As explantas derivadas do paciente são um método de curto prazo que fornece dados imediatos de resposta a medicamentos que podem prever com precisão os resultados dos pacientes. As plataformas PD permitem que as respostas medicamentosas sejam examinadas em um contexto 3D que espelha as características patológicas e arquitetônicas dos tumores regionais o mais próximo possível. Explantas têm o potencial de oferecer novas percepções sobre o metabolismo e mecanismo de ação de uma droga e facilitar a identificação de novos biomarcadores farmacodinâmicos.
Antes de iniciar o experimento, limpe todos os equipamentos cirúrgicos com solução de 70% de espíritos metilados industriais. Encha um prato de cultura de 10 centímetros com 25 mililitros de meio fresco no gelo. Usando pinças, transfira a amostra para uma superfície de cera dentária e use duas lâminas de enxerto de pele para cortar o tecido em fragmentos de aproximadamente dois a três milímetros cúbicos.
Transfira as explantas em uma antena de 10 centímetros e coloque de seis a nove pedaços do tecido em um tubo de um mililitro contendo uma solução de formalina 10% não tamponada para uma incubação de 24 horas à temperatura ambiente. Encha o número desejado de poços de uma placa de seis poços com 1,5 mililitros de meio fresco por poço. E coloque um prato de inserção de cultura organotípica em cada poço para que ele flutue em cima do meio.
Coloque de seis a nove explantes em cada disco de inserção e armazene para uma incubação de 16 horas em uma incubadora de dióxido de carbono de 5% para permitir a recuperação. No dia seguinte, adicione meio fresco e droga a cada poço de uma nova placa. Inclua um poço para o controle do veículo.
Quando todos os tratamentos medicamentosos tiverem sido preparados, use pinças para transferir uma inserção para cada poço da nova placa de seis poços para uma incubação de 24 a 48 horas na incubadora de dióxido de carbono. Após o tratamento da droga, transfira os discos para novas seis placas de poço contendo 10% de formalina. E adicione algumas gotas de 10% de formalina ao topo de cada explanta para garantir cobertura completa com o fixador por 24 horas de incubação à temperatura ambiente.
No dia seguinte, mergulhe um número apropriado de pequenas esponjas de histologia em 70% solução metilada industrial. E coloque as esponjas dentro de histologia. Quando todas as esponjas tiverem sido colocadas, transfira todas as explantas da mesma condição de tratamento medicamentoso para uma única esponja com o lado tratado da droga de cada explanta entrando em contato com o disco inserido.
Coloque outra esponja presoaked em cima de cada explanta e feche o para fixar as explantas no. Em seguida, submergir as fitas em solução metilada 70% industrial antes de prosseguir com o processamento histológico. Após a varredura, realize uma análise de treinamento e carregue as varreduras contendo os selos para treinamento no software de análise adequado.
Em uma visão de modo único, navegue pelas imagens e selecione as varreduras para analisar e a varredura com fluorescência intrínseca. com a fluorescência intrínseca em uma única exibição, clique no catador de autofluorescência para desenhar um segmento em uma área de tecido não manchado. Clique em editar marcadores e cores e digite os nomes dos marcadores na caixa associadas a cada fluoróforo.
Clique em preparar imagens para permitir que o software subtraia a intensidade da fluorescência intrínseca de todas as imagens enviadas. Clique no passo do tecido do segmento em cima da tela para abrir a janela de treinamento de segmentação de tecidos. No painel categorias teciduais, digite o nome de cada categoria de tecido a ser segmentado.
Clique em desenhar, para desenhar regiões em torno de grupos de células na categoria tecidual de interesse. Em seguida, mude para a próxima categoria de tecido e desenhe novas regiões. Quando todas as regiões de treinamento forem definidas, use o segmentador de tecido de trem e aguarde a precisão do treinamento para se estabelecer.
Possivelmente para um valor próximo a 100% Clique segmento tudo para segmentar os tecidos. Após verificar a qualidade da segmentação tecidual, clique na segmentação celular e selecione os compartimentos celulares para o segmento. Para configurar o componente nuclear, use o controle deslizante de intensidade típico para ajustar o limiar usado para detectar os pixels nucleares.
O feedback ao vivo é fornecido pela janela de visualização. Para dividir os clusters de pixels nucleares, no painel de divisão de componentes nucleares, selecione o botão que melhor descreve a qualidade de coloração dos núcleos e use a barra de controle deslizante para ajustar a sensibilidade de divisão. Em seguida, clique no segmento tudo para segmentar todas as imagens.
Quando todas as imagens tiverem sido segmentadas, no painel de fenótipos, adicione a lista de fenótipos a serem detectados e insira o nome dos fenótipos na caixa de texto correspondente. Clique em editar fenótipos para selecionar uma célula específica e selecione o fenótipo correspondente no menu suspenso. Após concluir a seleção para treinamento, clique no classificador de trem para avaliar o resultado de cada fenótipo.
Proceda com o fenótipo de todos, salve o projeto e clique em exportar. Selecione a guia de análise em lote e carregue o projeto no algoritmo do lote ou na caixa do projeto. Para exportar as imagens e tabelas, selecione todas as caixas nas opções de exportação, clique em adicionar slides e carregue todas as imagens contendo os selos dos lotes previamente preparados.
Em seguida, clique em executar para a análise do lote inicial de um selo e exporte os dados correspondentes quando ele tiver sido adquirido. A imagem multiespectral do tecido explant NSCLC manchado para marcadores de viabilidade celular, permite a identificação e fenotipagem de populações celulares individuais, bem como a identificação de tumores e componentes estrômicos dentro do micro ambiente tumoral explant. A segmentação de tecidos e células do marcador de viabilidade celular mancha imagens multiespectrais como demonstrado, pode ser usada para quantificar a morte celular e a proliferação em explantas derivadas do paciente tratadas com drogas de interesse.
Por exemplo, nesta análise, em amostras de tecidos de tumores tratados com Nivolumab, um maior número de células moribundas foram identificadas em comparação com as amostras de tumores tratados de controle. Além disso, como ilustrado, a capacidade de extrair informações espaciais a partir de dissecções manchadas, permite o cálculo das distâncias intercélulas. Explantas também podem ser usadas para perfis espaciais extensos ou citometria em massa, o que permite que centenas de biomarcadores sejam perfilado simultaneamente em resolução subsidiária, preservando a estrutura 3D da amostra.
Os PDs poderiam prever a eficácia da imunoterapia. Por exemplo, poderia ser possível distinguir casos sensíveis ou resistentes aos inibidores de checkpoint imunológicos e investigar os mecanismos que sustentam essa distinção.
