponer los vasos grandes que se encuentran en la parte posterior).</li>
	<li>Inmovilizar el corazón colocando pequeños alfileres a través del ápice y el apéndice auricular izquierdo (LAA) en la agarosa en la parte inferior de la placa de disección (Figura 2A). Usando pinzas finas y tijeras, retire cuidadosamente el tejido no cardíaco alrededor de la VCS y la vena cava inferior (VCI) (p. ej., pulmones, grasa, pericardio) para exponer la región intercava (Figura 3A).</li>
	<li>Retire la mayoría de los ventrículos cortando paralelo el surco entre los ventrículos y las aurículas con la microtijera. Preservar una pequeña parte del tejido ventricular para la carga posterior en el anillo de plexiglás.</li>
	<li>Para la fijación y deshidratación, poner la muestra (que contiene las aurículas, SVC y IVC) en PFA al 4% durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Al día siguiente, transfiera el corazón a una solución de sacarosa al 15% durante 24 horas a 4 °C.</li>
	<li>Al día siguiente, transfiera el corazón a una solución de sacarosa al 30% durante 24 horas a 4 °C. NOTA: Para la fijación y deshidratación en los pasos 2.13, 2.14 y 2.15, las muestras se dejan a 4°C sin agitación ni balanceo.</li>
</ol>3. Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo
<ol><li>Lavar el corazón en Triton X-100 al 1% diluido en PBS y bloquear y permeabilizar en solución de bloqueo (Tabla 1) durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Colocar el corazón en un tubo de 1,5 ml e incubar con conexina-43 de conejo anti-ratón (dilución de 1:200) y anticuerpos anti-ratón HCN4 de rata (dilución de 1:200) diluidos con solución bloqueante durante 7 días a 4 °C. NOTA: La concentración óptima de anticuerpos primarios debe probarse antes de utilizar las hojas de datos como orientación. Otros antígenos de interés también podrían teñirse en este paso, siempre y cuando la especie huésped del antígeno primario sea diferente de las demás. Una mayor concentración de Triton X-100 puede ayudar a obtener una tinción de anticuerpos más eficiente como se demostró antes de10, pero la concentración puede determinarse individualmente.</li>
	<li>Después de 7 días, retire la solución que contiene anticuerpos primarios con una pipeta y lave el corazón con una solución Triton X-100 al 1% 3 veces (cada vez durante 1 h a temperatura ambiente en el agitador orbital).</li>
	<li>Después del lavado, incubar el corazón = con Alexa Fluor 488 cabra anti-rata IgG (dilución de 1:200) y Alexa Fluor 647 cabra anti-conejo IgG (dilución de 1:200) durante 7 días a 4 °C.</li>
	<li>Después de 7 días, retire toda la solución que contiene los anticuerpos secundarios con una pipeta. Luego lave el corazón con solución de lavado (Tabla 1) 3 veces (cada vez durante 1 h a temperatura ambiente en el agitador orbital).</li>
	<li>Para teñir los núcleos, incubar el corazón en solución DAPI (10 μg/ml) durante la noche a 4 °C.</li>
	<li>Al día siguiente, lave el corazón con solución de lavado 3 veces (cada vez durante 1 h a temperatura ambiente en el agitador orbital). NOTA: Para el bloqueo, permeabilización, incubación de anticuerpos y tinción DAPI en los pasos 3.1, 3.2, 3.4 y 3.6, dejar las muestras en estado estacionario a 4 °C, no es necesario agitar. El tejido teñido podría conservarse completamente cubierto con solución de lavado a 4 °C y protegido de la luz durante unos días hasta obtener imágenes en el microscopio confocal.</li>
</ol>4. Microscopía confocal
<ol><li>Prepare los anillos de plexiglás y llénelos con plastilina (Figura 1). En el centro de la plastilina se forma un pequeño surco en el centro para cargar el corazón. Haga una ranura poco profunda, ya que sería más fácil adquirir un plano de imagen plana, y ajustar el espacio y evitar burbujas de aire entre la muestra y los cubreobjetos en el paso 4.4.</li>
	<li>Utilice la misma muestra de corazón para obtener imágenes de SAN y AVN secuencialmente. Para las imágenes SAN, cargue directamente el corazón, mientras que para las imágenes AVN, realice la microdisección antes.<ol><li>Imágenes del SAN<ol><li>Identificar la RAS por puntos de referencia anatómicos: se encuentra en el lado dorsal del corazón dentro de la región intercava (la región entre la vena cava superior e inferior). La crista terminalis (CT) es la raya muscular entre la RAS y la RAA.</li>
			<li>Coloque el corazón en la ranura de plastilina con la parte posterior del corazón hacia arriba. Agregue PBS al corazón para desplazar todo el aire dentro de la cavidad hasta que el corazón esté completamente cubierto con PBS (generalmente unas pocas gotas de PBS son suficientes).</li>
			<li>Bajo el microscopio de disección, presione suavemente el RAA, la LAA y las partes restantes del ventrículo izquierdo en la plastilina para fijar el corazón. Asegúrese de que toda la región intercaval y la crista terminalis puedan verse claramente (no cubiertas por plastilina). El área que se visualizará se muestra en la Figura 3A.</li>
		</ol></li>
		<li>Imágenes AVN<ol><li>Después de terminar la obtención de imágenes de SAN, recoja la misma muestra y posteriormente utilícela para la imagen AVN. Para la microdisección AVN, coloque el corazón = en una placa de disección bajo el microscopio de disección.</li>
