Hasta kaynaklı eksplantlar, hasta sonuçlarını doğru bir şekilde tahmin edebilen anında ilaç yanıt verileri sağlayan kısa vadeli bir yöntemdir. PD platformları, ilaç yanıtlarının bölgesel tümörlerin patolojik ve mimari özelliklerini mümkün olduğunca yakından yansıtan 3D bağlamda incelenmesini sağlar. Eksplantlar, bir ilacın metabolizması ve etki mekanizması hakkında yeni içgörüler sunma ve yeni farmakodinamik biyobelirteçlerin tanımlanmasını kolaylaştırma potansiyeline sahiptir.
Deneye başlamadan önce, tüm cerrahi ekipmanları% 70 endüstriyel metillenmiş ruh çözeltisi ile temizleyin. 10 santimetrelik bir kültür yemeğini buz üzerinde 25 mililitre taze ortamla doldurun. Cımbız kullanarak, numuneyi bir diş cilası yüzeyine aktarın ve dokuyu yaklaşık iki ila üç milimetreküp parçalar halinde dilimlemek için iki deri greft bıçağı kullanın.
Eksplantları 10 santimetrelik bir tabağa aktarın ve oda sıcaklığında 24 saatlik bir inkübasyon için% 10 tamponlanmamış formalin çözeltisi içeren bir mililitre tüpüne altı ila dokuz parça yerleştirin. Altı kuyu plakasının istenen kuyu sayısını kuyu başına 1,5 mililitre taze orta ile doldurun. Ve organotipik bir kültürün her kuyuya bir tabak yerleştirin, böylece ortamın üzerine yüzer.
Her bir kesici uç diskine altı ila dokuz eksplant yerleştirin ve geri kazanıma izin vermek için% 5 karbondioksit inkübatörde 16 saatlik bir inkübasyon için saklayın. Ertesi gün, yeni bir tabağın her kuyusuna taze orta ve ilaç ekleyin. Araç kontrolü için bir kuyu ekleyin.
Tüm ilaç tedavileri hazırlandığında, karbondioksit inkübatöründe 24 ila 48 saatlik bir inkübasyon için yeni altı kuyu plakasının her kuyusuna bir kesici uç aktarmak için cımbız kullanın. İlaç tedavisinden sonra, diskleri% 10 formalin içeren yeni altı kuyu plakasına aktarın. Ve oda sıcaklığında 24 saatlik inkübasyon için fiksatif ile tam kapsama sağlamak için her explant'ın üstüne birkaç damla% 10 formalin ekleyin.
Ertesi gün, uygun sayıda küçük histoloji süngerini% 70 endüstriyel metillenmiş çözeltiye batırın. Süngerleri histoloji kasetlerinin içine yerleştirin. Tüm süngerler yerleştirildiğinde, aynı ilaç tedavi durumundaki tüm eksplantları, takılan diske temas eden her eksplantın ilaçla tedavi edilen tarafıyla tek bir süngere aktarın.
Her eksplantın üzerine başka bir önceden yerleştirilmiş sünger yerleştirin ve kasetin içine eksplantları sabitlemek için kaseti kapatın. Daha sonra histolojik işleme devam etmeden önce kasetleri% 70 endüstriyel metillenmiş çözeltiye batırın. Taramadan sonra, bir eğitim analizi yapın ve eğitim için pulları içeren taramaları uygun analiz yazılımına yükleyin.
Tek modlu görünümde, görüntülerde gezinin ve analiz etmek için taramaları ve iç floresan ile taramayı seçin. tek bir görünümde iç floresan taraması ile, alaşağı edilmemiş doku alanına bir segment çizmek için otomatik mağaza seçiciyi tıklatın. İşaretçileri ve renkleri düzenle'yi tıklatın ve her floroforla ilişkili kutuya işaret adlarını girin.
Yazılımın yüklenen tüm görüntülerden iç floresan yoğunluğunu çıkarmasını sağlamak için görüntüleri hazırla'yı tıklayın. Doku segmentasyon eğitim penceresini açmak için ekranın üstündeki segment dokusu adımını tıklatın. Doku kategorileri paneline, segmentlere ayırılacak her doku kategorisinin adını girin.
