Los explantes derivados del paciente son un método a corto plazo que proporciona datos de respuesta inmediata al fármaco que pueden predecir con precisión los resultados del paciente. Las plataformas de EP permiten examinar las respuestas a los fármacos en un contexto 3D que refleja las características patológicas y arquitectónicas de los tumores regionales lo más cerca posible. Los explantes tienen el potencial de ofrecer nuevos conocimientos sobre el metabolismo y el mecanismo de acción de un fármaco y facilitar la identificación de nuevos biomarcadores farmacodinámicos.
Antes de comenzar el experimento, limpie todo el equipo quirúrgico con una solución de licores metilados al 70% industrial. Llene un plato de cultivo de 10 centímetros con 25 mililitros de medio fresco sobre hielo. Usando pinzas, transfiera la muestra a una superficie de cera dental Y use dos cuchillas de injerto de piel para cortar el tejido en fragmentos de aproximadamente dos a tres milímetros cúbicos.
Transfiera los explantes a un plato de 10 centímetros y coloque de seis a nueve piezas del tejido en un tubo de un mililitro que contenga una solución de formalina no tamponada al 10% durante una incubación de 24 horas a temperatura ambiente. Llene el número deseado de pocillos de una placa de seis pocillos con 1,5 mililitros de medio fresco por pozo. Y coloque un plato organotípico de cultivo inserte en cada pozo para que flote sobre el medio.
Coloque de seis a nueve explantes en cada disco de inserción y guárdelo durante una incubación de 16 horas en una incubadora de dióxido de carbono al 5% para permitir la recuperación. Al día siguiente, agregue medio fresco y droga a cada pocillo de un plato nuevo. Incluye un pozo para el control del vehículo.
Cuando se hayan preparado todos los tratamientos farmacológicos, use pinzas para transferir un inserto a cada pozo de la nueva placa de seis pocillos para una incubación de 24 a 48 horas en la incubadora de dióxido de carbono. Después del tratamiento farmacológico, transfiera los discos a nuevas placas de seis pocillos que contengan 10% de formalina. Y agregue unas gotas de formalina al 10% en la parte superior de cada explante para garantizar una cobertura completa con el fijador durante 24 horas de incubación a temperatura ambiente.
Al día siguiente, remoje un número apropiado de pequeñas esponjas histológicas en una solución metilada industrial al 70%. Y coloca las esponjas dentro de casetes histológicos. Cuando se hayan colocado todas las esponjas, transfiera todos los explantes de la misma condición de tratamiento farmacológico a una sola esponja con el lado tratado con el medicamento de cada explante en contacto con el disco insertado.
Coloque otra esponja presomada encima de cada explante y cierre el cassette para asegurar los explantes en el cassette. Luego sumerja los casetes en una solución metilada industrial al 70% antes de continuar con el procesamiento histológico. Después del escaneo, realice un análisis de entrenamiento y cargue los escaneos que contienen los sellos para el entrenamiento en el software de análisis apropiado.
En la vista de modo único, navegue por las imágenes y seleccione los escaneos a analizar y el escaneo con fluorescencia intrínseca. con la exploración de fluorescencia intrínseca en una sola vista, haga clic en el selector de autofluorescencia para dibujar un segmento en un área de tejido no teñido. Haga clic en editar marcadores y colores e introduzca los nombres de los marcadores en el cuadro asociado a cada fluoróforo.
Haga clic en preparar imágenes para permitir que el software reste la intensidad de la fluorescencia intrínseca de todas las imágenes cargadas. Haga clic en el paso de tejido de segmento en la parte superior de la pantalla para abrir la ventana de entrenamiento de segmentación de tejido. En el panel Categorías de tejidos, introduzca el nombre de cada categoría de tejidos que se va a segmentar.
Haga clic en dibujar para dibujar regiones alrededor de grupos de células en la categoría de tejido de interés. A continuación, cambie a la siguiente categoría de tejido y dibuje nuevas regiones. Cuando se hayan definido todas las regiones de entrenamiento, use el segmentador de tejidos de tren y espere a que se asiente la precisión del entrenamiento.
Posiblemente a un valor cercano al 100%Click segmenta todo para segmentar los tejidos. Después de verificar la calidad de la segmentación del tejido, haga clic en segmentación celular y seleccione los compartimentos celulares para segmentar. Para configurar el componente nuclear, utilice el control deslizante de intensidad típico para ajustar el umbral utilizado para detectar los píxeles nucleares.
Los comentarios en vivo son proporcionados por la ventana de vista previa. Para dividir los grupos de píxeles nucleares, en el panel de división de componentes nucleares, seleccione el botón que mejor describa la calidad de tinción de los núcleos y use la barra deslizante para ajustar la sensibilidad de división. A continuación, haga clic en segmentar todo para segmentar todas las imágenes.
Cuando todas las imágenes se hayan segmentado, en el panel fenotipos, agregue la lista de fenotipos a detectar e ingrese el nombre de los fenotipos en el cuadro de texto correspondiente. Haga clic en editar fenotipos para seleccionar una celda en particular y seleccione el fenotipo correspondiente en el menú desplegable. Después de completar la selección para el entrenamiento, haga clic en el clasificador de trenes para evaluar el resultado de cada fenotipo.
Continúe con el fenotipo todo, guarde el proyecto y haga clic en exportar. Seleccione la ficha análisis de lotes y cargue el proyecto en el algoritmo por lotes o en el cuadro de proyecto. Para exportar las imágenes y tablas, seleccione todas las casillas de las opciones de exportación, haga clic en agregar diapositivas y cargue todas las imágenes que contienen los sellos de los lotes preparados anteriormente.
A continuación, haga clic en Ejecutar para iniciar el análisis por lotes de un sello y exporte los datos correspondientes cuando se haya adquirido. La imagen multiespectral del tejido explantado de NSCLC teñido para marcadores de viabilidad celular, permite la identificación y fenotipado de poblaciones celulares individuales, así como la identificación de componentes tumorales y estromales dentro del microambiente tumoral de explante. La segmentación tisular y celular de las manchas de marcadores de viabilidad celular de imágenes multiespectrales como se ha demostrado, se puede utilizar para cuantificar la muerte celular y la proliferación en explantes derivados de pacientes tratados con fármacos de interés.
Por ejemplo, en este análisis, en muestras de tejido de tumores tratados con Nivolumab, se identificó un mayor número de células moribundas en comparación con las muestras tumorales tratadas con control. Además, como se ilustra, la capacidad de extraer información espacial de disecciones teñidas, permite el cálculo de distancias intercelulares. Los explantes también se pueden utilizar para perfiles espaciales extensos o citometría de masas, lo que permite perfilar cientos de biomarcadores simultáneamente a resolución subsidiaria al tiempo que se preserva la estructura 3D de la muestra.
Los PD podrían predecir la eficacia de la inmunoterapia. Por ejemplo, podría ser posible distinguir los casos sensibles o resistentes a los inhibidores del punto de control inmunitario e investigar los mecanismos que sustentan esta distinción.