			<li>Orientar el corazón con el lado derecho hacia arriba (incluidas las partes restantes del ventrículo derecho). Coloque clavos a través de la parte restante de la pared libre del VI (que ahora está en la parte inferior) para inmovilizar el tejido (Figura 2B).</li>
			<li>Corte la pared libre de RV restante hacia arriba a través de la válvula tricúspide y la vena cava superior. Luego voltee el RV y la AR para exponer el tabique interventricular e interauricular. (Figura 3B) NOTA: Preste atención a no dañar el seno coronario (CS), ya que es un hito anatómico importante para encontrar el triángulo de Koch que luego permite localizar el AVN. El SC corre transversalmente en el surco auriculoventricular izquierdo en el lado posterior del corazón, y la abertura del orificio CS se encuentra entre la VCI y la válvula tricúspide en la parte inferior del tabique interauricular (Figura 3A y B).</li>
			<li>Identificar el triángulo de Koch que se puede encontrar en la superficie endocárdica de la aurícula derecha, bordeado anteriormente por la línea de bisagra de la valva septal de la válvula tricúspide (TV), y posteriormente por el tendón de Todaro. La base está formada por el orificio del seno coronario (Figura 3B). Dado que esta es la región objetivo para las imágenes AVN, debe ser claramente visible.</li>
			<li>Transfiera el corazón a la ranura de plastilina dentro del anillo de plexiglás con el triángulo de Koch claramente expuesto (es decir, no cubierto por plastilina). Presione suavemente el tejido alrededor del triángulo de Koch en la plastilina para fijar la muestra. Agregue PBS al corazón para desplazar todo el aire dentro de la cavidad hasta que el corazón esté completamente cubierto con PBS (generalmente unas pocas gotas de PBS son suficientes).</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>Aplique silicona en los bordes de los anillos de plexiglás para permitir cubrir los corazones cargados dentro de los anillos de plexiglás llenos de plastilina con cubreobjetos.</li>
	<li>Presione suavemente la parte posterior de la plastilina para exprimir partes del PBS y para unir el corazón al cubreobjetos, evitando cualquier burbuja de aire dentro del área de imágenes. NOTA: Asegúrese de que las regiones de interés no estén dobladas y cubiertas durante el prensado de la parte posterior de la plastilina. Un plano plano de imagen sin sobrecompresión de la muestra es necesario para conservar la anatomía y para obtener imágenes confocales adecuadas de las muestras. Para la RAS, es importante asegurarse de que la región intercava esté claramente expuesta. Para AVN, el triángulo de Koch debe estar completamente expuesto.</li>
	<li>Coloque las muestras de tinción de montaje completo boca abajo en la plataforma del microscopio confocal. El SAN/AVN expuesto unido al cubreobjetos está ahora en la parte inferior de la plataforma del microscopio (Figura 4). NOTA: Para tomar imágenes, utilizamos el Carl Zeiss LSM800 con Airyscan Unit y el software ZEN 2.3 SP1 negro.</li>
	<li>Elija la placa "BP420-480 + LP605" para la excitación de Alexa Fluor 647 conjugado anti-HCN4. Varíe la ganancia maestra de 650-750.</li>
	<li>Tome una imagen general de toda la región SAN y AVN mediante la función Tile Scan . A continuación, seleccione la región positiva para HCN4 haciendo clic y agregando un cuadrado en la imagen general alrededor del área de interés que se escaneará.</li>
	<li>Compruebe los parámetros, incluidas las placas y la ganancia maestra para los canales restantes (Alexa Fluor 488 y DAPI) del microscopio confocal y configúrelos como se describe en el paso 4.6.</li>
	<li>Ajuste lentamente el enfoque de arriba a abajo de la muestra para obtener una vista previa de toda la muestra y establecer el primero y el último para el rango de pila Z. Establezca un intervalo óptimo para la pila Z en función del grosor de la muestra óptica. Usamos un objetivo de 20x y 0.8-1 μm como intervalo para la pila Z.</li>
	<li>Después de que todos los parámetros estén configurados correctamente, analice toda el área de la SAN y AVN.</li>
	<li>Realice la reconstrucción 3D de las imágenes utilizando software (por ejemplo, Imaris versión 8.4.2).<ol><li>Seleccionar procesamiento de imágenes | Resta basal para eliminar las manchas de fondo.</li>
		<li>Seleccione la creación de superficie en la configuración para el canal seleccionado y la región de interés para el procesamiento.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+arrhythmia:+classic+electrophysiology+to+genetically+modified+large+animals.">Animal models of arrhythmia: classic electrophysiology to genetically modified large animals.</a> Nature Reviews Cardiology. 16 (8), 457-475 (2019).</li><li>Clauss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+porcine+model+of+atrial+arrhythmogenicity+in+the+context+of+ischaemic+heart+failure.">Characterization of a porcine model of atrial arrhythmogenicity in the context of ischaemic heart failure.</a> PLoS One. 15 (5), 0232374 (2020).</li><li>Schuttler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+Models+of+Atrial+Fibrillation.">Animal Models of Atrial Fibrillation.</a> Circulation Research. 127 (1), 91-110 (2020).</li><li>van Weerd, J. 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Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