İlgi alanı doku kategorisindeki hücre gruplarının etrafına bölgeler çizmek için çiz'i tıklatın. Ardından bir sonraki doku kategorisine geçin ve yeni bölgeler çizin. Tüm eğitim bölgeleri tanımlandığında, tren dokusu segmenterini kullanın ve eğitim doğruluğunun oturmasını bekleyin.
Muhtemelen %100'e yakın bir değere dokuları segmentlere ayırın. Doku segmentasyonunun kalitesini doğruladıktan sonra, hücre segmentasyonunu tıklayın ve segmentlere ayıracak hücresel bölmeleri seçin. Nükleer bileşeni yapılandırmak için, nükleer pikselleri algılamak için kullanılan eşiği ayarlamak için tipik yoğunluk kaydırıcısını kullanın.
Canlı geri bildirim önizleme penceresi tarafından sağlanır. Nükleer piksel kümelerini bölmek için, nükleer bileşenlerin bölünen panelinde, çekirdeğin boyama kalitesini en iyi açıklayan düğmeyi seçin ve bölme hassasiyetini ayarlamak için kaydırıcı çubuğunu kullanın. Ardından, tüm görüntüleri segmentlere ayır'ı tıklatın.
Tüm görüntüler bölümlere ayırıldığında, fenotipler panelinde, algılanacak fenotiplerin listesini ekleyin ve fenotiplerin adını ilgili metin kutusuna girin. Belirli bir hücreyi seçmek ve açılır menüden karşılık gelen fenotipi seçmek için fenotipleri düzenle'yi tıklatın. Eğitim seçimini tamamladıktan sonra, her fenotipin sonucunu değerlendirmek için tren sınıflandırıcısını tıklatın.
Fenotip tümü ile devam edin, projeyi kaydedin ve dışa aktar'ı tıklatın. Toplu iş çözümleme sekmesini seçin ve projeyi toplu iş algoritmasına veya proje kutusuna yükleyin. Görüntüleri ve tabloları dışa aktarmak için dışa aktarma seçeneklerindeki tüm kutuları seçin, slayt ekle'yi tıklatın ve daha önce hazırlanmış toplu işlerle ilgili pulları içeren tüm görüntüleri yükleyin.
Ardından, bir damganın toplu iş çözümlemesine başlamak için çalıştır'ı tıklatın ve elde edildiğinde ilgili verileri dışarı aktar. Hücre canlılığı belirteçleri için boyanmış NSCLC eksplant dokusunun çoklu spektral görüntülemesi, bireysel hücre popülasyonlarının tanımlanmasına ve fenotiplemesinin yanı sıra eksiz tümör mikro ortamında tümör ve stromal bileşenlerin tanımlanmasına izin vermektedir. Hücre canlılık belirteci lekelerinin doku ve hücre segmentasyonu, gösterildiği gibi multi-spektral görüntüleri lekeler, ilgi çekici ilaçlarla tedavi edilen hasta türevli eksplantlarda hücre ölümünü ve çoğalmasını ölçmek için kullanılabilir.
Örneğin, bu analizde Nivolumab ile tedavi edilen tümörlerden alınan doku örneklerinde, tedavi edilen tümör örneklerine kıyasla daha yüksek sayıda ölmekte olan hücre tespit edilmiştir. Ek olarak, gösterildiği gibi, lekeli diseksiyonlardan mekansal bilgi çıkarma yeteneği, hücreler arası mesafelerin hesaplanmasına izin verir. Eksplantlar, numunenin 3D yapısını korurken yüzlerce biyobelirtecinin yan çözünürlükte aynı anda profillenebilmesini sağlayan kapsamlı uzamsal profilleme veya kütle sitometrisi için de kullanılabilir.
PD'ler immünoterapinin etkinliğini tahmin edebilir. Örneğin, hassas veya dirençli vakaları immün kontrol noktası inhibitörlerine ayırt etmek ve bu ayrımı destekleyen mekanizmaları araştırmak mümkün olabilir.