La anatomía cardíaca ha sido tradicionalmente estudiada utilizando secciones histológicas delgadas11. Sin embargo, estos métodos no preservan la estructura tridimensional del sistema de conducción y, por lo tanto, solo proporcionan información 2D. El protocolo de tinción de inmunofluorescencia de montaje completo descrito aquí permite superar estas limitaciones y se puede usar de forma rutinaria para imágenes SAN y AVN.
En comparación con los métodos estánda...

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62058">Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse</a>. The Authors section was updated from:
Ruibing Xia1,2,3 
Julia Vlcek1,2 
Julia Bauer1,2,3 
Stefan K&#228;&#228;b1,3 
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2 
Dominic Adam van den Heuvel1,2 
Christian Schulz1,2,3 
Steffen Massberg1,2,3 
Sebastian Clauss1,2,3 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilian University Munich 
2Walter Brendel Center of Experimental Medicine, Ludwig Maximilian University Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance
to:
Ruibing Xia1,2,3 
Julia Vlcek1,2 
Julia Bauer1,2,3 
Stefan K&#228;&#228;b1,3 
Hellen Ishikawa-Ankerhold1,2 
Dominic Adam van den Heuvel1,2 
Christian Schulz1,2,3 
Steffen Massberg1,2,3 
Sebastian Clauss1,2,3 
1University Hospital Munich, Department of Medicine I, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich 
2Institute of Surgical Research at the Walter Brendel Center of Experimental Medicine, University Hospital Munich, Ludwig Maximilians University (LMU) Munich 
3German Center for Cardiovascular Research (DZHK), Partner Site Munich, Munich Heart Alliance

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/62058">Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

Las arritmias son enfermedades comunes que afectan a millones de personas y son la causa de una morbilidad y mortalidad significativas en todo el mundo. A pesar de los enormes avances en el tratamiento y la prevención, como el desarrollo de marcapasos cardíacos, el tratamiento de las arritmias sigue siendo un desafío, principalmente debido al conocimiento muy limitado sobre los mecanismos subyacentes de la enfermedad 1,2,3. Una mejor comprensión tanto de la electrofisiología normal como de la fisiopatología de las arritmias puede ayudar a desarrollar estrategias de tratamiento novedosas, innovadoras y causales en el futuro. Además, para estudiar exhaustivamente la arritmogénesis, es importante localizar y visualizar el sistema de conducción cardíaca específico en modelos animales como el ratón, ya que los ratones son ampliamente utilizados en la investigación electrofisiológica.
Las partes principales del sistema de conducción cardíaca son el nódulo sinoauricular (SAN), donde el impulso eléctrico se genera en células marcapasos especializadas, y el nódulo auriculoventricular (AVN), que es la única conexión eléctrica entre las aurículas y los ventrículos4. Siempre que se alteran las propiedades electrofisiológicas de la RAS y la AVN, pueden ocurrir arritmias como el síndrome del seno enfermo o el bloqueo auriculoventricular que pueden conducir a deterioro hemodinámico, síncope e incluso la muerte, y así subrayar el papel esencial de la RAS y la NVA en electrofisiología y arritmogénesis5.
Los estudios exhaustivos sobre SAN o AVN requieren una localización y visualización precisas de ambas estructuras, idealmente dentro de su entorno fisiológico. Sin embargo, debido a su pequeño tamaño y ubicación dentro del miocardio de trabajo, sin establecer una estructura macroscópicamente visible clara, estudiar la anatomía y electrofisiología de SAN y AVN es un desafío. Los puntos de referencia anatómicos se pueden usar para identificar aproximadamente la región que contiene SAN y AVN 6,7,8. En resumen, la RAS se encuentra en la región intercava de la aurícula derecha adyacente a la crista terminal muscular (TC), la AVN se encuentra dentro del triángulo de Koch establecido por la válvula tricúspide, el ostium del seno coronario y el tendón de Todaro. Hasta ahora, estos puntos de referencia anatómicos se utilizaron principalmente para localizar, eliminar y luego estudiar SAN y AVN como estructuras individuales (por ejemplo, por histología convencional). Sin embargo, para comprender mejor la compleja electrofisiología de SAN y AVN (por ejemplo, los efectos reguladores de las células adyacentes del miocardio de trabajo), es necesario estudiar los sistemas de conducción dentro del entorno fisiológico 3D.
La tinción de inmunofluorescencia de montaje completo es un método que se utiliza para estudiar las estructuras anatómicas in situ , preservando la integridad del tejido circundante9. Aprovechando el software de microscopía confocal y análisis de imágenes, SAN y AVN se pueden visualizar con anticuerpos marcados con fluorescencia dirigidos a canales iónicos expresados específicamente en estas regiones.
El siguiente protocolo explica los pasos necesarios para realizar un método de tinción de montaje completo bien establecido para la localización y visualización de microscopios SAN y AVN. Específicamente, este protocolo describe cómo (1) localizar SAN y AVN por puntos de referencia anatómicos para preparar estas muestras para tinción y análisis de microscopía (2) realizar tinción de inmunofluorescencia de montaje completo de los marcadores de referencia HCN4 y Cx43 (3) para preparar muestras SAN y AVN para microscopía confocal (4) para realizar imágenes confocales de SAN y AVN. También describimos cómo se puede modificar este protocolo para incluir tinción adicional de miocardio circundante o células no miocitos que funcionan, como fibras nerviosas autónomas, lo que permite una investigación exhaustiva del sistema de conducción cardíaca dentro del corazón.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">Anesthesia</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane vaporizer system&#160;</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>34-0458, 34-1030, 73-4911, 34-0415, 73-4910</td>
			<td>Includes an induction chamber, a gas evacuation unit and charcoal filters</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Modified Bain circuit</td>
			<td>Hugo Sachs Elektronik</td>
			<td>73-4860</td>
			<td>Includes an anesthesia mask for mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Platform</td>
			<td>Kent Scientific</td>
			<td>SURGI-M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">In vivo instrumentation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11295-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iris scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14084-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11051-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26007-01</td>
			<td>Could use 27G needles as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General lab instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital shaker</td>
			<td>Sunlab</td>
			<td>D-8040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic stirrer</td>
			<td>IKA&#160;</td>
			<td>RH basic</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette,volume 10 &#181;L, 100 &#181;L, 1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>Z683884-1EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Microscopes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection stereo- zoom microscope&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10836-004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Scanning Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>LSM 800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris 8.4.2</td>
			<td>Oxford instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZEN 2.3 SP1 black</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">General Lab Material</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m syringe filter</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>17597</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 mm petri dish</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>351029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27G needle</td>
			<td>BD Microlance 3</td>
			<td>300635</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Polypropylene conical Tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5ml Syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4606108V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover slips</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>7632160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Eppendorf Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>30121872</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Chemicals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>20-158</td>
			<td>Components of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Formaldehyde Solution</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td>28908</td>
			<td>use as a 4% solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic acid</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100063</td>
			<td>Components of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Biozym</td>
			<td>850070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A2153-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X) Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal goat serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>NS02L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1888-1kg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris-base</td>
			<td>Roche</td>
			<td>TRIS-RO</td>
			<td>Components of TEA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787-250ml</td>
			<td>Diluted to 1% in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2287-500ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Drugs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fentanyl 0.5&#160;mg/10&#160;mL</td>
			<td>Braun Melsungen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane 1 mL/mL</td>
			<td>Cp-pharma</td>
			<td>31303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen 5 L</td>
			<td>Linde</td>
			<td>2020175</td>
			<td>Includes a pressure regulator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Antibodies</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rabbit IgG Alexa Fluor&#160;488&#160;</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>#4412</td>
			<td>diluted to 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-Rat IgG Alexa Fluor 647</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>#A-21247</td>
			<td>diluted to 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate (DAPI)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>H3570</td>
			<td>diluted to 1:1000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-Connexin-43</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6219</td>
			<td>diluted to 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti-HCN4 (SHG 1E5)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>MA3-903</td>
			<td>diluted to 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Other</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic ring</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Self-designed and 3D printed</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasticine</td>
			<td>Cernit</td>
			<td>49655005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silikonpasten, Baysilone</td>
			<td>VWR</td>
			<td>291-1220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">Animals</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse, C57BL/6</td>
			<td>The Jackson Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

whole-mount immunofluorescence staining, confocal imaging and 3d reconstruction of the sinoatrial and atrioventricular node in the mouse

La señal eléctrica generada fisiológicamente por las células marcapasos en el nódulo sinoauricular (SAN) se conduce a través del sistema de conducción, que incluye el nódulo auriculoventricular (AVN), para permitir la excitación y contracción de todo el corazón. Cualquier disfunción de SAN o AVN resulta en arritmias, lo que indica su papel fundamental en la electrofisiología y la arritmogénesis. Los modelos de ratón son ampliamente utilizados en la investigación de arritmias, pero la investigación específica de SAN y AVN sigue siendo un desafío.
La RAS se encuentra en la unión de la crista terminal con la vena cava superior y la AVN se encuentra en el vértice del triángulo de Koch, formado por el orificio del seno coronario, el anillo tricúspide y el tendón de Todaro. Sin embargo, debido al pequeño tamaño, la visualización por histología convencional sigue siendo un desafío y no permite el estudio de SAN y AVN dentro de su entorno 3D.
Aquí describimos un enfoque de inmunofluorescencia de montaje completo que permite la visualización local de SAN y AVN de ratón marcados. La tinción de inmunofluorescencia de montaje completo está diseñada para secciones más pequeñas de tejido sin necesidad de seccionamiento manual. Para este propósito, se disecciona el corazón del ratón, se elimina el tejido no deseado, seguido de fijación, permeabilización y bloqueo. Las células del sistema de conducción dentro de SAN y AVN se tiñen con un anticuerpo anti-HCN4. La microscopía de barrido láser confocal y el procesamiento de imágenes permiten diferenciar entre las células ganglionares y los cardiomiocitos que funcionan, y localizar claramente SAN y AVN. Además, se pueden combinar anticuerpos adicionales para etiquetar otros tipos de células, como las fibras nerviosas.
En comparación con la inmunohistología convencional, la tinción de inmunofluorescencia de montaje completo preserva la integridad anatómica del sistema de conducción cardíaca, lo que permite la investigación de AVN; especialmente en su anatomía e interacciones con el miocardio circundante y las células no miocitarias.

Mediante el uso del protocolo descrito anteriormente, se pueden realizar imágenes de microscopía confocal de SAN y AVN de manera confiable. La tinción específica del sistema de conducción utilizando anticuerpos fluorescentes dirigidos a HCN4 y la tinción del miocardio de trabajo utilizando anticuerpos fluorescentes dirigidos a Cx43 permite la identificación clara de SAN (Figura 5, Video 1) y AVN (Figura 6, Video 2<...

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Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

Proporcionamos un protocolo paso a paso para la tinción de inmunofluorescencia de montaje completo del nódulo sinoauricular (SAN) y el nódulo auriculoventricular (AVN) en corazones murinos.

Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo, imágenes confocales y reconstrucción 3D del nódulo sinoauricular y auriculoventricular en el ratón

The electrical signal physiologically generated by pacemaker cells in the sinoatrial node (SAN) is conducted through the conduction system, which includes ...

whole-mount-immunofluorescence-staining-confocal-imaging-3d

Research

JoVE Journal

Medicine

5.1K vistas.  Ludwig Maximilians University (LMU) Munich. Proporcionamos un protocolo paso a paso para la tinción de inmunofluorescencia de montaje completo del nódulo sinoauricular (SAN) y el nódulo auriculoventricular (AVN) en corazones murinos.

Video: Whole-Mount Immunofluorescence Staining, Confocal Imaging and 3D Reconstruction of the Sinoatrial and Atrioventricular Node in the Mouse

Multispectral Real-time Fluorescence Imaging for Intraoperative Detection of the Sentinel Lymph Node in Gynecologic Oncology

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical excision of the tumor with a full lymphadenectomy in the drainage area of the tumor. However, removal of lymph nodes is associated with increased morbidity due to infection, wound breakdown and lymphedema.4,5 As an alternative, the sentinel lymph node procedure (SLN) was developed several decades ago to detect the first draining lymph node from the tumor.6 In case of lymphogenic dissemination, the SLN is the first lymph node that is affected (Figure 1). Hence, if the SLN does not contain metastases, downstream lymph nodes will also be free from tumor metastases and need not to be removed. The SLN procedure is part of the treatment for many tumor types, like breast cancer and melanoma, but also for cancer of the vulva and cervix.7 The current standard methodology for SLN-detection is by peritumoral injection of radiocolloid one day prior to surgery, and a colored dye intraoperatively. Disadvantages of the procedure in cervical and vulvar cancer are multiple injections in the genital area, leading to increased psychological distress for the patient, and the use of radioactive colloid.
Multispectral fluorescence imaging is an emerging imaging modality that can be applied intraoperatively without the need for injection of radiocolloid. For intraoperative fluorescence imaging, two components are needed: a fluorescent agent and a quantitative optical system for intraoperative imaging. As a fluorophore we have used indocyanine green (ICG). ICG has been used for many decades to assess cardiac function, cerebral perfusion and liver perfusion.8 It is an inert drug with a safe pharmaco-biological profile. When excited at around 750 nm, it emits light in the near-infrared spectrum around 800 nm. A custom-made multispectral fluorescence imaging camera system was used.9.
The aim of this video article is to demonstrate the detection of the SLN using intraoperative fluorescence imaging in patients with cervical and vulvar cancer. Fluorescence imaging is used in conjunction with the standard procedure, consisting of radiocolloid and a blue dye. In the future, intraoperative fluorescence imaging might replace the current method and is also easily transferable to other indications like breast cancer and melanoma.

Fluorescence imaging is a promising innovative modality for image-guided surgery in surgical oncology. In this video we describe the technical procedure for detection of the sentinel lymph node using fluorescence imaging as showcased in gynecologic oncologicy. A multispectral fluorescence camera system, together with the fluorescent agent indocyanine green, is applied.

Multiespectrales en tiempo real imágenes de fluorescencia para la detección intraoperatoria del ganglio centinela en Oncología Ginecológica

The prognosis in virtually all solid tumors depends on the presence or absence of lymph node metastases.1-3 Surgical treatment most often combines radical ...

Investigación

Medicina

Technical Aspects of the Mouse Aortocaval Fistula

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta and inferior vena cava (IVC) are exposed. The proximal infrarenal aorta and the distal aorta are dissected for clamp placement and needle puncture, respectively. Special attention is paid to avoid dissection between the aorta and the IVC. After clamping the aorta, a 25 G needle is used to puncture both walls of the aorta into the IVC. The surrounding connective tissue is used for hemostatic compression. Successful creation of the AVF will show pulsatile arterial blood flow in the IVC. Further confirmation of successful AVF can be achieved by post-operative Doppler ultrasound.

The goal is to produce an arteriovenous fistula that is simple and reproducible. This method does not use sutures or glue adhesive. Therefore the samples can be used with the least amount of foreign materials for analysis.

Aspectos técnicos de la aortocava Fístula Ratón

Technical aspects of creating an arteriovenous fistula in the mouse are discussed. Under general anesthesia, an abdominal incision is made, and the aorta ...

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo: A Model of Single Vessel Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to image cellular events in an intact animal. Additionally, the ability to induce physiological disease states such as stroke in vivo increases its utility. The technique described herein allows for physiological assessment of cellular responses within the CNS following a stroke and can be adapted for other pathological conditions being studied. The technique presented uses laser excitation of the photosensitive dye Rose Bengal in vivo to induce a focal ischemic event in a single blood vessel. 
The video protocol demonstrates the preparation of a thin-skulled cranial window over the somatosensory cortex in a mouse for the induction of a Rose Bengal photothrombotic event keeping injury to the underlying dura matter and brain at a minimum. Surgical preparation is initially performed under a dissecting microscope with a custom-made surgical/imaging platform, which is then transferred to a confocal microscope equipped with an inverted objective adaptor. Representative images acquired utilizing this protocol are presented as well as time-lapse sequences of stroke induction. This technique is powerful in that the same area can be imaged repeatedly on subsequent days facilitating longitudinal in vivo studies of pathological processes following stroke.

Rose Bengal Photothrombosis by Confocal Optical Imaging In Vivo:  A Model of Single Vessel Stroke

Here, we describe a semi-invasive optical microscopy approach for the induction of a Rose Bengal photothrombotic clot in the somatosensory cortex of a mouse in vivo. The technical aspects of the imaging procedure are described from induction of a photothrombotic event to application and data collection.

Rosa de Bengala Photothrombosis por imagen óptica confocal<em&gt; En Vivo</em&gt;: Un modelo de solo recipiente Stroke

In vivo imaging techniques have increased in utilization due to recent advances in imaging dyes and optical technologies, allowing for the ability to ...

Imaging- and Flow Cytometry-based Analysis of Cell Position and the Cell Cycle in 3D Melanoma Spheroids

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to traditional two-dimensional (2D) cell culture. The spheroid model is able to mimic the effects of cell-cell interaction, hypoxia and nutrient deprivation, and drug penetration. One characteristic of this model is the development of a necrotic core, surrounded by a ring of G1 arrested cells, with proliferating cells on the outer layers of the spheroid. Of interest in the cancer field is how different regions of the spheroid respond to drug therapies as well as genetic or environmental manipulation. We describe here the use of the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) system along with cytometry and image analysis using commercial software to characterize the cell cycle status of cells with respect to their position inside melanoma spheroids. These methods may be used to track changes in cell cycle status, gene/protein expression or cell viability in different sub-regions of tumor spheroids over time and under different conditions.

We describe two complementary methods using the fluorescence ubiquitination cell cycle indicator (FUCCI) and image analysis or flow cytometry to identify and isolate cells in the inner G1 arrested and outer proliferating regions of 3D spheroids.

Análisis basado en Citometría Imaging- y flujo de Cell posición y el ciclo celular en 3D melanoma esferoides

Three-dimensional (3D) tumor spheroids are utilized in cancer research as a more accurate model of the in vivo tumor microenvironment, compared to ...

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the brain for visual perception. Damage to RGCs and their axons leads to vision loss and/or blindness. Although the specific cause of glaucoma is unknown, the primary risk factor for the disease is an elevated intraocular pressure. Glaucoma-inducing procedures in animal models are a valuable tool to researchers studying the mechanism of RGC death. Such information can lead to the development of effective neuroprotective treatments that could aid in the prevention of vision loss. The protocol in this paper describes a method of inducing glaucoma - like conditions in an in vivo rat model where 50 &#181;l of 2 M hypertonic saline is injected into the episcleral venous plexus. Blanching of the vessels indicates successful injection. This procedure causes loss of RGCs to simulate glaucoma. One month following injection, animals are sacrificed and eyes are removed. Next, the cornea, lens, and vitreous are removed to make an eyecup. The retina is then peeled from the back of the eye and pinned onto sylgard dishes using cactus needles. At this point, neurons in the retina can be stained for analysis. Results from this lab show that approximately 25% of RGCs are lost within one month of the procedure when compared to internal controls. This procedure allows for quantitative analysis of retinal ganglion cell death in an in vivo rat glaucoma model.

Glaucoma-inducing Procedure in an In Vivo Rat Model and Whole-mount Retina Preparation

Glaucoma is characterized by damage to retinal ganglion cells. Inducing glaucoma in animal models can provide insight into the study of this disease. Here, we outline a procedure that induces loss of RGCs in an in vivo rat model and demonstrates the preparation of whole-mount retinas for analysis.

Glaucoma de inducir en un Procedimiento<em&gt; En Vivo</em&gt; Modelo de rata y Todo el montaje-Retina Preparación

Glaucoma is a disease of the central nervous system affecting retinal ganglion cells (RGCs). RGC axons making up the optic nerve carry visual input to the ...

A Postoperative Evaluation Guideline for Computer-Assisted Reconstruction of the Mandible

Valid comparisons of postoperative accuracy results in computer-assisted reconstruction of the mandible are difficult due to heterogeneity in imaging modalities, mandibular defect classification, and evaluation methodologies between studies. This guideline uses a step-by-step approach guiding the process of imaging, classification of mandibular defects and volume assessment of three-dimensional (3D) models, after which a legitimized quantitative accuracy evaluation method can be performed between the postoperative clinical situation and the preoperative virtual plan. The condyles and the vertical and horizontal corners of the mandible are used as bony landmarks to define virtual lines in the computer-assisted surgery (CAS) software. Between these lines the axial, coronal, and both sagittal mandibular angles are calculated on both pre- and postoperative 3D models of the (neo)mandible and subsequently the deviations are calculated. By superimposing the postoperative 3D model to the preoperative virtually planned 3D model, which is fixed to the XYZ axis, the deviation between pre- and postoperative virtually planned dental implant positions can be calculated. This protocol continues and specifies an earlier publication of this evaluation guideline.

Here, we propose a practical, feasible and reproducible evaluation guideline for computer-assisted reconstruction of the mandible in order to create uniformity between studies regarding postoperative accuracy evaluation. This protocol continues and specifies an earlier publication of this evaluation guideline.

Una Guía de Evaluación Postoperatoria para la Reconstrucción Asistida por Computadora de la Mandíbula

Valid comparisons of postoperative accuracy results in computer-assisted reconstruction of the mandible are difficult due to heterogeneity in imaging ...

Blood Circuit Reconstruction in an Abdominal Mouse Heart Transplantation Model

The surgical technique of heterotopic abdominal heart transplantation in mice is a standard model for research in transplantation immunology. Here, the established technique for a modified blood circuit reconstruction in a heterotopic abdominal heart transplantation model is presented. This method uses the intrathoracic inferior vena cava (IIVC) instead of the pulmonary artery of the donor heart for the anastomosis to the inferior vena cava of the recipient. It is facilitating and improving success rates for abdominal heart transplantation in mice.

A novel technique for blood circuit reconstruction in a heterotopic abdominal mouse heart transplantation model is demonstrated.

Reconstrucción Del Circuito Sanguíneo En Un Modelo De Trasplante De Corazón De Ratón Abdominal

The surgical technique of heterotopic abdominal heart transplantation in mice is a standard model for research in transplantation immunology. Here, the ...

Refined CLARITY-Based Tissue Clearing for Three-Dimensional Fibroblast Organization in Healthy and Injured Mouse Hearts

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ventricular stiffness with altered cardiac function. This increase in cardiac ventricular fibrosis is due to activation of resident fibroblasts, although how these cells operate within the 3-dimensional (3-D) heart, at baseline or after activation, is not well understood. To examine how fibroblasts contribute to heart disease and their dynamics in the 3-D heart, a refined CLARITY-based tissue clearing and imaging method was developed that shows fluorescently labeled cardiac fibroblasts within the entire mouse heart. Tissue resident fibroblasts were genetically labeled using Rosa26-loxP-eGFP florescent reporter mice crossed with the cardiac fibroblast expressing Tcf21-MerCreMer knock-in line. This technique was used to observe fibroblast localization dynamics throughout the entire adult left ventricle in healthy mice and in fibrotic mouse models of heart disease. Interestingly, in one injury model, unique patterns of cardiac fibroblasts were observed in the injured mouse heart that followed bands of wrapped fibers in the contractile direction. In ischemic injury models, fibroblast death occurred, followed by repopulation from the infarct border zone. Collectively, this refined cardiac tissue clarifying technique and digitized imaging system allows for 3-D visualization of cardiac fibroblasts in the heart without the limitations of antibody penetration failure or previous issues surrounding lost fluorescence due to tissue processing.

A refined method of tissue clearing was developed and applied to the adult mouse heart. This method was designed to clear dense, autofluorescent cardiac tissue, while maintaining labeled fibroblast fluorescence attributed to a genetic reporter strategy.

Refinado CLARIDAD Basada En La Limpieza De Tejidos Para La Organización De Fibroblastos TridimensionalEs En Corazones De Ratón Sanos Y Lesionados

Cardiovascular disease is the most prevalent cause of mortality worldwide and is often marked by heightened cardiac fibrosis that can lead to increased ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

Aislamiento y cultivo de macrófagos cardíacos residentes del nódulo sinoauricular y auriculoventricular murino

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Microelectrode Array Recording of Sinoatrial Node Firing Rate to Identify Intrinsic Cardiac Pacemaking Defects in Mice

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or bradycardia. Reliable identification of cardiac pacemaking defects requires the measurement of intrinsic heart rates by largely preventing the influence of the autonomic nervous system, which can mask rate deficits. Traditional methods to analyze intrinsic cardiac pacemaker function include drug-induced autonomic blockade to measure in vivo heart rates, isolated heart recordings to measure intrinsic heart rates, and sinoatrial strip or single-cell patch-clamp recordings of sinoatrial pacemaker cells to measure spontaneous action potential firing rates. However, these more traditional techniques can be technically challenging and difficult to perform. Here, we present a new methodology to measure intrinsic cardiac firing rate by performing microelectrode array (MEA) recordings of whole-mount sinoatrial node preparations from mice. MEAs are composed of multiple microelectrodes arranged in a grid-like pattern for recording in vitro extracellular field potentials. The method described herein has the combined advantage of being relatively faster, simpler, and more precise than previous approaches for recording intrinsic heart rates, while also allowing easy pharmacological interrogation.

This protocol aims to describe a new methodology to measure intrinsic cardiac firing rate using microelectrode array recording of the whole sinoatrial node tissue to identify pacemaking defects in mice. Pharmacological agents can also be introduced in this method to study their effects on intrinsic pacemaking.

Registro de la matriz de microelectrodos de la tasa de disparo del nódulo sinoauricular para identificar defectos intrínsecos de marcapasos cardíacos en ratones

The sinoatrial node (SAN), located in the right atrium, contains the pacemaker cells of the heart, and dysfunction of this region can cause tachycardia or ...